KR20110007608A - 변형된 전달체 발현을 통해 에틸카바메이트 생산을 최소화하기 위한 효모의 기능 향상 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발효 조건에서 우레아를 효모 세포로 능동적으로 수송할 수 있도록 우레아 전달체를 발현하는 기능이 향상된 효모 균주를 이용하여 감소된 에틸카바메이트 농도를 갖는 발효된 음료 및 식품을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 효모는 또한 발효 조건에서 세포내 우레아 분해 효소 활성의 발현이 향상될 수 있다. 우레아 전달체는 예를 들면 DUR3p일 수 있으며, 우레아 분해 효소 활성은 DUR1,2p일 수 있다.

Description

변형된 전달체 발현을 통해 에틸카바메이트 생산을 최소화하기 위한 효모의 기능 향상 {Functional Enhancement of Yeast to Minimize Production of Ethyl Carbamate via Modified Transporter Expression}

본 발명은 발효 조건에서 우레아를 효모 세포 내로 능동적으로 수송하는 DUR3과 같은 우레아 전달체를 발현하도록 형질전환된 효모 균주를 이용하여 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트 농도를 감소시키는 데에 제공하기 위한 생성물 및 방법에 관한 것이다.

우레탄(urethane)으로도 알려진 에틸카바메이트(ethyl carbamate)는 식품 및 음료의 발효시 효모의 이용으로부터 직접 부산물로서 생성된다. 예를 들면, 발암 후보물질인 에틸카바메이트의 생성은 그레이프머스트(grape must, 와인)의 발효시 우레아와 에탄올의 반응에 의해 일어난다.

DUR1 , 2 의 구성적 발현(구성적 발현)을 통해 우레아를 분해하는 효모 균주는 저농도의 에틸카바메이트와 함께 발효 음료 또는 발효 식품을 생산하는데 이용될 수 있다 (Coulon et al., 2006, Am. J. Enol. Vitic.: 113 - 124).

Saccharomyces cerevisiae 에서, DUR3 유전자는 특정 조건에서 우레아를 효모 세포 내로 능동적으로 수송하는 우레아 전달체(DUR3p)를 암호화한다. DUR3 유전자의 전사는 보통 질소 이화물질 억제작용(Nitrogen Catabolite Repression, NCR)의 영향을 받는다(ElBerry et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 4688 - 4698; Goffeau et al., 1996, Science 274 (5287), 546-547; Johnston et al., 1994, Science 265 (5181), 2077-2082). 이것은 탄수화물을 활용하는 효모 세포의 질소 대사와 관련된 동화 및 이화작용 효소의 조절 네트워크의 한 측면에 불과하다.

한 측면에서 본 발명은 발효 조건에서 우레아를 효모 세포 내로 능동적으로 수송하는 DUR3과 같은 우레아 전달체를 발현하도록 형질전환된 효모 균주를 이용하여 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트 농도를 감소시키는 데에 제공하기 위한 생성물 및 방법에 관한 것이다. 상기 효모는 또한 발효 조건에서 DUR1 ,2와 같이 세포내 우레아 분해 효소 활성을 발현하도록 변형될 수 있다.

