CN1191367C - 生物发酵提纯苦马豆素工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物发酵提纯苦马豆素工艺，利用自行分离鉴定的豆类丝核菌7-3菌株，通过生物发酵工程培养出含苦马豆素较高的豆类丝核菌菌丝体，采用醇类溶剂提取法、阳离子交换法、硅胶柱层析及分段升华技术获得苦马豆素纯品。该工艺制备的苦马豆素呈白色针状结晶，分子量为173，熔点144～145℃，纯度≥99%。实验结果表明，UV、IR、GC、MS、NMR光谱数据与苦马豆素标准光谱数据完全吻合。本发明有利于工厂化批量生产，使生产成本大幅度降低，提取率及产品纯度均高于其他方法。
Description
一、技术领域
本发明属于生物工程研究领域，具体涉及生物发酵，生物制药，天然产物提取、分离和鉴定方法，特别涉及一种生物发酵提纯苦马豆素工艺。
二、背景技术
关于苦马豆素的来源有三种途径：①从植物中提取分离，目前已经知道含苦马豆素的植物主要是豆科黄芪属和棘豆属植物(疯草)，这类植物广泛分布于世界各地，尤其是北美和我国，资源十分丰富；其次是豆科苦马豆属植物，该属植物仅局限于澳大利亚。②从豆类丝核菌(Rhizoctonia leguminicola)中提取分离。Schneider等(1983)首次从豆类丝核菌中分离出苦马豆素。③人工合成苦马豆素。鉴于苦马豆素及其相关化合物在生物化学、免疫学、医学和毒理学等方面的众多用途，美国的化学家Yasuda(1984)、Bennett(1989)和我国科学院院士周维善先后对苦马豆素人工合成进行了研究。由于苦马豆素有4个手性碳原子，即使很好地控制反应，但是合成的产物中还有16个化学结构相同，而立体构象不同的异构体，要使之分离却十分困难，整个合成过程有21步，产率仅为6.6％。
国内在苦马豆素提纯方面的研究起步较晚。从80年代中期相继发现甘肃棘豆、小花棘豆、茎直黄芪、宽苞棘豆、变异黄芪等疯草类植物也含有苦马豆素。
国外分离提纯苦马豆素的主要来源有2种途径①从疯草中提纯；②从豆类丝核菌(Rhizoctonia leguminicola)中提纯。分离技术工艺是先将植物样品或菌丝体在有机溶剂中浸提，再经过阳离子交换柱和琼脂糖凝胶柱，最后重结晶获得苦马豆素纯品。国内提纯苦马豆素主要来源于疯草类植物，由于植物中苦马豆素含量很低，使得在提纯的主要技术研究方面尚属空缺，若人工合成，则成本很高。
三、发明内容
针对上述现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种采用生物发酵提纯苦马豆素工艺。
为了实现上述目的，本发明的生物发酵提纯苦马豆素工艺通过豆类丝核菌7-3生物发酵，使提取所用的原材料中苦马豆素得以富集，在采用阳离子交换柱层析、硅胶柱层析，分段升华等技术获得苦马豆素。利用生物发酵系统从已筛选确定的豆类丝核菌中提纯苦马豆素，使苦马豆素原材料来源更为便利，有利于工厂化批量生产，使生产成本大幅度降低。最终为促进苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂等方面的产业化提供物质保障。
本发明的生物发酵提纯苦马豆素工艺，具体工艺如下：
1)豆类丝核菌7-3保存：自行分离的豆类丝核菌7-3 PDA培养基接种，4℃冰箱保存，每20天～30天传代一次；
2)豆类丝核菌7-3接种、培养与菌丝体收集：在无菌状态下，将7-3菌种接种于生物发酵用Czapek’s培养基，25℃～27℃通气培养2周，收集菌丝体，干燥，备用；
3)豆类丝核菌中苦马豆素的提纯：按下列工艺进行：
第一步，将豆类丝核菌菌丝体100g～1000g置入80～95％乙醇溶液1000～5000mL，提取乙醇提取液并分离残留物；
