CN107522781A - 从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括鱼鳞预处理、蛋白酶共固定化、酶解、超滤和冷冻干燥。采用1‑乙基‑3‑（3‑甲基氨基）丙基碳二亚胺活化壳聚糖，并与戊二醛偶联形成脂肪酶固定化载体，并利用大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶协同酶解来提高草鱼鱼鳞蛋白的水解程度、酶解反应速度和改变端基的类型。有益效果为：得到胶原蛋白肽分子量小，纯度高，可直接到达皮肤真皮层，使皮肤变得紧致细滑。具有较好的抗氧化作用，对DPPH·、超O2 ‑·、·OH自由基的清除率高，抗衰老效果明显。意外的具有抗肿瘤作用，在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白提取技术领域，具体是一种从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法。
背景技术
我国是世界淡水鱼生产大国，淡水鱼产量占世界总产量的 60％以上。近年来淡水鱼加工业发展迅速，已成为淡水渔业的新增长点。在淡水鱼的加工过程中会产生约 40％的副产品，包括鱼鳞、鱼头和鱼油等，这些下脚料通常被作为废料或猪食廉价处理，造成了严重的资源浪费与环境污染。其中鱼鳞营养丰富，含有丰富的胶原蛋白。目前现有的提取鱼鳞胶原蛋白的方法普遍存在的问题是提取率低、胶原蛋白纯度低、以及残留有鱼腥味等。
草鱼属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属。草鱼的俗称有：鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根（东北）、混子、黑青鱼等。英文名：Grass carp 。栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。性活泼，游泳迅速，常成群觅食。为典型的草食性鱼类。在干流或湖泊的深水处越冬。生殖季节亲鱼有溯游习性。已移殖到亚、欧、美、非各洲的许多国家。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，上述方法操作步骤简单，提取率高。制备得到的胶原蛋白肽分子量小，纯度高，可直接到达皮肤真皮层，使皮肤变得紧致细滑；具有较好的抗氧化作用，对DPPH·、超O2 -·、·OH自由基的清除率高，抗衰老效果明显，并意外的具有抗肿瘤作用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括鱼鳞预处理、蛋白酶共固定化、酶解、超滤和冷冻干燥。其中，蛋白酶共固定化步骤为：取干燥壳聚糖粉末， 用pH6.0~6.8的60~80mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜，然后加入壳聚糖粉末质量0.7~1.2％的1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化0.5~0.9h，再加入壳聚糖粉末1~2倍体积的戊二醛偶联反应1~1.8h，用蒸馏水清洗5~8次，加入大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌0.5~1.5h ，然后放置冰箱中过夜，次日用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复合酶。1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺对壳聚糖进行化学改性，有效活化了壳聚糖表面羟基基团。活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联得到优良的大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶固定化载体。大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶吸附在载体上形成壳聚糖固定化复合酶。
作为优选，大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液的浓度分别为0.5~1.0mg/mL和0.8~2.0mg/mL，加入量均为壳聚糖粉末体积的2~8倍。上述复合蛋白酶的配比以及蛋白酶于载体之间的比例为最优选，达到复合蛋白酶固定化转化率高，酶解效率高，酶解成本低的目的。
作为优选，冰浴搅拌的过程中加入壳聚糖重量1~3%的活性短肽；活性短肽的氨基酸序列为SCASVCGYKAYVSVFYRGRCYCRCLRC。上述活性短肽可明显增强大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶和酶固定化载体之间的物理和化学吸附作用力，提高固定化大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶转化率，并且提高壳聚糖固定化复合酶可重复使用次数。
作为优选，鱼鳞预处理步骤为：将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白。鱼鳞预处理步骤可将鱼鳞中杂质作初步去除，提高草鱼鱼鳞胶原蛋白肽的提取率。
