CN103555803A - 一种鱼皮抗冻蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鱼皮抗冻蛋白的制备方法，由该方法得到的鱼皮抗冻蛋白以及它的应用。所述方法包括：将鱼皮打浆，得到的鱼皮浆与水混合后磨成鱼皮浆液；将鱼皮浆液离心，去除上层脂肪得到去脂鱼皮浆液；将去脂鱼皮浆液进行超声波处理；将超声波处理后的去脂鱼皮浆液与复合蛋白酶混合，进行酶解反应；保温、冷却并离心，收集上清液；将上清液经过超滤处理，得到鱼皮蛋白液；将鱼皮蛋白液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼皮抗冻蛋白。本发明针对目前抗冻蛋白产品开发的现状，以鱼皮为原料，经过大量的实验，开发了一种简单高效的鱼皮抗冻蛋白的制备方法；得到的鱼皮抗冻蛋白具有较好的特定抗冻功能，较易实现产业化生产，具有巨大的应用前景和市场价值。

Description

一种鱼皮抗冻蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水产食品加工领域，具体地，涉及一种以鱼皮为原料制备抗冻蛋白的方法，由该方法得到的鱼皮抗冻蛋白，以及该鱼皮抗冻蛋白的应用。

背景技术

抗冻蛋白（Antifreeze Protein,AFP），又称热滞蛋白（ThermalHysteresis Protein,THP），冰结合蛋白（Ice Binding Proteins）或冰晶组织蛋白（Ice Structuring Proteins）。抗冻蛋白能通过与特定的冰晶表面结合，非依数性地降低溶液的冰点或者抑制冰晶生长，具有低温保护功能。抗冻蛋白可用于人体或动物器官的超低温保存，改善其冷冻质量；可提高特定微生物的抗冻能力，减小食品冻藏时冰晶的形成和重结晶对食品结构的破坏，改善食品品质。抗冻蛋白可作为一种高级防冻剂应用，在医学、化妆品、生物和食品领域均有广泛的应用价值。

目前关于抗冻蛋白开发的国内外专利申请情况来看，国外专利申请方面，如：（1）JP2003057888公开了一种在低温下培养担子菌类而从其培养液中分离纯化高活性抗冻蛋白的方法；（2）JP2003142850公开了一些低值鱼类血中的抗冻蛋白以及它们的氨基酸序列和碱基序列；（3）EP9301969公开了一种获得抗冻蛋白基因的方法，并利用其在酵母中的表达生产抗冻蛋白多肽，而含有抗冻多肽的酵母可以用在冷冻面团等的生产中。

国内已有从小麦麸皮、沙冬青、牛皮、猪皮、昆虫中提取制备抗冻蛋白的相关专利申请，如：（1）CN200810072986.8（公开号：CN101392019A，公开日：2009年3月25日）公开了一种由采样、研磨、提取总蛋白、离子交换层析初步分离抗冻蛋白、凝胶过滤系统再次分离抗冻蛋白及脱盐等步骤组成的提取分离沙冬青叶片抗冻蛋白的方法；（2）CN200610166427.4（公开号：CN1995062A，公开日：2007年7月11日）公开了一种经水提取、硫酸氨沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和冷冻干燥等步骤，分离得到小麦麸皮抗冻蛋白的方法；（3）CN201010277569.4（公开号：CN101921328A，公开日：2010年12月22日）公开了一种由碱性蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白制备得到的特异性抗冻多肽的氨基酸全序列：Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Arg；（4）CN201010277410.2（公开号：CN101921311A，公开日：2010年12月22日）公开了一种由木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白制备的特异性抗冻多肽的氨基酸全序列：HyP-Gly-Met-Hyl-Gly-His-Arg–Gly；（5）CN200380107092.3（公开号：CN1729295，公开日：2006年2月1日）公开了一种通过降低蛋白糖基化程度来提高III型抗冻蛋白特异活性的方法；（6）CN201110091198.5（公开号：CN102177872A，公开日：2011年9月14日）公开了一种昆虫抗冻蛋白源的获取方法；（7）CN200780008726.8（公开号：CN101400695，公开日：2009年4月1日）公开了一种来自甲壳类的具有抗冻活性的蛋白质的制备方法；（8）CN97181371.X（公开号：CN1244895，公开日：2000年2月16日）公开了一种胡萝卜抗冻多肽的制备方法。

目前国内外未见利用鱼皮资源制备抗冻蛋白及蛋白多肽的文献报道，若能开发出一种利用鱼皮资源制备抗冻蛋白，并且简单高效的方法，得到的抗冻蛋白具有特定抗冻功能，势必将会有巨大的应用前景和市场价值。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于，提供一种鱼皮抗冻蛋白的制备方法。

