HU176627B - Process for producing 3a-alpha-h-4-alpha-bracket-3-comma above-propionic acid-bracket closed-7a-beta-methyl-hexahydro-1,5-indanedione by microbiologicaltransformation of sytosterine - Google Patents

Process for producing 3a-alpha-h-4-alpha-bracket-3-comma above-propionic acid-bracket closed-7a-beta-methyl-hexahydro-1,5-indanedione by microbiologicaltransformation of sytosterine Download PDF

Info

Publication number
HU176627B
HU176627B HU77UO140A HUUO000140A HU176627B HU 176627 B HU176627 B HU 176627B HU 77UO140 A HU77UO140 A HU 77UO140A HU UO000140 A HUUO000140 A HU UO000140A HU 176627 B HU176627 B HU 176627B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
alpha
bracket
compound
indanedione
propionic acid
Prior art date
Application number
HU77UO140A
Other languages
English (en)
Inventor
Candice B Biggs
Thomas R Pyke
Merle G Wovcha
Original Assignee
Upjohn Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Upjohn Co filed Critical Upjohn Co
Publication of HU176627B publication Critical patent/HU176627B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/94—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with rings other than six-membered or with ring systems containing such rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • C12R2001/33—Mycobacterium fortuitum
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/83—Arthrobacter
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/84—Brevibacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/867—Micromonospora
    • Y10S435/868—Micromonospora chalcea
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/872—Nocardia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/88—Serratia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/939—Rhizopus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya új mikrobiológiai eljárás szitoszterin szelektív átalakítására I képletű 3aa-H-4a-(3'-propionsav)-7a β-metilhexahidro-l ,5-indándionná, oly módon, hogy Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia és Streptomyces, Mycobacterium, előnyösen Mycobacterium fortuitum NRRL B—8129 mutáns mikroorganizmust, amely mutáns szelektíven bontja le a szitoszterint, vizes táptalajon 7—9 pH értéken aerob körülmények mellett szitoszterin jelenlétében tenyésztünk.
A szteroidok mikroorganizmusokkal történő átalakítását széles körben tanulmányozták és sokan le is írták. A legkorábbi munka ebben a témában Matnoli és Ver-ceUone 1937-es cikke: Bér. 70, 470 és Bér. 70, 2079. 17-ketoszteroidok redukcióját írták le 17[3-hidroxi-szteroidokká fermentáló élesztő segítségével. Peterson és Murray nemrég írták le — progeszteron lla-hidroxilezését Rhizopus nigricans fungus-szal 1. 2 602 769 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1952). Kraychy és tsai a 3 684 657 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (1972) 17-alkil-szteroidok szelektív mikrobiológiai lebontását írják le oly módon, hogy a 17-alkil oldalláncban legalább 8 szénatomot tartalmazó szteroidot Mycobacterium sp. NRRL—B— 3683-mal fermentálják és így androszt-4-én-3,17-diont, androszl-l,4-dién-3,17-diont, és 20-hidroxi-mctil-pregfea4j4*dÍMit -kapnak. Még egy újabb eljárást írtak le Marsheok és tsai a 3 759 791 (1973) sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban androszt-4-én-3,17-idisá szelektív mikrebiológiai előállítására, oly módon, hogy a 17-alkil-oldalláncban legalább 8 szénatomot tartalmazó kolesztán vagy sztigmasztán sorba tartozó szteroidot Mycobacterium sp. NRRL—B—3805-tel fermentálják.
A találmány szerinti eljárással kapott vegyület az I képletű 3aa-H-4a-(3'-propionsav)-7a β-metilhexahidro-1,5-indándion ismert vegyület, Sih és Wang írták le „Mechanisms of steroid oxidation by microorganisms II. Isolation and characterization of 3aa-H-4a-(3'-propionic-acid)-7a β-metilhexahydro-l,5-indanediooe:'’ J. Am. Chem. Soc. 85, 2135—2137 (1963) cikkükben.
Sih és Wang úgy írták le az I képletű vegyületet mint az androszt-4-én-3,17-dion lebontásának közbenső termékét, ahol a bontást Nocardia restrictus-szal végzik.
