JPS6231906B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 微生物によるステロイド類の転化は広く研究さ
れ、記録されてきた。明らかに最初のこのような
研究は、1937年のベリヒテ（Ber）70巻740頁と
同70巻2079頁におけるマリモ（Mamoli）及びヴ
エルセローネ（Vercellone）によるものであつ
た。彼らは酵母醗酵による17−ケトステロイドの
17β−ヒドロキシステロイドへの還元を明らかに
した。これ以後にピーターソン（Peterson）及び
マレー（Murray）がカビのリゾプス・ニグリカ
ンス（Rhizopus nigricans）によるプロゲステロ
ンの11α−ヒドロキシル化を明らかにしている。
合衆国特許第2602769号（1952年）を参照。更に
最近ではクレーキー（Kraychy）等が合衆国特許
第3684657号（1972年）で、17−アルキル側鎖中
に少なくとも８個の炭素を含有するステロイドを
ミコバクテリウム・スペシーズNRRL Ｂ−3683
によつて発酵させてアンドロスト−４−エン−
３・17−ジオン、アンドロスト−１・４−ジエン
−３・17−ジオン、及び20α−ヒドロキシメチル
−プレグナ−１・４−ジエン−３−オンをつくる
ことによる、ステロイドの17−アルキルの選択的
微生物減成を明らかにしている。もつと最近で
は、合衆国特許第3759791号（1973年）でマーシ
エツク（Marsheck）等が、17−アキル側鎖中に
少なくとも８個の炭素を含有するコレクタ又はス
チグマスタン系のステロイドを、ミコバクテリウ
ム・バカエ（Mycobacterium vaccae）として特
徴づけられるミコバクテリウム・スペシーズ
NRRL Ｂ−3805で発酵させることによる、アン
ドロスト−４−エン−３・17−ジオンの選択的微
生物製造を明らかにしている。

本発明は２〜10個の炭素原子の17−アルキル側
鎖をもつステロイド類を選択的に減成させ発酵液
中にアンドロスト−４−エン−３・17−ジオン
（以下ADと称する）を蓄積する能力によつて特徴
づけられる突然変異株に関する。この突然変異株
は、本明細書で明らかにされた突然変異手順又は
その他の突然変異手順を使用してミコバクテリウ
ム属の微生物から得られる。

本明細書中に特定的に例示されているものは、
２〜10個の炭素原子の17−アルキル鎖をもつステ
ロイド類をADへ選択的に減成させるのに用いら
れる新規な突然変異株の微生物ミコバクテリウ
ム・フオルトウイツム（Mycobacterium
fortuitum）、NRRL Ｂ−11045である。適当なス
テロイド基質の例はシトステロール、コレステロ
ール、スチグマステロール、カンペステロール
等、２〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をも
つステロイド類である。これらのステロイド基質
は純粋な形又は粗製型でありうる。

微生物 ２〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をもつ
ステロイド類を選択的に減成し発酵液中にADを
蓄積する能力によつて特徴づけられる突然変異株
は、ミコバクテリウム属に属している微生物から
つくられる。ミコバクテリウム・フオルトウイツ
ムATCC6842を本明細書で明らかにされたとおり
に突然変異させると、新規実験室的突然変異株の
微生物を生ずる。

1974年度ATCCカタログはATCC6842の掲載の
ほか次のものを明らかにしている。「ジエー・シ
ー・クルス（J.C.Cruz）、２寒性膿瘍、Acta
Med.Rio de Janeiro １巻１頁（1936年）。培地
90 37C」。エム・フオルトウイツムATCC 6842
はステロールを小分子量の化合物、例えばCO₂＋
H₂Oへ非選択的に分解する。このためこの微生物
は選択的ステロイド減成微生物として適していな
い。

