CN110317732A - 一种艾草内生菌的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种艾草内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)在端午节前后采集健康野生蕲艾，分别取下新鲜成熟叶片、茎段和根，低温保鲜备用；(2)根据各组织材料特性，对新鲜成熟叶片、茎段和根分别进行表面灭菌处理得到备用材料；(3)将备用材料进行接种前处理，处理后接种到对应培养基上培养；(4)待培养平板上长出菌落时，进行划线分离纯化，即得到蕲艾内生菌；(5)蕲艾内生菌的保存。本发明提供的一种艾草内生菌的分离方法，以新鲜野生蕲艾为研究对象，充分利用蕲艾全草入药及各组织材料的特性，分别采用不同的消毒灭菌方法，尽可能全面地分离获得内生菌。

Description

一种艾草内生菌的分离方法

技术领域

本发明属于药用植物和农业微生物技术领域，涉及一种艾草内生菌的分离方法。

背景技术

艾草(Artemisia argyi)隶属于菊科艾属，作为功能性药用植物，艾草代谢多种化合物，主要物质挥发油多达100多种，艾灸就是根据挥发油特性应用而生的中医科学，其次艾草还产生黄酮类、鞣质类、三萜类、桉叶烷类、多糖类及微量元素等成分。2010年11月16日艾灸被列入了人类非物质文化遗产，被欧美等各国人民逐渐认可并广泛传播使用。明朝，《本草纲目》记载艾叶自成化以来，则以蕲州者为胜，用充方物，天下重之，谓之“蕲艾”。

“蕲艾”，湖北省蕲春县特产，目前蕲艾种植面积达5733公顷，中国国家地理标志产品。蕲艾植株高大，高150～250厘米，香气浓烈；叶厚纸质，被毛密而厚。现代药理学研究表明，蕲艾有温经、去湿、散寒、止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗过敏等作用。

内生菌(endophyte)是指生活在健康的植物组织或细胞内且不会引起宿主植物明显感染症状的一类微生物群。它是植物微生态系统的天然组成部分，虽然内生菌在宿主植物体中的生物量极其微少，但其可以通过自身的代谢产物或借助信号传导作用对宿主植物产生影响。对内生菌与药用植物的相互影响研究表明，内生菌不仅能促进药用植物的生长；还能够增强宿主植物对生物和非生物胁迫的耐受性，如降低水分消耗、增加宿主植物生物氧化、产生次生代谢物等来增加宿主植物抗干旱、抗盐碱、抗高温的适应性；以及作为药用植物生防菌有效对抗植物病虫害；此外，内生菌还能影响宿主植物次生代谢产物的形成或积累以及影响中药材的道地性；不仅如此，内生菌自身还能产生与宿主药用植物相同或相似的活性成分。因此，药用植物内生菌的研究对于保护野生与濒危药用植物、拓展药用资源、新药研发等均有一定意义。

作为全草入药且能产生丰富代谢化合物的“蕲艾”，对其内生菌的开发挖掘尚处于起步阶段。由王沫等人发明的专利“一株产bostrycin的蕲艾内生真菌HCH285”表明，从蕲艾中能分离出能产生重要代谢产物的内生菌。但是该专利只介绍了对“蕲艾”茎段内生真菌的分离方法，并没有详细阐述蕲艾不同组织内生菌的分离方法，且截止目前只分离出一株具有生物活性的内生真菌；此外，高云等人的发明专利CN108060084A公开了“一种艾草中拮抗菌株筛选及纯化的生产方法”，通过对干野生艾草叶的提取液并进行分离纯化，得到了三种具有抑菌效果的内生细菌。但是该方法是利用干野生艾草叶进行提取分离，一方面艾草叶风干处理导致的水分大量丢失会影响内生菌丰富度，最终导致可分离培养的内生菌种类减少；另外一方面，该专利只用艾草叶分离纯化内生菌，忽略了蕲艾全草入药及各组织材料的特性；不仅如此，以上两个专利都忽略了内生菌生活于宿主植物组织或细胞内，只有将植物组织或细胞充分裂解，才能最大限度的释放出内生菌，最终导致不能充分挖掘艾草内生菌资源。因此，亟需一种高效完善的、能够全面地分离和提取艾草各组织内生菌的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种能够最大限度地保留和提取艾草各组织内生菌方法，并提供了各组织内生菌的分离方法。

本发明提供的方法使用新鲜的蕲艾作为原材料，在处理过程中尽可能地保留艾草中的水分，以最大程度地保留内生菌的丰富度；除此以外，各组织采用不同的杀毒灭菌方法进行灭菌，可以最大限度的保留不同组织的内生菌；不仅如此，在对组织材料进行接种前处理时，按照最优的比例加入果胶酶和纤维素酶，可以更充分的破坏植物细胞的胞间层和细胞壁，从而尽可能多的释放出内生菌。综上所述，本发明提供的方法通过尽可能的保留和释放更多种类的内生菌，进而保证能够全面地分离和提取蕲艾内生菌。

