JPS584552B2 - インダノン及びインダノンヘミアセタ−ルの微生物による製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 微生物によるステロイド類の転化は広く研究され、記録
されている。

明らかに、最初のこのような研究は、１９３７年のマモ
リ（ Ｍａｍｏｌ ｉ ）とヴエルセローネ（ Ｖｅｒ
ｃｅｌｌｏｎｅ ）、Ｂｅｒ．７０巻４７０頁及びＢｅ
ｒ．７０巻２０７９頁によるものである。

彼らは酵母発酵による１７−ケトステロイド類から１７
β−ヒドロキシステロイド類への還元を明らかにした。

より最近では、ピーターソン（ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ）
及びマレー（ Ｍｕｒｒａｙ ）が、カビのリゾプス・
ニグリカンス（ Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｉｃａｎｓ
）によるプロケステロンの１１α−ヒドロキシル化を
明らかにした。

合衆国特許第２６０２７６９号（１９５２年）を参照。

また最近では、クレーキー（Ｋｒａｙｃｈｙ）らが合衆
国特許第３６８４６５７号（１９７２年）で、アンドロ
ス｝−４−エンー３・１７−ジオン、アンドロス｝−１
・４−ジエンー３・１７−ジオン、及び２０α−ヒドロ
キシメチループレグナ−１・４−ジエンー３−！オンを
製造するため１７−アルキル側鎖中に少なくとも８個の
炭素を含有するステロイド類をミコ・バクテリウム・ス
ペシーズ（ Ｍｙｃｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ ｓｐ．）
ＮＲＲＬ Ｂ−３６８３によって発酵させることによ
る、ステロイドの１７−アルギル側鎖の選択的な微生物
的減成分解を明らかにしている。

もつと最近では、マーシエツク（ Ｍａｒｓｈｅｃｋ
）らが合衆国特許第３７５９７９１号（１９７３年）で
、１７−アルキル側鎖中に少なくとも８個の炭素を含有
するコレスタン又はスチグマスタン系のステロイドをミ
コハクテリウム・スペシーズＮＲＲＬＢ−３８０５によ
って発酵させることによる、アンドロストー４−二ンー
３・１７−ジオンの選択的ナ微生物学的製造を明らかに
している。

本発明の化合物■は、１９６３年（ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２巻１２３８−１２４３頁）にワン（ Ｗａｎｇ ）及
びシー（Ｓ市つが、ノカルディア・レストリクツス（
Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ ）によるア
ンドロストー４−エンー１７β−オール−３−オンの減
成分解における−中間体として開示されている。

化合物Ｉの開環型である７α−メチルーパーヒドロイン
ダンジオン−（１・５）−（β−プロビルアルコール−
（４）〕は、ミコハクテリウム・スメグマチス（ Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｆｎ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ）に
よるプロゲステロンの減成分解における中間体として、
１９６４年（「ステロイド類」４巻５８１〜５８６頁）
シューベルト（ Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ）らによって開示
された。

突然変異株は、２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させ、発酵液中に次の化合物類を蓄積する能力に
よって特徴づけられる。

３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロパノール〕−７ａβ−
メチルへキサヒドロ−１・５−インダンジオンへミケタ
−ル （以下化合物Ｉと称する）、 ３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロパナール〕−５α−ヒ
ドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒドロ−１−インダノ
ンヘミアセタール （以下化合物■と称する）、 ３ａα−Ｈ−４α−〔３’−プロピオン酸〕−５α−ヒ
ドロキシー７ａβ−メチルへキサヒドロ−１−インダノ
ン−δ−ラクトン （以下化合物■と称する）、及び ３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロパノール〕−５α−ヒ
ドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒドロー１−インダノ
ン （以下化合物■と称する） これらの突然変異株は、本明細書に明らかにされている
突然変異化手順又はその他の突然変異化手順を使用して
、次の属のステロールを減成分解させる微生物から得る
ことができる。

アースロバクター（ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）、
バチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）、フルウイハクテリ
ウム（ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバ
クテリウム（ Ｃｏｌｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）
、ミコノくクテリウム（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、ノカルディア（ Ｎｏｃａｒｄｉａ ）、プロ
トアミノバクター（ Ｐｒｏｔｏａｍ ｉｎｏｔａｃｔ
ｅｒ ）、セラテイア（ Ｓｅｒｒａｔｉａ ）及びス
トレプトミセス（ Ｓ ｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）
。

好ましい属はミコバクテリウムである。

この属の例示的な種はエム・フレイ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ
）、エム・スメグマチス（Ｍ，ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、
エム−ｏ−ドクロウス（Ｍ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
）、エム・ムコスム（Ｍ．ｍ ｕｃｏｓｕ ｍ ）、エ
ム・フオルトウイトウム（Ｍ，ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）及
びエム・ブチリクム（Ｍ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）である
。

