CN113897409B - 一种鱼糜抗冻小分子肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼糜抗冻小分子肽的制备方法，涉及水产品加工技术领域；包括以下步骤：(1)以大黄鱼为原料，将大黄鱼去头和内脏，粉碎成肉糜，肉糜经脱钙处理后，用水提取水溶性粗蛋白，冷冻干燥后获得大黄鱼水提粗蛋白粉；(2)将步骤(1)得到的大黄鱼水提粗蛋白粉加水复溶，再加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；(3)将步骤(2)得到的酶解液进行超声处理，再经透析处理，得到分子量不超过3500D的透析液，冷冻干燥，得到所述鱼糜抗冻小分子肽。本发明将大黄鱼鱼骨与鱼肉中的抗冻肽一同提取，制备的鱼糜抗冻小分子肽有良好的抗冻活性，与商业抗冻剂效果相当。
Description
技术领域
本发明涉及水产品加工技术领域，特别是涉及一种鱼糜抗冻小分子肽的制备方法。
背景技术
目前，鱼或鱼糜制品通常采用冷链运输来提高其销售半径。但在鱼或鱼糜制品冻藏过程中会发生鱼肉口感下降，鱼肉中的蛋白和脂肪也会发生氧化，从而导致鱼或鱼糜制品的价值和品质的降低。为了保持鱼或鱼糜制品的品质，通常会添加如蔗糖、麦芽糊精等抗冻剂，这些抗冻剂会改变鱼或鱼糜制品的口感和品质。因此，寻找新型的高效、健康、天然而不改变品质的抗冻剂成为了鱼或鱼糜制品储运过程中的一重大问题。
大黄鱼是一种营养丰富的水产品。大多栖息于中底层水域。大黄鱼蛋白的营养价值高且具有良好的抗氧化活性，抗炎活性及抗肿瘤活性。值得一提的是，大黄鱼有一定的药用价值，是一些中、西成药的原料。鱼鳔炒炼焙黄制成中药“鱼鳔胶珠”可治疗消化性溃病、肾结石等。越来越多的证据表明，蛋白质含量高的水产品通过消化酶解转化为小生物活性肽更加易于人体吸收，进而食用高蛋白质的水产品对人体有很大的益处。
目前对于抗冻活性的研究，一些抗冻蛋白可以通过对热滞后冰重结晶的抑制来改变冰晶生长,从而减少鱼或鱼糜中细胞器的损伤进而表现出抗冻活性。但是，由于抗冻蛋白不易被吸收，其有效抗冻活性的结构不容易暴露。抗冻蛋白水溶性也相对较差，不容易应用于鱼或鱼糜制品中，很难达到应用工业生产的目的。一些研究表明大分子多肽相对于小分子多肽的活性差。现有从鱼类中提取抗冻肽的技术中多以单独的鱼皮、鱼肉或鱼骨为原料，很少进行全鱼提取，并且提取过程中需要剥除鱼皮、剔除鱼骨，操作复杂，不适于实际生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种鱼糜抗冻小分子肽的制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，根据本发明的制备方法可以获得具有抗冻活性的大黄鱼小分子多肽产品。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鱼糜抗冻小分子肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)大黄鱼水提粗蛋白粉的制备
以大黄鱼为原料，将大黄鱼去头和内脏，粉碎成肉糜，肉糜经脱钙处理后，用水提取水溶性粗蛋白，冷冻干燥后获得大黄鱼水提粗蛋白粉；
(2)酶解
将步骤(1)得到的大黄鱼水提粗蛋白粉加水复溶，再加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
(3)超声处理和小分子截留
将步骤(2)得到的酶解液进行超声处理，再经透析处理，得到分子量不超过3500D的透析液，冷冻干燥，得到所述鱼糜抗冻小分子肽。
进一步地，在步骤(1)中，所述脱钙处理为利用EDTA脱钙液进行脱钙处理。
进一步地，所述EDTA脱钙液的浓度为0.25mol/L。