A technika állásához tartozik még Schubert, K., Bohme, K—H. és Horhold, C. „Formation of Jow molecular’degradation from progesterone by microorganisms”. Steroids 4, 581—586 (1964) cikke. Ezek a szerzők tricisklusos intermedierek képződését írták le progeszteron Mycobacterium smegmatitis-sal történő lebontása során.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott Mycobacterium fortuitum NRRJL·—B—8129 a 4039381 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban van leírva (Elsőbbsége 1975. november 17.). Az eljárás körülményei nem alkalmazhatók az I képletű vegyület találmány szerinti előállítására.
A találmány tárgya tehát új mikrobiológiai átalakítási eljárás mutánsok felhasználásával, melyre jellemző, hogy szitoszterint szelektíven lebontunk és főleg I képletű vegyületet halmozunk fel a fermentlében.
Ezeket a mutánsokat a következő nemekhez tartozó szterin-bontó mikroorganizmusokból kapjuk az itt leírt mutációs eljárással vagy más ismert mutációs eljárásokkal:
Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia és Streptomyces. Előnyös genus a Mycobacterium. Ehhez a nemhez tartoznak a következő fajok: M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum, és M. butyricum. Külön megemlítjük mutáns mikroorganizmusként a Mycobacterium fortuitum NRRL—B—8129-et, melyet az I képletű vegyület előállítására, azaz szitoszterin lebontására alkalmazunk.
A szteroid tiszta, vagy nyers formában is alkalmazható. ,
A fermentlében található kis mennyiségű II képletű 3aa-H-4a-(3'-propanol)-7a[i-metilhexahidro-l,5-indándion hemiketál, ezentúl II vegyületnek nevezzük, valamint III képletű 3aa-H-4a-(3'-propanol)-5a-hidroxi-7a^-metilhexahidro-l-indanon hemiacetál nyomai, ezentúl III vegyületnek nevezzük, IV képletű 3aa-H-4a-(3'-propíonsav)-5a-hidroxi-7a β-metilhexahidro-l -indanon-Makton, továbbiakban IV vegyület, valamint az V képletű 3aa-H-4a-(3'-propanol)-5<z-hidroxi-7a3-metilhexahidro-l-indanon, továbbiakban V vegyület.
A mikroorganizmusok
A szitoszterin szelektív lebontására és a fermentlében túlnyomórészt I képletű vegyületet felhalmozni képes mutánsokat úgy állíthatunk elő, hogy a következő fajok szterinlebontó mikroorganizmusait mutáljuk: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia, és Streptomyces. A Mycobacterium fortuitum ATCC 6842-t mutálva laboratóriumi mutáns mikroorganizmust kapunk. Az 1974-es ATCC katalógus a következőket íija az ATCC 6842-ről: J. C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Médium 90 37C. Az M’. fortuitum, ATCC 6842 a szteriöeket nem szelektíven bontja le kismolekulasúlyú vegyületekre például CC^ r lIiO-ra. így ez a mikroorganizmus nem alkalmas a szteroidok szelektív lebontására. Az M. fortuitum ATCC 6842 nitrozo-guanidinnel történő mutálásával olyan mutánst kapunk, amely szelektíven bontja le a szitoszterint, valamint túlnyomórészt I képletű vegyületet termel a fermentlében. Az M. fortuitumnak ezt a mutáns mikroorganizmusát NRRL—B—8129 deponálási számon deponáltuk a Northern Régiónál Research Laboratory Ú.S. Department of Agriculture, Peoria Illinois, amerikai egyesült államokbeli deponáló helyen.
Az M. fortuitum NRRL—B—8129 morfológiája és gyógyszer érzékenysége különbözik az eredeti M. fortuitum ATCC 6842-től. Mindkét M. fortuitum tenyészet az Actinomycetales rend Mycobacteriaceae családjához tartozó saválló, nem-mozgó, nem spóraképző bacillus. Runyon osztályozása szerint (Runyon, E. H. 1959 Med. Gin. - North America 43:273) nem-kromogén IV mycobacterium csoport, azaz alacsony hőiriérsékleten gyorsan nő és viszonylag egyszerű táptalajon nem-színezetttelepeket termel. ;
Az M. fortuitum ATCC 6842 és az M. fortuituiti
NRRL B—8129 tisztán megkülönböztethetők a szteroid molekulákra gyakorolt hatásukban. Mint már fent említettük, az M. fortuitum ATCC 6842 lebont szteroidokat, de az M. fortuitum NRRL—B—8129 szelektíven bontja le a szteroidokat. Ez a tulajdonsága teszi az M. fortuitum NRRL—B—8129-et olyan hasznossá.
