JPS6117478B2 - - Google Patents

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JPS6117478B2
JPS6117478B2 JP12302577A JP12302577A JPS6117478B2 JP S6117478 B2 JPS6117478 B2 JP S6117478B2 JP 12302577 A JP12302577 A JP 12302577A JP 12302577 A JP12302577 A JP 12302577A JP S6117478 B2 JPS6117478 B2 JP S6117478B2
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JP
Japan
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steroid
nrrl
mycobacterium
androst
dione
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JP12302577A
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JPS5356389A (en
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Jenu Bobucha Maaru
Burenda Bigusu Kyandeisu
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Pharmacia and Upjohn Co
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Upjohn Co
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Publication date
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Publication of JPS6117478B2 publication Critical patent/JPS6117478B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
    • C07J1/0003—Androstane derivatives
    • C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 微生物によるステロイド類の転化は広く研究さ
れ、記録されてきた。明らかに最初のこのような
研究は、1937年のベリヒテ（Ber）70巻470頁と
同70巻2079頁におけるマモリ（Mamoli）及びヴ
エルセローネ（Vercellone）によるものであつ
た。彼らは発酵酵母による17−ケトステロイドの
17β−ヒドロキシステロイドへの還元を明らかに
した。これ以後にピーターソン（Peterson）及び
マレー（Murray）がカビのリゾプス・ニグリカ
ンス（Rhizopus nigricans）によるプロゲステロ
ンの11α−ヒドロキシル化を明らかにしている。
合衆国特許第2602769号（1952年）を参照。更に
最近ではクレーキー（Kraychy）等が合衆国特許
第3684657号（1972年）で、17−アルキル側鎖中
に少なくとも８個の炭素を含有するステロイドを
ミコバクテリウム・スペシーズNRRL Ｂ−3683
によつて発酵させてアンドロスト−４−エン−
３，17−ジオン、アンドロスト−１，４−ジエン
−３，17−ジオン、及び20α−ヒドロキシメチル
−プレグナ−１，４−ジエン−３−オンをつくる
ことによる、ステロイドの17−アルキルの選択的
微生物減成を明らかにしている。もつと最近で
は、合衆国特許第3759791号（1973年）でマーシ
エツク（Marsheck）等が、17−アキル側鎖中に
