CN106565908A

CN106565908A - 一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法

Info

Publication number: CN106565908A
Application number: CN201610937759.1A
Authority: CN
Inventors: 吴仁安; 席光辉; 王泽锋; 苏云飞; 戴玲凤
Original assignee: WENZHOU BIOMEDICAL MATERIALS AND ENGINEERING RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: WENZHOU BIOMEDICAL MATERIALS AND ENGINEERING RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2036-10-25
Also published as: CN106565908B

Abstract

本发明涉及一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法，属生物分离技术领域,其制备方法是：首先以聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA）、聚甲基丙烯酸甲酯（MMA）或苯乙烯（St）做单体，通过分散聚合制备出1~10μm的单分散微球，然后以微球为种子，水或液体石蜡做分散介质，以PEGMA做二次单体进行种子溶胀乳液聚合，得到1~200μm的大粒径单分散聚（聚乙二醇甲基丙烯酸酯）（PPEGMA）微球，宏观形貌为白色固体粉末。得到的微球状PPEGMA带有丰富的聚乙二醇（PEG）链和羟基，进一步活化后可用作层析介质进行蛋白分离。

Description

一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型单分散大粒径聚合物微球的制备方法，属生物分离技术领域。

背景技术

蛋白质、核酸、多糖以及维生素和抗生素等生物活性物质，是生物科学研究的对象，也是重要的医药品、保健品和食品，对人类的生活和健康具有重要的意义。在生物技术研究中，生物活性物质的分离是一个重要的步骤，而层析法是生物活性物质分离纯化最常用的手段。层析的关键在于所使用的层析介质。目前，许多微球，如天然高分子微球、合成高分子微球、无机微球和各种复合微球等，成为最重要的层析介质。

理想的微球介质材料要高度亲水、中性、又不溶于水，且必须具有化学和物理稳定性，有一定的机械强度和均匀性。常见的微球材料有琼脂糖、纤维素、交联葡聚糖、多孔硅胶等，也有一些合成高分子材料如交联聚苯乙烯、交联聚甲基丙烯酸甲酯、交联聚甲基丙烯酸等。

已公开报道的文献中，Yu等（J Colloid Interf Sci, 2015, 453: 151-158）以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）和PEGMA₃₆₀做单体，通过ATRP法合成了平均粒径为5.7μm的共聚物微球，并通过表面丰富的环氧基共价固定G蛋白，从而实现对免疫球蛋白G（IgG）的亲和纯化。Tan等（Macromolecules, 2014, 47: 6856-6866）以甲基丙烯酸甲酯（MMA）为单体，以PEGMA₂₀₀₀为大分子稳定剂，通过光引发RAFT分散聚合法制备了粒径分布非常窄的PMMA微球，其多分散系数（CV_d）小于3% 。然后进一步用PMMA微球为种子，以甲基丙烯酸做共聚单体进行种子溶胀聚合，制得羧基功能的PMMA微球，并以此为载体通过共价键结合牛血清蛋白（BSA）或IgG，进行蛋白分离。

除了通过单体聚合得到聚合物微球，还有很多其他方法被用于各种微球的制备。

如中国专利CN105776180A揭示的方法，将细菌纤维素溶于LiCl/DMAC溶液，首先利用微流控设备制备出细菌纤维素微球，然后通过水热法碳化，并进行冷冻干燥，得到尺寸分布均匀的纳米多孔碳微球。

中国专利CN105061785A揭示的方法，在氮气保护下将FeCl₃·6H₂O水溶液、FeCl₂·4H₂O水溶液和KOH的水溶液混合并搅拌均匀，磁分离得到Fe₃O₄纳米粒子，另外将纤维素溶解在离子液体中得澄清胶状纤维素溶液，再向其中加入Fe₃O₄纳米粒子并搅拌均匀，最后将含有Fe₃O₄纳米粒子的纤维素溶液分散到真空泵油中制成乳液，纤维素从粒子液体中再生，得到磁性纤维素微球。

中国专利CN105480983A揭示的方法，以3-氨基丙基三乙氧基硅烷和γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷为前驱体，与六亚甲基二异氰酸酯反应，通过溶胶凝胶法制备得到有机无机杂化产物，然后烧去有机组分，制得多孔二氧化硅微球。

上述各专利尽管各种微球被用于分离蛋白，但很多微球对蛋白容易产生非特异性吸附，不利于蛋白的精确分离，一般要进行表面改性，从而使微球制备过程更加复杂。

发明内容

本发明的目的是为了克服传统生物分离用层析介质制备程序复杂、易发生非特异性吸附、分离效率低等缺点，而提供一种简单的生物分离用大粒径单分散聚合物微球的制备方法，其所制备的聚合物为微球结构，所得微球粒径大，尺寸分布均匀，具有丰富的PEG链和羟基，生物相容性好。

为实现本发明的发明目的，本发明的技术方案是单分散大粒径聚合物微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）以聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯或苯乙烯做一次单体，通过分散聚合反应制备出1~10μm的单分散微球；