Az M. fortuitum ATCC 6842 mutálását M. fortuitum NRRL—B—8129-é nitrozo-guanidinnel végezzük. Az eljárás részletei alább következnek. Bár az irodalomból a mutációs eljárások általában ismertek, még sincsen utalás az irodalomban a mutánsok típusára, melyeket a jelen mutációs eljárással kaphatunk. Bár a jelen eljárás mutációs és transzformációs lépéseit Mycobacteriumra írjuk le részletesen, magától értetődő, hogy más nemekhez tartozó mikroorganizmusokhoz is használhatunk hasonló vagy ekvivalens eljárásokat.
A transzformációs eljárás
A találmány szerinti szelektív transzformációt M. fortuitum NRRL—B—8129 növekvő tenyészetében hajtjuk végre vagy oly módon, hogy az inkubációs periódus alatt a szitoszterint a tenyészethez adjuk vagy beoltás előtt a táptalajba helyezzük. A szteroidot önállóan vagy más szteroiddal kombinálva alkalmazhatjuk. A szitoszterint előnyösen 0,1—100 g/líter koncentrációban alkalmazzuk a tenyészetben. A Tenyészetet szénforrást, például asszimilálható szénhidrátot, nitrogén forrást, példáiul asszimilálható nitrogénvegyületet vagy fehérjét tartalmazó táptalajon végezzük. Előnyös szénforrások a kö^tíkezökJjgtükőz, barna cukor, szacharóz, glicerol, keményítő, kukoricakeményítő, laktóz, dextrin, melaszok stb. Előnyös nitrogénforrások a következők; kukoricaszárkivonat, élesztő, autolizált Brewer-féle élesztő tejporral, szójaliszt, gyapotmagliszt, kukoricaliszt, tejpor, kazein hasnyálmirigy kivonat, halliszt, karbamid, lepárlási termékek, állati pepton folyadékok, hús és csont darabok, ammónium sók stb. Előnyösen ezeket a szén és nitrogénforrásokat kombinációban is használhatjuk. Nyomelemeket például' cinket; magnéziumot, mangánt, kobaltot, vasat stb. nem szükséges a fermentációs táptalajhoz adni, mert csapvizet és nem tisztított komponenseket alkalmazunk a táptalaj alkotóelemeként. A táptalaj sterilizálása előtt a pH-t 7 fölé, előnyösen 7—9 érték közé állítjuk. A pH-beállítást erős bázissal, például nátriüm-hidroxiddal, kálium-hidroxiddal stb. végezzük.
A találmány szerinti eljárás kritikus vonása a pH 7 fölött való tartása a fermentáció alatt, hogy főleg I képletű vegyületet kapjunk. A pH fenntartását az irodalomból ismert módszerekkel végezhetjük például kalciumkarbonátot, vagy foszfát puffért teszünk a táptalajba vagy egy bázissal például nátrium-hidroxiddal vagy ammónium-hidroxiddal szabályozzuk a pH-t.
A transzformációs eljárás 72 órától 15 napig is tarthat. A transzformációs eljárás alatt az inkubációs hőmérséklet 25—37 °C között változhat, előnyösen 31 °C. A transzformációs edény tartalmát sterilizált levegővel levegőztetjük, és a mikroorganizmus növekedésének elősegítésére keverést alkalmazunk és így a transzformációs eljárás hatékonyságát serkentjük.
A transzformációs eljárás befejeződését szilikagélen (Merek, Darmstadt) végzett vékonyrétegkromatográfiával követjük nyomon, oldószer-rendszerként 60: 40:1 térfogatarányú etil-acetát, ciklohexán, jégecet elegyet használunk. A befejeződés után a kívánt transzformált szteroidot ismert módszerrel nyerjük ki. Például a fermentlevet és sejteket magábafoglaló fermentációs (transzformációs) elegyet erős bázissal (lásd fent) vagy puífer-oldattal például telített nátrium-hidrogénkarbonát oldattal stb. 8-as pH-ra állítjuk, majd a vízzel nem elegyedő szerves szteroidokat oldó oldószerrel extraháljuk. Alkalmas oldószerek a metilénklorid (előnyösen), kloroform, széntetraklorid, etilénklorid, triklóretilén, éter, amilacetát, benzol stb.