本发明提供的技术方案如下：

一种艾草内生菌的分离方法，包括如下步骤：

(1)艾草的采收、清洗和保藏；

(2)叶片、茎段和根的消毒灭菌；

(3)叶片、茎段和根的接种前处理；

(4)各组织材料的接种；

(5)内生菌的分离纯化和保藏。

具体的，上述步骤(1)中所述的艾草为健康野生蕲艾；采收的时间为端午节前后一周，在晴天中午12至14时；采收的方式为将蕲艾整株挖起；上述步骤(1)中所述的清洗方式为将整株蕲艾用自来水冲洗20～30min，洗净表面尘土，然后自然风干；上述步骤(1)中所述的保藏方式为将洗净的蕲艾，取新鲜健康的成熟叶片，装在自封袋置0～4℃保鲜；取新鲜健康的茎段和根，裁成4～5cm茎段，装在自封袋置0～4℃保鲜。

具体的，上述叶片的消毒方法如下：取健康、无病害的艾叶10片约5g，用自来水冲洗干净后，剪成小片放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次；然后用75％乙醇浸泡消毒10～30s，无菌水浸泡冲洗5次，再用2％～5％的次氯酸钠溶液浸泡2～3min取出，无菌水浸泡冲洗5次。

具体的，上述茎段和根的消毒方法如下：取健康、无病害的蕲艾茎段和根各5g，分别用自来水冲洗干净后，剪成小段放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次；然后分别用75％乙醇浸泡消毒30s～60s，无菌水浸泡冲洗5次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡1～3min取出，无菌水浸泡2min，循环3次。

具体的，所述步骤(3)中所述的各组织材料的接种前处理方法如下：将消毒的叶片、茎段和根分别置于灭菌的研钵中，依次加入无菌生理盐水、灭菌石英砂、果胶酶和纤维素酶，在常温下充分研磨，取匀浆，并分别进行10～10³梯度稀释。

具体的，所述的蕲艾组织、无菌生理盐水、灭菌石英砂、果胶酶和纤维素酶的质量比为1000：200：200：0.6～0.8：1.0～1.5。

具体的，所述步骤(4)中所述的各组织材料的接种包括：取200μL步骤(2)最后一次消毒冲洗的无菌水接种，将其设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；分别取200μL叶、茎段和根组织匀浆的不同稀释梯度溶液涂布LB培养基以分离内生细菌和PDA培养基以分离内生真菌，每样品重复3～5次；其中分离细菌的平板分别放在23℃和37℃恒温培养箱培养1～2天，分离真菌的平板放在28℃恒温培养箱培养2～7天。更进一步的，所述分离真菌所用的PDA培养基加入了终浓度为30μg/mL的链霉素。

具体的，所述步骤(5)中所述的内生菌的分离纯化和保藏包括：待内生菌长出后，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养；平板划线培养时内生细菌用LB培养基，真菌用PDA培养基；最后，将经纯培养的单菌落活化后转接至终浓度20％的甘油管于-80℃保存。

本发明的有益效果：

(1)本发明以中国国家地理标志产品“蕲艾”作为试验材料，采收端午节前后一周，晴天中午12至14时的蕲艾，保证采集的蕲艾内生菌是处于种类和数量最多的时期，最终得到的内生菌种类与数量最多；

(2)针对不同组织分别采用不同的消毒灭菌方法，可以保证尽可能保留更多种类的内生菌；

(3)对组织样品进行接种前处理时，按照最优比例加入果胶酶和纤维素酶，更充分的破坏植物细胞的胞间层和细胞壁，可以保证尽可能释放更多种类的内生菌；

(4)提供了蕲艾各组织内生菌的分离和提取方法；

(5)本发明为深入探究内生菌对蕲艾的生长及其对生物和非生物胁迫的耐受性、次生代谢产物的形成或积累、道地性的影响以及具有生物活性的内生菌代谢产物的研究奠定了基础，对推动湖北省省级核心品牌“蕲艾”产业发展具有重要意义。

附图说明

图1为本发明采收的新鲜的“蕲艾”外观图；

图2为本发明分离纯化的“蕲艾”内生细菌图；

图3为本发明分离纯化的“蕲艾”内生真菌图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了便于说明，采用图X-Y的形式代表图X中第Y幅小图。

实施例1

一种艾草内生菌的分离方法，包括以下步骤：

(1)艾草的采收、清洗和保藏：端午节前后一周，在晴天中午12至14时整株挖起野生蕲艾。用自来水冲洗20～30min，洗净表面尘土，自然风干后，取新鲜健康的蕲艾成熟叶片，装在自封袋后置0～4℃保鲜备用。图1示出了新鲜的“蕲艾”。

