CN105639590B - 一种解淀粉芽孢杆菌在酱油酿造中的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌在酱油酿造中的应用方法，属于微生物和食品技术领域。本发明方法是在酱油生产过程中成曲拌盐水进行发酵后的第0d至第3d接种食品安全菌解淀粉芽孢杆菌。采用本发明的方法，可以在不改变酱油主要理化指标的前提下，改善了酱油风味物质和口感，并降低了酱油中的氨基甲酸乙酯。
Description
技术领域
本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌在酱油酿造中的应用方法，属于微生物和食品技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)被世界卫生组织归为2A类致癌物质，与丙烯胺同等危险。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等严重性肿瘤疾病。氨基甲酸乙酯广泛存在于传统发酵食品中，包括酒类、酱油、腐乳等产品。酱油中氨基甲酸乙酯前体物质主要有瓜氨酸和尿素，他们均可与酱油中的乙醇(日式酱油中乙醇含量为2.5％)反应生成氨基甲酸乙酯。
国内关于控制和减少酱油中氨基甲酸乙酯的研究和解决措施较少。有研究采用添加嗜盐四联球菌降低酱油中EC的前体物质---瓜氨酸以期实现减少产品中的EC含量。然而该菌用于酱油生产是否能够最终降低酱油的氨基甲酸乙酯是不确定的，添加该菌对于酱油理化指标、风味物质会产生何种影响也是未知的。
目前改善酱油风味方法主要有改善生产工艺，比如延长发酵时间，分阶段恒温控制等。也有人为添加乳酸菌和酵母菌来增加酱油风味。但是增加风味的同时，降低酱油中有害物质氨基甲酸乙酯的研究未见报道。
发明内容
为了克服上述问题，本发明通过在酱油生产过程中添加一定量的解淀粉芽孢杆菌，在不改变酱油主要理化指标的前提下，改善了酱油风味物质和口感，并降低了酱油中的氨基甲酸乙酯，同时解淀粉芽孢杆菌是食品安全菌。
本发明的第一个目的是提供一种降低酱油氨基甲酸乙酯含量的方法，是在酱油酿造过程中添接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BBE-JY06。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BBE-JY06，已于2015年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015423，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述解淀粉芽孢杆菌在180g/LNaCl的高盐环境下能利用精氨酸且不积累瓜氨酸。
本发明中，如无特殊说明，菌体数量10n CFU/mL是指菌体数量达到数量级n，比如107是指菌体数目大于等于1×107且小于1×108。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是在酱油发酵的第0-3d接种解淀粉芽孢杆菌至酱醪中解淀粉芽孢杆菌达到106CFU/mL至108CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述方法，具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦经浸泡、灭菌、降温后，加入麸皮、面粉，并接种米曲霉孢子，培养，待曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲拌盐水，开始发酵，在发酵的第0-3d内接种解淀粉芽孢杆菌，控温10-20℃，发酵第7d接种107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。
本发明的第二个目的是提供一种改善酱油风味的方法，所述改善酱油风味的方法是在成曲拌盐水进行发酵后的第3d接种解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06。
在本发明的一种实施方式中，所述接种解淀粉芽孢杆菌是接种至酱醪中解淀粉芽孢杆菌达到107CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述改善酱油风味的方法，具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦经浸泡、灭菌、降温后，加入麸皮、面粉，并接种米曲霉孢子，培养，待曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲拌盐水，开始发酵，发酵的第3d接种解淀粉芽孢杆菌，控温10-20℃，发酵第7d接种107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述改善酱油风味的方法，具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5min，降温至80℃，按比例加入麸皮、面粉，脱脂大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8×109个/g初始原料(初始原料是指成曲发酵初始原料，包括脱脂大豆、炒麦、麸皮、面粉、水等)，30℃恒温箱中培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h，曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲与20％的盐水(w:v)以体积比为1:1.7的比例混合，开始发酵，在发酵的第3d接种解淀粉芽孢杆菌，控温10-20℃，发酵第7d接种107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。
本发明的有益效果：本发明通过在酱油生产过程中添加一定量的解淀粉芽孢杆菌，在不改变酱油主要理化指标的前提下，改善了酱油风味物质和口感，并降低了酱油中的氨基甲酸乙酯，同时解淀粉芽孢杆菌是食品安全菌。
生物材料保藏
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BBE-JY06，已于2015年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015423，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
具体实施方式
解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06的培养条件为：将保藏的解淀粉芽孢杆菌在含100g/LNaCl的LB固体培养基上划线，于30℃静置培养2d，挑取单菌落接入含100g/L NaCl的LB液体培养基，30℃静置培养36h，离心1min(8000rpm，4℃)后去上清，所获得菌体的用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)重悬浮。
实施例1：酱油制作
(1)制曲：脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5min，降温至80℃，按比例加入麸皮、面粉，脱脂大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8×109个/g初始原料，30℃恒温箱中培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h，曲变成嫩绿色，制曲完成；