Az I képletű vegyületet jó termeléssel kapjuk, ha a hidrogénkarbonáttal kezelt reakcióelegy pH-ját koncentrált ásványi savval, például sósavval 2-re állítjuk be. A reakcióelegyet ezután a fent leírt módon extraháljuk és I képletű vegyületet tartalmazó extraktumot kapunk. Ciklohexán lassú hozzáadása hatására 107—110 °C-on olvadó kristályos I képletű vegyületet kapunk.
Az I képletű vegyület hasznos szteroidok előállításához szükséges intermedierként használható fel. A 3 880 884 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírt eljárás kiindulási anyagává alakítható, amely eljárás a hasznos 19-nor-szteroidok totál szintézise. A kiindulási anyaggá alakítást irodalomból ismert módszerekkel, például ecetsavanhidrides és nátrium-acetátos kezeléssel végezhetjük. L. J. A. C. S. 85: 2135—2137.
A találmány további részleteit a következő nem-korlátozó jellegű példákkal szemléltetjük (a százalékok súlyszázalékok, és az oldószer arányok térfogatarányok):
A pH-t 1 n sósavval sterilizálás előtt 121 °C-on 20 percig 7-re állítjuk be. A sejteket ezután a mutánsok kiválasztására lemezekre helyezzük.
b) M. fortuitum NRRL—B—8129 mutáns kiválasztása és izolálása
A fent leírt módon mutagenizált sejteket hígítjuk és a következő összetételű táptalajt tartalmazó lemezekre terítjük szét (módosított Fraser és Jerrel, 1963. J. Bioi.
Chem. 205: 291—295):
glicerin dinátrium-hidrogénfoszfát kálium-dihidrogénfoszfát ammónium-klorid magnézium-szulfát-heptahidrát vastriklorid-hexahidrát desztillált víz, tetszés szerint
10,00 g/liter
8,40 g/liter
4,50 g/liter
2,00 g/liter
0,30 g/liter
0,05 g/liter liter g/liter agart adunk hozzá és a táptalajt 121 °C-on autoklávba helyezzük 30 percre, majd steril Petrilemezekre helyezzük.
Az ezen a táptalajon történő növekedés kiküszöböli a mutagenezis folyamatban termelt legtöbb auxotrófot, például a vitaminokat igénylő tenyészeteket, és olyan növekedési tényezőket, hogy például kémiailag definiált médiumon történjék a növekedés. 28 °C-on 7 napig végzett inkubáció után a kapott telepeket a mutánsok szelektálására alkalmas teszt-lemezekre helyezzük, majd visszatesszük a glicerin-alapú táptalajt tartalmazó kontroli-lemezekre. A teszt-lemezek előállítását illetően 1.
1. példa
M. fortuitum NR.RL—B—2129 mutáns előállítása
M. fortuitum ATCC 6842-ből
a) Nitrozo-guanidines mutagenezis
M. fortuitum ATCC 6842 sejteket 28 °C-on a következő összetételű steril beoltott táptalajon növesztünk: táptalaj (Difco) 8 g/liter élesztő extraktum 1 g/liter nátrium-propionát 0,5 g/liter desztillált víz, tetszés szerint 1 liter
A pH-t 1 n nátrium-hidroxiddal sterilizálás előtt
121 °C-on 20 percig 7-re állítjuk. ,
A sejteket 5 x 108/ml sűrűségig növesztjük, szemcsézés végett centrifugáljuk, majd egyenlő' térfogatú steril 0,1 M nátrium-citráttal pH=5,6-ra mossuk. A mosott sejteket ugyanannyi citrát pufferben újra szuszpendáljuk, titráláshoz mintát veszünk (sejt számlálás) és nitrozo-guanidint adunk hozzá, amíg a koncentráció 50 [ig/ml lesz. A sejt-szuszpenzíót 37 °C-on 30 percig víz-fürdőn inkubáljuk, majd titrálásához ismét mintát veszünk és a maradékot centrifugáljuk és azonos menynyiségű steril 0,1 M kálium-foszfáttal mossuk amíg a pH=7 nem lesz. Végül a sejteket steril szénforrás nélküli kis mennyiségű só-táptalajban újra szuszpendáljuk, a táptalaj összetétele a következő: ammónium-nitrát dikálium-hidrogénfoszfát magnézium-szulfát-heptahidrát nátrium-klorid vasszulfát-heptahidrát desztillált víz, tetszés szerint
1,000 g/liter
0,250 g/liter
0,250 g/liter
0,005 g/liter
0,001 g/liter liter
Peterson, G. E., H. L. Lewis és J. R. Davis 1962. „koleszterin és más víz-oldhatatlan szén-forrás egyenletes diszperziójának előállítása agar táptalajon” J. Lipid Research 3 : 275—276. A minimális só-táptalaj előállítá35 sát az la példában ismertettük. 15 g/liter agart, és
1,0 g/liternek megfelelő szénforrást például szitoszterint vagy adrosztendiont (AD) adunk hozzá és a kapott szuszpenziót 30 percig 121 °C-on autoklávban tartjuk. A steril forró elegyet ezután steril keverőbe helyezzük, 40 percekig keverjük, majd steril Petri-lemezekre öntjük.
