JPS61205480A - 新規微生物 - Google Patents
新規微生物Info
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- JPS61205480A JPS61205480A JP26953985A JP26953985A JPS61205480A JP S61205480 A JPS61205480 A JP S61205480A JP 26953985 A JP26953985 A JP 26953985A JP 26953985 A JP26953985 A JP 26953985A JP S61205480 A JPS61205480 A JP S61205480A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0003—Androstane derivatives
- C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
微生物によるステロイド類の転化は広く研究され、記録
されてきた。明らかに最初のこのような研究は、１９３
７年のベリヒテ（Ｂｅｒ ） ７Ｑ巻４７０頁と同７０
巻２０７９頁におけるマモリ（ＭａｍＯｌｉ ）及びグ
エルセローネ′λ’５ｒｃｅｌユｏｎｅ ）によるもの
であった。
されてきた。明らかに最初のこのような研究は、１９３
７年のベリヒテ（Ｂｅｒ ） ７Ｑ巻４７０頁と同７０
巻２０７９頁におけるマモリ（ＭａｍＯｌｉ ）及びグ
エルセローネ′λ’５ｒｃｅｌユｏｎｅ ）によるもの
であった。
彼らは＠枡醪闇による１７ニケトステロイドの１７β−
ヒドロキシステロイドへの還元を明らかにした。
ヒドロキシステロイドへの還元を明らかにした。
これ以後にピーターンン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ）及びマ
レ−（Ｍｕｒｒａｙ ）がカビのリゾプス・ニグリカン
ス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｇ ）による
ブロゲＸ ｆ Ｏ７１７）１１α−ヒドロキシル化を明
らかにしている。合衆国特許第２．６０２，７６９号（
１９已２年）を参照。更に最近で１はクレーキー（Ｋｒ
ａｙｃｈ７ ）等が合衆国特許第３．６８４，６５７号
（１９７２年）で、１７−アルキル側鎖中に少なくとも
８個の炭素を含有するステロイドをミコバクテリウム・
スペシーズＮＲＲＬ Ｂ −３６８３Ｋよって発酵させ
てアンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン、アンド
ロスト−１，４−ジエン−３，１７−ジオン、及び加α
−ヒドロキシメチループレグナ−１，４−ジエン−３−
オンをつくるこトニよる、ステロイドの１７−アルキル
の選択的微生物減成を明ら牟にしている。もつと最近で
は、合衆国特許第３．７５９．７９１号（１９７３年）
でマーシェック（Ｍａｒ−ｓｈｅｃｋ ）等が、１７−
アキル側鎖中に少なくとも８個の炭素を含有するコレス
タン又はスチグマスタン系のステロイドを、ミらバクテ
リウム・バカ二（Ｍｙｃｏ’：ａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａ
ｃｃａｅ ）として特徴づけられるミコバクテリウム・
スペシーズＮＲＲＩ、 ！３−３８０５ ｆ発酵させる
ことによる、７ノドロストー４−エン−３，１７−ジオ
ンの通釈的微生物製造を明らかにしている。
レ−（Ｍｕｒｒａｙ ）がカビのリゾプス・ニグリカン
ス（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｇ ）による
ブロゲＸ ｆ Ｏ７１７）１１α−ヒドロキシル化を明
らかにしている。合衆国特許第２．６０２，７６９号（
１９已２年）を参照。更に最近で１はクレーキー（Ｋｒ
ａｙｃｈ７ ）等が合衆国特許第３．６８４，６５７号
（１９７２年）で、１７−アルキル側鎖中に少なくとも
８個の炭素を含有するステロイドをミコバクテリウム・
スペシーズＮＲＲＬ Ｂ −３６８３Ｋよって発酵させ
てアンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン、アンド
ロスト−１，４−ジエン−３，１７−ジオン、及び加α
−ヒドロキシメチループレグナ−１，４−ジエン−３−
オンをつくるこトニよる、ステロイドの１７−アルキル
の選択的微生物減成を明ら牟にしている。もつと最近で
は、合衆国特許第３．７５９．７９１号（１９７３年）
でマーシェック（Ｍａｒ−ｓｈｅｃｋ ）等が、１７−
アキル側鎖中に少なくとも８個の炭素を含有するコレス
タン又はスチグマスタン系のステロイドを、ミらバクテ
リウム・バカ二（Ｍｙｃｏ’：ａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａ
ｃｃａｅ ）として特徴づけられるミコバクテリウム・
スペシーズＮＲＲＩ、 ！３−３８０５ ｆ発酵させる
ことによる、７ノドロストー４−エン−３，１７−ジオ
ンの通釈的微生物製造を明らかにしている。
本発明は２〜１０個の炭素原子の１７−アルシル僻＃ｊ
ｌ ｔ−もつステロイド類を選択的に減成させ発酵液中
ニアエンロスト−４−工ン−３ｖ １７ ＝ジオン（以
下ＡＤと称する）を蓄積する能力によって特徴づけられ
る突然変異株に関する。この突然変異株は、本明細書で
明らかにされた突然変異手順又はその他の突然変異手順
を使用してミコバクテリウヘ属リイや友ｚ物力・ら イ
稈 Ｉ；ｉて る。
ｌ ｔ−もつステロイド類を選択的に減成させ発酵液中
