CN112646745A

CN112646745A - 一种暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用

Info

Publication number: CN112646745A
Application number: CN202011595712.4A
Authority: CN
Inventors: 李永; 薛寒; 朴春根
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112646745B

Abstract

本发明公开了一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)10015、由其制备的菌剂及其应用。采用本发明的暹罗芽孢杆菌10015菌株制备的菌剂能够有效抑制欧美杨细菌性溃疡病菌，对欧美杨细菌性溃疡病具有较好的防治效果，通过田间防治试验发现，在欧美杨细菌性溃疡病发病初期施加本发明的菌剂能够得到较明显的防治效果，平均防效可达70％以上。适合在欧美杨细菌性溃疡病生防实践中推广应用。

Description

一种暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用

技术领域

本申请涉及生物防治领域，具体而言，涉及一种暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用。

背景技术

速生杨是我国人工林的主要树种，主要栽培品系为美洲黑杨(Populusdeltoides)和欧美(Populus×euramericana)杂交杨的品系，属于杨柳科杨属黑杨派成员，其因为生长快、抗病虫能力强的特点在国内广泛种植。

然而2000年以后我国速生杨上新发生了一种细菌性病害-欧美杨细菌性溃疡病，该病害发病初期树皮轻微开裂，流出白色酸臭汁液，随后树皮迅速腐烂降解，危害严重的会导致树木死亡。2013年以前，虽然确定了该病原菌，但是由于分类鉴定水平所限，一直将该病原菌鉴定为Lonsdalea quercina，如徐方媛等(“欧美杨溃疡病防治的初步研究”，中国农学通报，2013，29(16)：12-17)就采用了Lonsdalea quercina这一种名。但是欧美杨细菌性溃疡病菌与Lonsdalea quercina种下的三个亚种(L.quercinasubsp.quercina，L.quercinasubsp.iberica，L.quercinasubsp.britannica)存在明显的生理生化的差异。2014年Li等(“A Canker Disease of Populus×euramericanain China Caused byLonsdaleaquercinasubsp.populi”，Plant Disease，2014，98(3)：368-378)将该病害的病原菌鉴定为L.quercinasubsp.populi。2017年Li等(“Elevation of three subspecies ofLonsdalea quercina to species level：Lonsdalea britannicasp.nov.，Lonsdaleaibericasp.nov.and Lonsdalea populi sp.nov.Int J Syst Evol Microbiol”，2017，67(11)：4680-4684)利用基因组比较等方法，将Lonsdalea quercina种下的四个亚种鉴定为种的水平，并将欧美杨细菌性溃疡病原菌鉴定为Lonsdalea populi。因此，Lonsdaleaquercina、L.quercinasubsp.populi为欧美杨细菌性溃疡病原菌的曾用名，Lonsdaleapopuli为该病原菌的现用名。该病害主要在河南省、山东省、河北省、天津市和宁夏回族自治区5省市自治区的部分地区大面积发生和危害，据菏泽市林业局统计，菏泽市2007年有3万公顷杨树发生该病害，最严重的地块发病率高达70％，对我国杨树人工林造成了重大威胁。并且欧美杨细菌性溃疡病是广发性病害，2000年以后在西班牙、匈牙利、葡萄牙等欧洲地区也有该病害发生和危害的报道。

该病害导致树木产生大量伤流，损耗树木养分，随后韧皮部局部坏死，造成病部枝干枯死，严重影响树木的健康生长，甚至造成死亡。从目前的研究看，该病害一旦发生，难以控制，尚无有效的防治药剂和防治方法。徐方媛等(“欧美杨溃疡病防治的初步研究”，中国农学通报，2013，29(16)：12-17)，从土壤中得到5株对欧美杨溃疡病原菌(Lonsdaleaquercina)有拮抗作用的菌株，通过灌根和涂干实验发现，菌株P2(枯草芽孢杆菌，Bacillussubtilis)和P4(委内瑞拉链霉菌，Streptomyces venezuelae)灌根防效分别达到51.8％和48.6％，涂干处理的防效分别为17.1％和23.5％。虽然采用菌株P2和P4灌根处理具备一定的防效，但是该方法工作量大、工作繁琐、生防菌用量大，必须灌根3次才达到了防效最高51.8％，且这种大量土施菌液的方法容易破坏土壤微生物菌群的生态平衡。因此，用上述两种菌株灌根的处理方法尚不适宜用于欧美杨细菌性溃疡病的生防实践。另外，文章中采用的涂干处理方法是先用无菌棉浸湿菌液(10⁸CFU/mL)包裹在健康完好枝干干部，保鲜膜保湿，3天后接种病原菌。由于先接种拮抗菌会使其在树干形成优势种群，继而对后接种的病原菌可形成抑制作用，可想而知，如果是在树体已发病状态下，即病原菌先在树体上形成优势种群的情况下，菌株P2和P4涂干处理的防效必定远低于17.1％和23.5％这一数值。因此，菌株P2和P4并不适合在生防实践中使用。