第二步，将H2O和CH2CL2混合成100mL～1000mL萃取液，并回收CH2CL2，将水提取液调pH10.0再用萃取液萃取，分离CH2CL2层，即得总生物碱5g～50g；
第三步，将总生物碱5g～50g上阳离子交换柱层析，经洗脱并收集洗脱液，挥发至干；
第四步，然后再经硅胶柱层析；
第五步，将得到的总生物碱进行减压梯度升华，最后得到苦马豆素纯品1.5mg～15mg。
本发明的另外的特点是，所述PDA培养基的配方组成为：去皮马铃薯200g～2000g，琼脂15g～150g，葡萄糖20g～200g，水1000ml～10000ml；
所述Czapek’s培养基的配方组成为：蔗糖30g～300g，硝酸钠3g～30g，磷酸氢二钾1.3g～13g，硫酸镁0.5g～5g，氯化钾0.5g～5g，硫酸亚铁0.01g～0.1g，酵母浸膏3g～30g，水1000ml～10000ml。
四、附图说明
图1是本发明的具体工艺路线流程图；
图2是本发明的提纯工艺图。
五、具体实施方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
图1是本发明的具体工艺路线流程图，图2是本发明的提纯工艺图，按本发明的流程和工艺图，发明人给出了如下一些实施例，但不限于这些实施例。
实施例1：按照本发明的技术方案，提纯苦马豆素工艺按以下步骤进行：
1)豆类丝核菌7-3保存：自行分离的豆类丝核菌7-3 PDA培养基接种，4℃冰箱保存，每20天传代一次；
PDA培养基的配方组成为：去皮马铃薯200g，琼脂15g，葡萄糖20g，水1000ml；
2)豆类丝核菌7-3接种、培养与菌丝体收集：在无菌状态下，将7-3菌种接种于生物发酵用Czapek’s培养基，25℃通气培养2周，收集菌丝体，干燥，备用；
Czapek’s培养基的配方组成为：蔗糖30g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1.3g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，酵母浸膏3g，水1000ml。
3)豆类丝核菌中苦马豆素的提纯：按下列工艺进行：
第一步，将豆类丝核菌菌丝体100g置入95％乙醇溶液1000mL，提取乙醇提取液并分离残留物；
第二步，将H2O和CH2CL2混合成100mL萃取液，并回收CH2CL2，将水提取液调pH10.0再用萃取液萃取，分离CH2CL2层，即得总生物碱5g；
第三步，将总生物碱5g上阳离子交换柱层析，经洗脱并收集洗脱液，挥发至干；
第四步，然后再经硅胶柱层析；
第五步，将得到的总生物碱进行减压梯度升华，最后得到苦马豆素纯品1.5mg。
实施例2：按照本发明的技术方案，提纯苦马豆素工艺按以下步骤进行：
1)豆类丝核菌7-3保存：自行分离的豆类丝核菌7-3 PDA培养基接种，4℃冰箱保存，每25天传代一次；
PDA培养基的配方组成为：去皮马铃薯1000g，琼脂75g，葡萄糖100g，水5000ml；
2)豆类丝核菌7-3接种、培养与菌丝体收集：在无菌状态下，将7-3菌种接种于生物发酵用Czapek’s培养基，27℃通气培养2周，收集菌丝体，干燥，备用；
Czapek’s培养基的配方组成为：蔗糖150g，硝酸钠15g，磷酸氢二钾6.5g，硫酸镁2.5g，氯化钾2.5g，硫酸亚铁0.05g，酵母浸膏15g，水5000ml。
3)豆类丝核菌中苦马豆素的提纯：按下列工艺进行：
第一步，将豆类丝核菌菌丝体500g置入90％乙醇溶液2000mL，提取乙醇提取液并分离残留物；
第二步，将H2O和CH2CL2混合成500mL萃取液，并回收CH2CL2，将水提取液调pH10.0再用萃取液萃取，分离CH2CL2层，即得总生物碱25g；