ニアエンロスト−４−工ン−３ｖ １７ ＝ジオン（以
下ＡＤと称する）を蓄積する能力によって特徴づけられ
る突然変異株に関する。この突然変異株は、本明細書で
明らかにされた突然変異手順又はその他の突然変異手順
を使用してミコバクテリウヘ属リイや友ｚ物力・ら イ
稈 Ｉ；ｉて る。
本明細書中に特定的に例示されているわのステロイド類
をＡＤへ選択的に減成させるのに用いられる新規な突然
変異株の微生物ミコバクテリウム・フォルドウイア Ａ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ
）、ＮＲＲＩ、 Ｂ−１１０４５である。適当なステ
ロイド基質の例ハシトスチロール、；レステａ−ル、ス
チグマステロール、カンペステロール等、２〜１０個の
炭素原子の１７−アルキル側御をもつステロイド類であ
る。これらのステロ、イド基質は純粋な形又は粗製型で
ありうる。
をＡＤへ選択的に減成させるのに用いられる新規な突然
変異株の微生物ミコバクテリウム・フォルドウイア Ａ
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ
）、ＮＲＲＩ、 Ｂ−１１０４５である。適当なステ
ロイド基質の例ハシトスチロール、；レステａ−ル、ス
チグマステロール、カンペステロール等、２〜１０個の
炭素原子の１７−アルキル側御をもつステロイド類であ
る。これらのステロ、イド基質は純粋な形又は粗製型で
ありうる。
微生物
２〜１０個の炭素原子の１７−アルキル側鎖をもつステ
ロイド類を選択的に減成し発酵液中にＡＤｔ−蓄ＡＴＣ
Ｃ６ｇ４２を本明細書で明らかにされたと１？、９に突
然変異させると、新規実験呈的突然変異株の微生物を生
ずる。
ロイド類を選択的に減成し発酵液中にＡＤｔ−蓄ＡＴＣ
Ｃ６ｇ４２を本明細書で明らかにされたと１？、９に突
然変異させると、新規実験呈的突然変異株の微生物を生
ずる。
１９７４ 年ｆ ｊｋＴｃｃ カタａ ／はＡＴＣＣ６
８４２の掲載のほか次のものを明らかにしている。「ジ
ェー・シー・クルス（Ｊ、 Ｃ，Ｃｒｕｘ ）、２．
寒ａｍ瘍、ＡｃｔａＭｅｄ、 Ｒｌｏ ｄｅ Ｊａｎｅ
ｉｒｏ １巻１頁（１９３６年）。培地９０ ３７Ｃ
Ｊ。エム・フォルトライツムＡＴＣＣ，６８４２はステ
ロールを小分子量の化合物、例えばＣＯ２＋Ｈ２０へ非
選択的に分解する。このためこの微生物は選択的ステロ
イド減成微生物として適してい々い。
８４２の掲載のほか次のものを明らかにしている。「ジ
ェー・シー・クルス（Ｊ、 Ｃ，Ｃｒｕｘ ）、２．
寒ａｍ瘍、ＡｃｔａＭｅｄ、 Ｒｌｏ ｄｅ Ｊａｎｅ
ｉｒｏ １巻１頁（１９３６年）。培地９０ ３７Ｃ
Ｊ。エム・フォルトライツムＡＴＣＣ，６８４２はステ
ロールを小分子量の化合物、例えばＣＯ２＋Ｈ２０へ非
選択的に分解する。このためこの微生物は選択的ステロ
イド減成微生物として適してい々い。
ニトロソグアニジンを使用するエム・７オルトウイツム
ＡＴＣＣ６８４２の突然変異化は、２〜１０個の炭素原
子の１７−アルキル備鎖をもつステロイド類を選択的に
減成してＡＤをつくるような新規突然変異株の生成をも
たらす。この突然変異株の微生物は、これが永久収集物
として寄託されている合衆国イリノイ州ビオリアの合衆
国農務省北部地域研死所で、受入れ番号ＮＲＲ］１．＋
Ｂ’ −１１０４５を与えられた。
ＡＴＣＣ６８４２の突然変異化は、２〜１０個の炭素原
子の１７−アルキル備鎖をもつステロイド類を選択的に
減成してＡＤをつくるような新規突然変異株の生成をも
たらす。この突然変異株の微生物は、これが永久収集物
として寄託されている合衆国イリノイ州ビオリアの合衆
国農務省北部地域研死所で、受入れ番号ＮＲＲ］１．＋
Ｂ’ −１１０４５を与えられた。
この微生物１’Ｌ二次培養基は、こ＼に要求すればこの
寄託機関から自由に入手できる。この培養基を入手でき
ることが、政府決定により題目付証書を以って授与され
た特許権を損じて本発明を実施できるというライセンス
を構成するものではないこ託されている。本願が特許出
願公告された後では同所よシ自由に分譲を受けることが
できる。゛本発明の微生物は、上忙論じられている合衆
国特許第３，７５９，７９１号で明らかにされたミコバ
クテリウム・スペシーズＮＲＲＬ Ｂ−３８０５から区
別された。
寄託機関から自由に入手できる。この培養基を入手でき
ることが、政府決定により題目付証書を以って授与され
た特許権を損じて本発明を実施できるというライセンス
を構成するものではないこ託されている。本願が特許出
願公告された後では同所よシ自由に分譲を受けることが
できる。゛本発明の微生物は、上忙論じられている合衆
国特許第３，７５９，７９１号で明らかにされたミコバ
クテリウム・スペシーズＮＲＲＬ Ｂ−３８０５から区
別された。
ＮＲＲＬＢ−３８０５はミコバクテリウム・バヵ二の全
般的特徴をもっておシ、これは本発明のエム・フォルト
ライツムとははつ＠シと異なっている。これらＤ微生物
の比較についてはパーギー（Ｂｅｒｇｅｙ ）のマニア
ルオプデタミネテプベクテリオロジイ（Ｍａｎｕａユ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ ） ｆ。
般的特徴をもっておシ、これは本発明のエム・フォルト
ライツムとははつ＠シと異なっている。これらＤ微生物
の比較についてはパーギー（Ｂｅｒｇｅｙ ）のマニア
ルオプデタミネテプベクテリオロジイ（Ｍａｎｕａユ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ ） ｆ。
８版、ウィリアムス・アンド・ウィルキンス社（１９７