进一步地，在步骤(1)中，用水提取水溶性粗蛋白时，脱钙处理后的肉糜与水的质量比为1：5～10。
进一步地，在步骤(2)中，加水复溶时所述大黄鱼水提粗蛋白粉与水的质量比为1:40～120。
进一步地，在步骤(2)中，所述蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。
进一步地，在步骤(2)中，所述酶解的温度为30～50℃，酶解时间为1～6h。
进一步地，在步骤(3)中，所述超声为依次用100～200W功率超声5～30min，200～400W功率超声5～30min，100～200W功率超声5～30min。
进一步地，在步骤(3)中，所述透析处理为使用500～3500D的透析袋进行透析。
进一步地，在步骤(1)中，所述冷冻干燥采用梯度变温方式进行：第一段：-65℃～-50℃预冻3～5h；第二段：-50℃～-40℃冷冻1～3h；第三段：-40℃～-25℃冷冻1～2h；第四段：-25℃～-5℃冷冻1～2h；第五段：5℃～15℃干燥1～2h；第六段：15℃～20℃干燥1～2h；第七段：20℃～25℃干燥1～2h。
本发明公开了以下技术效果：
(1)大黄鱼是一种来源广泛的，常见的水产品，以大黄鱼为原料取材容易，安全无副作用，可显著降低生产成本，满足大规模生产的需要。
(2)本发明将生物酶解的方法结合变频超声技术，达到了有效提取小分子多肽的目的，操作简单，生产条件温和。
(3)本发明对提取的水溶性蛋白采取冷冻干燥处理，可以提升鱼糜抗冻小分子肽的抗冻活性性能。
(4)本发明将大黄鱼鱼骨与鱼肉中的抗冻肽一同提取，简化了鱼的处理过程，同时制备的鱼糜抗冻小分子肽还具有了更好的抗冻活性。
(5)本发明仅通过添加极微量的鱼糜抗冻小分子肽，即可达到甚至优于传抗冻剂大量添加蔗糖的效果，且本身就源自于水产品、抑腥增香，效果相较传统抗冻剂更佳。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为经过不同处理的鱼肉的汁液流失率检测结果；
图2为经过不同处理的鱼肉的气味变化检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)大黄鱼水提粗蛋白的制备
以大黄鱼为原料，将大黄鱼去头和内脏，粉碎成肉糜，在浓度为0.25mol/L的EDTA脱钙液中脱钙处理12h，用水洗至中性，得到脱钙处理后的肉糜。取脱钙处理后的肉糜550g，加入5500g水，使用匀浆机在10000rpm，匀浆10min，再在4℃条件下，以40rpm速度搅拌6h提取蛋白，10000G离心30min，得到的水提粗蛋白溶液。
(2)冷冻干燥
将步骤(1)得到的水提粗蛋白溶液采用梯度变温方式进行冷冻干燥，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3h，第二段：-50℃冷冻3h，第三段：-40℃冷冻2h，第四段：-5℃冷冻1h，第五段：10℃干燥2h，第六段：20℃干燥2h，第七段：25℃干燥2h。在第二段时间进行抽真空，在第七段时间进行恒温。真空泵启动温度为-65℃，隔板温度设定为-23℃，得到大黄鱼水提粗蛋白粉10g。
(3)大黄鱼抗冻肽的制备
将步骤(2)得到的大黄鱼水提粗蛋白粉，加入800g水复溶，再加入胰蛋白酶5000U/g(相对于水提粗蛋白粉)，在温度37℃下酶解5h，得到酶解液。
(4)变频超声处理
将步骤(3)得到的酶解液进行变频超声：100W功率超声5min，200W功率超声5min，100W功率超声5min，得到均匀溶于水的大黄鱼混合肽溶液。
(5)小分子截留
将步骤(4)得到的大黄鱼混合肽溶液置于3000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，双蒸水的用量为大黄鱼混合肽溶液的100倍，每12h更换一次双蒸水，共透析24h，得到透析液。