(2)叶片的消毒灭菌：取健康、无病害的艾叶10片约5g，用自来水冲洗干净后，剪成约1cm*2cm大小放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次。然后用75％乙醇浸泡消毒30s，无菌水浸泡冲洗5次，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡2.5min取出，无菌水浸泡冲洗5次。

(3)叶片接种前处理：将5g消毒灭菌的叶片置于灭菌的研钵中，依次加入1mL无菌生理盐水、1g灭菌石英砂、0.003g果胶酶、0.005g纤维素酶，在常温下充分研磨，取匀浆，并分别进行10～10³梯度稀释。

(4)叶片匀浆的接种：取步骤(2)中最后一次消毒冲洗的无菌水200μL接种，将其设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；取200μL叶片匀浆的梯度稀释液涂布LB培养基(分离内生细菌)和含终浓度30μg/mL链霉素的PDA培养基(分离内生真菌)，每样品重复3～5次；其中分离细菌的平板分别放在23℃和37℃恒温培养箱培养1～2天，分离真菌的平板放在28℃恒温培养箱培养2～7天。

(5)内生菌的分离纯化和保藏：待内生菌长出后，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养；平板划线培养时内生细菌用LB培养基，真菌用含终浓度30μg/mL链霉素的PDA培养基；最后，将经纯培养的单菌落活化后转接至终浓度20％的甘油管于-80℃保存。

图2-1～2-7示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生细菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功分离到了五种产色素(图2-1～2-4和图2-6)和两种不产色素(图2-5和图2-7)且菌落形态各异的内生细菌。

图3-1～3-3示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生真菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功分离到了一种产色素(图3-2)和两种不产色素(图3-1和图3-3)且菌落形态各异的内生真菌。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)中叶片消毒处理方法不同。

具体如下：

叶片的消毒灭菌：取健康、无病害的艾叶10片约5g，用自来水冲洗干净后，剪成1cm*2cm放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次。然后用75％乙醇浸泡消毒10s，无菌水浸泡冲洗5次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡3min取出，无菌水浸泡冲洗5次。

图2-8～2-12示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生细菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了四种产色素(图2-8和图2-10～2-12)和一种不产色素(图2-9)且菌落形态各异的内生细菌。

图3-4～3-5示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生真菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了一种产色素(图3-5)和一种不产色素(图3-4)且菌落形态有着显著差异的内生真菌。

实施例3

本实施例与实施例1和2的区别在于：分离内生菌的组织材料和添加的果胶酶及纤维素酶比例不同。

具体如下：

(1)艾草的采收、清洗和保藏：端午节前后一周，在晴天中午12至14时整株挖起野生蕲艾。用自来水冲洗20～30min，洗净表面尘土，自然风干后，取新鲜健康的老茎和根，裁成4～5cm茎段，装在自封袋后置0～4℃保鲜备用。

(2)茎段和根的消毒灭菌：取健康、无病害的蕲艾茎段和根各5g，分别用自来水冲洗干净后，剪成1cm*2cm放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次。然后分别用75％乙醇浸泡消毒30s，无菌水浸泡冲洗5次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡1.5min取出，无菌水浸泡2min，循环3次。

(3)茎段和根的接种前处理：将5g消毒灭菌的茎段和根分别置于灭菌的研钵中，依次加入1mL无菌生理盐水、1g灭菌的石英砂、0.004g果胶酶、0.0065g纤维素酶，在常温下充分研磨，取匀浆，并分别进行10～10³梯度稀释。

(4)各组织匀浆的接种：取步骤(2)中最后一次消毒冲洗无菌水200μL接种，将其设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；取200μL茎段和根匀浆的梯度稀释液涂布LB培养基(分离内生细菌)和含终浓度30μg/mL链霉素的PDA培养基(分离内生真菌)，每样品重复3～5次；其中分离细菌的平板分别放在23℃和37℃恒温培养箱培养1～2天，分离真菌的平板放在28℃恒温培养箱培养2～7天。

(5)内生菌的分离纯化和保藏：待内生菌长出后，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养；平板划线培养时内生细菌用LB培养基，真菌用含终浓度30μg/mL链霉素的PDA培养基；最后，将经纯培养的单菌落活化后转接至终浓度20％的甘油管于-80℃保存。

图2-13～2-15示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生细菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了三种产不同颜色色素且菌落形态不同的内生细菌。

图3-6～3-9示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生真菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了两种产不同颜色色素(图3-6和图3-9)、两种不产色素(图3-7和图3-8)且菌落形态显著不同的内生真菌。