４年）の６９５〜６頁を参照のこと。
４年）の６９５〜６頁を参照のこと。
エム・７オルｉウィッムＮＲＲＬＢ−１１０４５Ｄ形Ｍ
及び薬剤感受性は、親株エム・フォルトライツムＡＴＣ
Ｃ６８４２Ｏそれらとは区別できない。エム・フォルト
ライツムはアクチノマイ七タレス（ＡＣｔｉｎＯ−ｍ７
ＱｅｔｔＬユｅａ ）目のミコバクテリアセアエ（Ｍン
ｃｏ−ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）族に属する抗酸性
、非自動性、胞ｉ→←ヱｌ −シム 、七ｔ 填■ 、
−ｍ ｊ ＋ −＋ 、
−５、＋−＋ −Ｊ Ｈ１１９５９，Ｍｅｄ、Ｃ１１ｎ
、 Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ４３巻２７３頁）に
よると、エム・フォルトライツムは非色素生産性群■の
ミコバクテリウムである。すなわち比較的簡単な培地上
で低温で急速に生育し、色素を含まない集落をつくる。
及び薬剤感受性は、親株エム・フォルトライツムＡＴＣ
Ｃ６８４２Ｏそれらとは区別できない。エム・フォルト
ライツムはアクチノマイ七タレス（ＡＣｔｉｎＯ−ｍ７
ＱｅｔｔＬユｅａ ）目のミコバクテリアセアエ（Ｍン
ｃｏ−ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ）族に属する抗酸性
、非自動性、胞ｉ→←ヱｌ −シム 、七ｔ 填■ 、
−ｍ ｊ ＋ −＋ 、
−５、＋−＋ −Ｊ Ｈ１１９５９，Ｍｅｄ、Ｃ１１ｎ
、 Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ４３巻２７３頁）に
よると、エム・フォルトライツムは非色素生産性群■の
ミコバクテリウムである。すなわち比較的簡単な培地上
で低温で急速に生育し、色素を含まない集落をつくる。
エム・フォルトライツムＡＴＣＣ６８４２とエム・フォ
ルトライツムＮＲＲＬ Ｂ −１１０４５は、ステロイ
ド分子への作用において明瞭に区別できる。上に明らか
にされたように、エム・フォルトライツムＡＴＣＣ６８
４２はステロイドの非選択的減成微生物であるが、一方
エム・フォルトライツムＮＲＲＬＢ−１１０４５ハ選択
的減成微生物である。エム・フォルトライツムＮＲＲＬ
Ｂ−１１０４５のこの性質ｉｄ、本明細書で明らかに
されてｂるどおシこれを非常に有用なものとする０ エム・フォルトライツムＡＴＣＣ６８４２を突然変異化
して突然変異株を与え、次にこれを再び突然変異すせて
エム・フォルトライツムＮＲＲＴ、＋ Ｂ−１１’０４
５を得ることは、ニトロソグアニジン使用にょシ達成さ
れた。手順の詳細は下に記載されている。本明細書で明
らかにされた突然変異及び転化手順がミコバクテリウム
について詳細に述べであるが、本明細書で明らかにされ
ているように他の属の微生物によっても類似の又は同等
な手順が使用できることは理解されるべきである。
ルトライツムＮＲＲＬ Ｂ −１１０４５は、ステロイ
ド分子への作用において明瞭に区別できる。上に明らか
にされたように、エム・フォルトライツムＡＴＣＣ６８
４２はステロイドの非選択的減成微生物であるが、一方
エム・フォルトライツムＮＲＲＬＢ−１１０４５ハ選択
的減成微生物である。エム・フォルトライツムＮＲＲＬ
Ｂ−１１０４５のこの性質ｉｄ、本明細書で明らかに
されてｂるどおシこれを非常に有用なものとする０ エム・フォルトライツムＡＴＣＣ６８４２を突然変異化
して突然変異株を与え、次にこれを再び突然変異すせて
エム・フォルトライツムＮＲＲＴ、＋ Ｂ−１１’０４
５を得ることは、ニトロソグアニジン使用にょシ達成さ
れた。手順の詳細は下に記載されている。本明細書で明
らかにされた突然変異及び転化手順がミコバクテリウム
について詳細に述べであるが、本明細書で明らかにされ
ているように他の属の微生物によっても類似の又は同等
な手順が使用できることは理解されるべきである。
転化方法
本発明の選択的転化は、培養期中に培養基へ選ばれたス
テロイド基質を加えるか、又は接種に先立って栄養瑠地
中へこれを取入れることによって、エム・フォルトライ
ツムＮＲＲＬ Ｂ−１１０４５の生育培養基中で実施で
きる。ステロイドは単独で又は他のステロイドと組合わ
せて加えることができる。
テロイド基質を加えるか、又は接種に先立って栄養瑠地
中へこれを取入れることによって、エム・フォルトライ
ツムＮＲＲＬ Ｂ−１１０４５の生育培養基中で実施で
きる。ステロイドは単独で又は他のステロイドと組合わ
せて加えることができる。
培養基中のステロイドの好″ましいが限定的でない濃度
範囲は、リットル当シ約０．１ないし約１００２である
。培養基を炭素源、例えば同化できる炭水化物及び窒素
源、例えば同化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有
する栄養培地中で生育させる。
範囲は、リットル当シ約０．１ないし約１００２である
。培養基を炭素源、例えば同化できる炭水化物及び窒素
源、例えば同化できる窒素化合物又は蛋白質材料を含有
する栄養培地中で生育させる。
好ましい炭素源はブドウ糖、黒砂糖、蔗糖、゛グリセロ
ール、殿粉、トウモロコシ殿粉、乳糖、デキストリン、
糖蜜等を包含する。好ましい窒素源は己分解醸造酵母、
大豆粉、綿実粉、コーンミール、固型孔、カゼインの幹
液消化物、魚粉、デイスチラーズソリツＰ、動物滅プト
ン液、肉と骨の砕片、アンモニウム塩類等を包含する。
ール、殿粉、トウモロコシ殿粉、乳糖、デキストリン、
糖蜜等を包含する。好ましい窒素源は己分解醸造酵母、
大豆粉、綿実粉、コーンミール、固型孔、カゼインの幹
液消化物、魚粉、デイスチラーズソリツＰ、動物滅プト