(6)冷冻干燥
将步骤(5)得到的透析液进行冷冻干燥：第一段：-60℃预冻3h；第二段：-50℃冷冻3h；第三段：-40℃冷冻2h；第四段：-5℃冷冻1h；第五段：10℃干燥2h；第六段：20℃干燥2h；第七段：25℃干燥2h。在第二段时间进行抽真空，在第七段时间进行恒温。真空泵启动温度为-65℃，隔板温度设定为-23℃，得到鱼糜抗冻小分子肽6g。
实施例2
(1)大黄鱼水提粗蛋白的制备
以大黄鱼为原料，将大黄鱼去头和内脏，粉碎成肉糜，在浓度为0.25mol/L的EDTA脱钙液中脱钙处理12h，用水洗至中性，得到脱钙处理后的肉糜。取脱钙处理后的肉糜450g，加入2250g水，使用匀浆机在10000rpm，匀浆10min，再在4℃条件下，以40rpm搅拌6h提取蛋白，10000G离心30min，得到的水提粗蛋白溶液。
(2)冷冻干燥
将步骤(1)得到的水提粗蛋白溶液采用梯度变温方式进行冷冻干燥，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-65℃预冻3h，第二段：-50℃冷冻1h，第三段：-40℃冷冻1h，第四段：-25℃冷冻1h，第五段：5℃干燥1h，第六段：15℃干燥1h，第七段：20℃干燥1h。在第二段时间进行抽真空，在第七段时间进行恒温。真空泵启动温度为-65℃，隔板温度设定为-23℃，得到大黄鱼水提粗蛋白粉8g。
(3)大黄鱼抗冻肽的制备
将步骤(2)得到的大黄鱼水提粗蛋白粉，加入320g水复溶，再加入胃蛋白酶5000U/g(相对于水提粗蛋白粉中蛋白含量)，在温度30℃下酶解1h，得到酶解液。
(4)变频超声处理
将步骤(3)得到的酶解液进行变频超声：100W功率超声5min，200W功率超声5min，100W功率超声5min，得到均匀溶于水的大黄鱼混合肽溶液。
(5)小分子截留
将步骤(4)得到的大黄鱼混合肽溶液置于500D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，双蒸水的用量为大黄鱼混合肽溶液的100倍，每12h更换一次双蒸水，共透析24h，得到透析液。
(6)冷冻干燥
将步骤(5)得到的透析液进行冷冻干燥：第一段：-65℃预冻3h，第二段：-50℃冷冻1h，第三段：-40℃冷冻1h，第四段：-25℃冷冻1h，第五段：5℃干燥1h，第六段：15℃干燥1h，第七段：20℃干燥1h。在第二段时间进行抽真空，在第七段时间进行恒温。真空泵启动温度为-65℃，隔板温度设定为-23℃，得到鱼糜抗冻小分子肽4.5g。
实施例3
(1)大黄鱼水提粗蛋白的制备
以大黄鱼为原料，将大黄鱼去头和内脏，粉碎成肉糜，在浓度为0.25mol/L的EDTA脱钙液中脱钙处理12h，用水洗至中性，得到脱钙处理后的肉糜。取脱钙处理后的肉糜800g，加入8000g水，使用匀浆机在10000rpm，匀浆10min，再在4℃条件下，以40rpm搅拌6h提取蛋白，10000G离心30min，得到的水提粗蛋白溶液。
(2)冷冻干燥
将步骤(1)得到的水提粗蛋白溶液采用梯度变温方式进行冷冻干燥，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-50℃预冻5h，第二段：-40℃冷冻3h，第三段：-25℃冷冻2h，第四段：-5℃冷冻2h，第五段：15℃干燥2h，第六段：20℃干燥2h，第七段：25℃干燥2h。在第二段时间进行抽真空，在第七段时间进行恒温。真空泵启动温度为-65℃，隔板温度设定为-23℃，得到大黄鱼水提粗蛋白粉14.5g。
(3)大黄鱼抗冻肽的制备