少なくとも８個の炭素を含有するコレスタン又は
スチグマスタン系のステロイドを、ミコバクテリ
ウム・バカエ（Mycobacterium vaccae）として
特徴づけられるミコバクテリウム・スペシーズ
NRRL Ｂ−3805で発酵させることによる、アン
ドロスト−４−エン−３，17−ジオンの選択的微
生物製造を明らかにしている。
本発明は２〜10個の炭素原子の17−アルキル側
鎖をもつステロイド類を選択的に減成させ発酵液
中にアンドロスト−４−エン−３，17−ジオン
（以下ADと称する）を蓄積する能力によつて特徴
づけられる突然変異株に関する。この突然変異株
は、本明細書で明らかにされた突然変異手順又は
その他の突然変異手順を使用してミコバクテリウ
ム属の微生物から得られる。本明細書中に特定的
に例示されているのは、２〜10個の炭素原子の17
−アルキル鎖をもつステロイド類をADへ選択的
に減成させるのに用いられる新規な突然変異株の
微生物ミコバクテリウム・フオルトウイツム
（Mycobacterium fortuitum）、NRRL Ｂ−11045
である。適当なステロイド基質の例はシトステロ
ール、コレステロール、スチグマステロール、カ
ンペステロール等、２〜10個の炭素原子の17−ア
ルキル側鎖をもつステロイド類である。これらの
ステロイド基質は純粋な形又は粗製型でありう
る。
微生物 ２〜10個の炭素原子の17−アルキル側鎖をもつ
ステロイド類を選択的に減成し発酵液中にADを
蓄積する能力によつて特徴づけられる突然変異株
は、ミコバクテリウム属の微生物を突然変異させ
ることによつて得られる。ミコバクテリウム・フ
オルトウイツムATCC6842を本明細書で明らかに
されたとおりに突然変異させると、新規実験室的
突然変異株の微生物を生ずる。
1974年度ATCCカタログはATCC6842の掲載の
ほか次のものを明らかにしている。「ジエー・シ
ー・クルス（J.C.Cruz）、２寒性膿瘍、Acta
Med.Rio de Janeiro １巻１頁（1936年）。培地
90 37C」。エム・フオルトウイツムATCC6842は
ステロールを小分子量の化合物、例えばCO2＋
H2Oへ非選択的に分解する。このためこの微生物
は選択的ステロイド減成微生物として適していな
い。
ニトロソグアニジンを使用するエム・フオルト
ウイツムATCC 6842の突然変異化は、２〜10個
の炭素原子の17−アルキル側鎖をもつステロイド
類を選択的に減成してADをつくるような新規突
然変異株の生成をもたらす。この突然変異株の微
生物は、これが永久収集物として寄託されている
合衆国イリノイ州ピオリアの合衆国農務省北部地
域研究所で、受入れ番号NRRL Ｂ−11045を与え
られた。この微生物は二次培養基は、こゝに要求
すればこの寄託機関から自由に入手できる。この
培養基を入手できることが、政府決定により題目
付証書を以つて授与された特許権を損じて本発明
を実施できるというライセンスを構成するもので
はないことが理解されるべきである。この突然変
異種は日本においては受託番号第4112号で工業技
術院微生物工業研究所に保管寄託されている。本
願が特許出願公告された後では同所より自由に分
譲を受けることができる。
本発明の微生物は、上に論じられている合衆国
特許第3759791号で明らかにされたミコバクテリ
ウム・スペシーズNRRL Ｂ−3805から区別され
た。NRRL Ｂ−3805はミコバクテリウム・バカ
エの全般的特徴をもつており、これは本発明のエ
ム・フオルトウイツムとははつきりと異なつてい
る。これらの微生物の比較についてはバーギー
（Bergey）のアニアル オブ デタミネテブ ベ
クテリオロジイ（Manual of Determinative
Bacteriology）第８版、ウイリアムス・アンド・
ウイルキンス社（1974年）の695〜６頁を参照の
こと。
エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045の形
態及び薬剤感受性は、親株エム・フオルトウイツ