ン液、肉と骨の砕片、アンモニウム塩類等を包含する。
これらの炭素及び窒素源の組合わせを使用するのが有利
である。
である。
痕跡量の金属例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、コ
バルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。というの
は、培地の滅菌前に培地成分として水道水及び未精製の
成分を用いるからである。
バルト、鉄等は発酵培地に加える必要がない。というの
は、培地の滅菌前に培地成分として水道水及び未精製の
成分を用いるからである。
転化方法は約７２時間ないし１５日又はそれ以上の範囲
になりうる。培養温度は約５°Ｃないし約３７°Ｃの範
囲でありうるが、ＮＲＲＬ Ｂ −１１０４５に対して
はＩｏＣが好ましい。微生物の生育を促進し、こうして
転化方法の有効性を高めるため、内容物に滅菌された空
気を通じ、曝気させる。
になりうる。培養温度は約５°Ｃないし約３７°Ｃの範
囲でありうるが、ＮＲＲＬ Ｂ −１１０４５に対して
はＩｏＣが好ましい。微生物の生育を促進し、こうして
転化方法の有効性を高めるため、内容物に滅菌された空
気を通じ、曝気させる。
シリカゲル板（イー・メルク、ダルムシュタット）及び
２：３容量比の酢酸エチル−シクロヘキサンからなる溶
媒系ｆ：ｆ！用する薄層クロマトグラフィで立証される
とおりに転化方法の終了時に、望んでいる転化ステロイ
ドはこの技術に周知の手段によって回収される。例えば
発酵液と菌体を含めた発酵（転化）反応混合物を、ステ
、ロイド用の水と混ざらない有機溶媒で抽出液る。適当
な溶媒はジクロロメタン（好ましい）、塩化メチレン、
りｒ２０ホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、トリクロ
ロエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベンゼン等である
。
２：３容量比の酢酸エチル−シクロヘキサンからなる溶
媒系ｆ：ｆ！用する薄層クロマトグラフィで立証される
とおりに転化方法の終了時に、望んでいる転化ステロイ
ドはこの技術に周知の手段によって回収される。例えば
発酵液と菌体を含めた発酵（転化）反応混合物を、ステ
、ロイド用の水と混ざらない有機溶媒で抽出液る。適当
な溶媒はジクロロメタン（好ましい）、塩化メチレン、
りｒ２０ホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、トリクロ
ロエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベンゼン等である
。
その代わシに、発酵液と菌体をまず慣用方法、例えばろ
過又は遠心分離によって分離し、次いで別々に適当な溶
媒で抽出する。菌体を水と混ざる溶媒又は水と混ざらな
い溶媒で抽出できる。菌体を含まない発酵液を水と混ざ
らない溶媒で抽出できる。
過又は遠心分離によって分離し、次いで別々に適当な溶
媒で抽出する。菌体を水と混ざる溶媒又は水と混ざらな
い溶媒で抽出できる。菌体を含まない発酵液を水と混ざ
らない溶媒で抽出できる。
抽出液を珪藻土に通してろ過し、ろ液を乾固するまで真
空蒸留する。望んでいる転化ステロイ゛ドを含有する生
じた残留物を最少量の酢酸エチル−シクロヘキサン（２
０：８０）に溶解できる。この溶液をシリカゲル上のク
ロマトグラフィにかけるこトカできる。ＡＤは゛酢酸エ
チルークロロホルム（１５：８５）の溶媒系での溶離に
よってシリカゲルから分離できる。次に溶媒蒸発とへキ
サンからの再結晶によって化合物を別個の物として単離
できる。
空蒸留する。望んでいる転化ステロイ゛ドを含有する生
じた残留物を最少量の酢酸エチル−シクロヘキサン（２
０：８０）に溶解できる。この溶液をシリカゲル上のク
ロマトグラフィにかけるこトカできる。ＡＤは゛酢酸エ
チルークロロホルム（１５：８５）の溶媒系での溶離に
よってシリカゲルから分離できる。次に溶媒蒸発とへキ
サンからの再結晶によって化合物を別個の物として単離
できる。
本発明の転化方法の望んでいる生成物は、既知のステロ
イド中間体ＡＤである。この化合物は有用なステロイド
ホルモンの合成における中間体として有用である。例え
ばＡＤは、合衆国特許第２．１４３，４５３号、第２，
２５３，７９８号、第２，２６４，８８８号及び第２．
３５６．１５４号で明らかにされた方法に従ってテスト
ステロンをつくるのに使用できる。
イド中間体ＡＤである。この化合物は有用なステロイド
ホルモンの合成における中間体として有用である。例え
ばＡＤは、合衆国特許第２．１４３，４５３号、第２，
２５３，７９８号、第２，２６４，８８８号及び第２．
３５６．１５４号で明らかにされた方法に従ってテスト
ステロンをつくるのに使用できる。
以下の実施例は本発明方法と生成物の例示であるが、限
定的に考えられてはならない。他に注意がなければ、百
分率はすべて重量によシ、また溶媒混合物の開傘はすべ
て容量による。
定的に考えられてはならない。他に注意がなければ、百
分率はすべて重量によシ、また溶媒混合物の開傘はすべ
て容量による。
実施例１ エム・フォルトライツムＡＴＣＣ６８４２
からの突然変異株エム・フォルトラ イツムＮＲＩ’ｌＩ＋ Ｂ−１１０４５の調製エム・フ
ォルトライツムＡＴＣＣ６８４２の菌体をあ℃で次の無
菌的種菌培地中で生育させる。
からの突然変異株エム・フォルトラ イツムＮＲＩ’ｌＩ＋ Ｂ−１１０４５の調製エム・フ
ォルトライツムＡＴＣＣ６８４２の菌体をあ℃で次の無
菌的種菌培地中で生育させる。
栄養培養液（ディフコ） Ｂｙ／を酵母液