将步骤(2)得到的大黄鱼水提粗蛋白粉，加入1740g水复溶，再加入胰蛋白酶5000U/g(相对于水提粗蛋白粉中蛋白含量)，在温度50℃下酶解6h，得到酶解液。
(4)变频超声处理
将步骤(3)得到的酶解液进行变频超声：200W功率超声30min，400W功率超声30min，200W功率超声30min，得到均匀溶于水的大黄鱼混合肽溶液。
(5)小分子截留
将步骤(4)得到的大黄鱼混合肽溶液置于3500D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，双蒸水的用量为大黄鱼混合肽溶液的100倍，每12h更换一次双蒸水，共透析24h，得到透析液。
(6)冷冻干燥
将步骤(5)得到的透析液进行冷冻干燥：第一段：-50℃预冻5h，第二段：-40℃冷冻3h，第三段：-25℃冷冻2h，第四段：-5℃冷冻2h，第五段：15℃干燥2h，第六段：20℃干燥2h，第七段：25℃干燥2h。在第二段时间进行抽真空，在第七段时间进行恒温。真空泵启动温度为-65℃，隔板温度设定为-23℃，得到鱼糜抗冻小分子肽9g。
对比例1
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中将大黄鱼的鱼骨、头和内脏一同去除，仅剩余鱼肉。本对比例制备得到鱼糜抗冻小分子肽5.6g。
对比例2
同实施例1，区别仅在于，在步骤(1)中将大黄鱼的鱼肉、头和内脏一同去除，仅剩余鱼骨。本对比例制备得到鱼糜抗冻小分子肽0.4g。
对比例3
同实施例1，区别仅在于，步骤(1)得到的水提粗蛋白溶液不经冻干处理，直接加入酶进行酶解。本对比例制备得到鱼糜抗冻小分子肽6g。
对比例4
同实施例1，区别仅在于缺少步骤(4)。本对比例制备得到鱼糜抗冻小分子肽5.2g。
对比例5
同实施例1，区别仅在于，步骤(4)超声条件为100W功率超声15min。本对比例制备得到鱼糜抗冻小分子肽5.6g。
抗冻活性检测
将源自同一部位的新鲜鱼肉切成大小均一的鱼块(1cm*1cm*0.5cm)，分别按表1的处理方法进行处理，之后用质构仪测定TPA质构特性，p/50探头；测前，测中，测后速度均为1mm/s；位移2mm；5×g触发力，得到其硬度、弹性、黏聚性、咀嚼度及回复性，检测结果见表2。从表2可以看出，单独从鱼骨或鱼肉提取的鱼糜抗冻小分子肽，抗冻效果较差，而鱼骨和鱼肉共同提取的鱼糜抗冻小分子肽能够达到很好的抗冻效果；对提取的水溶性蛋白采取冷冻干燥处理，可以从弹性、咀嚼度和回复性方面提升鱼糜抗冻小分子肽的抗冻活性性能。
表1
表2
| 项目 | 硬度，g | 弹性，mm | 黏聚性，g | 咀嚼度，mJ | 回复性，mm |
| 新鲜 | 51.5 | 1.12 | 0.49 | 22.0 | 0.28 |
| 空白 | 36.2 | 0.80 | 0.36 | 18.1 | 0.20 |
| 蔗糖 | 42.1 | 0.92 | 0.42 | 18.0 | 0.17 |
| 实施例1 | 48.9 | 1.08 | 0.48 | 21.2 | 0.24 |
| 实施例2 | 47.7 | 1.02 | 0.45 | 21.0 | 0.22 |
| 实施例3 | 46.0 | 1.00 | 0.43 | 20.8 | 0.22 |
| 对比例1 | 40.2 | 0.82 | 0.42 | 20.2 | 0.20 |
| 对比例2 | 43.8 | 0.96 | 0.40 | 20.1 | 0.24 |
| 对比例3 | 48.1 | 0.94 | 0.47 | 18.2 | 0.20 |
将源自同一部位的新鲜鱼肉切成大小均一的鱼块并称重(约5g)，再分别按表1的处理方法进行处理，之后将其表面液体拭干再次称重，得到其汁液流失率，检测结果见图1。从图1可以看出，单独从鱼骨或鱼肉提取的鱼糜抗冻小分子肽，持水力较差，而鱼骨和鱼肉共同提取的鱼糜抗冻小分子肽能够达到很好的持水效果；对提取的水溶性蛋白采取冷冻干燥处理，可以从持水性方面提升鱼糜抗冻小分子肽的抗冻活性性能。