本明細書に判定的に例示されているのは、新規な突然変
異株の微生物ミコバクテリウム・フオルトウイトウム （ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ
）、ＮＲＲＬ Ｂ−８１２８である。

これは２〜１０個の炭素原子を含有する１７−アルキル
側鎖を伴った、又は伴わないステロイド類を選択的に減
成分解させて化合物Ｉ、■、■及び■を得るのに用いら
れる。

適当なステロイド類の例は、シトステロール、コレステ
ロール、スチクマステロール、カンペステロール、等の
、２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル側鎖をもった
ステロイド類、それにアンドロスト−４−エンー３・１
７−ジオン、アンドロスター１・４−ジエンー３・１７
−ジオン、デヒドロエヒアンドロステロン、及ヒテスト
ステロンである。

これらのステロイド基質は精製型又は粗製型でありうる
。

微生物 上記のようにステロイド類を選択的に減成分解させ、発
酵液中に化合物Ｉ、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株は、次の属すなわちアース
ロバクター、バチルス、グレヴイバクテリウム、コリネ
バクテリウム、ミコバクテリウム、ノカルディア、プロ
トアミノバクター、セラチア、及びストレプトミセスの
、ステロールを劣化分解させる微生物を突然変異させる
ことによって得られる。

本明細書に記載のとおりにミコバクテリウム・フオルト
ウイトウムＡＴＣＣ６８４２を突然変異させると、新規
な実験室的突然変異株の微生物を生ずる。

１９７４年度ＡＴＣＣカタログは、ＡＴＣＣ６８ ４２
の名薄と共に以下を明らかにしている。

ジエイ・シー・クルス（ Ｊ．Ｃ， Ｃｒｕｚ ） ２
、Ｃｏｌｄ ａｂｓｃｅｓｓ． Ａｃｔａ．Ｍｅｄ，
Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ １巻１頁（１９３６年
）。

Ｍｅｄｉｕｍ ９ ０ ３ ７ Ｃ ｏＭ．フオルトウ
イトウムＡＴＣＣ６８４２はステロール類を小分子量の
化合物類、例えばＣ０２＋Ｈ２０へ非選択的に減成分解
させる。

このためこの微生物は選択的なステロイド減成生物とし
て適当ではない。

ニトロソグアニジンを使用するＭ．フオルトウィトウム
ＡＴＣＣ６８４２の突然変異化は、本明細書に定義され
たとおりに、ステロイド類を選択的に減成分解させて化
合物類Ｉ、■、■及び■をつくるような新規な突然変異
株の産生なもたらした。

これが永久保存株中に寄託されている合衆国イリノイ州
ピオリアの合衆国農務省北部地域研究所により、Ｍ．フ
オルトウイトウムのこの突然変異株の微生物はＮＲＲＬ
Ｂ−８１２８という受入れ番号を与えられた。

この微生物の二次培養基は、ここへ要求すればこの寄託
所から自由に入手できる。

上記の突型変異株は、又日本においても昭和５１年１１
月１１日に工業技術院微生物工業技術研究所に保管委託
申請した。

微生物受託番号は第３８０４号である。

二次培養基が入手できるからといって、政府命令によっ
て証書と共に授与される特許権を侵害して本発明を実施
するという実施権を構成するものではないことを理解す
べきである。

Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８の形態
及び薬剤感受性は親のＭ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ
６８４２のそれと区別できない。

双方のＭ．フオルトウイトウムの培養基はアクチノマイ
セタレス（ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ）目の
ミコバクテリアセア（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ
ａｅ ）科に属する耐酸性で非自動型の胞子を形成しな
い杆菌である。

ラニョンの分類（ラニョン・イー・エイチ（ Ｒｕｎｙ
ｃｎ ． Ｅ．Ｈ．）、１９５９年Ｍｅｄ．Ｃ ｌ ｉ
Ｈ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ４ ３巻２７３頁）
によると、これは非色素群■のミコバクテリウムである
。

すなわち低温で急速に生育して、比較的簡単な培地上で
色素をもたない集落をつくる。

ステロイト゛分子に対するイ乍用においては、Ｍ．フオ
ルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２とＭ．フオルトウイト
ウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８は明瞭に区別できる。

上に明らかにされたように、Ｍ．フオルトウイトウムＡ
ＴＣＣ６８４２はステロイド類の非選択的な減成分解生
物であるのに反し、Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ
Ｂ−８１２８は選択的な減成分解生物である。

Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８のこ
の性状によって、これは本明細書で明らかにされたよう
に非常に有用なものとなっている。

Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８をつ
くるためのＭ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２の
突然変異化は、ニトロソグアニジンを用いて達成される
。

手順の詳細はあとに記載されている。

突然変異の手順は概してこの技術に知られているが、こ
の突然変異の手順を用いて得られる突然変異株の種類を
教示したり、或は示唆したりさえするような既知の技術
はまたない。

また本明細書に明らかにされた突然変異化及び転化手順
はミコバクテリウムに対して詳細に記載されているが、
同様な又は同等の手順を本明細書に明らかにされている
ようにその他の属の微生物に対して使用できることを理
解すべきである。

転化方法 本発明の選択的転化は、培養期間中に選ばれたステロイ
ド基質を培養基へ加えるか、又は接種に先立って栄養培
地へこれを混入させることによって、Ｍ．フオルトウイ
トウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８の生育している培養基
中で実施できる。

ステロイドを単独で、又は他のステロイドと組合わせて
添加できる。

限定はしないが培養基中のステロイドの好ましい濃度範
囲は、リットル当り約０．１ないし約１００？である。

炭素源、例えば同化できる炭水化物、及び窒素源、例え
ば同化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有する栄養
培地中で培養基を生育させる。

好ましい炭素源は萄葡糖、黒砂糖、庶糖、グリセロール
、殿粉、コーンスターチ、乳糖、デキストリン、糖蜜等
である。

好ましい窒素源はコーンスチープリカー、酵母、固形乳
を加え自己消化されたビール酵母、大豆粉、棉実粉、コ
ーンミール、固形乳、カゼインのすい液消化物、魚粉、
ディスチラーズソリッド、動物ペプトン液、肉と骨の破
片、アンモニウム塩等を包含する。

これらの炭素源と窒素源の組合わせを有利に使用できる
。

痕跡の金属類、例えば亜鉛、マクネシウム、マンガン、
コバルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。

というのは、培地の滅菌前に培地の成分として水道水及
び未精製の成分を使用するからである。

転化方法は約７２時間から１５日までの範囲である。

転化過程中の培養温度は約２５℃ないし約３７℃の範囲
であり、３０℃が好ましい。

転化容器の内容物に滅菌された空気を通してかきまぜ、
微生物の生育を容易ならしめかくして転化過程の有効度
を強める。

シリカゲル板（Ｅ．メルク社、タンレムシュタット）及
び２：３（容量比）の酢酸エチルーシクロヘキサンから
なる溶媒系を使用する薄層クロマトグラフイによって証
拠立てられるように、転化方法の終了後、望んでいる転
化されたステロイド類はこの技術によく知られた手段に
よって回収される。

例えば発酵液と菌体とを含んだ発酵（転化）反応混合物
をステロイド用の水と混ざらない有機溶媒で抽出できる
。

適当な溶媒は塩化メチレン（好適）、クロロホルム、四
塩化炭素、塩化エチレン、トリクロロエチレン、エーテ
ル、酢酸アミル、ベンゼン等である。

その代わりに、発酵液と菌体なまず慣用方法、例えばろ
過又は遠心分離によって分離し、次に適岸な溶媒で別々
に抽出する。

菌体を水と混ざる、又は水と混ざらない溶媒で抽出でき
る。

菌体を含んでいない発酵液を水と混ざらない溶媒で抽出
できる。

抽出液を硅藻土に通してろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留できる。

望んでいる転化ステロイドを含有する残留物をスケリソ
ルブＢ中の１０％クロロホルム中に溶解し、スクリソル
ブＢ（異性体ヘキサン）及びそれと増加量の酢酸エチル
との混合物を展開溶媒として使用して、シリカゲル上の
クロマトグラフイにかける。

この手順により、化合物Ｉ、■、及び■が溶離される。

化合物■は例えば酢酸エチル中の５％メタノールで溶離
できる。

結晶生成物は溶媒、例えば酢酸エチルを用いて得られる
。

望んでいる転化ステロイドも、残りの上澄液から、上澄
液中の溶媒蒸発によって得られる。

化合物■、■、■及び■は有用なステロイド類の化学合
成における中間体として有用である。

例えば、本化合物類は、有用な１９−ノルステロイド類
の全合成法を明らかにした合衆国特許第３８８０８８４
号の方法に対する出発材料へ転化できる。

出発材料へのこの転化は、この技術に知られた手順、例
えば酢酸中でクロム酸によって酸化させ、続いて無水酢
酸と酢酸ナトリウム処理によって行なわれる。

Ｂｉｏｃｈｅｍ ２巻１２３８〜１２４３頁及びＪ．Ａ
．Ｃ．Ｓ．８５巻２１３５〜２１３７頁を参照。

以下の実施例は本発明の方法と生成物の例示であるが、
限定的に考えられてはならない。

他に注意がなければ百分率はすべて重量によるものであ
り、またあらゆる溶媒混合物の割合は容量による。

実施例 Ｉ Ｍ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ ６８ ４２から突然
変異株Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬＢ−８１２８の
調製 （ａ）ニトロソグアニジンによる突然変異種の生成Ｍ．
フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２の菌体を２８℃で
次の無菌的な種菌培地中で生育させる。