发明内容

本发明提供了一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，该暹罗芽孢杆菌命名为暹罗芽孢杆菌菌株10015(简称10015)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2018年02月08日；保藏编号为：CGMCC No.15350。

本发明还提供了一种暹罗芽孢杆菌菌剂，该菌剂由暹罗芽孢杆菌株10015制备而成。具体的，该菌剂的10015活性菌数量≥10⁸CFU/mL。

本发明还提供了一种暹罗芽孢杆菌株10015、或一种由暹罗芽孢杆菌株10015制备的暹罗芽孢杆菌菌剂在防治欧美杨细菌性溃疡病中的应用。

优选的，暹罗芽孢杆菌菌剂的施用浓度为10015活性菌数量≥10⁸CFU/mL；施用方法为喷施或注射，施用前可先将病斑部位树皮和分泌物去除；施用时期为欧美杨细菌性溃疡病发病初期。

本发明的有益效果包括：

发明人从本实验室保藏的500余株土壤分离细菌样本中，通过对峙培养实验筛选出本发明的生防菌暹罗芽孢杆菌10015菌株。采用本发明的暹罗芽孢杆菌10015菌株制备的菌剂能够有效抑制欧美杨细菌性溃疡病菌，对欧美杨细菌性溃疡病具有较好的防治效果，通过田间防治试验发现，在欧美杨细菌性溃疡病发病早期施加本发明的菌剂能够得到较明显的防治效果，平均防效可达70％以上。适合在欧美杨细菌性溃疡病生防实践中推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中暹罗芽孢杆菌10015菌株在涂布欧美杨细菌性溃疡病菌悬液(浓度为10⁸CFU/mL)的培养皿中形成的抑菌圈图；

图2为本发明实施例3中接种试验第21天的树体病斑症状图，其中，图2A为阴性对照，图2B为先接种病原菌13731后施用生防菌剂10015，图2C为同时接种病原菌和生防菌剂10015，图2D为阳性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、土壤细菌的分离、纯化与鉴定

(1)细菌的分离

从各地采集林木的根基土壤，称取5.0g倒入装有95ml无菌水无菌三角瓶，盖上封口膜，置于摇床220rpm震荡培养15min，室温下静置10min，取上清液分别稀释10¹-10³倍，分别吸取100ul稀释液涂布于NA平板上，每个稀释梯度设3个重复，30℃倒置培养2天后计数及纯化培养。然后挑取单菌落在新的NA平板上划线纯化目标细菌，于-70℃冰箱保藏备用。从2006年至2016年共分离鉴定土壤来源的细菌500余株。

(2)生防功能菌株的筛选

通过平板对峙培养方法筛选生防功能菌株，首先取100ul欧美杨细菌性溃疡病菌悬液(10⁸CFU/mL)涂布于TSA平板上，然后将步骤(1)得到的细菌活化后接种于平板上(0.4cm)，每个平板接种3个点，每个细菌做3个平板(3个实验重复)。将培养皿置于30℃培养箱中倒置培养48h后观察和测量抑菌圈。通过该实验成功筛选出10余株对欧美杨细菌性溃疡病菌具有拮抗作用的菌株，再进一步通过高浓度(10⁹CFU/mL和10¹⁰CFU/mL)菌悬液的对峙培养实验，获得了本发明的功能菌株10015，该菌株来源于北京市海淀区香山山脉柏树林根际土壤。该菌株对峙试验中形成的抑菌圈明显，在欧美杨细菌性溃疡病菌悬液浓度为10⁸CFU/mL的三个培养皿中的9个抑菌圈直径为1.45-1.60cm(结果如图1和表1所示)。经过多次对峙实验证实，10015对欧美杨细菌性溃疡病菌具有较强的拮抗作用。