Az eljárás során fellépő habzás problémát jelent, azonban a habzás csökkenthető, ha az elegyet forrón keverjük, és ha a megolvadt agar lemezek felszínét lángoljuk. Ily módon a vízben oldhatatlan szénforrás homogén 45 diszperzióját kapjuk, és így igen homogén, de homályos agar lemezeket állítunk elő. A kontroli-lemezeken növesztett és nem AD-t mint egyedüli szénforrásként tartalmazó teszt-lemezeken növesztett telepeket úgy tisztítjuk, hogy tápagar lemezekre vonalakat húzunk 50 (szélesztés). Miután 28 °C-on tenyésztettük a telepeket, az egyes kiónokat steril fogpíszkálókkal vesszük ki a tápagar lemezekről és újra vizsgáljuk oly módon, hogy egyedüli szénforrásként AD-t tartalmazó kockás lemezeket oltunk be. A tisztított izolátumokat, melyek még 55 mindig az eredeti tenyészettől eltérő fenotípust mutatnak, rázó lombikban, értékeljük ki.
e) Rázó lombikos kiértékelés
500 ml-es zárólombikok a következő összetételű
100 ml biotranszformációs táptalajt tartalmaznak:
glicerin dinátrium-hidrogénfoszfát kálium-hidrogénfoszfát ammónium-klorid
10,00 g/liter
8,40 g/liter
4,50 g/liter
2,00 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrát vas-triklorid. hexahidrát desztillált víz (tetszés szerint)
0,30 g/liter
0,05 g/liter literre kiegészítve g/liter szójalisztet elegyítünk a táptalajba, majd szitoszterint is adunk 10 g/liter mennyiségben a táptalajhoz. A lombikokat 20 percig 121 °C-on autoklávban tartjuk, majd 28 °C-on hűtjük és 10 ml oltott növekménnyel beoltjuk, amelyet a következőképpen állítunk elő:
Ab) részben előállított tisztított izolátumot agar ferde tenyészeteken tenyésztjük 28 °C-on. A ferdetenyészetből vett sejtkaccsal beoltunk egy 500 ml-es lombikot, amely 100 ml következő összetételű steril oltott táptalajt tartalmaz:
táptalaj (Difco) élesztő kivonat glicerin desztillált víz (tetszés szerint) g/liter g/liter g/liter literre kiegészítve
A pH-t 1 n nátrium-hidroxiddal 7-re állítjuk, mielőtt a lombikokat 121 °C-on 20 percig autoklávban tartanánk. A beoltott lombikokat 28 °C-on 72 óra hosszat inkubáljuk.
ml oltott növekménnyel beoltunk minden 500 ml-es lombikot, amely 100 ml steril transzformációs táptalajt tartalmaz. A lombikokat 28—30 °C-on inkubáljuk rotációs rázó készüléken és különböző időközökben mintát veszünk. 10 ml-es mintákat elkülönítünk és 3 térfogat metilénkloriddal rázva extraháljuk. Az extraktumok egyes adagjait egyrészt vékonyrétegkromatográfiásan szilikagélen analizáljuk a fent leírt oldószerrendszert: etil-acetát és ciklohexán 2:3 térfogatarányú elegyét alkalmazzuk futtató elegyként, másrészt gázfolyadék kromatográfiásan analizáljuk. AII és V vegyületek jelenléte azt igazolja, hogy az M. fortuitum ATCC 6842-ből termelt új mutáns szelektíven lebontja a szitoszterint.