本发明的另一目的在于，提供一种由所述方法得到的鱼皮抗冻蛋白。

本发明的又一目的在于，提供所述鱼皮抗冻蛋白的应用。

为了实现上述目的，本发明提供的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）将鱼皮打浆，得到的鱼皮浆与水混合后磨成鱼皮浆液；将所述鱼皮浆液（研磨后的）离心，去除上层脂肪，得到去脂鱼皮浆液；

（2）将所述去脂鱼皮浆液进行超声波处理；

（3）将超声波处理后的去脂鱼皮浆液与复合蛋白酶混合，进行酶解反应；然后保温、冷却并离心，收集上清液；

（4）将所述上清液经过超滤处理，得到鱼皮蛋白液；

（5）将所述鱼皮蛋白液通过浓缩、冷冻干燥，得到所述鱼皮抗冻蛋白。

其中，步骤（1）中，所述水的用量为鱼皮浆重量的1.0～3.0倍。

其中，步骤（1）中，将鱼皮浆液通过4000～6000克离心5～15分钟，优选8～12分钟。

其中，步骤（1）中，所述鱼皮若选用冷冻鱼皮，需进行解冻10～15小时。新鲜的鱼皮也可以使用，但一般条件下选取冷冻鱼皮。

进一步地，所述鱼皮若选用冷冻鱼皮，在7℃的条件下解冻。

其中，步骤（1）中，用水温为10℃的水清洗鱼皮。

其中，步骤（2）中，超声波处理的时间为10～15分钟。

其中，步骤（2）中，所述超声波功率为700～1000w、频率为20～25KHz；超声波功率优选为800～1000w。

其中，步骤（3）中，所述复合蛋白酶的用量为鱼皮重量的0.1～0.5%，优选0.2～0.5%。

其中，步骤（3）中，所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶，碱性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为(1～2):1。

其中，步骤（3）中，所述酶解反应的条件包括：温度为45～55℃，pH值为7.0～8.0，反应时间为0.3～1.5小时；pH值优选7.2～8.0，反应时间优选0.5～1.0。

进一步地，在酶解反应过程中，pH值用1mol/L的NaOH或HCl来调节。

其中，步骤（3）中，在90～95℃下保温3～5分钟，冷却至室温，并且在4000～6000克条件下离心5～10分钟。

其中，步骤（4）中，超滤处理为二步超滤方法：先后利用孔径为0.5μm和0.2μm的陶瓷膜进行超滤。

进一步地，先利用孔径为0.5μm的陶瓷膜超滤所述上清液取滤过液，再利用孔径为0.2μm的陶瓷膜超滤所述滤过液取截留液。

上述制备方法中，步骤（4）所述鱼皮蛋白液和步骤（5）所述鱼皮抗冻蛋白的分子量为8000～15000道尔顿。

本发明提供的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，优选地，包括以下步骤：

（1）选用冷冻鱼皮，在7℃的条件下进行解冻10～15小时，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮，清洗水温为10℃；鱼皮清洗后，用打浆机将鱼皮打成浆；然后在打好的鱼皮浆中加入1.0～3.0倍鱼皮浆重量的水，利用胶体磨磨成鱼皮浆液，通过4000～6000克离心5～15分钟，去除上层脂肪，得到去脂鱼皮浆液；

（2）将所述去脂鱼皮浆液置于超声波发生器中，经过功率为700～1000w、频率为20～25KHz的超声波处理10～15分钟；用超声波处理的目的是改变鱼皮蛋白的组织结构；

（3）按照鱼皮重量0.1～0.5%的重量百分比的比例，向经过超声波处理后的去脂鱼皮浆液中加入复合蛋白酶；所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成，两者的质量比为(1～2)：1；在45～55℃、pH值为7.0～8.0的条件下进行酶解反应0.3～1.5小时；然后在90～95℃下保温3～5分钟，冷却至室温，并且在4000～6000克条件下离心5～10分钟，收集上清液；所述上清液中的鱼皮蛋白分子量为1000～80000。

（4）将步骤（3）得到的上清液经过二步超滤方法进行处理：先利用孔径为0.5μm的陶瓷膜超滤所述上清液取滤过液；再利用孔径为0.2μm的陶瓷膜超滤所述滤过液取截留液，即得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液；

（5）取分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液，通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮抗冻蛋白。