栄養培養液（ディフコ） ８ ｇ／ｌ酵母エキ
ス １ ｇ／ｌプロピオ．４ナト
リウム ０． ５ ｇ／ｌ蒸留水
１ｌとするに十分な量 １ＮＮａＯＨでｐｎを７．０に調整しテカラ、１２１℃
で２０分滅菌する。

菌体を約５×１０８／ｍｌの密度まで生育させ、遠心分
離Ｋよってペレット化し、次いで同量の無菌的な０．１
Ｍくえん酸ナトリウム（ｐＨ５．６）で洗う。

洗った菌体を同量のくえん酸緩衡液に再懸濁し、滴定（
菌の計数）のため試料を除き、ニトロソグアニジンを５
０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加える。

菌の懸濁液を３７℃の水浴中で３０分温ため、次いで一
試料を滴定のため除去し、残りを遠心分離し、同量の無
菌的な０． １ Ｍ燐酸カリウム（ ｐＨ ７．０ ）
で洗う。

最後に以下からなる炭素源をもたない無菌的な最少の塩
媒質中に菌体を再懸濁させる。

ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ／ｌ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２５ ｇ／ｌ
ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０．２５ ｇ／
ｌＮａＣｌ ０．００５ｇ／ｌ
ＦｅＳ０４・７Ｈ２０ ０．００１ｇ／ｇ
蒸留水 １ｌとするのに十分な
量 １ＮＨｃｌでｐＨを７．０に調整シテカラ、１ ２ １
℃で２０分滅菌する。

次に突然変異株を選び出すために菌体をプレート上へ広
げる。

（ｂ） 突然変異株Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ
Ｂ−８１２８の選択と単離 上記のとおりに突然変異化された菌体を希釈し、次のも
のからなる培地（フレーザー （Ｆｒａｓｅｒ ）及びジエレル（ Ｊｅｒｒｅｌ ）
、１９６３年、Ｊ， Ｂｉｏｌ， Ｃｈｅｍ．２ ０
５巻２９１〜２９５頁から変更したもの）を含有するプ
レート上へ広げる。

グリセロール １０．０ ｇ／ｌＮａ２
ＨＰ０４ ８．４ ｇ／ｌＫＨ２Ｐ
Ｏ４ ４．５ ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ ２．０ ｇ／ｌＭ
ｇＳＯ４・７Ｈ２０ ０．３ ｇ／ｌＦ
ｅｅｌ３・６Ｈ２０ ０．０５ ｇ／ｌ蒸
留水 １ｌとするに十分な量 寒天（１５ｇ／ｌ）を加え、培地を１２１℃で３０分間
オートクレープ処理し、次いで無菌のペトリ皿に注ぐ。

この培地上の生育は、突然変異種生成手順によってつく
られるほとんどの栄養作用物質を排除している。

例えば化学的に定義された培地上での生育のためにビタ
ミ／類、生長要素等を必要とする培養基は排除される。

２８℃で約７日間培養後、生ずる集落を突然変異の選定
に適した試験プレート上へ複製し、次いでグリセロール
基盤の培地を含有する対照プレート上へ戻す。

試験プレートはピーターソン・ジー・イー（ Ｐｅｔｅ
ｒｓｏｎ，ＩＧ， Ｅ．）、エイチ・エル・ルイス（Ｈ
．Ｌ，Ｌｅｗｉｓ ）及びジエイ・アール・デービス（
Ｊ， Ｒ，Ｄａｖｉｓ） １ ９ ６ ２年「寒天培
地中におけるコレステロールその他の水に溶けない炭素
源の均一分散物の調製ｊ （ Ｊ． ＬｉｐｉｄＲｅｓ
ｅａｒｃｈ ３巻２７５〜２７６頁）に記載のとおりに
つくられる。

これらのプレート中の最少塩培地哄実施例１の（ａ）節
に記載されたとおりである。

寒天（１５ｇ／Ｊ）と、シトステロール又はアンドロス
テンジオン（ＡＤ）のような適当な炭素源（ １．０ｇ
／ｌ）を加え、生ずる懸濁液を１２１℃で３０分オート
クレープ処理する。