ムATCC 6842のそれらとは区別できない。エ
ム・フオルトウイツムはアクチノマイセタレス
（Actinomycetales）目のミコバクテリアセアエ
（Mycobacteriaceae）族に属する抗酸性、非自動
性、胞子非形成性の杆菌である。ラニヨンの分類
（Runyon、E.H.1959.Med.Clin.North America
43巻273頁）によるとエム・フオルトウイツムは
非色素生産性群のミコバクテリウムである。す
なわち比較的簡単な培地上で低温で急速に生育
し、色素を含まない集落をつくる。
エム・フオルトウイツムATCC 6842とエム・
フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045は、ステロイ
ド分子への作用において明瞭に区別できる。上に
明らかにされたように、エム・フオルトウイツム
ATCC 6842はステロイドの非選択的減成微生物
であるが、一方エム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ−11045は選択的減成微生物である。エム・フ
オルトウイツムNRRL Ｂ−11045のこの性質は、
本明細書で明らかにされているとおりこれを非常
に有用なものとする。
エム・フオルトウイツムATCC 6842を突然変
異化して突然変異株を与え、次にこれを再び突然
変異させてエム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−
11045を得ることは、ニトロソグアニジン使用に
より達成された。手順の詳細は下に記載されてい
る。本明細書で明らかにされた突然変異及び転化
手順がミコバクテリウムについて詳細に述べてあ
るが、本明細書で明らかにされているように他の
属の微生物によつても類似の又は同等な手順が使
用できることは理解されるべきである。
転化方法 本発明の選択的転化は、培養期中に培養基へ選
ばれたステロイド基質を加えるか、又は接種に先
立つて栄養培地中へこれを取入れることによつ
て、エム・フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045の
生育培養基中で実施できる。ステロイドは単独で
又は他のステロイドと組合わせて加ることができ
る。培養基中のステロイドの好ましいが限定的で
ない濃度範囲は、リツトル当り約0.1ないし約100
ｇである。培養基を炭素源、例えば同化できる炭
水化物及び窒素源、例えば同化できる窒素化合物
又は蛋白質材料を含有する栄養培地中で生育させ
る。好ましい炭素源はブドウ糖、黒砂糖、庶糖、
グリセロール、殿粉、トウモロコシ殿粉、乳類、
デキストリン、糖蜜等を包含する。好ましい窒素
源はコーンスチープリカー、酵母、固型乳を加え
た自己分解醸造酵母、大豆粉、棉実粉、コーンミ
ール、固型乳、カゼインの〓液消化物、魚粉、デ
イスチラーズソリツド、動物ペプトン液、肉と骨
の砕片、アンモニウム塩類等を包含する。これら
の炭素及び窒素源の組合わせを使用するのが有利
である。痕跡量の金属例えば亜鉛、マグネシウ
ム、マンガン、コバルト、鉄等は発酵培地に加え
る必要がない。というのは、培地の滅菌前に培地
成分として水道水及び末精製の成分を用いるから
である。
転化方法は約72時間ないし15日又はそれ以上の
範囲になりうる。培養温度は約25℃ないし約37℃
の範囲でありうるが、NRRL Ｂ−11045に対して
は30℃が好ましい。微生物の生育を促進し、こう
して転化方法の有効性を高めるため、内容物に滅
菌された空気を通じ、曝気させる。
シリカゲル板（イー・メルク、ダルムシユタツ
ト）及び２：３容量比の酢酸エチル−シクロヘキ
サンからなる溶媒系を使用する薄層クロマトグラ
フイで立証されるとおりに転化方法の終了時に、
望んでいる転化ステロイドはこの技術に周知の手
段によつて回収される。例えば発酵液と菌体を含
めた発酵（転化）反応混合物を、ステロイド用の
水と混ざらない有機溶媒で抽出される。適当な溶
媒はジクロロメタン（好ましい）、塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、塩化エチレン、