作为优选，酶解步骤为：在预处理后的草鱼鱼鳞中加入10~20倍体积水，再加入鱼鳞重量1~5%的壳聚糖固定化复合酶，于40~60℃，pH5.0~7.0，超声波辅助酶解1.0~3.0h，灭酶，过滤取酶解液。利用大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶水解位点的互补作用和协同作用，可提高草鱼鱼鳞蛋白的水解程度、酶解反应速度和改变端基的类型，水解出分子量小，纯度高，可直接到达皮肤真皮层，具有较好的抗氧化作用，具有抗肿瘤作用的胶原蛋白肽。超声波辅助壳聚糖固定化复合酶酶解草鱼鱼鳞，可明显提高酶解效率，且上述酶解条件为最优选，配置的底物浓度适于壳聚糖固定化复合酶酶解，上述pH和温度条件下壳聚糖固定化复合酶的活性强。
作为优选，超声波频率为15~30kHZ，功率为100~300W，作用时间为1~5min。上述超声波频率及功率下，壳聚糖固定化复合酶的酶解效率高。
作为优选，超滤步骤为：先采用截留相对分子质量15~20kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量1~3kD的膜超滤。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于1~3kD的杂质。
作为优选，冷冻干燥步骤为：将超滤后得到的滤过液冷到干燥得到胶原蛋白肽。得到胶原蛋白肽具有三股相互缠绕的α肽链（亚基）组成的特有三螺旋结构，链间氢键数量较多，三螺旋结构稳定性好，其交联程度较低，到达皮肤真皮层，使皮肤变得紧致细滑。具有较好的抗氧化作用，对DPPH·、超O2 -·、·OH自由基的清除率高，抗衰老效果明显。意外的具有抗肿瘤作用，在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1. 采用1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化壳聚糖，并与戊二醛偶联形成脂肪酶固定化载体，再利用氨基酸序列为SCASVCGYKAYVSVFYRGRCYCRCLRC的活性短肽来增强大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶和酶固定化载体之间的物理和化学吸附作用力，提高固定化大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶转化率，并且提高壳聚糖固定化复合酶可重复使用次数；
2. 利用大豆蛋白酶和菠萝蛋白酶水解位点的互补作用和协同作用，可提高草鱼鱼鳞蛋白的水解程度、酶解反应速度和改变端基的类型，水解出分子量小，纯度高，可直接到达皮肤真皮层，具有较好的抗氧化作用，具有抗肿瘤作用的胶原蛋白肽；
3. 得到胶原蛋白肽具有三股相互缠绕的α肽链（亚基）组成的特有三螺旋结构，链间氢键数量较多，三螺旋结构稳定性好，其交联程度较低，到达皮肤真皮层，使皮肤变得紧致细滑。具有较好的抗氧化作用，对DPPH·、超O2 -·、·OH自由基的清除率高，抗衰老效果明显。意外的具有抗肿瘤作用，在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
1）鱼鳞预处理：将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白；
2）蛋白酶共固定化：取干燥壳聚糖粉末， 用pH6.0~6.8的60~80mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜，然后加入壳聚糖粉末质量0.7~1.2％的1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化0.5~0.9h，再加入壳聚糖粉末1~2倍体积的戊二醛偶联反应1~1.8h，用蒸馏水清洗5~8次，加入大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌0.5~1.5h ，然后放置冰箱中过夜，次日用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复合酶。大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液的浓度分别为0.5~1.0mg/mL和0.8~2.0mg/mL，加入量均为壳聚糖粉末体积的2~8倍。冰浴搅拌的过程中加入壳聚糖重量1~3%的活性短肽；活性短肽的氨基酸序列为SCASVCGYKAYVSVFYRGRCYCRCLRC；
3）酶解：在预处理后的草鱼鱼鳞中加入10~20倍体积水，再加入鱼鳞重量1~5%的壳聚糖固定化复合酶，于40~60℃，pH5.0~7.0，超声波辅助酶解1.0~3.0h，灭酶，过滤取酶解液。超声波频率为15~30kHZ，功率为100~300W，作用时间为1~5min；
4）超滤：先采用截留相对分子质量15~20kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量1~3kD的膜超滤；
5）冷冻干燥：将超滤后得到的滤过液冷到干燥得到胶原蛋白肽。得到胶原蛋白肽具有三股相互缠绕的α肽链（亚基）组成的特有三螺旋结构，链间氢键数量较多，三螺旋结构稳定性好，其交联程度较低，到达皮肤真皮层，使皮肤变得紧致细滑。具有较好的抗氧化作用，对DPPH·、超O2 -·、·OH自由基的清除率高，抗衰老效果明显。意外的具有抗肿瘤作用，在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。
实施例2：
从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的最优选方法，包括以下步骤：
1）鱼鳞预处理：将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白；