（2）以单分散微球为种子微球，水或液体石蜡为分散介质下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯做二次单体进行种子溶胀聚合反应，得到1~200μm的大粒径单分散聚（聚乙二醇甲基丙烯酸酯）微球，其成分为带有聚乙二醇侧链的刷状聚（聚乙二醇甲基丙烯酸酯）大分子。

进一步设置是所述的步骤（1）为：将一次单体在分散介质下，该分散介质为乙醇、甲醇或其与水组成的混合溶剂，一次单体所用的比例为总体质量的10% ~ 50%；用聚乙烯吡咯烷酮做稳定剂，其比例为单体质量的1% ~ 20%；偶氮二异丁腈做引发剂，其比例为单体摩尔量的0.1% ~ 1%；分散聚合反应温度为70℃。

进一步设置是所述步骤（2）为：以水为分散介质，种子微球所用比例为总体质量的1%，二次单体所用的比例为总体质量的1% ~ 40%；聚乙烯吡咯烷酮做稳定剂，其比例为单体质量的1% ~ 20%；过硫酸钾做引发剂，其比例为单体摩尔量的0.1% ~ 1%；乙二醇二甲基丙烯酸酯或N,N-二甲基双丙烯酰胺为交联剂，其比例为单体摩尔量的1% ~ 10%；种子溶胀时间为12h，种子聚合时间为6 ~ 24h，种子溶胀聚合温度为60 ~ 80℃，种子溶胀聚合时采用机械搅拌，转速100rpm ~ 500rpm，反应过程通氮气保护。

进一步设置是所述的步骤（2）为：以液体石蜡为分散介质，种子微球所用比例为总体质量的1%，二次单体所用的比例为总体质量的10% ~ 40%；司盘-80做稳定剂，其比例为单体质量的1% ~ 20%；偶氮二异丁腈做引发剂，其比例为单体摩尔量的0.1% ~ 1%；乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，其比例为单体摩尔量的1% ~ 10%；种子溶胀时间为12h，种子溶胀聚合时间为6 ~ 24h，种子溶胀聚合温度为60 ~ 80℃，聚合时采用机械搅拌，转速100rpm ~500rpm，反应过程通氮气保护。

所述的单分散大粒径聚合物微球的制备方法，种子聚合结束后，反应产物通过离心分离，并用乙醇反复清洗三次以上，最后进行冷冻干燥，得到产物。

所述的单分散大粒径聚合物微球的制备方法，所得产物为白色固体粉末，其微观形貌为粒径在1~200μm的微球，分散系数小于 10%。

本发明以聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA）为单体，通过种子溶胀聚合制备出以聚（聚乙二醇甲基丙烯酸酯）（PPEGMA）为主要基质的聚合物微球材料，所得微球粒径大，尺寸分布均匀，具有丰富的PEG链和羟基，生物相容性好。

与已有技术相比，一种新型单分散大粒径聚合物微球及其制备方法，具有如下的优越性和有益效果：

1）与传统方法相比，本发明所使用的聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体带有PEG链，聚合后形成带有PEG侧链的刷状线型聚合物，带有丰富的PEG支链和羟基（见附图3），具有良好的生物相容性，用于层析介质能够减少蛋白的非特异性吸附。

2）本发明使用种子溶胀聚合法，用聚乙二醇甲基丙烯酸酯做二次单体聚合得到高分子微球，制备程序简单，所得微球粒径大，分布均匀（见附图2），用于层析介质可以提高分离效率，降低色谱柱的压力降。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1 由实施例1制备的PPEGMA微球的SEM图。

图2 由实施例1制备的PPEGMA微球的粒径分布。

图3 由实施例1制备的PPEGMA微球的红外吸收光谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：

取一个装有回流冷凝管、机械搅拌和通氮气装置的250ml三口烧瓶，先加入64g甲醇和16g超纯水组成的混合溶剂，再加入2g PVPk30、20g苯乙烯和0.32g AIBN，机械搅拌使其溶解，氮气保护下水浴加热升温至70℃，恒温反应24h得白色乳液。将产物离心分离，并用乙醇清洗三次后干燥，得PS微球。

另外在250ml三口烧瓶中加入80ml超纯水、0.25g PVPk30、0.038g KPS和5gPEGMA₃₆₀，搅拌溶解均匀，将1g PS微球分散在20ml超纯水中形成乳液，然后将其加入到上述水溶液搅拌均匀，不断搅拌使种子微球溶胀1h。然后在氮气保护下水浴加热升温至70℃，恒温反应6h。最后将产物离心分离，并用乙醇清洗三次后干燥，得白色粉末状PPEGMA微球，粒径尺寸在1μm。

将少量样品分散到乙醇中超声形成乳液，用动态光散射仪（DLS）测其粒径及尺寸分布。将少量样品乳液滴到铜箔上，加热使溶剂挥发，在铜箔上形成一层样品的涂层，用场发射扫描电镜（SEM）对样品表面形貌进行表征，得到样品的SEM图像（附图1）。用傅里叶红外光谱仪（FTIR）对样品的化学结构进行表征，得到样品的红外谱图（附图3）。