ｘｔ７ｔ グリセロール ５１／を蒸 留 水
１ｔとするに十分な量ｌ Ｎ ＮａＯＨ
でｐＨを７．０に調整してから１２１℃で四分滅菌する
。
ｘｔ７ｔ グリセロール ５１／を蒸 留 水
１ｔとするに十分な量ｌ Ｎ ＮａＯＨ
でｐＨを７．０に調整してから１２１℃で四分滅菌する
。
菌体をｄ当シ約５ Ｘ １０Ｂのｉ度まで生育させ、遠
心分離によってペレット化し、次に同じａｔの無菌的な
０．１ Ｍ （えん酸ナトリウム（１）Ｈ５，６）で洗
う。
心分離によってペレット化し、次に同じａｔの無菌的な
０．１ Ｍ （えん酸ナトリウム（１）Ｈ５，６）で洗
う。
洗った嶽体を酌量のくえん酸緩衝液中に再懸濁し、試料
を滴定（菌体計数）のために終？、二）ロノグアニジン
を艶μｆ ／ｍｌの最終゛濃度まで添加する。
を滴定（菌体計数）のために終？、二）ロノグアニジン
を艶μｆ ／ｍｌの最終゛濃度まで添加する。
忌体懸濁液を３７℃の水浴中で妬分培養し、このあと試
料を滴定用に、再び疎さ、残シを遠心分離にかけ、同会
量の無菌的０．１Ｍ燐酸カリウム（ｐＨ７，０）で洗う
。最後に菌体を次のものからなるが炭素源を含まない無
菌的種菌培地中に再懸濁する。
料を滴定用に、再び疎さ、残シを遠心分離にかけ、同会
量の無菌的０．１Ｍ燐酸カリウム（ｐＨ７，０）で洗う
。最後に菌体を次のものからなるが炭素源を含まない無
菌的種菌培地中に再懸濁する。
ＮＨ４ＮＯ３１、０ｆ ／ １
ＫｇＨＰＯ４０、２５ｆ ／ Ｌ
ＭｇＳＯ，−７Ｂ４０ ０．２５ ｆ／１ＮａＣ
４０，００５ｆ／Ｌ ＦｅＥＩＯ，−７Ｅ、ＯＯ，００１ｆ／Ｌ蒸 留 水
ＩＬとする量 ｌ Ｎ ＢＣＬでｐＨを７．０に調整してから１２１℃
で四分滅菌する。次に菌体をプレート上に播いて突然変
異株を選定する。
４０，００５ｆ／Ｌ ＦｅＥＩＯ，−７Ｅ、ＯＯ，００１ｆ／Ｌ蒸 留 水
ＩＬとする量 ｌ Ｎ ＢＣＬでｐＨを７．０に調整してから１２１℃
で四分滅菌する。次に菌体をプレート上に播いて突然変
異株を選定する。
（′ｂ）選定と単離
上記のように突然変異を起し１体を希釈し、以下からな
る培地（フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ ）及びジエレル（
Ｊｅｒｔｅｌ ）、１９６３年、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、 ２０５巻２９１〜２９５頁から変性）を含有す
るプレート上に広げる。
る培地（フレーザー（Ｆｒａｓｅｒ ）及びジエレル（
Ｊｅｒｔｅｌ ）、１９６３年、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、 ２０５巻２９１〜２９５頁から変性）を含有す
るプレート上に広げる。
グリセロール １０゜’ｏ ｔ７ｔＫ２ＨＰ０．
０．５ ｆ／ＬＮＨ４ＣＬ１．Ｏｆ／１ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，５ｆ／ Ｌ ＦｅＣＬ３−６Ｈ，Ｏｏ、ｏｓ ｆ／Ｌ蒸 留
水 ＩＬとする量寒天（１５ｔ／ｌ ”）を加
え、培地を１２１℃で加分オートクレーブにかけ、次い
で無菌的なペトリ皿に注ぐ。
０．５ ｆ／ＬＮＨ４ＣＬ１．Ｏｆ／１ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，５ｆ／ Ｌ ＦｅＣＬ３−６Ｈ，Ｏｏ、ｏｓ ｆ／Ｌ蒸 留
水 ＩＬとする量寒天（１５ｔ／ｌ ”）を加
え、培地を１２１℃で加分オートクレーブにかけ、次い
で無菌的なペトリ皿に注ぐ。
この培地上の生育は、突然変異発生手順によってつくら
れる大抵の栄養的自家栄養体を排除する。
れる大抵の栄養的自家栄養体を排除する。
例えば化学的に定義された培地上で生育するためにビタ
ミン類、生長因子等を必要とするような培養基は排除さ
れる。２８℃で約７日培養後、生ずる集落を突然変異株
の選定に適した試験プレートへ複製し、次いでグリセロ
ールを基盤とする培地を含む対照プレートへ逆複製する
。試験プレートはピーターンｙ−ジー・イー（Ｐｅｔｅ
ｒｓｏｎ、 Ｇｊｌ：、 ）、エッチ・エル・ルイス（
ＨｏＬ、Ｌｅｗｉａ ） 及ヒシエー・アール・デービ
ス（Ｊ、Ｒ，Ｄａｖｉｓ ）、１９６２年、「コレステ
ロール及びその他の水に不溶の炭素源の寒天培地中にお
ゆる均一分散液の調製Ｊ 、７． Ｌｉｐｉ４Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ３巻２７５〜２７６頁に記載のとおシにつく
られる。これらのプレート中の最少塩培地は実施例１の
（ａ）部で述べたとおシである。寒天（１５ｆ／ｌ）及
びシトステロール又はアンドロステンジ牙ン（ＡＤ）の
ような適当な炭素源（１，Ｏｆ／ｌ ）を加え、生ずる
懇濁液を１２１℃で加分オートクレーブにかける。無菌
の熱した混合物を無菌のプレンダー容器に注ぎ、数分間
配合し、次に無菌のベトＵ、皿に注ぐ。この手順で発泡
が問題になシがちであるが、これは混合物が熱い時に配
合することと溶融寒天プレート表面に焔をあてることに
よって減少できる。このやシ方で水に不溶な炭素源の均
一分散液が得られ、非常に均質であるが不透明の寒天プ
レートの調製が容易となる。
ミン類、生長因子等を必要とするような培養基は排除さ
れる。２８℃で約７日培養後、生ずる集落を突然変異株
の選定に適した試験プレートへ複製し、次いでグリセロ
ールを基盤とする培地を含む対照プレートへ逆複製する
。試験プレートはピーターンｙ−ジー・イー（Ｐｅｔｅ
ｒｓｏｎ、 Ｇｊｌ：、 ）、エッチ・エル・ルイス（
ＨｏＬ、Ｌｅｗｉａ ） 及ヒシエー・アール・デービ
ス（Ｊ、Ｒ，Ｄａｖｉｓ ）、１９６２年、「コレステ