第三步，将总生物碱25g上阳离子交换柱层析，经洗脱并收集洗脱液，挥发至干；
第四步，然后再经硅胶柱层析；
第五步，将得到的总生物碱进行减压梯度升华，最后得到苦马豆素纯品7.5mg。
实施例3：按照本发明的技术方案，提纯苦马豆素工艺按以下步骤进行：
1)豆类丝核菌7-3保存：自行分离的豆类丝核菌7-3 PDA培养基接种，4℃冰箱保存，每20天～30天传代一次；
PDA培养基的配方组成为：去皮马铃薯2000g，琼脂150g，葡萄糖200g，水10000ml；
2)豆类丝核菌7-3接种、培养与菌丝体收集：在无菌状态下，将7-3菌种接种于生物发酵用Czapek’s培养基，26℃通气培养2周，收集菌丝体，干燥，备用；
Czapek’s培养基的配方组成为：蔗糖300g，硝酸钠30g，磷酸氢二钾13g，硫酸镁5g，氯化钾5g，硫酸亚铁0.1g，酵母浸膏30g，水10000ml。
3)豆类丝核菌中苦马豆素的提纯：按下列工艺进行：
第一步，将豆类丝核菌菌丝体1000g置入80％乙醇溶液5000mL，提取乙醇提取液并分离残留物；
第二步，将H2O和CH2CL2混合成1000mL萃取液，并回收CH2CL2，将水提取液调pH10.0再用萃取液萃取，分离CH2CL2层，即得总生物碱50g；
第三步，将总生物碱50g上阳离子交换柱层析，经洗脱并收集洗脱液，挥发至干；
第四步，然后再经硅胶柱层析；
第五步，将得到的总生物碱进行减压梯度升华，最后得到苦马豆素纯品15mg。
本发明所产生的技术效果是：
(1)苦马豆素提取率：0.7％。
(2)苦马豆素技术指标：苦马豆素白色针状结晶，分子量为173，熔点144～145℃，纯度≥99％。UV、IR、GC、MS、NMR光谱数据与苦马豆素标准光谱数据完全吻合。
(3)苦马豆素市场售价：从147美元/毫克降到100元/毫克。
Claims (2)
1.一种生物发酵提纯苦马豆素工艺，其特征在于，通过豆类丝核菌7-3生物发酵，使提取所用的原材料中苦马豆素得以富集，再采用阳离子交换柱层析、硅胶柱层析，分段升华获得苦马豆素。
2.根据权利要求1所述的生物发酵提纯苦马豆素工艺，其特征在于，具体工艺如下：
1)豆类丝核菌7-3保存：自行分离的豆类丝核菌7-3 PDA培养基接种，4℃冰箱保存，每20天～30天传代一次；
PDA培养基的配方组成为：去皮马铃薯200g～2000g，琼脂15g～150g，葡萄糖20g～200g，水1000ml～10000ml；
2)豆类丝核菌7-3接种、培养与菌丝体收集：在无菌状态下，将7-3菌种接种于生物发酵用Czapek’s培养基，25℃～27℃通气培养2周，收集菌丝体，干燥，备用；
Czapek’s培养基的配方组成为：蔗糖30g～300g，硝酸钠3g～30g，磷酸氢二钾1.3g～13g，硫酸镁0.5g～5g，氯化钾0.5g～5g，硫酸亚铁0.01g～0.1g，酵母浸膏3g～30g，水1000ml～10000ml；
3)豆类丝核菌中苦马豆素的提纯，按下列工艺进行：
第一步，将豆类丝核菌菌丝体100g～1000g置入80％～95％乙醇溶液1000mL～5000mL，提取乙醇提取液并分离残留物；
第二步，将H2O和CH2CL2混合成萃取液100mL～1000mL，并回收CH2CL2，将水提取液调pH10.0再用萃取液萃取，分离CH2CL2层，即得总生物碱5g～50g；
第三步，将总生物碱5g～50g上阳离子交换柱层析，经洗脱并收集洗脱液，并挥发至干；
第四步，然后再经硅胶柱层析；
第五步，将得到的总生物碱进行减压梯度升华，最后得到苦马豆素纯品1.5mg～15mg。
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