次に滅菌された熱い混合物を無菌の配合容器に注ぎ、数
分間配合し、次いで無菌のベトリ皿へ注ぐ。

この手順で発泡が問題となりがちであるが、混合物が熱
いうちに配合することと、溶融寒天のプレート表面に炎
を当てることによって減少できる。

この方法で水に溶けない炭率源の均質分散が得られる。

これは非常に均質であるが不透明な寒天プレートの調製
を容易ならしめる。

対照プレート上で生育するが、唯一の炭素源としてＡＤ
を含有する試験プレート上では生育しない集落は、栄養
寒天プレート上の画線分離によって精製される。

２８℃で生育後、個々の集落を滅菌．したつまようじヂ
栄養寒天プレートから取上げ、′炭素源としてＡＤを含
有するプレートヘ穿刺によって接種して再試験をする。

親培養基とは異なる表現型を示す精製された単離物は、
振と５フラスコで評価される。

（ｃ） 振とうフラスコ評価法 ． 振と５不ラスコ（５００ｍｌ）は以下の成分からなる生
物転化培地１００ｍｌを含有する。

グリセロール １０．０ ｇ／ｌＮａ２Ｈ
ＰＯ４ ８．４ ｇ／ｌＫＨ２Ｐ０
４ ４．５ ｇ／ｌＮＨ４Ｃｌ
２．０ ｇ／ｌＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０．３ｇ／ｌＦｅＣｌ・６Ｈ２Ｏ
０．０５ｇ／ｌ蒸留水 １ｌ
とするに十分な量 大豆粉（１ｇ／ｌ）を培地へ配合し、次にシトステｐ−
ル（１０ｇ／ｌ）を培地に配合する。

フラスワを１２１℃で２０分オートクレープ処理してか
ら、２８℃に冷却し、次いで以下のようにして調製され
た種菌生育物１０ｍｌを接種する。

（ｂ）部からの精製された単離菌を２８℃で寒天斜面培
坤に生育させる。

斜面培地からの一すくいの菌体を取って、次の成分から
なる滅菌した種菌培地１００ｍｌを含有する５００ｍｌ
フラスコに接種するために使用する。

栄養培讐液（ディフコ） ８ｇ／ｌ酵母エ
キス １ｇ／ｌグリセロール
５ｇ／ｌ蒸留水
１ｌとするに十分な量 １ＮＮａＯＨでｐＨを７．Ｏに調整してから、フラスコ
を１２１℃で２０分オートクレープ処理する。

種菌フラスコを２８℃で７２時間培養する。

上に明らかにされたように、種菌生育物１０ｍｌを使用
して、滅菌した転化培地１００ｍｌを含有する各々の５
００ｍｌフラスコを接種する。

次にフラスコを回転振とう機上で２８℃ないし３０℃で
培養し、種々の間隔で試料を採取する。

１ ０ ｍｌ試料を除去し、３倍量の塩化メチレンと共
に振とラすることによって抽出する。

抽出液の一部はシリカゲル及び上記の浴媒系すなわち２
：３（容量比）の酢酸エチルーシクロヘキサンを使用す
る薄層クロマトグラフイ、及び気液クロマトグラフイに
よって分析される。

化合物類．■、■、■及び■が存在する証拠は、親Ｍ．
フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２からつくられる新
規突然変異株によるシトステロールの選択的減成分解を
確証している。

実施例 ２ シトステロールから化合物■、■、■及び■への転化 使用の培地は実施例１ （ｃ）におけるものと同じであ
る。

この培地を１２１℃で３０分加熱することによって滅菌
する。

次いでこれを３０℃に冷却し、実施例１（Ｃ）に記載さ
れたとおりに調製された突然変異株のミコバクテリウム
Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ Ｂ−８１２８の種
菌培養基１０部を接種する。

接種された混合物は水面下の生育を促進するためかきま
ぜながら、３０℃で３３６時間培養される。

培養後、混合物を塩化メチレンで抽出する。

抽出液を硅藻土に通してろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留する。

残留物をスケリソルブＢ中の１０％クロロホルム中に取
上げ、シリカゲル上で展開剤としてスケリソルブＢ及び
それと増加量の酢酸エチルとの混合物を使用してクロマ
トグラフイ処理にかける。

この手順で化合物■、■及び■が溶離される。

化合物■は酢酸エチル中の５％メタノールによりカラム
から溶離される。

化合物の溶離順序はＩ→■→■→■である。

薄層クロマトグラフイでのこれらの化合物のＲｆ値は以
下のとおりである（シクロヘキサンー酢酸エチル３：２
）。

Ｉ＝０．３７ ＩＩ＝０．２８ ＩＩＩ＝０．１６ ＩＶ＝０．０５ ＴＬＣで決定されるとおりに適当なフラクションを一緒
にして乾固するまで蒸発させると、化合物■、■、■及
び■の良好な収量を与える。