ニトロソグアニジンを使用するエム・フオルト
ウイツムATCC6842の突然変異化は、２〜10個の
炭素原子の17−アルキル側鎖をもつステロイド類
を選択的に減成してADをつくるような新規突然
変異株の生成をもたらす。この突然変異株の微生
物は、これが永久収集物として寄託されている合
衆国イリノイ州ピオリアの合衆国農務省北部地域
研究所で、受入れ番号NRRL Ｂ−11045を与えら
れた。この微生物は二次培養基は、こゝに要求す
ればこの寄託機関から自由に入手できる。この培
養基を入手できることが、政府決定により題目付
証書を以つて授与された特許権を損じて本発明を
実施できるというライセンスを構成するものでは
ないことが理解されるべきである。この突然変異
種は日本においては受託番号第4112号で工業技術
院微生物工業研究所に保管寄託されている。本願
が特許出願公告された後では同所より自由に分譲
を受けることができる。

本発明の微生物は、上に論じられている合衆国
特許第3759791号で明らかにされたミコバクテリ
ウム・スペシーズNRRL Ｂ−3805から区別され
た。NRRL Ｂ−3805はミコバクテリウム・バカ
エの全般的特徴をもつており、これは本発明のエ
ム・フオルトウイツムとははつきりと異なつてい
る。これらの微生物の比較についてはバーギー
（Bergey）のマニアル オブ デタミネテブ ベ
クテリオロジイ（Manual of Determinative
Bacteriology）第８版、ウイリアムス・アンド・
ウイルキンス社（1974年）の695〜６頁を参照の
こと。

エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045の形
態及び薬剤感受性は、親株エム・フオルトウイツ
ムATCC 6842のそれらとは区別できない。エ
ム・フオルトウイツムはアクチノマイセタレス
（Actinomycetales）目のミコバクテリアセアエ
（Mycobacteriaceae）族に属する抗酸性、非自動
性、胞子非形成性の杆菌である。ラニヨンの分類
（Runyon、E.H.1959.Med.Clin、North America
43巻273頁）によると、エム・フオルトウイツム
は非色素生産性群のミコバクテリウムである。
すなわち比較的簡単な培地上で低温で急速に生育
し、色素を含まない集落をつくる。

エム・フオルトウイツムATCC6842とエム・フ
オルトウイツムNRRL Ｂ−11045は、ステロイド
分子への作用において明瞭に区別できる。上に明
らかにされるように、エム・フオルトウイツム
ATCC6842はステロイドの非選択的減成微生物で
あるが、一方エム・フオルムウイツムNRRL Ｂ
−11045は選択的減成微成物である。エム・フオ
ルトウイツムNRRL Ｂ−11045のこの性質は、本
明細書で明らかにされているとおりこれを非常に
有用なものとする。

エム・フオルトウイツムATCC6842を突然変異
化して突然変異株を与え、次にこれを再び突然変
異させてエム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−
11045を得ることは、ニトロソグアニジン使用に
より達成された、手順の詳細は下に記載されてい
る。本明細書で明らかにされた突然変異及び転化
手順がミコバクテリウムについて詳細に述べてあ
るが、本明細書で明らかにされているように他の
属の微生物によつても類似の又は同等な手順が使
用できることは理解されるべきである。

転化方法 本発明の選択的転化は、培養期中に培養基へ選
ばれたステロイド基質を加えるか、又は接種に先
立つて栄養培地中へこれを取入れることによつ
て、エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045の
生育培養基中で実施できる。ステロイドは単独で
又は他のステロイドと組合わせて加えることがで
きる。培養基中のステロイドの好ましいが限定的
でない濃度範囲は、リツトル当り約0.1ないし約
100ｇである。培養基を炭素源、例えば同化でき
る炭水化物及び窒素源、例えば同化できる窒素化
合物又は蛋白質材料を含有する栄養培地中で生育
させる。好ましい炭素源はブドウ糖、黒砂糖、庶
糖、グリセロール、殿粉、トウモロコシ殿粉、乳
糖、デキストリン、糖蜜等を包含する。好ましい
窒素源はコーンスチープリカー、酵母、固型乳を
加えた自己分解醸造酵母、大豆粉、棉実粉、コー
ンミール、固型乳、カゼインの〓液消化物、魚
粉、デイスチラーズソリツド、動物ペプトン液、
肉と骨の砕片、アンモニウム塩類等を包含する。
これらの炭素及び窒素源の組合わせを使用するの
が有利である。痕跡量の金属例えば亜鉛、マグネ
シウム、マンガン、コバルト、鉄等は発酵培地に
加える必要がない。というのは、培地の滅菌前に
培地成分として水道水及び未精製の成分を用いる
からである。