ロール及びその他の水に不溶の炭素源の寒天培地中にお
ゆる均一分散液の調製Ｊ 、７． Ｌｉｐｉ４Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ３巻２７５〜２７６頁に記載のとおシにつく
られる。これらのプレート中の最少塩培地は実施例１の
（ａ）部で述べたとおシである。寒天（１５ｆ／ｌ）及
びシトステロール又はアンドロステンジ牙ン（ＡＤ）の
ような適当な炭素源（１，Ｏｆ／ｌ ）を加え、生ずる
懇濁液を１２１℃で加分オートクレーブにかける。無菌
の熱した混合物を無菌のプレンダー容器に注ぎ、数分間
配合し、次に無菌のベトＵ、皿に注ぐ。この手順で発泡
が問題になシがちであるが、これは混合物が熱い時に配
合することと溶融寒天プレート表面に焔をあてることに
よって減少できる。このやシ方で水に不溶な炭素源の均
一分散液が得られ、非常に均質であるが不透明の寒天プ
レートの調製が容易となる。
対照プレート上に生育するがＡＤを鴎−■炭素源培地上
の画線接種によって精製する。２８℃で生育後、個々の
クロンを無菌的なつまようじで栄養寒天プレートから、
取゛シ上げ、ＡＤを炭素源として含有するグリデッドプ
レートに接種することＫよシ再試験する。栽培養基とは
異なる表現型をまた現わしている精製された単離物を振
とうフラスコ中で評価する。
の画線接種によって精製する。２８℃で生育後、個々の
クロンを無菌的なつまようじで栄養寒天プレートから、
取゛シ上げ、ＡＤを炭素源として含有するグリデッドプ
レートに接種することＫよシ再試験する。栽培養基とは
異なる表現型をまた現わしている精製された単離物を振
とうフラスコ中で評価する。
（Ｃ） 振とうフラスコによる評価
振とりフラスコ（５００＋ｄ ）は次の成分からなる生
物転化培地１００ ｍｌを含有する。
物転化培地１００ ｍｌを含有する。
グリセロール ｉｏ、ｏ ｙ７ｔＫ２ＨＰ０．
０．５ ｆ／ＬＮ曳ＣＬ
１．Ｏ１７１Ｍｇ８０．−７Ｈ２０ｏ、、ｉ ｙ
／１ＦｅＣｔ３−５）ｉ、ｏ ｏ、ｏｓ り／
を蒸 留 水 １ｔとする量 大豆粉（１？／Ｌ ）を培地に配合し、次にシトステロ
ール（１０９／Ｌ ）も培地に配合する。フラスコを１
２１℃で□□□分オ、−トクレープにかけてから、四℃
に冷却し、次に以下のとおりにつくられる種菌生育物１
０ｍ１を接種する。
０．５ ｆ／ＬＮ曳ＣＬ
１．Ｏ１７１Ｍｇ８０．−７Ｈ２０ｏ、、ｉ ｙ
／１ＦｅＣｔ３−５）ｉ、ｏ ｏ、ｏｓ り／
を蒸 留 水 １ｔとする量 大豆粉（１？／Ｌ ）を培地に配合し、次にシトステロ
ール（１０９／Ｌ ）も培地に配合する。フラスコを１
２１℃で□□□分オ、−トクレープにかけてから、四℃
に冷却し、次に以下のとおりにつくられる種菌生育物１
０ｍ１を接種する。
（１））部からの精製された単離物を３℃で寒天斜面培
地上に生胃寛せる。斜面培地から取った菌体ひとすくい
を使用して、次の成分からなる無菌的種菌培地１００Ｗ
ｔを含有する５００コフラスコに接種す酵母エキス
１． ｆ／ｌ グリセロール ５９／Ｌ 蒸 留 水 ＩＬとする量１ Ｎ ＮａＯ
ＨでｐＨを７．０に調整してから、フラスコを１２１℃
で加分オートクレーブにかける。一種菌フラスコを２８
’Ｃで７２時間培養する。
地上に生胃寛せる。斜面培地から取った菌体ひとすくい
を使用して、次の成分からなる無菌的種菌培地１００Ｗ
ｔを含有する５００コフラスコに接種す酵母エキス
１． ｆ／ｌ グリセロール ５９／Ｌ 蒸 留 水 ＩＬとする量１ Ｎ ＮａＯ
ＨでｐＨを７．０に調整してから、フラスコを１２１℃
で加分オートクレーブにかける。一種菌フラスコを２８
’Ｃで７２時間培養する。
上に明らかにされたように、種菌生育物１０−を使用し
て、無菌の転化培地１００−を含有する各々の５００−
フラスコを接種する。フラスコを回転振とう機上で２８
°〜３０Ｃで培養し、種々の間隔で試料採取を行なう。
て、無菌の転化培地１００−を含有する各々の５００−
フラスコを接種する。フラスコを回転振とう機上で２８
°〜３０Ｃで培養し、種々の間隔で試料採取を行なう。
１０＃＋７！の試料を取シ出し、３＠ｌの塩化メチレン
と一緒に振とうして抽出する。抽出液の少量ずつを、シ
リカゲル及び上記溶媒系すなわち２：３容量比の酢酸エ
チル−シクロヘキサン使用の薄層クロマトグラフィ、及
び気液クロマトグラフィによって分析する５ ＡＤＤ及
び少量のＡＤが存在する証拠によ）、親のエム・フォル
トライツムＡＴＣＣ６８４２からつくられる突然変異株
によるシトステロールの選択的減成が確認される。
と一緒に振とうして抽出する。抽出液の少量ずつを、シ
リカゲル及び上記溶媒系すなわち２：３容量比の酢酸エ
チル−シクロヘキサン使用の薄層クロマトグラフィ、及
び気液クロマトグラフィによって分析する５ ＡＤＤ及
び少量のＡＤが存在する証拠によ）、親のエム・フォル
トライツムＡＴＣＣ６８４２からつくられる突然変異株
によるシトステロールの選択的減成が確認される。
ＡＤを含有する寒天プレート上で非常に緩慢に生育する
上の突然変異株を、上に明らかにされた突然変異手順に
かけると、突然変異化された菌体を生ずる。これらの菌
体を上記の（ｂ）及び（Ｃ）部の手順にかけると、ＡＤ
及び少量のＡＤＤを製造できる新規突然変異株ミコバク
テリウム・フォルトライツムＮＲＲＬ Ｂ −１１０４
５を生ずる。
上の突然変異株を、上に明らかにされた突然変異手順に
かけると、突然変異化された菌体を生ずる。これらの菌
体を上記の（ｂ）及び（Ｃ）部の手順にかけると、ＡＤ
及び少量のＡＤＤを製造できる新規突然変異株ミコバク
テリウム・フォルトライツムＮＲＲＬ Ｂ −１１０４
５を生ずる。
−整ＪＬ製」１ シトステロールのＡＤへの転化使