한 측면에서 본 발명은 발효 조건에서 DUR3을 발현하도록(예를 들면 구성적으로) 형질전환된 신규한 효모 균주 뿐만 아니라 효모가 발효 조건에서 DUR3을 발현하도록(예를 들면 구성적으로) 효모 균주의 기능을 향상시키는 방법 및 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트를 감소시키기 위한 상기 효모 균주의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서는, DUR1 ,2 및 DUR3을 구성적으로 발현하도록 형질전환된 신규한 효모 균주 및 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트를 감소시키기 위한 상기 효모 균주의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서는, DUR3p를 계속적으로(continually) 발현하도록 형질전환된 효모 균주 및 DUR3p와 우레아 카르복시화효소 및 알로파네이트 가수분해효소 활성을 모두 포함하는 우레아 아미도리아제를 모두 계속적으로(continually) 발현하도록 형질전환된 효모 균주를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 발효 조건에서 우레아를 계속적으로 흡수하도록 형질전환된 효모 균주를 제공한다. 상기 효모는 구성적으로 DUR3를 발현할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 발효 조건에서 우레아를 계속적으로 흡수하고 분해하도록 형질전환된 효모 균주를 제공한다. 상기 효모 균주는 DUR1 ,2 및 DUR3를 모두 구성적으로 발현할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 발효 조건에서 우레아 전달체의 유전자 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 효모 균주를 형질전환하는 것을 포함하는 효모 균주의 변형 방법을 제공한다. 상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화될 수 있으며 DUR3p일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, DUR3을 구성적으로 발현시키기 위한 효모 균주의 변형 방법을 제공한다. 상기 방법은 1/2 TRP1 - PGK _p - DUR3 - PGK _t - kanMX -1/2 TRP1 카세트의 TRP1 locus로의 통합을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 효모 균주를 DUR3p를 암호화하는 코딩서열을 포함하는 신규한 핵산으로 형질전환하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 효모를 질소 이화물질 억제작용에 영향을 받지 않는 프로모터를 포함하는 재조합 핵산으로 형질전환하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 예를 들면 발효 조건에서 구성적 발현에 의해 DUR3을 발현하거나 DUR1 ,2 및 DUR3 모두를 발현하는 것과 같이 기능이 향상된 전술한 효모 균주를 이용하여 발효 음료 또는 발효 식품을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트의 농도를 감소시키기 위하여 DUR3을 발현하거나 DUR1 ,2 및 DUR3 모두를 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주의 용도를 제공한다. 상기 발효 음료 또는 발효 식품은 와인일 수 있으며, 30 ppb 미만의 감소된 에틸카바메이트 농도를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, DUR3을 발현하거나 DUR1 ,2 및 DUR3 모두를 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주를 이용하여 생산된 감소된 에틸카바메이트 농도를 갖는 발효 음료 또는 발효 식품을 제공한다. 상기 발효 음료 또는 발효 식품은 와인일 수 있으며, 30 ppb 미만의 감소된 에틸카바메이트 농도를 가질 수 있다.

도 1은 DUR3 유전자 카세트를 보여준다.
도 2는 S. cerevisiae DUR3p 단백질 서열(서열번호 7)을 보여준다.
도 3은 S. cerevisiae DUR3 코딩서열(서열번호 8)을 보여준다.
도 4는 DUR1 ,2 시작코돈 ATG에서 끝나는 DUR1 ,2 유전자의 업스트림 영역의 일부 서열을 보여준다(서열번호 9). 두 개의 추정 NCR 인자 GATAA(G) boxes와 (-54부터 -58 위치 및 -320 부터 -324 위치) 추정 TATAA boxes가 표시되었다.
도 5 는 DUR3 유전자의 업스트림 영역의 일부 서열을 보여준다(서열번호 10).
도 6 은 DUR3p (서열 NP_011847.1 (서열번호7))와 7 개의 다른 단백질들 (NP_595871.1 (서열번호11), XP_452980.1 (서열번호12), NP_982989.1 (서열번호13), XP_364218.1 (서열번호14), XP_329657.1 (서열번호15), NP_199351.1 (서열번호16), NP_001065513.1 (서열번호17)) 사이의 상동성을 보여주는 다수 단백질 서열 정렬(multiple protein sequence alignment) 결과를 나타낸다.
도 7 은 DUR3p (서열번호7) 와Schizosaccharomyces pombe 의 (예상되는) 우레아 전달체(서열번호11)와의 BLAST 비교 결과를 나타내며 공통서열(consensus sequence)을 보여준다. 대체 실험에서, 본 발명의 우레아 전달체는 최적으로 정렬되었을 때 80%의 유사성을 갖는 것처럼 S. cerevisiae DUR3p 서열, S. pombe 우레아 전달체 또는 본 도면에 나타난 공통서열에 비교해 다양한 유사성 정도를 가질 수 있다.
도 8 은 샤르도네 와인(Chardonnay wine)의 와인 효모 균주 522, 522DUR1,2 [52^{2 EC -,}의 대체 명칭], 522DUR3 및 522DUR1,2/DUR3 [52^{2 EC - DUR3}의 대체 명칭] 의 발효 프로파일(weight loss)을 보여준다. 샤르도네 와인은 최종 OD600 = 0.1 이고 20℃에서(~300 시간) 배양한 여과하지 않은 칼로나 샤르도네 머스트로부터 생산되었다. 발효는 세 번 수행하였고 데이터는 평균내었으며; 에러바(error bar)는 표준편차를 의미한다.
도 9 는 본 발명의 DUR3 자가-클로닝 카세트의 개략도이다.
도 10 은 kanMX 마커를 이용한 자가-클로닝 leu2-PGK1p-kanMX-PGK1p-DUR3-PGK1t-leu2 카세트의 S. cerevisiae 산업 균주의 LEU2 locus 로의 통합 및 이후의 PGK1 프로모터 반복부위(direct repeat)의 재조합에 의한 마커의 손실을 보여주는 개략도이다.

