CN104046611A - 具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，通过反相体系制备得到磁性壳聚糖微球，用稀盐酸除去致孔剂得到磁性多孔壳聚糖，再通过与修饰剂反应在磁性多孔壳聚糖上接上摇臂，实现对酶的固定化。
Description
技术领域
本发明属于固定化酶载体的制备方法，具体涉及一种具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法。
背景技术
酶是一种具有催化功能的活性生物大分子，广泛应用于医药，发酵，化工，环保，检测等各个领域，与一般催化剂相比，酶具有催化效率高，底物专一性强，反应条件温和，反应过程便于控制的优点。但游离酶对环境敏感，难于与产物分离，另外难于重复使用。固定化酶可以克服上述游离酶的缺点。
对于固定化酶，载体材料的结构和性能对固定化酶的有效固载量、固载稳定性以及催化活性有着巨大的影响。壳聚糖由于其机械性能好,化学性能稳定,且具有可生物降解、固定化酶效率高等诸多优点而在固定化酶技术中广泛应用，壳聚糖分子结构中含有游离-NH2和-OH，不仅具有较高的生物活性，而且具有配位螯合功能。
柯叶芳等采用壳聚糖将脂肪酶固定于Fe3O4粒子表面制成磁性微球，并将其应用于(R,S)-1-苯乙醇的生物拆分该方法具有操作简便酶载量大且易分离，可广泛应用于各种生物催化反应。刘博等以壳聚糖、海藻酸钠为微载体制备材料，采用脉冲电场液滴工艺制备壳聚糖/海藻酸钙微胶囊应用于脂肪酶的固定化。但是以壳聚糖凝胶作为载体固定化酶时，液体流通性不好，难于进行长时间的连续操作；与壳聚糖联用的醛可能会使酶失活，壳聚糖自身也可能会被酶降解。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，通过反相体系制备得到磁性多孔壳聚糖微球，再通过与修饰剂反应在磁性多孔壳聚糖上接上摇臂，实现对酶的固定化。
技术方案
一种具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：配制质量分数为0.1～1％的Span-80液体石蜡溶液作为油相；
步骤2：将致孔剂和磁性纳米粒子分散在水中，加入壳聚糖及冰醋酸，混合溶解配成水相；所述致孔剂、磁性纳米粒子、壳聚糖、冰醋酸及水的质量比为1﹕1～0.4﹕1～6﹕10～50﹕400～1000；
步骤3：将得到的水相和油相按照质量比1﹕3～7混合搅拌20～60min，得到反相乳液；
步骤4：在反相乳液中加入戊二醛和0.1M的NaOH水溶液，升温至70～90℃，再加入等比例的戊二醛，反应6～12h，得到分散有黑褐色颗粒的溶液；所述戊二醛、NaOH水溶液与壳聚糖的质量比为0.05～0.5﹕1～5﹕1；
步骤5：对步骤4中得到的分散有黑褐色颗粒的溶液在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒；采用乙醇、0.1M的盐酸水溶液对黑褐色颗粒各洗涤三次，水洗至中性后干燥得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
步骤6：将修饰剂溶于甲醇和醋酸混合溶液中，再加入磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在室温下搅拌混合；所述甲醇和醋酸的体积比为1:1；所述修饰剂质量分数为0.2～1％；所述磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的质量分数为2～10％；
步骤7：调节步骤6体系的PH值为6～6.5，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥后得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
所述步骤2的搅拌速度为100～500r/min。
所述步骤6的搅拌混合为1h，搅拌速度为100～300r/min。
所述步骤2中的致孔剂为CaCO3、Mg(OH)2、BaCO3、Al(OH)3、Ca(OH)2、Al2O3中的一种或者几种的任意比混合。
所述步骤2中磁性纳米粒子为Fe3O4、Fe2O3、锰铁氧体、锌铁氧体中的一种或几种的任意比混合。
所述步骤6中的修饰剂为双氨基聚乙二醇、双羧基聚乙二醇、双醛基聚乙二醇或羧基-聚乙二醇-氨基。
有益效果
本发明提出的一种具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，通过反相体系制备得到磁性壳聚糖微球，用稀盐酸除去致孔剂得到磁性多孔壳聚糖，再通过与修饰剂反应在磁性多孔壳聚糖上接上摇臂，实现对酶的固定化。
附图说明
图1：摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备流程图
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
本发明实施例的技术方案：
步骤1：配制质量分数为0.1～1％的Span-80液体石蜡溶液作为油相；
步骤2：将致孔剂和磁性纳米粒子均匀分散在水中，并向其中加入壳聚糖及冰醋酸，充分混合溶解配成水相。其中致孔剂、磁性纳米粒子、壳聚糖、冰醋酸及水的质量比为1：1～0.4：1～6：10～50：400～1000；
步骤3：将得到的水相和油相按照质量比1：3～7在配有机械搅拌的三口瓶中混合，100～500r/min转速下机械搅拌20～60min，得到反相乳液；
步骤4：向上述反相乳液中先后加入戊二醛及0.1M的NaOH水溶液，其中戊二醛、NaOH水溶液与壳聚糖的质量比为0.05～0.5：1～5：1；将体系升温至70～90℃，再向其中加入等比例的戊二醛，反应6～12h，得到分散有黑褐色颗粒的溶液；
步骤5：步骤4中得到的分散有黑褐色颗粒的溶液在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒，该黑褐色颗粒经乙醇、0.1M的盐酸水溶液各洗涤三次，水洗至中性后干燥，即得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