転化方法は約72時間ないし15日又はそれ以上の
範囲になりうる。培養温度は約25℃ないし約37℃
の範囲でありうるが、NRRL Ｂ−11045に対して
は30℃が好ましい。微生物の生育を促進し、こう
して転化方法の有効性を高めるため、内容物に滅
菌された空気を通じ、曝気させる。

シリカゲル板（イー・メルク、ダルムシユタツ
ト）及び２：３容量比の酢酸エチル−シクロヘキ
サンからなる溶媒系を使用する薄層クロマトグラ
フイで立証されるとおりに転化方法の終了時に、
望んでいる転化ステロイドはこの技術に周知の手
段によつて回収される。例えば発酵液と菌体を含
めた発酵（転化）反応混合物を、ステロイド用の
水と混ざらない有機溶媒で抽出される。適当な溶
媒はジクロロメタン（好ましい）、塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、
トリクロロエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベ
ンゼン等である。

その代わりに、発酵液と菌体をまず慣用方法、
例えばろ過又は遠心分離によつて分離し、次いで
別々に適当な溶媒で抽出する。菌体を水と混ざる
溶媒又は水と混ざらない溶媒で抽出できる。菌体
を含まない発酵液を水と混ざらない溶液で抽出で
きる。

抽出液を珪藻土に通してろ過し、ろ液を乾固す
るまで真空蒸留する。望んでいる転化ステロイド
を含有する生じた残留物を最少量の酢酸エチル−
シクロヘキサン（20：80）に溶解できる。この溶
液をシリカゲル上のクロマトグラフイにかけるこ
とができる。ADは酢酸エチル−クロロホルム
（15：85）の溶媒系での溶離によつてシリカゲル
から分離できる。次に溶媒蒸発とヘキサンからの
再結晶によつて化合物を別個の物として単離でき
る。

本発明の転化方法の望んでいる生成物は、既知
のステロイド中間体ADである。この化合物は有
用なステロイドホルモンの合成における中間体と
して有用である。例えばADは、合衆国特許第
2143453号、第2253798、第2264888号及び第
2356154号で明らかにされた方法に従つてテスト
ステロンをつくるのに使用できる。

以下の実施例は本発明方法と生成物の例示であ
るが、限定的に考えられてはならない。他に注意
がなければ、百分率はすべて重量により、また溶
媒混合物の割合はすべて容量による。

実施例 １ エム・フオルトウイツムATCC6842からの突然
変異株エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−
11045の調製 (a) ニトロソグアニジンによる突然変異の発生 エム・フオルトウイツムATCC6842の菌体を
28℃で次の無菌的種菌培地中で生育させる。

栄養培養液（デイフコ） ８ｇ／ 酵母液 １ｇ／ グリセロール ５ｇ／ 蒸留水 １とするに十分な量 1N NaOHでPHを7.0に調整してから121℃で
20分滅菌する。

菌体をml当り約５×10⁸の密度まで生育さ
せ、遠心分離によつてペレツト化し、次に同じ
容量の無菌的な0.1Mくえん酸ナトリウム（PH
5.6）で洗う。洗つた菌体を同容量のくえん酸
緩衝液中に再懸濁し、試料を滴定（菌体計数）
のために除き、ニトロソグアニジンを50μｇ／
mlの最終濃度まで添加する。菌体懸濁液を37℃
の水浴中で30分培養し、このあと試料を滴定用
に再び除き、残りを遠心分離にかけ、同容量の
無菌的0.1M燐酸カリウム（PH7.0）で洗う。最
後に菌体を次のものからなるが炭素源を含まな
い無菌的最少塩培地中に再懸濁する。

NH₄NO₃ 1.0ｇ／ K₂HPO₄ 0.25ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.25ｇ／ NaCl 0.005ｇ／ FeSO₄・7H₂O 0.001ｇ／ 蒸留水 １とする量 1N NClでPHを7.0に調整してから121℃で20
分滅菌する。次に菌体をプレート上に播いて突
然変異株を選定する。