(2)发酵：成曲与20％的盐水(w:v)以体积比为1:1.7的比例混合发酵，第3d接种解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06，控温10-20℃，发酵第7d接种终浓度为107CFU/mL的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至在酱醅中的终浓度为107CFU/mL，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。
发酵结束后分析了酱油的理化指标并对酱油进行感官评定，同时测定了酱油中EC及其前体物质，结果如表1所示。
表1酱油理化指标
注：1为不添加BBE-JY06；2为第0d添加107CFU/mL的BBE-JY06；3为第0d添加108CFU/mL的BBE-JY06；4为第3d添加107CFU/mL的BBE-JY06。
由表1可知，酱油发酵时添加解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06对于酱油主要理化指标几乎没有影响，总酸明显比不添加BBE-JY06的样品提高了。酸类物质主要是乳酸，乳酸本身是风味物质，可以和乙醇发生酯化反应生成乳酸乙酯，提高酱油风味。
表2酱油感官评定
注：1为不添加BBE-JY06；2为第0d添加107CFU/mL的BBE-JY06；3为第0d添加108CFU/mL的BBE-JY06；4为第3d添加107CFU/mL的BBE-JY06。
由表2可知，解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06在酱油中的添加量不能小于107CFU/mL，而且第3d添加时能够提高酱油风味。
表3酱油中EC及其前体物质含量
注：“-”未检测到；1为不添加BBE-JY06；2为第0d添加107CFU/mL的BBE-JY06；3为第0d添加108CFU/mL的BBE-JY06；4为第3d添加107CFU/mL的BBE-JY06。
由表3可知，解淀粉芽孢杆菌能够降低酱油中的EC前体物质瓜氨酸，从而降低EC。第3d添加解淀粉芽孢杆菌对于EC的降低效果没有第0d添加的效果好，但是也能降低50％的EC。
表4压榨后原油中精氨酸代谢相关氨基酸含量
注：1为不添加BBE-JY06；2为第0d添加107CFU/mL的BBE-JY06；3为第0d添加108CFU/mL的BBE-JY06；4为第3d添加107CFU/mL的BBE-JY06。
表1至表4数据表明，第0d和第3d添加107CFU/mL至108CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06，都能通过精氨酸脱亚胺酶代谢途径将精氨酸大量转化为鸟氨酸。第3d添加BBE-JY06对于酱油风味改善有好处，但是对于降低EC前体物质效果没有第0d添加明显。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06在增加酱油中γ-聚谷氨酸含量的应用
(1)BBE-JY06在纯培养基利用L-谷氨酸产生γ-聚谷氨酸
种子培养基：蔗糖1％，蛋白胨1％，L-谷氨酸2％，MgSO40.1％，NaCl 0.5％，K2HPO40.05％，pH 7.0，115℃灭菌20min。
发酵培养基：蔗糖2％，蛋白胨2％，L-谷氨酸2％，MgSO40.1％，NaCl 2％，K2HPO40.05％，pH 7.0，115℃灭菌20min。
挑取少许解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06至种子培养基中，37℃，200rpm摇床培养12h。按10％的接种量将解淀粉芽孢杆菌接种至盛有50mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，37℃静置培养24h。
(2)BBE-JY06在酱油发酵中利用L-谷氨酸产生γ-聚谷氨酸，具体方法与实施例1中的样品2一样。
(3)γ-聚谷氨酸的检测方法
准确量取50mL发酵液，经9000rpm离心15min，除去菌体，取上清液，用HCl将上清液的pH值调至4，然后加入4倍体积的甲醇，在4℃静置过夜，8000r/min离心15min取沉淀，甲醇洗涤沉淀物2次，然后加入超纯水溶解后透析16h。取透析液加入4倍体积甲醇沉淀，离心收集沉淀物，再加入超纯水溶解，冷冻干燥48h得到淡黄色粉末。将此粉末用6M的HCl溶解，抽真空，然后沸水浴24h。将酸水解后的γ-聚谷氨酸溶液冷却后1000rpm离心5min，去除黑色杂质，然后用NaOH溶液将pH调至中性，再稀释至5倍、10倍、15倍。取1mL稀释液过滤，以未经酸水解的样品为对照，分别用HPLC测定γ-聚谷氨酸含量。标样为0.2g/L的L-谷氨酸溶液。
γ-聚谷氨酸是微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，具有促进矿物质吸收的作用，是一种食品保健因子。由表5看出，单独培养解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06和将其添加到酱醪中进行酱油发酵时，都可以产生或提高γ-聚谷氨酸的产量。其中，在酱油发酵时向酱醪中添加解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06，γ-聚谷氨酸的含量比对照组提高了64％。
表5γ-聚谷氨酸的含量
注：1为纯培养基中添加BBE-JY06，2是酱油发酵时不添加BBE-JY06，3酱油发酵时第0d添加107CFU/mL的BBE-JY06。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (3)
1.一种改善酱油风味的方法，其特征在于，所述方法是在酱油酿造过程中接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BBE-JY06；
所述方法是在成曲拌盐水进行发酵后的第3d接种解淀粉芽孢杆菌；
所述接种解淀粉芽孢杆菌是接种至酱醪中解淀粉芽孢杆菌达到107CFU/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦经浸泡、灭菌、降温后，加入麸皮、面粉，并接种米曲霉孢子，培养，待曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲拌盐水，开始发酵，发酵的第3d接种解淀粉芽孢杆菌，控温10-20℃，发酵第7d接种最终在酱醪中的浓度为107CFU/mL的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至最终在酱醪中的浓度为107CFU/mL，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121℃灭菌5min，降温至80℃，按比例加入麸皮、面粉，脱脂大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8×109个/g初始原料，30℃恒温箱中培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h，曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲与20％w/v的盐水以体积比为1:1.7的比例混合，开始发酵，在发酵的第3d接种解淀粉芽孢杆菌，控温10-20℃，发酵第7d接种最终在酱醪中的浓度为107CFU/mL的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至最终在酱醪中的浓度为107CFU/mL，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。
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