トリクロロエチレン、エーテル、酢酸アミル、ベ
ンゼン等である。
その代わりに、発酵液と菌体をまず慣用方法、
例えばろ過又は遠心分離によつて分離し、次いで
別々に適当な溶媒で抽出する。菌体を水と混ざる
溶媒又は水と混ざらない溶媒で抽出できる。菌体
を含まない発酵液を水と混ざらない溶媒で抽出で
きる。
抽出液を珪藻土に通してろ過し、ろ液を乾固す
るまで真空蒸留する。望んでいる転化ステロイド
を含有する生じた残留物を最少量の酢酸エチル−
シクロヘキサン（20：80）に溶解できる。この溶
液をシリカゲル上のクロマトグラフイにかけるこ
とができる。ADは酢酸エチル−クロロホルム
（15：85）の溶媒系での溶離によつてシリカゲル
から分離できる。次に溶媒蒸発とヘキサンからの
再結晶によつて化合物を別個の物として単離でき
る。
本発明の転化方法の望んでいる生成物は、既知
のステロイド中間体ADである。この化合物は有
用なステロイドホルモンの合成における中間体と
して有用である。例えばADは、合衆国特許第
2143453号、第2253798号、第2264888号及び第
2356154号で明らかにされた方法に従つてテスト
ステロンをつくるのに使用できる。
以下の実施例は本発明方法と生成物の例示であ
るが、限定的に考えられてはならない。他に注意
がなければ、百分率はすべて重量により、また溶
媒混合物の割合はすべて容量による。
実施例１ エム・フオルトウイツムATCC6842からの突然
変異株エム・フオルトウイツムNRRLB−11045
の調製 (a) ニトロソグアニジンによる突然変異の発生 エム・フオルトウイツムATCC 6842の菌体
を28℃で次の無菌的種菌培地中で生育させる。
栄養培養液（デイフコ） ８ｇ／ 酵 母 液 １ｇ／ グリセロール ５ｇ／ 蒸 留 水 １とするに十分な量 1NNaOHでPHを7.0に調整してから121℃で20
分滅菌する。
菌体をml当り約５×108の密度まで生育さ
せ、遠心分離によつてペレツト化し、次に同じ
容量の無菌的な0.1Mくえん酸ナトリウム（PH
5.6）で洗う。洗つた菌体を同量のくえん酸緩
衝液中に再懸濁し、試料を滴定（菌体計数）の
ために除き、ニトロソグアニジンを50μｇ／ml
の最終濃度まで添加する。菌体懸濁液を37℃の
水浴中で30分培養し、このあと試料を滴定用に
再び除き、残りを遠心分離にかけ、同じ容量の
無菌的0.1M燐酸カリウム（PH7.0）で洗う。最
後に菌体を次のものからなるが炭素源を含まな
い無菌的最少塩培地中に再懸濁する。
NH4NO3 1.0ｇ／ K2HPO4 0.25ｇ／ MgSO4・7H2O 0.25ｇ／ NaCl 0.005ｇ／ FeSO4・7H2O 0.001ｇ／ 蒸 留 水 １とする量 1NHClでPHを7.0に調整してから121℃で20分
滅菌する。次に菌体をプレート上に播いて突然
変異株を選定する。
(b) 選定と単離 上記のように突然変異を起した菌体を希釈
し、以下からなる培地（フレーザー
（Fraser）及びジエレル（Jerrel）、1963年、J.
Biol.Chem.205巻291〜295頁から変性）を含有
するプレート上に広げる。
グリセロール 10.0ｇ／ K2HPO4 0.5ｇ／ NH4C 1.0ｇ／ MgSO4・7H2O 0.5ｇ／ FeC３・6H2O 0.05ｇ／ 蒸 留 水 １とする量 寒天（15ｇ／）を加え、培地を121℃で30
分オートクレープにかけ、次いで無菌的なペト
リ皿に注ぐ。
この培地上の生育は、突然変異発生手順によ
つてつくられる大抵の栄養的自家栄養体を排除
する。例えば化学的に定義された培地上で生育
するためにビタミン類、生長因子等を必要とす
るような培養基は排除される。28℃で約７日培
養後、生ずる集落を突然変異株の選定に適した
試験プレートへ複製し、次いでグリセロールを
基盤とする培地を含む対照プレートへ逆複製す
る。試験プレートはピーターソン・ジー・イー
（Peterson.G.E.）、エツチ・エル・ルイス（H.
L.Lewis）及びジエー・アール・デービス（J.
