CN114747595A - 洋葱伯克霍尔德氏菌jt79在防治南方根结线虫中的应用 - Google Patents
洋葱伯克霍尔德氏菌jt79在防治南方根结线虫中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在防治南方根结线虫中的应用，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC，NO：60798。本发明采用JT79菌株对离体的根结线虫处理后，具有明显的致死性；采用JT79菌液及其10倍稀释液对南方根结线虫处理3h就能达到80％以上的致死率，处理6h后南方根结线虫的死亡率达90％以上，表明JT79菌株对南方根结线虫具有高效的触杀作用；同时，该菌株能有效防止南方根结线虫的对作物的危害。本发明为提高根结线虫的防治效果和杀虫活性提供了方法和思路，筛选出了具有更好防治效果和杀虫活性的优良菌种资源，以供生产选择。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物防治技术领域。更具体地，涉及洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在防治南方根结线虫中的应用。
背景技术
为提高农作物品质和提高产量，农药和肥料是人们在种植过程中必不可少的一部分。但长期施用化学肥料导致土壤硬化、土壤重金属污染和水体富营养化等土壤生态问题越来越严重。同时大量的化学农药被用于防控各种病害，导致植物病原菌的抗性越来越强，而且也导致农药残留等严峻问题。为解决这一生态安全问题，微生物肥料因为具有合理利用土壤元素资源，提高施肥效率，提高耕地质量等优势受到人们关注，高效低毒，绿色环保的微生物农药的研发也成为了时代的趋势。2015年1月7日，我国农业部公布了“一控两减三基本”的整体规划，并计划到2020年，肥料利用率提高到40％以上，化学农药使用量实现零增长。现今严峻的生态环境问题和国际生物农药技术和市场前景发展趋势需要我们正确的认识到现今生物药剂的属性，高效、低毒、环境友好。在提高作物产量和品质的前提下维护土壤健康，保证作物健康和食品安全，坚持绿色可持续发展原则。
根结线虫于1855年在英国自黄瓜中发现，是一种具有高度专化特性的植物寄生线虫，也是危害最严重的一类植物寄生线虫。此线虫在土壤中寄生侵染寄主而致病，广泛分布于世界各地，寄主范围广，主要侵害葫芦科和十字花科植物。据统计，全球每年各类灾害所造成的所有损失中，根结线虫的危害占总值的5％，高达500亿美元。全世界已经报道的根结线虫种类有上百种，而在我国已经发现了近30种，其中造成危害最严重的是南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫。南方根结线虫可危害茶树、洋葱、甜菜、西瓜、豆科、茄、马铃薯、葡萄、姜等几百种作物，每年都造成巨大的经济损失。
洋葱伯克霍尔德氏菌作为一种较新型的优良生防菌类，可以分泌多种防病促生的物质，对防治多种病害，以及促进多种植物的生长都有明显的效果。而洋葱伯克氏菌群是一组基因型不同、表型相近的复合物(Burtholderia cepacia complex，Bcc)，其中许多菌株是常见的生防菌，不但用于植物病害防治和促进农作物生长，而且也被用于环境保护、生物修复、降解土壤中的有毒物质等。国内已有专利报道洋葱伯克霍尔德氏菌在植物促生和生物防治上具有巨大的开发潜力。例如中国专利CN112625970B公开了一株洋葱伯克霍尔德氏菌，该菌可以稳定定殖在土壤中，可以防治棉花黄萎病菌、菜心炭疽病菌等十余种病害；但是，洋葱伯克霍尔德氏菌对根结线虫的防治还鲜有报道，现有研究也仅表明越南伯克霍尔德氏菌B418对番茄南方根结线虫病的防效为63.42％(王贻莲,陈凯,李哲,吴远征,郭凯,李纪顺,杨合同.越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的分离鉴定[J].植物保护,2014,40(04):65-69.)，该菌株对南方根结线虫的防治效率不高；为了提高对根结线虫的防治效果和杀虫活性，有必要需筛选出更多具有更好防治效果和杀虫活性的优良菌种资源，以供生产选择。因此，研究洋葱伯克霍尔德氏菌对南方根结线虫的杀线虫活性，对茶树线虫病和瓜类根结线虫的防治具有重大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在防治南方根结线虫中的应用。
本发明第一个的目的是提供洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的应用。
本发明第二个的目的是提供一种防治南方根结线虫的方法。
本发明第三个的目的是提供所述防治南方根结线虫的方法的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的新应用，涉及农业微生物技术领域，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC，NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号，NCBI登录号为MK928421。本发明采用JT79菌液及其10倍稀释液对南方根结线虫处理3h就能达到80％以上的致死率，处理6h后南方根结线虫的死亡率达90％以上，表明JT79菌株对南方根结线虫具有高效的触杀作用；同时，该菌株能有效防止南方根结线虫的对作物的危害。