出発物質に対し化合物Ｉ、■、■、及び■の収率はそれ
ぞれ重量基盤で４．０％、５．０％，８．０％及び１２
．０％である。

酢酸エチルから再結晶後、化合物Ｉは二つのエピマー類
の１：１混合物である。

化合物■は１００〜１１２℃で溶融する。

化合物■は油である。

化合物■は融点１２２〜１２４℃である。

化合物■は融点１４８〜１５０℃である。

実施例 ３ 実施例２のシトステロールの代わりにコレステロールを
使用して、化合物Ｉ、■、■及び■が得られる。

実施例 ４ 実施例２においてシトステロールの代わりにスチグマス
テロールを使用して、化合物Ｉ、■、■及び■が得られ
る。

実施例 ５ 実施例２のシトステロールの代わりにカンペステロール
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。

実施例 ６ 実施例２においてシトステロールの外に、又はシトステ
ロールの代わりに、実施例２〜５のステロイド類の任意
のものの組合せを加えて、化合物Ｉ，■、■及び■が得
られる。

参考例 ７ ミコバクテリウム・フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４
２の代わりに実施例１において、アースロバクター（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ）、バチルス（ Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ）、ブレヴィバクテリウム（ Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ）、コリネバクテリウム（ Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）、ノカルディア（ Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ ）、プロトアミノバクター（ Ｐ ｒｏ
ｔａｍ ｉｎｏｂａｃｔｅｒ ）、セラテイア（ Ｓｅ
ｒｒａｔｉａ ）及びストレプトミセス（ Ｓｔｒｅｐ
ｔｏ ｍｙｃｅｓ ）属からのステロールを減成分離さ
せる微生物を使用して、２〜１０個の炭素原子の１７−
アルキル側鎖をもった又はもたないステロイド類を選択
的に減成分解させて、発酵液中に化合物類Ｉ、■、■及
び■を蓄積する能力によって特徴づけられる突然変異株
の微生物が得られる。

参考例 ８ 実施例２〜６のＭ．フオルトウイトウムＮＲＲＬＢ−８
１２８の代わりに参考例７で得られる突然変異株を使用
して、化合物■、■、■及び■が得られる。

実施例 ９ 実施例１０Ｍ．フオルトウイトウムＡＴＣＣ６８４２の
代わりに、ミコバクテリウム・フレイ（ Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅｉ ）、エム・スメグマチス
（ Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ）、エム・ロードクロウ
ス（ Ｍ．ｒｈｏｄｏ ｃｈｒｏｕｓ ）、エム・ムコ
スム（Ｍ．ｍｕｃｏｓｕｍ ）及びエム・プチリクム
（ Ｍ，ｂｕ ｔｙｒ ｉ ｃｕ ｍ ）を使用して、
２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル側鎖をもった、
又はもたないステロイド類を選択的に減成分解させて発
酵液中に化合物Ｉ、■、■及び■を蓄積する能力によっ
て特徴づけられる突然変異株の微生物が得られる。

実施例 １０ 実施例２〜６０Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬＢ−８
１２８の代わりに実施例９で得られる突然変異株を使用
して、化合物Ｉ、■、■及び■が得られる。

実施例 １１ 実施例２のシトステロールの代わりにアンド口スト−４
−エンー３・１７−ジオン、アンドロスタ−１・４−ジ
エン−３・１７−ジオン、テヒドロエピアンドロステち
ン、及びテストステロンからなる群から選ばれる化合物
を使用して、化合物■、■、■及び■が得られる。

実施例 ｌ２ 実施例２のジトステロールの代わりにシトステロール、
コレステロール、スチグマステロール、アンドロスト−
４−エンー３・１７−ジオン、アンドロスター１・４−
ジエンー３・１７−ジオン、デヒドロエピアンドロステ
ロン、及びテストステロンからなる群から選ばれる２種
又はそれ以上の化合物類の組合せを使用して、化合物類
Ｉ、■、■及び■が得られる。

参考例 １３ 実施例１１と１２０Ｍ．フオルトウイトウムＮＲＲＬ
Ｂ−８１２８の代わりに参考例７で得られる突然変異
株を使用して、化合物類Ｉ、■、■及び■が得られる。