R.Davis）、1962年、「コレステロール及びその
他の水に不溶の炭素源の寒天培地中における均
一分散液の調整」J.Lipid Reserch3巻275〜276
頁に記載のとおりにつくられる。これらのプレ
ート中の最少塩培地は実施例１の(a)部で述べた
とおりである。寒天（15ｇ／）及びシトステ
ロール又はアンドロステンジオン（AD）のよ
うな適当な炭素源（1.0ｇ／）を加え、生ず
る懸濁液を121℃で30分オートクレープにかけ
る。無菌の熱した混合物を無菌のブレンダー容
器に注ぎ、数分間配合し、次に無菌のペトリ皿
に注ぐ。この手順で発泡が問題になりがちであ
るが、これは混合物が熱い時に配合することと
溶融寒天プレート表面に焔をあてることによつ
て減少できる。このやり方で水に不溶な炭素源
の均一分散液が得られ、非常に均質であるが不
透明の寒天プレートの調製が容易となる。
対照プレート上に生育するがADを唯一の炭
素源として含有する試験プレート上では生育す
るとしてもわずかしか生育を示さないような集
落を、栄養寒天培地上の画線接種によつて精製
する。28℃で生育後、個々のクロンを無菌的な
つまようじで栄養寒天プレートから取り上げ、
ADを炭素源として含有するグリテツドプレー
トに接種することにより再試験する。親培養基
とは異なる表現型をまだ現わしている精製され
た単離物を振とうフラスコ中で評価する。
(c) 振とうフラスコによる評価 振とうフラスコ（500ml）は次の成分からな
る生物転化培地100mlを含有する。
セレロース（Cerelose）（白色結晶精製デキス
トロースの商標名） 5.0ｇ／ MgSO4・7H2O 2.0ｇ／ NH4C 3.0ｇ／ 尿素 0.5ｇ／ KH2PO4 0.5ｇ／ トウイーン（Tween）80〓 2.0ｇ／
CaCO3 3.0ｇ／ ユコン（Ucon）〓〓 8.0ｇ／
Na3C6H5O7.2H2O 3.0ｇ／ 水道水で１にし、オートクレーブ処理に先
だつてINNaOHでPHを7.0に調整する。
〓 ニユージヤージー州 ニユーアークのアトラ
ス レフアイナリーインコ−ポレ−テツド
（Atlas Refinery lnc.） 〓〓 ニユーヨーク州ニユーヨークのユニオン
カーバイド ケミカルカンパニー（Union
CarbideChem.Co.）により供給される合成消
泡剤 大豆粉（１ｇ／）を培地に配合し、次にシト
ステロール（30ｇ／）も培地に配合する。フ
ラスコを121℃で30分オートクレーブにかけて
から、28℃に冷却し、次に以下のとおりにつく
られる種菌生育物10mlを接種する。
(b) 部からの精製された単離物を28℃で寒天斜面
培地上に生育させる。斜面培地から取つた菌体
ひとすくいを使用して、次の成分からなる無菌
的種菌培地100mlを含有する500mlフラスコに接
種する。
栄養培養液（デイフコ） ８ｇ／ 酵母エキス １ｇ／ グリセロール ５ｇ／ 蒸 留 水 １とする量 1NNaOHでPHを7.0に調整してから、フラス
コを121℃で20分オートクレーブにかける。種
菌フラスコを28℃で72時間培養する。
上に明らかにされたように、種菌生育物10ml
を使用して、無菌の転化培地100mlを含有する
各々の500mlフラスコを接種する。フラスコを
回転振とう機上で28゜〜30℃で培養し、種々の
間隔で試料採取を行なう。10mlの試料を取り除
き、３倍容量の塩化メチレンと一緒に振とうし
て抽出する。抽出液の少量ずつを、シリカゲル
及び上記溶媒系すなわち２：３容量比の酢酸エ
チル−シクロヘキサン使用の薄層クロマトグラ
フイ、及び気液クロマトグラフイによつて分析
する。ADD及び少量のADが存在する証拠によ
り、親のエム・フオルトウイツムATCC 6842
からつくられる突然変異株によるシトステロー
ルの選択的減成が確認される。
(d) 突然変異株エム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ−11045を得るための再突然変異化 ADを含有する寒天プレート上で非常に緩慢
に生育する上の突然変異株を、上に明らかにさ
れた突然変異手順にかけると、突然変異化され
た菌体を生ずる。これらの菌体を上記の(b)及び
(c)部の手順にかけると、AD及び少量のADDを
製造できる新規突然変異株ミコバクテリウム・
フオルトウイツムNRRL Ｂ−11045を生ずる。
実施例 ２ シトステロールのADへの転化 使用培地は実施例１(c)と同じである。この培地
は、121℃で30分オートクレーブにかけることに