步骤6：将修饰剂溶于体积比为1:1的甲醇、醋酸混合溶液中，修饰剂质量分数为0.2～1％，之后向其中加入质量分数为2～10％的磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，三口瓶中室温下搅拌1h，搅拌速度为100～300r/min；
步骤7：调节步骤6体系的PH值为6～6.5，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥即得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
步骤2中的致孔剂为CaCO3、Mg(OH)2、BaCO3、Al(OH)3、Ca(OH)2、Al2O3中的一种或者几种的任意比混合。
步骤2中磁性纳米粒子为Fe3O4、Fe2O3、锰铁氧体、锌铁氧体中的一种或几种的任意比混合。
步骤6中的修饰剂为双氨基聚乙二醇、双羧基聚乙二醇、双醛基聚乙二醇、羧基-聚乙二醇-氨基中的一种。
具体实施例如下：
实例1：摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备
将0.2g Span-80加入到200mL液体石蜡中作为油相；称取0.1g CaCO3、0.04gFe3O4纳米粒子均匀分散在60mL水中，并向其中加入0.2g壳聚糖及2g冰醋酸，充分混合溶解配成水相。将得到的水相和油相在配有机械搅拌的三口瓶中混合，200r/min转速下机械搅拌20min，得到反相乳液；然后先后加入0.08g戊二醛及0.6g0.1M的NaOH水溶液；体系升温至70℃后，再向其中加入等比例的戊二醛，反应6h后，在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒，该黑褐色颗粒经乙醇、0.1M的盐酸水溶液各洗涤三次，水洗至中性后干燥，即得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
将0.1g双醛基聚乙二醇溶于体积比为1:1的50mL甲醇、醋酸混合溶液中，之后向其中加入1g磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在三口瓶中室温下机械搅拌1h，搅拌速度为100r/min；再调节体系的PH值为6，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥即得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
实例2：摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备
将0.5g Span-80加入到200mL液体石蜡中作为油相；称取0.1g Mg(OH)2、0.05gFe2O3纳米粒子均匀分散在65mL水中，并向其中加入0.2g壳聚糖及2g冰醋酸，充分混合溶解配成水相。将得到的水相和油相在配有机械搅拌的三口瓶中混合，200r/min转速下机械搅拌30min，得到反相乳液；然后先后加入0.1g戊二醛及1g0.1M的NaOH水溶液；体系升温至80℃后，再向其中加入等比例的戊二醛，反应8h后，在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒，该黑褐色颗粒经乙醇、0.1M的盐酸水溶液各洗涤三次，水洗至中性后干燥，即得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
将0.2g双羧基聚乙二醇溶于体积比为1:1的50mL甲醇、醋酸混合溶液中，之后向其中加入2g磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在三口瓶中室温下机械搅拌1h，搅拌速度为150r/min；再调节体系的PH值为6，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥即得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
实例3：摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备
将0.8g Span-80加入到200mL液体石蜡中作为油相；称取0.1g BaCO3、0.06g锰铁氧体均匀分散在65mL水中，并向其中加入0.3g壳聚糖及2g冰醋酸，充分混合溶解配成水相。将得到的水相和油相在配有机械搅拌的三口瓶中混合，300r/min转速下机械搅拌40min，得到反相乳液；然后先后加入0.1g戊二醛及1.5g0.1M的NaOH水溶液；体系升温至90℃后，再向其中加入等比例的戊二醛，反应10h后，在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒，该黑褐色颗粒经乙醇、0.1M的盐酸水溶液各洗涤三次，水洗至中性后干燥，即得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
将0.3g双氨基聚乙二醇溶于体积比为1:1的50mL甲醇、醋酸混合溶液中，之后向其中加入2.5g磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在三口瓶中室温下机械搅拌1h，搅拌速度为200r/min；再调节体系的PH值为6.5，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥即得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
实例4：摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备