実施例 １４ 実施例１ｌと１２０Ｍ．フオルトウイトウムの代わりに
実施例９で得られる突然変異株を使用して、化合物Ｉ、
■、■及び■が得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １式 の化合物。 ２ 好気的条件下に水性栄養培地中で、２〜１０個の炭
   素原子を含有する１７−アルキル側鎖をもっている又は
   もっていないステロイドの存在下に、ミコバクテリウム
   （ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）属の突然変異株の
   微生物を培養することからなり、上記突然変異株は２〜
   １０個の炭素原子の１７−アルキル側鎖をもっているか
   又はもっていないステロイド類を選択的に減成分解され
   、発酵液中に３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロパノール
   〕−７ａβ−メチルへキサヒドロー１・５−インダンジ
   オンへミケタール、３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロパ
   ナール〕−５α−ヒドロキシ−７ａβ−メチルへキサヒ
   ドロ−１−インタソンへミアセクール、３ａα−Ｈ−４
   α−〔３′−プロピオン酸〕−５α−ヒドロキシ−７ａ
   β−メチルへキサヒドロ−１−インダノンーδ−ラクト
   ン及び３ａα−Ｈ−４α−（３’−プロパノール〕−５
   α−ヒドロキシー７ａβ−メチルへキサヒドロ−１−イ
   ンダノンを蓄積する能力により特徴づけられるものであ
   る、式 の化合物を含有する発酵液を得、この発酵液がら式 の化合物を採取することを特徴とする上式化合物の製法
   。 ３ 好気的条件下の水性栄養培地中で、２〜１０個の炭
   素原子を含む１７−アルキル側鎖を伴った、又は伴わな
   いステロイドの存在下にミコバクテリウム・フオルトウ
   イトウム（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｔｕｉ
   ｔｕｍ） ＮＲＲＬ Ｂ − ８ １ ２ ８を培養
   し、その培地から 式 の化合物を採取することを特徴とする、上式化合物の特
   許請求の範囲第２項に記載の製法。 ４ ステロイトカシトステロール、コレステロール、ス
   チグマステロール、カンペステロール、アンドロストー
   ４−エンー３・１７ − シオン、アンドロスタ−１・
   ４−ジエンー３・１７−ジオンデヒドロエピアンドロス
   テロン、及びテストステロンからなる群から選ばれる、
   特許請求の範囲第３項による方法。 ５ 好気的条件下の水性栄養培地中で、２種又はそれ以
   上のステロイド類混合物の存在下にミコバクテリウム・
   フオルトウイトウム （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）Ｎ
   ＲＲＬ Ｂ −１８１２８を培養し、その培地から 式 を有する化合物を採取することを特徴とする、上式化合
   物の特許請求の範囲第２項ＫｉｉｌＪの製法。 ６ 上記ステロイド混合物がシトステロール、コレステ
   ロール、スチグマステロール、カンペステロール、アン
   ドロストー４−エンー３・１７−ジオン、アンドロスタ
   ー１・４−ジエンー３・１７−ジオン、デヒドロエピア
   ノドロステロン及びテストステロンからなる群から選ば
   れる、特許請求の範囲第５項による方法。 ７ 好気的条件下の水性栄養培地中で、２〜１０個の炭
   素原子を含有する１７−アルキル側鎖を伴った、又は伴
   わないステロイドの存在下にミコバクテリウム（ Ｍｙ
   ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）の突然変異株を培養する
   ことからなり、この突然変異株が２〜１０個の炭素原子
   の１７−アルキル側鎖を伴った、又は伴わないステロイ
   ト顎を選択的に減成分解させ、発酵液中に３ａα−Ｈ−
   ４α−〔３′−プロパノール〕−７ａβ−メチルへキサ
   ヒドロ−１・５−インダンジオンへミケタール、３ａα
   −■−４α−（３’−プロパナール〕−５α−ヒドロキ
   シ−７ａβ−メチルへキサヒドロ−１−インダノンヘミ
   アセタール、３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロピオン酸
   〕−５α−ヒドロキシー７ａβ−メチルへキサヒドロ−
   １−インダノンーδ−ラクトン、及び３ａα−Ｈ−４α
   −〔３’−グロパノール〕−５α−ヒドロキシ−７ａ．
   β−メチルへキサヒドロ−１−インタソンを蓄褌する能
   力によって特徴づけられるものであり、その培地から 式 を有する化合物を採取することを特徴とする、上式化合
   物の特許請求の範囲第２項に記載の製法。 ８ 上記突然変異株の微生物が好気的条件下の水性培養