因此，本发明提供洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79和/或其菌液、发酵液在防治南方根结线虫、在制备防治南方根结线虫的杀线虫剂、在防治茶树南方根结线虫病和/或黄瓜根结线虫病中的应用。
进一步地，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。
本发明提供的洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液的制备方法为：将菌株活化后取单菌落接种在LB培养基中，在30℃培养48h，获得种子液，然后将种子液和液体培养基混合，培养48h，即得。
优选地，所述LB培养基的配方为：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，无菌水定容至1L。
优选地，所述液体培养基为LB培养基或NB培养基。
更有选地，所述LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，无菌水定容至1L；所述NB培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、无菌水定容至1L。
优选地，所述种子液和液体培养基的体积比为1：10。
本发明提供一种防治南方根结线虫的方法，采用洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液对感病植株或对南方根结线虫进行处理。
优选地，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液的浓度不低于2×107cfu/mL。
优选地，采用洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液进行稀释1～10倍进行处理。
本发明提供上述方法在防治南方根结线虫引起的植物病害方面的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在防治南方根结线虫中的应用，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC，NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。本发明采用JT79菌株对离体的根结线虫处理后，具有明显的致死性；采用JT79菌液及其10倍稀释液对南方根结线虫处理3h就能达到80％以上的致死率，处理6h后南方根结线虫的死亡率达90％以上，表明JT79菌株对南方根结线虫具有高效的触杀作用；同时，该菌株能有效防止南方根结线虫的对作物的危害。本发明对提高根结线虫的防治效果和杀虫活性提了方法和思路，筛选出了具有更好防治效果和杀虫活性的优良菌种资源，以供生产选择，对茶树线虫病和瓜类根结线虫的防治具有重大的意义。
附图说明
图1为JT79发酵液对线虫具有致死效果图(A为对照组清水处理后的线虫形态图，B为伯克霍尔德氏菌JT79发酵液处理后线虫的形态图)；
图2为JT79发酵液对黄瓜南方根结线虫防治效果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明供试线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita Kofoid etWhiteChitwood)来源于茶树根系的筛选。
实施例1洋葱伯克霍尔德菌JT79发酵液的制备
本实施例采用的洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)为JT79菌株，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。
将-80℃下保存的菌株活化，挑取活化后的菌落在LB液体培养基(酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.2)，在121℃下灭菌15min，30℃培养48h，获得种子液。
按照含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液和液体培养基体积比为1:10将含有洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的种子液加入NB液体培养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加无菌水定容至1L)中，在30℃、180r/min下培养48h，得到洋葱伯克霍尔德氏菌JT79发酵液。其中，洋葱伯克霍尔德氏菌JT79的发酵液浓度为2×108cfu/mL。
实施例2洋葱伯克霍尔德菌JT79杀线虫体外筛选试验
1、根结线虫二龄幼虫的获得
冲洗茶树根系，用镊子挑取线虫卵块，采用0.5％的NaClO进行表面消毒后，置于90mm培养皿中，加入无菌水，室温孵化48h后，收集孵化出来的J2s的南方根结线虫。在显微镜下观察并计数浓度，调节至100条/50μL。