(b) 選定と単離 上記のように突然変異を起した菌体を希釈
し、以下からなる培地（フレーザー
（Fraser）及びジエレル（Jerrel）、1963年、J.
Biol.Chem.205巻291〜295頁から変性）を含有
するプレート上に広げる。

グリセロール 10.0ｇ／ K₂HPO₄ 0.5ｇ／ NH₄Cl 1.0ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.5ｇ／ FeCl₃・6H₂O 0.05ｇ／ 蒸留水 １とする量 寒天（15ｇ／）を加え、培地を121℃で30
分オートクレーブにかけ、次いで無菌的なペト
リ皿に注ぐ。

この培地上の生育は、突然変異発生手順によ
つてつくられる大抵の栄養的自家栄養体を排除
する。例えば化学的に定義された培地上で生育
するためにビタミン類、生長因子等を必要とす
るような培養基は排除される。28℃で約７日培
養後、生ずる集落を突然変異株の選定に適した
試験プレートへ複製し、次いでグリセロールを
基盤とする培地を含む対照プレートへ逆複製す
る。試験プレートはピーターソン・ジー・イー
（Peterson、G.E.）、エツチ・エル・ルイス
（H.L.Lewis）及びジエー・アール・デービス
（J.R.Davis）、1962年、「コレステロール及びそ
の他の水に不溶の炭素源の寒天培地中における
均一分散液の調製」、J.Lipid Research3巻275
〜276頁に記載のとおりにつくられる。これら
のプレート中の最少塩培地は実施例１の(a)部で
述べたとおりである。寒天（15ｇ／）及びシ
トステロール又はアンドロステンジオン
（AD）のような適当な炭素源（1.0ｇ／）を
加え、生ずる懸濁液を121℃で30分オートクレ
ーブにかける。無菌の熱した混合物を無菌のブ
レンダー容器に注ぎ、数分間配合し、次に無菌
のペトロ皿に注ぐ。この手順で発泡が問題にな
りがちであるが、これは混合物が熱い時に配合
することと溶融寒天プレート表面に焔をあてる
ことによつて減少できる。このやり方で水に不
溶な炭素源の均一分散液が得られ、非常に均質
であるが不透明の寒天プレートの調製が容易と
なる。

対照プレート上に生育するがADを唯一の炭
素源として含有する試験プレート上では生育す
るとしてもわずかしか生育を示さないような集
落を、栄養寒天培地上の画線接種によつて精製
する。28℃で生育後、個々のクロンを無菌的に
つまようじで栄溶寒天プレートから取り上げ、
ADを炭素源として含有するグリデツドプレー
トに接種することにより再試験する。親培養基
とは異なる表現型をまだ現わしている精製され
た単離物を振とうフラスコ中で評価する。

(c) 振とうフラスコによる評価 振とうフラスコ（500ml）は次の成分からな
る生物転化培地100mlを含有する。

グリセロール 10.0ｇ／ K₂HPO₄ 0.5ｇ／ NH₄Cl 1.0ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.5ｇ／ FeCl₃・6H₂O 0.05ｇ／ 蒸留水 １とする量 大豆粉（１ｇ／）を培地に配合し、次にシ
トステロール（10ｇ／）も培地に配合する。
フラスコを121℃で30分オートクレーブにかけ
てから、28℃に冷却し、次に以下のとおりにつ
くられる種菌生育物10mlを接種する。

(b)部からの精製された単離物を28℃で寒天斜
面培地上に生育させる。斜面培地から取つた菌
体ひとすくいを使用して、次の成分からなる無
菌的種菌培地100mlを含有する500mlフラスコに
接種する。

栄養培養液（デイフコ） ８ｇ／ 酵母エキス １ｇ／ グリセロール ５ｇ／ 蒸留水 １とする量 1N NaOHでPHを7.0に調整してから、フラス
コを121℃で20分オートクレーブにかける。種
菌フラスコを28℃で72時間培養する。