2）蛋白酶共固定化：取干燥壳聚糖粉末， 用pH6.5的70mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜，然后加入壳聚糖粉末质量1％的1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化0.7h，再加入壳聚糖粉末1.5倍体积的戊二醛偶联反应1.5h，用蒸馏水清洗6次，加入0.5~1.0mg/mL的大豆蛋白酶溶液和0.8~2.0mg/mL的菠萝蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌1h ，然后放置冰箱中过夜，次日用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复合酶。大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液的加入量均为壳聚糖粉末体积的4倍。冰浴搅拌的过程中加入壳聚糖重量2%的活性短肽，活性短肽的氨基酸序列为SCASVCGYKAYVSVFYRGRCYCRCLRC；
3）酶解：在预处理后的草鱼鱼鳞中加入15倍体积水，再加入鱼鳞重量3%的壳聚糖固定化复合酶，于50℃，pH6.0，超声波辅助酶解1.8h，灭酶，过滤取酶解液。超声波频率为20kHZ，功率为200W，作用时间为3min；
4）超滤：先采用截留相对分子质量20kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量2kD的膜超滤；
5）冷冻干燥：将超滤后得到的滤过液冷到干燥得到胶原蛋白肽。得到胶原蛋白肽具有三股相互缠绕的α肽链（亚基）组成的特有三螺旋结构，链间氢键数量较多，三螺旋结构稳定性好，其交联程度较低，到达皮肤真皮层，使皮肤变得紧致细滑。具有较好的抗氧化作用，对DPPH·、超O2 -·、·OH自由基的清除率高，抗衰老效果明显。意外的具有抗肿瘤作用，在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浦江县欧立生物技术有限公司
<120> 从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工合成(Mytilus coruscus)
<400> 1
Ser Cys Ala Ser Val Cys Gly Tyr Lys Ala Tyr Val Ser Val Phe Tyr
1 5 10 15
Arg Gly Arg Cys Tyr Cys Arg Cys Leu Arg Cys
20 25
Claims (7)
1.从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括鱼鳞预处理、蛋白酶共固定化、酶解、超滤和冷冻干燥，其特征在于：所述的蛋白酶共固定化步骤为：取干燥壳聚糖粉末， 用pH6.0~6.8的60~80mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜，然后加入壳聚糖粉末质量0.7~1.2％的1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化0.5~0.9h，再加入壳聚糖粉末1~2倍体积的戊二醛偶联反应1~1.8h，用蒸馏水清洗5~8次，加入大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液，于冰浴中缓慢搅拌0.5~1.5h ，然后放置冰箱中过夜，次日用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化复合酶。
2.根据权利要求1所述的从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的大豆蛋白酶溶液和菠萝蛋白酶溶液的浓度分别为0.5~1.0mg/mL和0.8~2.0mg/mL，加入量均为壳聚糖粉末体积的2~8倍。
3.根据权利要求1所述的从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的冰浴搅拌的过程中加入壳聚糖重量1~3%的活性短肽；所述活性短肽的氨基酸序列为SCASVCGYKAYVSVFYRGRCYCRCLRC。
4.根据权利要求1所述的从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的鱼鳞预处理步骤为：将新鲜鱼鳞浸泡洗净、烘干、粉碎、筛网、脱钙，脱除鱼银、色素物质和可溶性杂蛋白。
5.根据权利要求1所述的从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的酶解步骤为：在预处理后的草鱼鱼鳞中加入10~20倍体积水，再加入鱼鳞重量1~5%的壳聚糖固定化复合酶，于40~60℃，pH5.0~7.0，超声波辅助酶解1.0~3.0h，灭酶，过滤取酶解液。
6.根据权利要求5所述的从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的超声波频率为15~30kHZ，功率为100~300W，作用时间为1~5min。
7.根据权利要求1所述的从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的超滤步骤为：先采用截留相对分子质量15~20kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量1~3kD的膜超滤。
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