よつて減菌され、次にこれを30℃に冷却してか
ら、実施例１(c)で述べたとおりにつくられる突然
変異株ミコバクテリウムのエム・フオルトウイツ
ムNRRL Ｂ−11045の種菌培養基10部を接種す
る。水面下の生育を促進するためかきまぜなが
ら、接種混合物を30℃で336時間培養する。培養
後、混合物をジクロロメタンで抽出する。抽出液
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を真空蒸
留によつて除去する。生ずる残留物を最少量の酢
酸エチル−シクロヘキサン（20：80）中に溶解す
る。この溶液をシリカゲル上のクロマトグラフイ
にかける。アンドロスト−４−エン−３，17−ジ
オン及び少量のアンドロスタ−１，４−ジエン−
３，17−ジオン（約８：１の比）の存在は、薄層
クロマトグラフイによつて示される。これらの化
合物は、酢酸エチル−クロロホルム（15：85）の
溶媒系での溶離によつてシリカゲルから分離され
る。次に化合物は溶媒蒸発とヘキサンからの再結
晶によつて単離される。
実施例 ３ 実施例２でシトステロールの代わりにコレステ
ロールを使用して、主要量のAD及び少量のADD
が得られる。
実施例 ４ 実施例２でシトステロールの代わりにスチグマ
ステロールを使用して、主要量のAD及び少量の
ADDが得られる。
実施例 ５ 実施例２でシトステロールの代わりにカンペス
テロールを使用して、主要量のAD及び少量の
ADDが得られる。
実施例 ６ 実施例２〜５でシトステロールのほかに、又は
シトステロールの代わりにステロイド類の任意の
ものの組合せを加えることによつて、主要量の
AD及び少量のADDが得られる。
参考例 １ 実施例１でミコバクテリウム・フオルトウイツ
ムATCC 6842の代わりにアースロバクター、バ
チルス、ブレヴイバクテリウム、コリネバクテリ
ウム、ミクロバクテリウム、ノカルデイア、プロ
トアミノバクター、セラテイア及びストレプトミ
セスの属からの微生物を使用して、２〜10個の炭
素原子の17−アルキル側鎖をもつステロイドを選
択的に減成し、発酵液中に圧倒的にADを蓄積す
る能力によつて特徴づられる突然変異株の微生物
が得られる。
参考例 ２ 実施例２〜６でエム・フオルトウイツムNRRL
Ｂ−11045の代わりに参考例１で得られる突然変
異株を使用して、主要量のADと少量のADDが得
られる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 好気的条件下に水性栄養培地中で、17−アル
    キル側鎖中に２〜10個の炭素原子を含有するステ
    ロイドの存在下にミコバクテリウム・フオルトウ
    イツム（Mycobacterium fortuitum）NRRL Ｂ
    −11045を培養し、その培地からアンドロスト−
    ４−エン−３，17−ジオンを採集することを特徴
    とするアンドロスト−４−エン−３，17−ジオン
    の製法。 ２ ステロイドがシトステロールである、特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。 ３ ステロイドがコレステロールである、特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。 ４ ステロイドがスチグマステロールである、特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ ステロイドがカンペステロールである、特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。 ６ 好気的条件下に水性栄養培地中で、各ステロ
    イドが17−アルキル鎖中に２〜10個の炭素原子を
    含有する二つ又はそれ以上のステロイド類の混合
    物の存在下にミコバクテリウム・フオルトウイツ
    ムNRRL Ｂ−11045を培養し、その培地からアン
    ドロスト−４−エン−３，17−ジオンを採集する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
    方法。 ７ ステロイド混合物がシトステロール、コレス
    テロール、スチグマステロール及びカンペステロ
    ールからなる群から選ばれる、前記第６項に記載
    の方法。
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