表1菌株10015形成的抑菌圈直径

(3)菌株10015的分子生物学鉴定

工作台中，从划线培养的细菌平板中挑取单菌落转接于TSB液体培养基中，220rpm摇床上30℃培养24h，取2mL过夜培养的菌悬液，10000rpm离心3min，弃上清；加200μL TEBuffer(10mmol/LTris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，涡旋振荡使细胞充分分散，加200μL提取Buffer(2％(m/v)CTAB，0.7mol/L NaCl，pH 7.5)，200μL 3mol/L NaCl，混匀；液氮和100℃环境反复冻融2次；加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，4℃6000rpm，离心10min，抽提2次；取上清，加1/10体积的NaAc(3mol/L pH 5.2)，加2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，4℃12000rpm离心15min；弃上清，风干沉淀，加100μL ddH₂O溶解沉淀，-20℃冻存备用。

16S rDNA扩增引物为细菌通用引物27F/1492R(5′-AGAGNTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR扩增产物直接送北京博迈德科技发展有限公司，经公司切胶纯化后测序。

PCR反应体系(25ul)：

2xPCR Master mix：12.5ul；Primer1(27F)：1ul；Primer2(1492R)：l ul；DNA：lul；ddH20：9.5ul。

PCR反应程序为：

利用网络鉴定工具对分离细菌进行种类鉴定(https：//www.ezbiocloud.net/)，将16S rRNA基因序列数据输入数据库进行细菌的鉴定，16S rRNA基因序列与模式菌种的同源性大于98.5％，即视为与该模式菌种同种。暹罗芽孢杆菌10015与BacillussiamensisKCTC 13613^T同源性为99.85％。

因此，本发明的菌株10015鉴定为Bacillus siamensis。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2018年02月08日；保藏编号为：CGMCC No.15350。

实施例2、10015生防菌剂的制备

(1)暹罗芽孢杆菌10015活化：在超净工作台中，用接种环沾取少量保藏的菌液，在TSB固体培养基的平板上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养24h；为恢复菌株的活力，挑取单菌落再连续转接培养3代。

(2)液体培养：在超净工作台中，用接种环从含TSB固体培养基的平板中挑取单菌落到10mL TSB液体培养基中进行液体培养，得到液体菌液。培养条件为：pH值7.2-7.5、30℃培养条件下，220rpm振荡培养16h。

(3)菌株的扩繁：在超净工作台中，将步骤(2)培养的液体菌液倒入250mlTSB液体培养基中进行扩繁液体培养，培养条件为：pH值7.2-7.5、30℃培养条件下，220rpm振荡培养24h。

(4)菌剂的制备：10000rpm离心5min沉淀培养的菌株，弃上清，将沉淀用无菌水稀释，测定液体菌液的吸光度(λ＝600nm)。当菌液的吸光值为1时，将其稀释10倍，得到菌剂，该菌剂中10015活性菌数量约为10⁸CFU/mL。

实施例3田间防治实验

(1)病原菌的准备

本实验室保藏有100余株欧美杨细菌性溃疡病菌菌株，通过试验筛选出了强致病菌12株。为确保生防效果实验的准确性，从中选取菌株13731用于田间防效试验，该菌株的致病力最强且稳定。

将病原菌13731转接到TSA培养皿中30℃培养24h，为恢复病原菌的致病力，挑取单菌落再连续转接培养3代。第4代培养物用无菌水稀释成浓度10⁸CFU/mL的菌悬液，用于接种实验。

(2)生防菌剂10015田间防效试验

本发明采用两种方法来测试菌剂10015的防效。

方法一：接种病原菌13731的同时，施用同剂量的菌剂10015。

方法二：先接种病原菌，一般接种病原菌3天后即可表现典型的发病症状，本发明在接种5天后，待病害发展到一定程度再施用生防菌株，以进一步确保实验的可靠性。

田间防效实验在濮阳市林科院苗圃开展，2018-2019开展连续两年的田间接种实验，选择107杨和46杨两个常见易感品系，每个品系随机选取9株健康杨树用于接种实验。具体接种方法如下：