본 명세서에서 직접적으로 정의되지 않은 임의의 용어는 본 발명의 기술 분야에서 보통 이해되는 바와 같은 의미를 갖는 것으로 이해될 수 있다. 몇몇 용어들과 그들을 어떻게 만들고 사용하는지는 본 발명의 조성물, 장치, 방법 및 실시예 등을 기술하는데 있어서 수행자에게 추가적인 도움을 제공하기 위하여 하기에서 논의되거나 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 동일한 것이 하나 이상의 의미로 쓰일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 결과적으로 본 명세서에서 사용된 하나 이상의 용어에 대하여 대체적인 언어 및 동의어들이 사용될 수 있다. 용어가 본 명세서에서 자세히 설명되거나 논의되었는지 아닌지는 중요하지 않다. 일부 동의어들 또는 대체 가능한 방법들, 물질들 등이 제공된다. 달리 명쾌하게 언급되지 않는 이상 하나 또는 소수의 동의어나 등가물에 대한 설명이 다른 동의어나 등가물의 사용을 배제하는 것은 아니다. 용어의 예를 포함하여 명세서에서 예를 사용하는 것은 예시적인 목적에 불과하며 본 발명의 범위 및 의미를 제한하는 것은 아니다.

본 명세서에서 언급하였듯이, '효모 균주'는 Saccharomyces cerevisiae 균주일 수 있다. 대체가능한 실시예에 따르면, 본 발명은 예를 들어 S. bayanus 효모 균주 또는 Schizosaccharomyces 효모 균주를 이용할 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 발효 음료 또는 발효 식품과 같은 다양한 생성물을 생산하기 위한 발효에 사용되는 효모 균주에 관한 것이다. '발효 음료 또는 발효 식품'은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 와인, 브랜디, 위스키, 증류주, 에탄올, 사케, 셰리, 맥주, 도우(dough), 빵, 식초 또는 간장일 수 있다.

다양한 측면에서, 본 발명은 유전자의 변형 및 재조합 유전자의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 용어 "유전자"는 그것의 일반적인 정의에 부합하도록 핵산서열의 작동가능하게 연결된 그룹을 의미하는 것으로 사용되었다. 본 발명에서 유전자의 변형은 유전자 내에서 작동가능하게 연결된 다양한 서열들 중 임의의 서열의 변형을 포함한다. "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현의 조정 또는 조절과 같이 특정 서열이 직접 또는 간접적으로 그의 의도된 기능을 수행하도록 상호작용하는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된 서열들의 상호작용은 예를 들면 차례로 핵산서열과 상호작용하는 단백질들에 의해 조정될 수 있다.

본 명세서에서 "프로모터"는 전사 조절영역이 관심서열에 작동가능하게 연결되어 있을 때 원하는 공간 또는 시간 패턴에서 원하는 정도로 관심 핵산서열의 전사를 조정하거나 조절할 수 있는 핵산서열을 의미한다. 전사 조절영역에 의해 관심서열의 전사가 조정되거나 조절되는 것을 허용하도록 서열들이 기능적으로 연결되어 있을 때 전사 조절영역 및 관심서열은 "작동 가능하게" 연결된다. 일부 실시예에 따르면, 전사 조절영역은 작동가능하게 연결되기 위해 관심서열과 동일한 가닥(strand)에 위치할 수 있다. 일부 실시예에 따르면, 전사 조절영역은 관심서열의 5'에 위치할 수 있다. 이러한 실시예에 따르면, 전사 조절영역은 관심서열의 5'에 직접 연결되거나 이 영역들 사이에 간섭서열(intervening sequence)이 위치할 수 있다. 일부 실시예에 따르면, 전사 조절서열은 관심서열의 3'에 위치할 수 있다. 전사 조절영역과 관심서열의 작동가능한 연결은 적절한 분자(전사 활성 단백질과 같은)가 전사 조절영역에 결합하는 것을 필요로 할 수도 있다. 따라서 본 발명은 in vitro 또는 in vivo에서 그러한 분자가 제공된 실시예들을 포함한다.

본 발명의 다양한 유전자들과 핵산서열들은 재조합 서열일 수 있다. 용어 "재조합"은 무엇인가 재결합되는 것을 의미하며, 핵산 구조체에 관해 상기 용어는 함께 이어지는 임의의 지점을 갖는 핵산서열로 구성되거나 분자생물학적인 방법에 의해 만들어진 분자를 말한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 관해 만들어진 용어 "재조합"은 분자생물학적 방법에 의해 만들어진 재조합 핵산 구조체를 이용하여 발현된 단백질 또는 폴리펩티드 분자를 말한다. 유전적 조성물에 관해 만들어진 용어 "재조합"은 자연발생하는 부모의 게놈에서는 발생하지 않는 대립형질과 새롭게 조합된 생식세포(gamete), 후대(progeny), 세포 또는 게놈을 말한다. 재조합 핵산 구조체는 라이게이션되거나 라이게이션되기 위해 조작된 핵산서열 또는 자연적으로는 라이게이션의 대상이 되지 않거나 다른 위치에서 라이게이션이 일어나는 핵산서열을 의미한다. 따라서 핵산 구조체를 "재조합"이라 지칭하는 것은 핵산분자가 유전자 엔지니어링을 이용한 인간의 간섭에 의해 조작되어 왔음을 나타낸다.