将1g Span-80加入到200mL液体石蜡中作为油相；称取0.05g Al2O3、0.1g Fe3O4纳米粒子均匀分散在60mL水中，并向其中加入0.3g壳聚糖及2.5g冰醋酸，充分混合溶解配成水相。将得到的水相和油相在配有机械搅拌的三口瓶中混合，400r/min转速下机械搅拌60min，得到反相乳液；然后先后加入0.1g戊二醛及1g0.1M的NaOH水溶液；体系升温至90℃后，再向其中加入等比例的戊二醛，反应8h后，在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒，该黑褐色颗粒经乙醇、0.1M的盐酸水溶液各洗涤三次，水洗至中性后干燥，即得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
将0.2g羧基-聚乙二醇-氨基溶于体积比为1:1的50mL甲醇、醋酸混合溶液中，之后向其中加入2g磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在三口瓶中室温下机械搅拌1h，搅拌速度为300r/min；再调节体系的PH值为6.5，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥即得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
实例5：摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备
将1.5g Span-80加入到200mL液体石蜡中作为油相；称取0.05g CaCO3、0.1gFe2O3纳米粒子均匀分散在50mL水中，并向其中加入0.2g壳聚糖及2g冰醋酸，充分混合溶解配成水相。将得到的水相和油相在配有机械搅拌的三口瓶中混合，200r/min转速下机械搅拌50min，得到反相乳液；然后先后加入0.06g戊二醛及0.8g0.1M的NaOH水溶液；体系升温至80℃后，再向其中加入等比例的戊二醛，反应12h后，在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒，该黑褐色颗粒经乙醇、0.1M的盐酸水溶液各洗涤三次，水洗至中性后干燥，即得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
将0.3g双醛基聚乙二醇溶于体积比为1:1的50mL甲醇、醋酸混合溶液中，之后向其中加入4g磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在三口瓶中室温下机械搅拌1h，搅拌速度为200r/min；再调节体系的PH值为6，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥即得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
Claims (6)
1.一种具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：配制质量分数为0.1～1％的Span-80液体石蜡溶液作为油相；
步骤2：将致孔剂和磁性纳米粒子分散在水中，加入壳聚糖及冰醋酸，混合溶解配成水相；所述致孔剂、磁性纳米粒子、壳聚糖、冰醋酸及水的质量比为1﹕1～0.4﹕1～6﹕10～50﹕400～1000；
步骤3：将得到的水相和油相按照质量比1﹕3～7混合搅拌20～60min，得到反相乳液；
步骤4：在反相乳液中加入戊二醛和0.1M的NaOH水溶液，升温至70～90℃，再加入等比例的戊二醛，反应6～12h，得到分散有黑褐色颗粒的溶液；所述戊二醛、NaOH水溶液与壳聚糖的质量比为0.05～0.5﹕1～5﹕1；
步骤5：对步骤4中得到的分散有黑褐色颗粒的溶液在磁场下进行产物分离，得到黑褐色颗粒；采用乙醇、0.1M的盐酸水溶液对黑褐色颗粒各洗涤三次，水洗至中性后干燥得磁性多孔壳聚糖固定化酶载体；
步骤6：将修饰剂溶于甲醇和醋酸混合溶液中，再加入磁性多孔壳聚糖固定化酶载体，在室温下搅拌混合；所述甲醇和醋酸的体积比为1:1；所述修饰剂质量分数为0.2～1％；所述磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的质量分数为2～10％；
步骤7：调节步骤6体系的PH值为6～6.5，反应2h后，经磁场分离，乙醇、水各洗涤3次，干燥后得到具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体。
2.根据权利要求1所述具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2的搅拌速度为100～500r/min。
3.根据权利要求1所述具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤6的搅拌混合为1h，搅拌速度为100～300r/min。
4.根据权利要求1所述具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的致孔剂为CaCO3、Mg(OH)2、BaCO3、Al(OH)3、Ca(OH)2、Al2O3中的一种或者几种的任意比混合。
5.根据权利要求1所述具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤2中磁性纳米粒子为Fe3O4、Fe2O3、锰铁氧体、锌铁氧体中的一种或几种的任意比混合。
6.根据权利要求1所述具有摇臂结构磁性多孔壳聚糖固定化酶载体的制备方法，其特征在于：所述步骤6中的修饰剂为双氨基聚乙二醇、双羧基聚乙二醇、双醛基聚乙二醇或羧基-聚乙二醇-氨基。
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| CN111909427A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-11-10 | 华南理工大学 | 壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用 |
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