上述制备方法中：

步骤（1）中，优选将鱼皮浆液通过5000～6000克离心8～12分钟。

步骤（2）中，超声波功率优选为800～1000w。

步骤（3）中，所述复合蛋白酶的用量优选为鱼皮重量的0.2～0.5%。

步骤（3）中，酶解反应中，pH值优选7.2～8.0，反应时间优选0.5～1.0。

本发明中，所述鱼皮为：鳕鱼、草鱼或罗非鱼鱼皮等。但不限于这些品种的鱼的鱼皮。

本发明还提供一种由上述任意一项方法制备得到的鱼皮抗冻蛋白。

其中，所述鱼皮抗冻蛋白的分子量为8000～15000道尔顿。

其中，所述鱼皮抗冻蛋白中，蛋白质含量大于90%，优选93～95%。

本发明还提供一种抗冻保护剂，包含上述鱼皮抗冻蛋白。

其中，鱼皮抗冻蛋白在抗冻保护剂中的重量百分含量为2～6%，优选3～5%，更优选5%。

其中，所述抗冻保护剂还包含：蔗糖和甘油，两者在抗冻保护剂中的重量百分含量分别为2～6%和3～7%，优选为5%。

本发明提供一种抗冻保护剂，包含以下重量百分比的组分：所述鱼皮抗冻蛋白3%，蔗糖5%，甘油5%。

本发明提供的上述任意一项抗冻保护剂，还可以含有其它物质，如：海藻糖、三聚磷酸钠或海藻酸钠。

本发明还提供所述鱼皮抗冻蛋白和抗冻保护剂在微生物或冷冻食品低温冷冻保护中的应用。

其中，所述微生物与抗冻保护剂的体积比为（3～5）：1，优选3:1。

其中，所述冷冻食品为冷冻鱼糜或冰淇淋。

本发明具有的优点如下：

（1）本发明开发的鱼皮抗冻蛋白制备方法简单，较易实现产业化生产，有效地解决目前抗冻蛋白难以实现产业化生产的问题。

（2）将鱼皮浆液去脂，可以提高超声波处理和酶解的效果。

（3）本发明开发的抗冻蛋白具有较好的抗冻功能，可以提高冷冻干燥微生物的活率10%以上。

（4）本发明利用超声波技术处理鱼皮蛋白浆，机械机制作用是超声波由于高辐射压强和高超声压强的作用对介质产生振动和冲击，使得蛋白质变性，细胞组织变形，某些化学键断裂，生物分子裂解；从而可以明显改善鱼皮蛋白的结构，提高鱼皮蛋白的抗冻能力和产品的得率。

（5）本发明开发的鱼皮抗冻蛋白产品安全，采用食品级复合蛋白酶，尤其是中性蛋白酶和碱性蛋白酶的组合；在温和条件下，经过适度酶解即获得特定分子量的鱼皮蛋白，不加任何添加剂，为100%鱼皮蛋白。

（6）本发明开发的抗冻蛋白，能广泛应用于微生物等的低温冷冻保护作用、改善冰淇淋的组织结构，具有优于现有技术的保护作用。

总之，本发明针对目前抗冻蛋白产品开发的现状，以鱼皮为原料，经过大量的实验，开发了一种简单高效的鱼皮抗冻蛋白的制备方法；得到的鱼皮抗冻蛋白具有较好的特定抗冻功能，较易实现产业化生产，具有巨大的应用前景和市场价值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中的室温均为25℃。

本发明中未提及的操作均为本领域的常规操作。

本发明的实施例中，所述碱性蛋白酶和中性蛋白酶购自北京东华强盛生物技术有限公司，陶瓷膜购自江苏久吾高科技股份有限公司。

本发明中，所用的水均为符合饮用水卫生标准的清洁水。

本发明中的pH值均用用1mol/L的NaOH或HCl来调节。

本发明中所使用的其他物料均为可以从市场上购买得到的常规物料。所使用的设备也为本领域的常规设备。

本发明中，鱼皮抗冻蛋白产品的蛋白质含量测定采用凯氏定氮法（GB5009.5-2010）。

在本发明中，将鱼皮打成鱼皮浆，重量没有损失。

本发明中，蛋白质含量的单位“%”为重量百分比。

本发明中，得到的上清液中鱼皮蛋白的分子量1000～80000道尔顿，鱼皮蛋白液和鱼皮抗冻蛋白产品的分子量8000～15000道尔顿，均是占相应产物（上清液、鱼皮蛋白液和鱼皮抗冻蛋白产品）95%以上的蛋白的分子量。