2. példa
Szitoszterin átalakítása I képletű vegyületté
Az le példában használt táptalajt alkalmazzuk, azzal a különbséggel, hogy a pH-t 4 n nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk. A táptalajt 121 °C-on 30 percig melegítve sterilizáljuk, majd 28 °C-ra hűtjük és beoltjuk M. fortuitum NRRL·—B—8129 mutáns oltott tenyészetével, amelyet az le példában leírt módon állítunk elő. A beoltott elegyet 28 °C-on 168 óra hosszat inkubáljuk és közben a süllyesztett növekedést a keveréssel gyorsítjuk. A pH-t szükség szerint nátrium-hidroxid hozzáadásával 7—9-re állítjuk. A biotranszformáció előrehaladását úgy követjük nyomon, hogy a reakcióelegy mintáját 4 térfogat metilénkloriddal extraháljuk és a kivonatot vékonyrétegkromatográfiának vetjük alá szilikagél lemezeken, 60 : 40:1 térfogatarányú etilacetát—ciklo5 hexán—jégecet oldószerrendszer alkalmazásával.
A biotranszformáció befejezése után a kapott termékeket a következő módon izoláljuk. A reakcióelegyet telített nátriumhidrogénkarbonát hozzáadásával pH=8ra állítjuk, majd metilénkloriddal extraháljuk. A II—V 10 vegyületet tartalmazó, de I vegyületet nem tartalmazó extraktumot diatoma földön keresztül leszűrjük és a szűrletet szárazra desztilláljuk. A szűrietből származó maradékot kloroformban vesszük fel és szilikagélen kromatografáljuk, Skellysolve B-t és elegyeit alkalmaz15 zuk és előhívószerként növekvő mennyiségű etilacetátot használunk. Ezzel a folyamattal a II, III és IV vegyületet eluáljuk azonban az V vegyületet nem, ez utóbbit metanol etilacetátos 5%-os oldatával eluáljuk az oszlopról. A vegyületek eluálási sorrendje II—III—IV—V. Az 20 egyes termékeket úgy kapjuk, hogy a megfelelő frakciókat egyesítjük és vékonyrétegkromatografálással mutatjuk ki, majd szárazra pároljuk. Etilacetátból átkristályosítjuk és a II vegyület két epimerjének 1:1 arányú elegyét (op.: 100—112 °C), IV vegyületet (op.: 122— 25 124 °C) és V vegyületet (op.: 148—150 °C) kapunk.
Az I képletű vegyületet jó termeléssel kapjuk, ha a hidrogénkarbonáttal kezelt elegy pH-ját koncentrált sósav oldattal pH—2-re állítjuk, kloroformmal vagy metilénkloriddal ismét extraháljuk és a ciklohexán lassú hozzá30 adásával a terméket kikristályosítjuk. Az I képletű vegyület 107—110 °C-on olvad.
Szabadalmi igénypontok

Claims (3)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás (I) képletű 3aa-H-4a-(3'-propionsav)-7aP-metilhexahidro-l,5-indiándion előállítására, azzal jellemezve, hogy Arthrobacter, Bacillus, Brevibacteriuna, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Sérratia
    40 és Streptomyces, Mycobacterium, előnyösen Mycobacterium fortuitum NRRL—B—8129 mutáns mikroorganizmust, amely mutáns szelektíven bontja le a szitoszterint, vizes táptalajon 7—9 pH értéken aerob körülmények mellett szitoszterin jelenlétében tenyész45 tünk, és a kapott (I) képletű vegyületet elkülönítjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerint eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Mycobacterium fortuitum NRRL—B—8129 mikroorganizmust vizes táptalajon 7—9 pH értéken aerob körülmények mellett szitoszterin
    50 jelenlétében tenyésztünk, és a kapott (I) képletű vegyületet elkülönítjük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerint eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 7,5 pH értékű táptalajt alkalmazunk.