2、体外筛选试验
向24孔细胞培养板中加入450μL处理液和50μL南方根结线虫悬浮液(100条线虫)，用锡箔纸包裹后，放入28℃培养箱中静置。分别在3h、6h和24h时，在体视显微镜下观察并记录J2s的死亡情况，并计算死亡率。判断标准：在24h时，向各处理中滴加1mol/L NaOH溶液后，仍保持僵直不动或卷曲状态的为死虫，弯曲蠕动的为活虫。本实验共设置5个处理，以无菌水与培养基10倍稀释液作为阴性对照，1.8％阿维菌素乳油1500倍稀释液作为阳性对照。每个处理重复5次。采用实施例1中制备得到的JT79菌株发酵液。
3、结果分析
结果如图1所示，采用JT79菌株发酵液对线虫进行处理后，线虫具有明显的致死性；具体的数据详见表1，在采用JT79发酵液及其10倍稀释液对南方根结线虫进行处理后24h后，南方根结线虫的死亡率达90％以上，表明菌株发酵液及其10倍稀释液均具有良好的根结线虫致死活性。
表1 JT79杀根结线虫的校正死亡率
实施例3洋葱伯克霍尔德菌防治南方根结线虫的盆栽试验
南方根结线虫可侵染黄瓜引起严重病害，本实施例盆栽实验以黄瓜作为模式作物来研究。本实施例采用葱伯克霍尔德菌JT79的发酵液由实施例1制得，采用的南方根结线虫为实施例2中在茶树根系筛选得到的，在黄瓜长到2叶1心期时，每株浇灌15mL处理液，设置三组实验。实验组一采用葱伯克霍尔德菌JT79的发酵液进行处理，实验组二以水处理为空白对照，实验组三采用阿维菌素乳油1500倍稀释液为阳性对照。每个处理10株，重复3次。24h后，在根系附近打1个2cm深的孔，加入南方根结线虫悬浮液，每株接种300条。在浇灌药剂2周后，测量各处理组的茎粗和展开度，评价各处理的促生效果。30天后观察并记录根结数，计算根结减退率，评价供试处理对根结线虫的防治效果。
根结减退率的计算公式：
统计结果如下表2所示，JT79发酵液可以有效防止南方根结线虫病害的发生，根结减退率为34.76％，其效果与阿维菌素1500倍稀释液的效果相当(差异不显著)。在接种了线虫后，JT79菌株发酵液可以缓解线虫对植物的危害，从而促进黄瓜生长；黄瓜的茎粗和张开度显著高于清水对照组和阿维菌素1500倍稀释液处理。从图2还可以看出，用JT79处理可以显著促进作物的根部发育，作物的根数显著多于清水对照组和阿维菌素1500倍稀释液处理。因此，JT79发酵液可以用于防治南方根结线虫。
表2 JT79发酵液对南方根结线虫病的防治效果
注：同列具相同字母者差异不显著(P<0.05)
综上可知，本发明提供了洋葱伯克霍尔德氏菌JT79在防治南方根结线虫中的应用，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC，NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100 5号。本发明采用JT79菌株对离体的根结线虫处理后，具有明显的致死性；采用JT79菌液及其10倍稀释液对南方根结线虫处理3h就能达到80％以上的致死率，处理6h后南方根结线虫的死亡率达90％以上，表明JT79菌株对南方根结线虫具有高效的触杀作用；同时，该菌株能有效防止南方根结线虫的对作物的危害。由此可知，洋葱伯克霍尔德氏菌JT79菌株是一种多功能高效生防菌，在防治南方根结线虫引起的植物病害方面有广阔的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)JT79和/或其菌液、发酵液在防治南方根结线虫中的应用。
2.洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液在制备防治南方根结线虫的杀线虫剂中的应用。
3.洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液在防治茶树南方根结线虫病中的应用。
4.洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液在防治黄瓜根结线虫病中的应用。
5.根据权利要求1～4任一所述应用，其特征在于，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。
6.一种防治南方根结线虫的方法，其特征在于，采用洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液对感病植株或对南方根结线虫进行处理。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60798，保藏地址为广州市先烈中路100号。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液的浓度不低于2×107cfu/mL。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，采用洋葱伯克霍尔德氏菌JT79和/或其菌液、发酵液稀释1～10倍后进行处理。
10.根据权利要求6～9任一所述方法在防治南方根结线虫引起的植物病害中的应用。
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