   培地中で、２種又はそれ以上のステロイド類混合物の存
   在下に培養される、特許請求の範囲第７項による方法。 ９ 上記ステロイトカシトステロール、コレステロール
   、スチクマステロール、カンペステロール、アンドロス
   トー４−エンー３・ １７−ジオン、アンドロスター１
   ・４−ジエンー３・１７−ジオン、デヒドロエピアンド
   ロステロン、及びテストステロンからなる群から選ばれ
   る、特許請求の範囲第７項による方法。 ：１０ 上記ステロイド混合物がシトステロール
   、コレステロール、スチクマステロール、カンペステロ
   ール、アンドロスト−４−エンー３・１７−ジオン、ア
   ンドヮスタ−１・４−ジェンー３・１７−ジオン、デヒ
   ドロエピアンドロステロン、及びテストステロンからな
   る群から選ばれる、特許請求の範囲第８項による．方法
   。 １１ 好気的条件下の水性栄養培地中で、２〜１０個
   の炭素原子を含有している１７−アルキル側鎖を伴った
   、又ヲ主伴わな．いステロイドの存在下にミコバクテリ
   ウみ・フオルトウイトウム （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）Ｎ
   ＲＲＬ Ｂ −８１２８を培養し、こ：の培地から 式 を有する化合物を採取することを特徴とする、上式化合
   物の特昨請求の：範囲第２項に記載の製法。 １２上記ステロイトがシトステロール、コレステロール
   、スチグマステヮール、カンペステロール、アンドロス
   ト−４−エン−３・１７−ジオン、アンドロスター１．
   ・４−ジエンー３・１７−ジオン、デヒドロエピアンド
   ロステロン、及びテストステロンからなる群から選ばれ
   る、特許請求の範囲第１１項による方法。 １３ 好気的条件下の水性栄養培地中で、２種又はそ
   れ以上のステロイド類の存在下にミコバクテリウム．７
   オルトウイトウム（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏ
   ｒｔｕｉｔｕｍ）ＮＲＲＬ Ｂ−８１２８を培養し、
   この培地から 式 を有する化合物を採取することを特徴とする、上式化合
   物の特許請求の範囲第２項に記載の製法。 １４ 上記ステロイド混合物がシトステロール、コレ
   ステロール、スチグマステロール、カンペステロール、
   アンドロスト−４−エンー３・１７−ジオン、アンドロ
   スター１・４−ジエンー３・ｌ７−ジオン、デヒドロエ
   ピアノドロステロン及びテストステロンからなる群から
   選ばれる、特許請求の範囲第１３項による方法。 １５ 好気的条件下の水性栄養培地中で、２〜１０個
   の炭素原子を含有する１７−アルキル側鎖を伴った、又
   は伴わないステロイドの存在下にミコバクテリウム（
   Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）の突然変異株を培養す
   ることからなり、この突然変異株が２〜１０個の炭素原
   子の１７−アルキル側鎖を伴った、又は伴わないステロ
   イド類を選択的に減成分解させ、発酵液中に３ａα−Ｈ
   −４α−〔３′−プロパノール）−７ａβ−メチルへキ
   サヒドロー１・５ーインダンジオンへミケタール、３ａ
   α−Ｈ−４α−（３’−プロパノール〕−５α−ヒドロ
   キシ−７ａβ−メチルへキサヒドロ−１−インダノンヘ
   ミアセタール、３ａα−Ｈ−４α−〔３′−プロピオン
   酸）−５α−ヒドロキシー７ａβ−メチルへキサヒドロ
   −１−インタソンーδ−ラクトン、及び３ａα−Ｈ−４
   α−〔３′−プロパノール〕−５α−ヒドロキシ−７ａ
   β−メチルへキサヒドロ−１−インダノンを蓄積する能
   力によって特徴づけられるものであり、この培地から を有する化合物を採取することを特徴とする、上式化合
   物の特許請求の範囲第２項に記載の製法。 １６ 上記突然変異株の微生物が好気的条件下の水性栄
   養培地中で、２種又はそれ以上のステロイド類混合物の
   存在下に培地される、特許請求の範囲第１５項による方
   法。 １７ ステロイドがシトステロール、コレステロール
   、スチクマステロール、カンペステロール、アンドロス
   ト−４−エンー３・１７−ジオン、アンドロスター１・
   ４−ジエンー３・１７−ジオン、デヒドロエピアンドロ
   ステロン、及びテストステロンからなる群から選ばれる
   、特許請求の範囲第１５項による方法。 １８ 上記ステロイド混合物がシトステロール、コレス
   テロール、スチグマステロール、カンペステロール、ア
   ンドロストー４−エンー３・１７−ジオン、アンドロス
   ター１・４−ジエンー３・１７−ジオン、デヒドロエピ
   アンドロステロン、及びテストステロンからなる群から
   選ばれる、特許請求の範囲第１６項による方法。