用培地は実施例１（Ｃ）と同じである。この培地は、１
２１℃で加分オートクレーブにかけることによって滅菌
され、次にこれを３００に冷却してから、実施例１ （
Ｃりで述べたとおシにつくられる突然変異株ミコバクテ
リウムのエム・フォルトライツムＮＲＲＬ Ｂ −１１
０４５の種菌培養基１０部を接種する。水面下の生育を
促進するため゛かきまぜながら、接種混合物を（資）℃
で３３６時間培養する。培養後、混合物をジクロロメタ
ンで抽出子る。抽出液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し
、溶媒を真空蒸留に二って除去する。生ずる残留物を最
少量の酢酸エチル−シクロヘキサン（２０： ８０ ）
中に溶解する。この溶液をシリカゲル上のクロマトグラ
フィにかける。
用培地は実施例１（Ｃ）と同じである。この培地は、１
２１℃で加分オートクレーブにかけることによって滅菌
され、次にこれを３００に冷却してから、実施例１ （
Ｃりで述べたとおシにつくられる突然変異株ミコバクテ
リウムのエム・フォルトライツムＮＲＲＬ Ｂ −１１
０４５の種菌培養基１０部を接種する。水面下の生育を
促進するため゛かきまぜながら、接種混合物を（資）℃
で３３６時間培養する。培養後、混合物をジクロロメタ
ンで抽出子る。抽出液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し
、溶媒を真空蒸留に二って除去する。生ずる残留物を最
少量の酢酸エチル−シクロヘキサン（２０： ８０ ）
中に溶解する。この溶液をシリカゲル上のクロマトグラ
フィにかける。
アンドロスト−４−エン−３，１７−シオン及ヒ少量の
アンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−シオン（約
８＝１の比）の存在は、薄層クロマトグラフィによって
示される。これらの化合物は、酢酸エチル−クロロホル
ム（１５： ８５ ）の溶媒系での溶離によってシリカ
ゲルから分離される。次に化合物は溶媒蒸発とへキサン
からの再結晶によって単離される。
アンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−シオン（約
８＝１の比）の存在は、薄層クロマトグラフィによって
示される。これらの化合物は、酢酸エチル−クロロホル
ム（１５： ８５ ）の溶媒系での溶離によってシリカ
ゲルから分離される。次に化合物は溶媒蒸発とへキサン
からの再結晶によって単離される。
３ユｊス
参名例１でシトステロールの代わりにコレステロールを
使用して、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが得られる。
使用して、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが得られる。
祭考例３
竪愚例１でシトステロ−ルの代わシにスチグマステロー
ルを使用して、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが得られ
る。
ルを使用して、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが得られ
る。
Ｊｆ口１土
命考例１でシトステロールの代わシにカンペステロール
を使用して、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが得られる
。 。
を使用して、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが得られる
。 。
３３！！
滲考例１〜令でシトステロールのほかに、又はシトステ
ロールの代わりにステロイド類の任意のものの組合せを
加えることによって、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが
得られる。
ロールの代わりにステロイド類の任意のものの組合せを
加えることによって、主要量のＡＤ及び少量のＡＤＤが
得られる。
皇１１Ｊ
笑施例１でミコバクテリウム・フォルトライツムＡＴＣ
Ｃ６８４２の代わシに′アースロバフタ−、バチルス、
プレヴイバクテリウム、コリネバクテリウム、ミクロバ
クテリウム、ノカルディア、プロトアミノバクター、セ
ラティア及びストレプトミセスの属からの微生物を使用
して、２〜１０個の炭素厘子の１７−アルキル側鎖をも
つステロイドを選択的に減成し、発酵液中に圧倒的にＡ
Ｄを蓄積する能力によって特徴づけれる１突然変異株の
微生物が得られる。
Ｃ６８４２の代わシに′アースロバフタ−、バチルス、
プレヴイバクテリウム、コリネバクテリウム、ミクロバ
クテリウム、ノカルディア、プロトアミノバクター、セ
ラティア及びストレプトミセスの属からの微生物を使用
して、２〜１０個の炭素厘子の１７−アルキル側鎖をも
つステロイドを選択的に減成し、発酵液中に圧倒的にＡ
Ｄを蓄積する能力によって特徴づけれる１突然変異株の
微生物が得られる。
ｊＡｊニ
ヤ考例１〜５でエム・フォルトライツムＮＲＲＬＢ −
１１０４５の代わシに１例６で得られる呉然変異株を使
用して、主要量（ＤＡＤと少量のＡＤＤが得られる。
１１０４５の代わシに１例６で得られる呉然変異株を使
用して、主要量（ＤＡＤと少量のＡＤＤが得られる。
手続補正書（方灼
１ 事件の表示 昭和６０年特許願１
！２６９５３９号３ 補正をする者 事件との関係 特許出願大 佐 所 アメリカ合衆国 ミシガン州 力ラマズ
ー ヘンリエツタ ストリート ３０１ 氏名（名称） ジ アップジョン カンパニー４代理人 住 所 東京都新宿区新宿２丁目 ８番１号セブン