实施例1：草鱼鱼皮抗冻蛋白的制备方法

（1）选用冷冻草鱼鱼皮100克，在7℃的条件下进行解冻12小时，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮，清洗水温为10℃；鱼皮清洗后，用打浆机将鱼皮打成浆；然后在打好的鱼皮浆中加入1.5倍鱼皮浆重量的水150克，利用胶体磨磨成鱼皮浆液，通过6000g离心8min，去除上层脂肪，得到去脂鱼皮浆液245克。

（2）将步骤（1）得到的去脂鱼皮浆液置于超声波发生器中，经过功率为800w、频率为25KHz的超声波处理10分钟，用以改变鱼皮蛋白的组织结构。

（3）按照鱼皮重量0.2%的重量百分比的比例，向经过步骤（2）超声波处理后的去脂鱼皮浆液中加入复合蛋白酶0.2克；复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成，两者的质量比为1:1；在50℃、pH值为7.5的条件下进行酶解0.5h；然后在95℃下保温3分钟，冷却至室温，并且在4000g条件下离心10min，收集上清液，得到上清液143克。上清液中的鱼皮蛋白分子量为1000～80000道尔顿。

（4）将步骤（3）得到的上清液143克经过二步超滤方法进行处理，先利用孔径为0.5μm的陶瓷膜超滤上清液取滤过液，将分子量小于15000的蛋白和多肽分离出来；再利用孔径为0.2μm的陶瓷膜超滤上次超滤得到的滤过液取截留液，将分子量为8000～15000道尔顿的蛋白截留出来，即得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液85克。

（5）取步骤（4）获得的分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液，通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮抗冻蛋白5.2克。

鱼皮抗冻蛋白产品的蛋白质含量为93.8%（重量百分比）。

实施例2：鳕鱼鱼皮抗冻蛋白的制备方法

（1）选用冷冻鳕鱼鱼皮200克，在7℃的条件下进行解冻10小时，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮，清洗水温为10℃；鱼皮清洗后，用打浆机将鱼皮打成浆；然后在打好的鱼皮浆中加入1.0倍鱼皮浆重量的水200克，利用胶体磨磨成鱼皮浆液，通过5000g离心12min，去除上层脂肪，得到去脂鱼皮浆液388克。

（2）将步骤（1）得到的去脂鱼皮浆液置于超声波发生器中，经功率为900w、频率为20KHz的超声波处理15分钟，用以改变鱼皮蛋白的组织结构。

（3）按照鱼皮重量0.3%的重量百分比的比例，向经过步骤（2）超声波处理后的去脂鱼皮浆液中加入复合蛋白酶0.6克；复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成，两者的质量比为1.5:1；在45℃、pH值为8.0的条件下进行酶解1.0h；然后在95℃下保温5分钟，冷却至室温，并且在5000g条件下离心10min，收集上清液，得到上清液195克。上清液中的鱼皮蛋白分子量为1000～80000道尔顿。

（4）将步骤（3）得到的上清液195克经过二步超滤方法进行处理，先利用孔径为0.5μm的陶瓷膜超滤上清液取滤过液，将分子量小于15000的蛋白和多肽分离出来；再利用孔径为0.2μm的陶瓷膜超滤上次超滤得到的滤过液取截留液，将分子量为8000～15000道尔顿的蛋白截留出来，即得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液125克。

（5）取步骤（4）获得的分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液，通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮抗冻蛋白9.8克。

鱼皮抗冻蛋白产品的蛋白质含量为94.8%。

实施例3：罗非鱼鱼皮抗冻蛋白的制备方法

（1）选用冷冻罗非鱼鱼皮100克，在7℃的条件下进行解冻15小时，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗鱼皮，清洗水温为10℃；鱼皮清洗后，用打浆机将鱼皮打成浆；然后在打好的鱼皮浆中加入3.0倍鱼皮浆重量的水300克，利用胶体磨磨成鱼皮浆液，通过4000g离心12min，去除上层脂肪，得到去脂鱼皮浆液390克。

（2）将步骤（1）得到的去脂鱼皮浆液置于超声波发生器中，经功率为1000w、频率为25KHz的超声波处理10分钟，用以改变鱼皮蛋白的组织结构。

（3）按照鱼皮重量0.5%的重量百分比的比例，向经过步骤（2）超声波处理后的去脂鱼皮浆液中加入复合蛋白酶0.5克；复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成，两者的质量比为2:1；在55℃、pH值为7.2的条件下进行酶解0.5h；然后在90℃下保温5分钟，冷却至室温，并且在6000g条件下离心5min，收集上清液，得到上清液305克。上清液中的鱼皮蛋白分子量为1000～80000道尔顿。