上に明らかにされたように、種菌生育物10ml
を使用して、無菌の転化培地100mlを含有する
各々の500mlフラスコを接種する。フラスコを
回転振とう機上で28゜〜30℃で培養し、種々の
間隔で試料採取を行なう。10mlの試料を取り出
し、３倍容量の塩化メチレンと一緒に振とうし
て抽出する。抽出液の少量ずつを、シリカゲル
及び上記溶媒系すなわち２：３容量化の酢酸エ
チル−シクロヘキサン使用の薄層クロマトグラ
フイ、及び気液クロマトグラフイによつて分析
する。ADD及び少量のADが存在する証拠によ
り、親のエム・フオルトウイツムATCC6842か
らつくられる突然変異株によるシトステロール
の選択的減成が確認される。

(d) 突然変異株エム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ−11045を得るための再突然変異化 ADを含有する寒天プレート上で非常に緩慢
に生育する上の突然変異株を、上に明らかなよ
うにされた突然変異手順にかけると、突然変異
化された菌体を生ずる。これらの菌体を上記の
(b)及び(c)部の手順にかけると、AD及び少量の
ADDを製造できる新規突然変異株ミコバクテ
リウム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045を
生ずる。

参考例 １ シトステロールのADへの転化 使用培地は実施例１(c)と同じである。この培地
は、121℃で30分オートクレーブにかけることに
よつて減菌され、次にこれを30℃に冷却してか
ら、実施例１(c)で述べたとおりにつくられる突然
変異株ミコバクテリウムのエム・フオルトウイツ
ムNRRL Ｂ−11045の種菌培養基10部を接種す
る。水面下の生育を促進するためかきまぜなが
ら、接種混合物を30℃で336時間培養する。培養
後、混合物をジクロロメタンで抽出する。抽出液
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を真空蒸
留によつて除去する。生ずる残留物を最少量の酢
酸エチル−シクロヘキサン（20：80）中に溶解す
る。この溶液をシリカゲル上のクロマトグラフイ
にかける。アンドロスト−４−エン−３・17−ジ
オン及び少量のアンドロスタ−１・４−ジエン−
３・17−ジオン（約８：１の比）の存在は、薄層
クロマトグラフイによつて示される。これらの化
合物は、酢酸エチル−クロロホルム（15：85）の
溶媒系での溶離によつてシリカゲルから分離され
る。次に化合物は溶媒蒸発とヘキサンからの再結
晶によつて単離される。

参考例 ２ 参考例１でシトステロールの代わりにコレステ
ロールを使用して、主要量のAD及び少量のADD
が得られる。

参考例 ３ 参考例１でシトステロールの代わりにスチグマ
ステロールを使用して、主要量のAD及び少量の
ADDが得られる。

参考例 ４ 参考例１でシトステロールの代わりにカンペス
テロールを使用して、主要量のAD及び少量の
ADDが得られる。

参考例 ５ 参考例１〜４でシトステロールのほかに、又は
シトステロールの代わりにステロイド類の任意の
ものの組合せを加えることによつて、主要量の
AD及び少量のADDが得られる。

参考例 ６ 実施例１でミコバクテリウム・フオルトウイツ
ムATCC6842の代わりにアースロバクター、バチ
ルス、ブレヴイバクテリウム、コリネバクテリウ
ム、ミクロバクテリウム、ノカルデイア、プロト
アミノバクター、セラテイア及びストレプトミセ
スの属からの微生物を使用して、２〜10個の炭素
原子の17−アルキル側鎖をもつステロイドを選択
的に減成し、発酵液中に圧倒的にADを蓄積する
能力によつて特徴づけれる。突然変異株の微生物
が得られる。

参考例 ７ 参考例１〜５でエム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ−11045の代わりに参考例６で得られる突然変
異株を使用して、主要量のADと少量のADDが得
られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 17−アルキル側鎖中に２〜10個の炭素原子を
   含有するステロイドを選択的にアンドロスト−４
   −エン−３・17−ジオンに減成させる能力により
   ミコバクテリウムフオルトウイツムATCC6842と
   区別されることを特徴とする新規突然変異株ミコ
   バクテリウムフオルトウイツムNRRL Ｂ−
   11045。