图1的SEM图显示所得的产物为1~2微米的微球，为想要制备的样品；图2为所制备的PPEGMA微球的粒径分布，显示所得微球样品尺寸分布较为均匀；图3为制备样品的红外谱图，其中在1107cm^-1、1665 cm^-1、2913 cm^-1和3435 cm^-1处较强的峰分别是C-O-C、C=O、-CH₂-和-OH伸缩振动吸收峰，表明所得样品为PEGMA的聚合产物，其中C-O-C和-OH来源于PEGMA上的PEG短链，证明所制备的微球样品含有丰富的PEG短链和羟基。

实施例2：

首先按与实施例1相同步骤制备出PS微球。然后在250ml三口烧瓶中加入80ml液体石蜡、0.25g司盘80、0.023g AIBN和5g PEGMA₃₆₀，搅拌溶解均匀，将1g PS微球分散在20ml液体石蜡中形成乳液，再将其加入到上述水溶液搅拌均匀，不断搅拌使种子微球溶胀1h。随后在氮气保护下水浴加热升温至70℃，恒温反应6h。最后将产物离心分离，并用乙醇清洗三次后干燥，得PPEGMA微球样品。

实施例3：

取一个装有回流冷凝管、机械搅拌和通氮气装置的250ml三口烧瓶，先加入90g乙醇，再加入2g PVPk30、10g甲基丙烯酸甲酯和0.164g AIBN，机械搅拌使其溶解，氮气保护下水浴加热升温至70℃，恒温反应24h得白色乳液。将产物离心分离，并用乙醇清洗三次后干燥，得PMMA微球。

另外在250ml三口烧瓶中加入80ml超纯水、0.25g PVPk30、0.038g KPS和5gPEGMA₃₆₀，搅拌溶解均匀，将1g PMMA微球分散在20ml超纯水中形成乳液，然后将其加入到上述水溶液搅拌均匀，不断搅拌使种子微球溶胀1h。然后在氮气保护下水浴加热升温至70℃，恒温反应6h。最后将产物离心分离，并用乙醇清洗三次后干燥，得白色粉末状PPEGMA微球样品。

实施例4：

首先按与实施例1相同步骤制备出PMMA微球。然后在250ml三口烧瓶中加入80ml液体石蜡、0.25g司盘80、0.023g AIBN和5g PEGMA₃₆₀，搅拌溶解均匀，将1g PMMA微球分散在20ml液体石蜡中形成乳液，再将其加入到上述水溶液搅拌均匀，不断搅拌使种子微球溶胀1h。随后在氮气保护下水浴加热升温至70℃，恒温反应6h。最后将产物离心分离，并用乙醇清洗三次后干燥，得PPEGMA微球产物。

Claims

1.一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）以单分散微球为种子微球，水或液体石蜡为分散介质下，以聚乙二醇甲基丙烯酸酯做二次单体进行种子溶胀聚合反应，得到1~200μm的大粒径单分散聚（聚乙二醇甲基丙烯酸酯）微球，其成分为带有聚乙二醇侧链的刷状线型聚（聚乙二醇甲基丙烯酸酯）大分子。

2.根据权利要求2所述的一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法，其特征在于：所述的步骤（1）为：将一次单体在分散介质下，该分散介质为乙醇、甲醇或其与水组成的混合溶剂，一次单体所用的比例为总体质量的10% ~ 50%；用聚乙烯吡咯烷酮做稳定剂，其比例为单体质量的1% ~ 20%；偶氮二异丁腈做引发剂，其比例为单体摩尔量的0.1% ~ 1%；分散聚合反应温度为70℃。

3.根据权利要求2所述的一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）为：以水为分散介质，种子微球所用比例为总体质量的1%，二次单体所用的比例为总体质量的1% ~ 40%；聚乙烯吡咯烷酮做稳定剂，其比例为单体质量的1% ~ 20%；过硫酸钾做引发剂，其比例为单体摩尔量的0.1% ~ 1%；乙二醇二甲基丙烯酸酯或N,N-二甲基双丙烯酰胺为交联剂，其比例为单体摩尔量的1% ~ 10%；种子溶胀时间为12h，种子聚合时间为6 ~24h，种子溶胀聚合温度为60 ~ 80℃，种子溶胀聚合时采用机械搅拌，转速100rpm ~500rpm，反应过程通氮气保护。

4.根据权利要求2所述的一种单分散大粒径聚合物微球的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）为：以液体石蜡为分散介质，种子微球所用比例为总体质量的1%，二次单体所用的比例为总体质量的10% ~ 40%；司盘-80做稳定剂，其比例为单体质量的1% ~ 20%；偶氮二异丁腈做引发剂，其比例为单体摩尔量的0.1% ~ 1%；乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，其比例为单体摩尔量的1% ~ 10%；种子溶胀时间为12h，种子溶胀聚合时间为6 ~ 24h，种子溶胀聚合温度为60 ~ 80℃，聚合时采用机械搅拌，转速100rpm ~ 500rpm，反应过程通氮气保护。