实施例4

本实施例与实施例3的区别在于：步骤(2)中茎段和根消毒处理方法不同。

具体如下：

茎段和根的消毒灭菌：取健康、无病害的蕲艾茎段和根各5g，分别用自来水冲洗干净后，剪成1-2cm小段放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次。然后分别用75％乙醇浸泡消毒60s，无菌水浸泡冲洗5次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡2.5min取出，无菌水浸泡2min，循环3次。

图2-16～2-18示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生细菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了三种产不同颜色色素的内生细菌。

图3-10～3-11示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生真菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了两种产不同颜色色素且菌落形态不同的内生真菌。

实施例5

本实施例与实施例3的区别在于：添加的果胶酶及纤维素酶比例不同。

具体如下：

茎段和根的接种前处理：将5g消毒灭菌的茎段和根分别置于灭菌的研钵中，依次加入1mL无菌生理盐水、1g灭菌的石英砂、0.005g果胶酶、0.0075g纤维素酶，在常温下充分研磨，取匀浆，并分别进行10～10³梯度稀释。

图2-19～2-20示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生细菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了两种产不同色素的内生细菌。

图3-12～3-13示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生真菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了两种产不同色素且形态差异显著的内生真菌。

实施例6

本实施例与实施例3的区别在于：步骤(2)中根消毒处理方法不同。

具体如下：

茎段的消毒灭菌：取健康、无病害的蕲艾根5g，用自来水冲洗干净后，剪成1-2cm小段放入灭菌平皿中，用无菌水洗涤3次。然后用75％乙醇对浸泡消毒45s，无菌水浸泡冲洗3次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡3min取出，无菌水浸泡2min，循环3次。

图2-21示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生细菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了一种产色素的内生细菌。

图3-14～3-15示出了本实施例分离提纯的“蕲艾”内生真菌图。从图中可以看出利用上述方法，我们成功额外分离到了一种产色素(图3-14)、一种不产色素(图3-15)且形态差异显著的两种内生真菌。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于依次包括如下步骤：

(1)艾草的采收、清洗和保藏；

(2)叶片、茎段和根的消毒灭菌；

(3)叶片、茎段和根的接种前处理；

(4)各组织材料的接种；

(5)内生菌的分离纯化和保藏。

2.根据权利要求1所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于：步骤(1)中所述的艾草为健康野生蕲艾；采收的时间为端午节前后一周，在晴天中午12至14时；采收的方式为将蕲艾整株挖起；清洗方式为将整株蕲艾用自来水冲洗20～30min，洗净表面尘土，然后自然风干；保藏方式为将蕲艾洗净后，取新鲜健康的成熟叶片，装在自封袋置0～4℃保鲜；取新鲜健康的茎段和根，裁成4～5cm茎段，装在自封袋置0～4℃保鲜。

3.根据权利要求1所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于，所述叶片的消毒方法为：取健康、无病害的艾叶10片约5g，用自来水冲洗干净后，剪成小片放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次；然后用75％乙醇浸泡消毒10～30s，无菌水浸泡冲洗5次，再用2％～5％的次氯酸钠溶液浸泡2～3min取出，无菌水浸泡冲洗5次。

4.根据权利要求1所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于，所述茎段和根的消毒方法为：取健康、无病害的蕲艾茎段和根各5g，分别用自来水冲洗干净后，剪成小段放入灭菌平皿中，再用无菌水洗涤3次；然后分别用75％乙醇浸泡消毒30s～60s，无菌水浸泡冲洗5次，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡1～3min取出，无菌水浸泡2min，循环3次。

5.根据权利要求1所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的各组织材料的接种前处理方法为：将消毒的叶片、茎段和根分别置于灭菌的研钵中，依次加入无菌生理盐水、灭菌石英砂、果胶酶和纤维素酶，在常温下充分研磨，取匀浆，并分别进行10～10³梯度稀释。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蕲艾组织、无菌生理盐水、灭菌石英砂、果胶酶和纤维素酶的质量比为1000：200：200：0.6～1.0：1.0～1.5。

7.根据权利要求1所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的各组织材料的接种方法如下：取200μL步骤(2)最后一次消毒冲洗的无菌水接种，将其设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；分别取200μL叶、茎段和根组织匀浆的不同稀释梯度溶液涂布LB培养基以分离内生细菌和PDA培养基以分离内生真菌，每样品重复3～5次；其中分离细菌的平板分别置于23℃和37℃恒温培养箱培养1～2天，分离真菌的平板置于28℃恒温培养箱培养2～7天。

8.根据权利要求7所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于：所述的分离真菌所用的PDA培养基加入了终浓度为30μg/mL的链霉素。

9.根据权利要求1所述的一种艾草内生菌的分离方法，其特征在于，步骤(5)中所述的内生菌的分离纯化和保藏包括：待内生菌长出后，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养；平板划线培养时内生细菌用LB培养基，真菌用PDA培养基；最后，将经纯培养的单菌落活化后转接至终浓度20％的甘油管于-80℃保存。