用75％酒精对杨树树皮进行表面消毒，用无菌手术刀在树皮上划十字形成人造伤口作为接种点，伤口深至木质部表层；接种后覆上浸过无菌水的脱脂棉，并用保鲜膜包裹保湿；每棵树接种4个点。4个接种点从上而下分别为：

接种点1：接种无菌水(阴性对照)；

接种点2：先接种病原菌13731，5天后施用生防菌剂10015；

接种点3：同时接种病原菌13731和生防菌剂10015；

接种点4：接种病原菌13731(阳性对照)。

具体的，阴性对照是在人造伤口上接种50ul无菌水后覆盖浸水脱脂棉保湿，然后包裹保鲜膜；阳性对照是在人造伤口处接种50ul的10⁸CFU/mL的欧美杨细菌性溃疡病原菌13731后覆盖浸水脱脂棉保湿，然后包裹保鲜膜；先接种病原菌13731再施用生防菌剂10015是接种50ul的10⁸CFU/mL的欧美杨细菌性溃疡病原菌13731后覆盖浸水脱脂棉保湿，然后包裹保鲜膜，接种5天后再施用500ul的10⁸CFU/mL的生防菌剂10015(接种生防菌剂后不再做保湿处理)；同时接种病原菌13731和生防菌剂10015是接种50ul的10⁸CFU/mL的欧美杨细菌性溃疡病原菌13731后再接种50ul的10⁸CFU/mL的生防菌剂10015，然后覆盖上浸水脱脂棉保湿，再包裹保鲜膜。

根据前期接种实验的经验和病害发生的规律，我们设计的调查方法如下：接种3天后去掉保鲜膜，接种后第21天(先接种病原菌13731再施用生防菌剂10015的处理以接种病原菌日期为起始日期计算)观察病斑大小，并记录结果。调查时，记录发病与否，测量和记录发病植株病斑长度和宽度。

防效＝[(对照病斑面积-处理病斑面积-处理前病斑面积)/(对照病斑面积-处理前病斑面积)]×100％。

其中，处理前病斑面积是指接种病原菌5天时病斑面积，由于定量接种，各处理条件一致，107杨的病斑大小基本都为1*2cm，46杨的病斑大小1*2.5cm，因此，本实施例中处理前病斑面积107杨统一按照1*2cm，46杨统一按照1*2.5cm计算。而同时接种病原菌与菌剂10015的“处理前病斑面积”为0。

接种试验第21天时观察记录的病斑症状如图2所示。从图2中可以看出，施用菌剂10015的病斑流汁液较少，而且树皮腐烂程度较低。同时接种病原菌和生防菌剂10015的处理(图2C)比接种病原菌5天后再接种生防菌剂10015的处理(图2B)对病原菌的抑制效果更好。如表2-5所示，同时接种病原菌和施用10015制剂时，病斑比较小一般在1-2*2-3.5cm之间，而先接种病原菌，5天后再施用菌剂10015，病斑大小一般会达到1-3cm*5-9cm之间，而阳性对照病斑面积较大一般在3-4cm*11-20cm之间。田间防效试验结果显示，本发明的生防菌株10015在先接种病原菌5天后再防治的情况下，防治效果在66-80％之间，不同品种、不同年份的平均防效达71-73％。在接种病原菌的同时施用该生防制剂，防治效果在90-95％之间，不同品种、不同年份的平均防效高达91-93％。

结合本实施例中同时接种病原菌和生防菌剂10015的处理以及接种病原菌5天后再接种生防菌剂10015的处理的防治效果可以预期，在欧美杨细菌性溃疡病发病初期施用本发明的生防菌剂可以取得良好的防治效果。

Claims

1.一种暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌命名为暹罗芽孢杆菌菌株10015，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间为2018年02月08日；保藏编号为：CGMCCNo.15350。

2.一种暹罗芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂由权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌菌株10015制备而成。

3.根据权利要求2所述的暹罗芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂中10015活性菌数量≥10⁸CFU/mL。

4.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌或权利要求2-3任一项所述的菌剂在防治欧美杨细菌性溃疡病中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在防治欧美杨细菌性溃疡病时,施用浓度为10015活性菌数量≥10⁸CFU/mL的暹罗芽孢杆菌剂。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，施用方法为喷施或注射。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，施用前先将病斑部位树皮和分泌物去除。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，施用时期为欧美杨细菌性溃疡病发病初期。