    1 db ábraoldal
    A kiadásért fölei; a Közgazdasági és Jogi K&nyvkiadó igazgatója
    81.1241 .66-42 Alföldi Nyomáé, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató
HU77UO140A 1976-11-26 1977-11-25 Process for producing 3a-alpha-h-4-alpha-bracket-3-comma above-propionic acid-bracket closed-7a-beta-methyl-hexahydro-1,5-indanedione by microbiologicaltransformation of sytosterine HU176627B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/745,113 US4062729A (en) 1976-11-26 1976-11-26 Microbial transformation of steroids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU176627B true HU176627B (en) 1981-03-28

Family

ID=24995304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU77UO140A HU176627B (en) 1976-11-26 1977-11-25 Process for producing 3a-alpha-h-4-alpha-bracket-3-comma above-propionic acid-bracket closed-7a-beta-methyl-hexahydro-1,5-indanedione by microbiologicaltransformation of sytosterine

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4062729A (hu)
JP (1) JPS5369885A (hu)
DE (1) DE2746323C2 (hu)
FR (1) FR2372137A1 (hu)
GB (1) GB1571143A (hu)
HU (1) HU176627B (hu)
IL (1) IL53156A (hu)
MX (1) MX4849E (hu)
NL (1) NL7712280A (hu)
PL (1) PL112030B1 (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53130492A (en) * 1977-04-15 1978-11-14 Satoru Arima Production of indane compound by microorganism
US4211841A (en) * 1977-09-08 1980-07-08 The Upjohn Company Process for microbial transformation of steroids
AT386225B (de) * 1979-03-07 1988-07-25 Henkel Kgaa Verfahren zur hestellung von 17-c-steroid-alpha- propionsaeureverbindungen, insbesondere von 3-oxopregna-4-en-20-carbons|ure und/oder 3-oxo-pregna-1,4-dien-20-carbonsaeure
DE3113053A1 (de) * 1981-04-01 1982-10-21 Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf Verfahren zur herstellung eines tricyclischen steroid-abbauprodukts
CN104496958A (zh) * 2014-11-28 2015-04-08 江西赣亮医药原料有限公司 一种膜法提取a环降解物的方法
CN113563170A (zh) * 2021-07-30 2021-10-29 湖南龙腾生物科技有限公司 一种a环降解物发酵液中副产物的提取方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3616228A (en) * 1968-09-26 1971-10-26 Kurt Schubert Beta-substituted propionic acids and method of making the same

Also Published As

Publication number Publication date
NL7712280A (nl) 1978-05-30
IL53156A0 (en) 1977-12-30
GB1571143A (en) 1980-07-09
FR2372137B1 (hu) 1984-03-23
FR2372137A1 (fr) 1978-06-23
PL202380A1 (pl) 1978-09-11
MX4849E (es) 1982-11-01
US4062729A (en) 1977-12-13
JPS5369885A (en) 1978-06-21
DE2746323A1 (de) 1978-06-01
IL53156A (en) 1982-04-30
JPS6155953B2 (hu) 1986-11-29
DE2746323C2 (de) 1984-12-06
PL112030B1 (en) 1980-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4035236A (en) Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione
US4029549A (en) Process of producing 9α-hydroxy-3-ketobisnorchol-4-en-22-oic with mycobacterium fortuitum
US4293645A (en) Process for preparing androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione
JPH022395A (ja) ９α―ヒドロキシ―１７―ケトステロイドの微生物学的製法
CN109251870B (zh) 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
HU176627B (en) Process for producing 3a-alpha-h-4-alpha-bracket-3-comma above-propionic acid-bracket closed-7a-beta-methyl-hexahydro-1,5-indanedione by microbiologicaltransformation of sytosterine
US4293644A (en) Process for preparing androst-4-ene-3,17-dione
US4039381A (en) Composition of matter and process
US4042459A (en) Composition of matter and process
US4304860A (en) Process for the microbial transformation of steroids
JPS6141547B2 (hu)
US4211841A (en) Process for microbial transformation of steroids
US4358538A (en) Mycobacterium fortuitum mutant
US4062880A (en) 9α-Hydroxy-bis-nor-cholanic acid
US4175006A (en) Composition of matter and process
US4097335A (en) Microbial transformation of steroids
US4345030A (en) Microorganism mutant conversion of sterols to androsta-4-ene-3,17-dione
US4177106A (en) Process for preparing 3aα-H-4α-[3&#39;-propanol]-7aβ-methylhexahydro-1,5-indanedione hemiketal
US4293646A (en) Composition of matter and process
US4176123A (en) Steroid intermediates
US4329432A (en) Mycobacterium fortuitum strain
US4214051A (en) Process for preparing 9α-OH BN acid methyl ester
JPH0157960B2 (hu)
US4345033A (en) Mycobacterium fortuitum mutant
JPS608120B2 (ja) 微生物による化合物の製法

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628