（4）将步骤（3）得到的上清液282克经过二步超滤方法进行处理，先利用孔径为0.5μm的陶瓷膜超滤上清液取滤过液，将分子量小于15000的蛋白和多肽分离出来；再利用孔径为0.2μm的陶瓷膜超滤上次超滤得到的滤过液取截留液，将分子量为8000～15000道尔顿的蛋白截留出来，即得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液168克。

（5）取步骤（4）获得的分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮蛋白液，通过浓缩、冷冻干燥，得到分子量为8000～15000道尔顿的鱼皮抗冻蛋白5.3克。

鱼皮抗冻蛋白产品的蛋白质含量为94.2%。

实验例1：鱼皮抗冻蛋白对微生物抗冻保护效果的测定

将离心浓缩后的乳酸菌菌体（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）分别添加不同冻干保护剂（即本发明实施例1～3得到的鱼皮抗冻蛋白产品，重量百分比分别为5%的蔗糖和甘油的冻干保护剂产品，以及两者的组合，其中本发明实施例的鱼皮抗冻蛋白用量为3～5%的重量百分比）后（冻干时菌体浓缩液与冻干保护剂溶液的比例为3:1(v/v)），置于-40℃的冻干机中，待菌液冻结后，于0.01mbar的真空度下冷冻干燥48小时，然后在适当条件下复水，测定菌体存活率。测定结果如表1所示。

表1：冻干保护剂的筛选实验结果

由表1的实验结果可以看出：使用本发明的鱼皮抗冻蛋白，可以使菌体存活率大大提升，比使用蔗糖和甘油作为冻干保护剂可以提高10个百分点，比不加冻干保护剂提升40个百分点左右，比没有经过超声波处理得到的鱼皮蛋白也要高30个以上的百分点（说明如果不经过超声波处理，产品的抗冻效果明显不如经过超声波处理过的；超声波处理后，可以很好地酶解）；菌体存活率可以达到50%以上；若将本发明的鱼皮抗冻蛋白和蔗糖与甘油联合使用，可以使菌体存活率达到80%以上；其中以实施例2得到的鱼皮抗冻蛋白产品抗冻效果更优。

实验例2：鱼皮抗冻蛋白氨基酸的组成

本发明实施例1～3得到的鱼皮抗冻蛋白，各自的氨基酸组成情况

如下表所示：

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种鱼皮抗冻蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）将鱼皮打浆，得到的鱼皮浆与水混合后磨成鱼皮浆液；将所述鱼皮浆液离心，去除上层脂肪，得到去脂鱼皮浆液；

（2）将所述去脂鱼皮浆液进行超声波处理；

（3）将超声波处理后的去脂鱼皮浆液与复合蛋白酶混合，进行酶解反应；然后保温、冷却并离心，收集上清液；

（4）将所述上清液经过超滤处理，得到鱼皮蛋白液；

（5）将所述鱼皮蛋白液通过浓缩、冷冻干燥，得到所述鱼皮抗冻蛋白。

2.根据权利要求1所述的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，水的用量为鱼皮浆重量的1.0～3.0倍；将鱼皮浆液通过4000～6000克离心5～15分钟，优选8～12分钟。

3.根据权利要求1或2所述的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，超声波处理的时间为10～15分钟；超声波功率为700～1000w，频率为20～25KHz。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述复合蛋白酶的用量为鱼皮重量的0.1～0.5%；所述复合蛋白酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶，碱性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为(1～2):1。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，酶解反应的条件包括：温度为45～55℃，pH值为7.0～8.0，反应时间为0.3～1.5小时；pH值优选7.2～8.0，反应时间优选0.5～1.0。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，在90～95℃下保温3～5分钟，冷却至室温，并且在4000～6000克条件下离心5～10分钟。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的鱼皮抗冻蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，超滤处理为：先后利用孔径为0.5μm和0.2μm的陶瓷膜进行超滤。

8.由权利要求1～7任意一项所述方法制备得到的鱼皮抗冻蛋白，分子量为8000～15000道尔顿；其中蛋白质含量大于90%，优选93～95%。

9.一种抗冻保护剂，包含权利要求8所述的鱼皮抗冻蛋白，其特征在于，鱼皮抗冻蛋白在抗冻保护剂中的重量百分含量为2～6%，优选3～5%，更优选5%。

10.权利要求8所述的鱼皮抗冻蛋白和权利要求9所述的抗冻保护剂在微生物或冷冻食品的低温冷冻保护中的应用。