ビル３０３号６ 補正により増加する発明の数
増加せず７ 補正の対象 明繕書（９頁）Δ・
−′・、。
！２６９５３９号３ 補正をする者 事件との関係 特許出願大 佐 所 アメリカ合衆国 ミシガン州 力ラマズ
ー ヘンリエツタ ストリート ３０１ 氏名（名称） ジ アップジョン カンパニー４代理人 住 所 東京都新宿区新宿２丁目 ８番１号セブン
ビル３０３号６ 補正により増加する発明の数
増加せず７ 補正の対象 明繕書（９頁）Δ・
−′・、。
Claims (1)
- １７−アルキル側鎖中に２〜１０個の炭素原子を含有す
るステロイドを選択的にアンドロスト−４−エン−３，
１７−ジオンに減成させる能力によりミコバクテリウム
フオルトウイツムＡＴＣＣ６８４２と区別されることを
特徴とする新規突然変異株ミコバクテリウムフオルトウ
イツムＮＲＲＬ Ｂ−１１０４５。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US73507576A | 1976-10-22 | 1976-10-22 | |
| US735075 | 2003-12-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61205480A true JPS61205480A (ja) | 1986-09-11 |
| JPS6231906B2 JPS6231906B2 (ja) | 1987-07-10 |
Family
ID=24954263
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12302577A Granted JPS5356389A (en) | 1976-10-22 | 1977-10-15 | Compostion of substance and method |
| JP26953985A Granted JPS61205480A (ja) | 1976-10-22 | 1985-12-02 | 新規微生物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12302577A Granted JPS5356389A (en) | 1976-10-22 | 1977-10-15 | Compostion of substance and method |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS5356389A (ja) |
| DE (1) | DE2746383A1 (ja) |
| NL (1) | NL189865C (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4293646A (en) * | 1978-08-07 | 1981-10-06 | The Upjohn Company | Composition of matter and process |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL6513718A (ja) * | 1965-10-22 | 1967-04-24 | ||
| US3684657A (en) * | 1970-05-11 | 1972-08-15 | Searle & Co | Selective microbiological degradation of steroidal 17-alkyls |
| US3759791A (en) * | 1970-12-10 | 1973-09-18 | Searle & Co | Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione |
| DE2703645C3 (de) * | 1976-03-01 | 1981-11-12 | The Upjohn Co., 49001 Kalamazoo, Mich. | Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion |
-
1977
- 1977-10-10 NL NL7711087A patent/NL189865C/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-10-14 DE DE19772746383 patent/DE2746383A1/de active Granted
- 1977-10-15 JP JP12302577A patent/JPS5356389A/ja active Granted
-
1985
- 1985-12-02 JP JP26953985A patent/JPS61205480A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6117478B2 (ja) | 1986-05-07 |
| JPS5356389A (en) | 1978-05-22 |
| JPS6231906B2 (ja) | 1987-07-10 |
| DE2746383A1 (de) | 1978-04-27 |
| NL189865C (nl) | 1993-08-16 |
| NL189865B (nl) | 1993-03-16 |
| NL7711087A (nl) | 1978-04-25 |
| DE2746383C2 (ja) | 1987-02-12 |
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