将源自同一部位的新鲜鱼肉切成大小均一的鱼块并称重(约5g)，再分别按表1的处理方法进行处理，之后用德国PEN3型电子鼻传感器进行分析，得到其对十种类型物质的响应程度见表3，检测结果见图2。从图2可以看出，单独从鱼骨或鱼肉提取的鱼糜抗冻小分子肽，对腥味抑制较差，而鱼骨和鱼肉共同提取的鱼糜抗冻小分子肽能够达到去腥、增香的效果，以良好的抑制水产品的腥味、增加肉香、提升整体的香气，对整体香味的和谐有一定的贡献；对提取的水溶性蛋白采取冷冻干燥处理，可以从维持风味方面提升鱼糜抗冻小分子肽的抗冻活性性能。
表3
| 传感器名称 | 性能描述 |
| W1C | 芳香成分苯类 |
| W5S | 氮氧化合物 |
| W3C | 氨类、芳香成分 |
| W6S | 氢化物 |
| W5C | 短链烷烃芳香成分 |
| W1S | 甲基类 |
| W1W | 无机硫化物 |
| W2S | 醇类、醛酮类 |
| W2W | 有机硫化物、芳香成分 |
| W3S | 长链烷烃 |
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种鱼糜抗冻小分子肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)大黄鱼水提粗蛋白粉的制备
以大黄鱼为原料，将大黄鱼去头和内脏，粉碎成肉糜，肉糜经脱钙处理后，用水提取水溶性粗蛋白，冷冻干燥后获得大黄鱼水提粗蛋白粉；
(2)酶解
将步骤(1)得到的大黄鱼水提粗蛋白粉加水复溶，再加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
(3)超声处理和小分子截留
将步骤(2)得到的酶解液进行超声处理，再经透析处理，得到分子量不超过3500D的透析液，冷冻干燥，得到所述鱼糜抗冻小分子肽；
在步骤(2)中，所述酶解的温度为30～50℃，酶解时间为1～6h；
在步骤(3)中，所述超声为依次用100～200W功率超声5～30min，200～400W功率超声5～30min，100～200W功率超声5～30min。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述脱钙处理为利用EDTA脱钙液进行脱钙处理。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA脱钙液的浓度为0.25mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，用水提取水溶性粗蛋白时，脱钙处理后的肉糜与水的质量比为1：5～10。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，加水复溶时所述大黄鱼水提粗蛋白粉与水的质量比为1：40～120。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述透析处理为使用500～3500D的透析袋进行透析。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述冷冻干燥采用梯度变温方式进行：第一段：-65℃～-50℃预冻3～5h；第二段：-50℃～-40℃冷冻1～3h；第三段：-40℃～-25℃冷冻1～2h；第四段：-25℃～-5℃冷冻1～2h；第五段：5℃～15℃干燥1～2h；第六段：15℃～20℃干燥1～2h；第七段：20℃～25℃干燥1～2h。
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