재조합 핵산 구조체는 예를 들면 형질전환에 의해 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 재조합 핵산 구조체는 동일하거나 상이한 숙주세포 종으로부터 유래된 서열들을 포함할 수 있으며, 분리되어 숙주 종의 세포 내로 재도입될 수 있다.

재조합 핵산서열은 숙주세포의 오리지날 형질전환, 차후의 재조합 및/또는 복구 현상의 결과로서 숙주세포의 게놈으로 도입될 수 있다. 그렇지 않으면 재조합 서열은 추가적인 염색체 인자로서 유지될 수 있다. 이러한 서열은, 예를 들면 돌연변이, 집단교배 또는 원형질체 융합에 의해 시행되는 균주 개량 절차를 위한 출발 균주로서 형질전환된 효모 균주와 같은 개체를 이용하여 재생산될 수 있다. 본 발명의 재조합 서열을 보존하고 있는 결과 균주들이 본 명세서에서 사용된 용어에 따른 "재조합" 된 균주들이다.

본 발명의 다양한 측면에서, 핵산분자는, 예를 들면 Itakura et al. U.S. Pat. No. 4,598,049; Caruthers et al. U.S. Pat. No. 4,458,066; 및 Itakura U.S. Pat. Nos. 4,401,796 및 4,373,071에 개시된 것과 같은 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 합성된 핵산은 본 명세서에서 사용된 용어에 따른 "재조합"의 성질을 갖는다(분자의 구성 부분을 결합시키는 성공적인 단계의 생성물이 됨).

형질전환은 세포가 지닌 유전적 물질이 하나 이상의 외인성 핵산의 세포 내로의 혼합에 의해 변화되는 과정이다. 예를 들면, 효모는 다양한 프로토콜을 이용하여 형질전환될 수 있다(Gietz et al., 1995). 이러한 형질전환은 외인성 핵산의 세포내 유전적 물질로의 혼합에 의해 일어나거나 세포가 외인성 핵산에 노출됨에 기인한 세포내 내생 유전적 물질의 변화에 의해 일어날 수 있다. 형질전환주(tansformant) 또는 형질전환된 세포는 외인성 핵산의 흡수를 통해 기능적으로 향상된 세포 또는 세포의 후손이다. 본 명세서에서 사용된 용어들은, 다음 세대의 세포에서 나타날 수 있는 돌연변이 또는 변화에 상관없이, 세포의 다음 세대를 거쳐 원하는 유전적 변화가 보존된 형질전환된 세포의 후손에게도 적용된다.

와인 제조에 사용되는 형질전환된 숙주세포는, 예를 들면 Bourgovin (RC 212 Saccharomyces cerevisiae), ICV D-47 Saccharomyces cerevisiae, 71B-1122 Saccharomyces cerevisiae, K1V-1116 Saccharomyces cerevisiae, EC-1118 Saccharomyces bayanus, Vin13, Vin7, N96, 및 WE352와 같은 S. cerevisiae 또는 Schizosaccharomyces 균주를 포함할 수 있다. Lallemand Inc. (Canada), AB Mauri (Australia) 및 Lesaffre (France)와 같은 효모 균주의 다양한 상업적인 출처가 있다.

다양한 실시예에서 본 발명은 DUR3의 우레아 수송 활성과 같은 우레아 수송 활성을 갖는 내재적 또는 이종성 효소를 이용할 수 있다. 이와 유사하게 몇몇 실시예에서 본 발명은 DUR1,2p 의 우레아 카르복시화효소 및 알로파네이트 가수분해효소활성과 같은 우레아 분해 활성을 갖는 내재적 또는 이종성 효소를 이용할 수 있다. 이러한 효소들은, 예를 들면 DUR3p, DUR1,2p 또는 유의미한 활성을 갖는 DUR3p 또는 DUR1의 영역에 상동성을 가질 수 있다.

서열들간의 상동성 정도는 (native DUR3p, native DUR1,2p, native DUR3 또는 native DUR1 ,2 핵산서열과 본 발명에서 사용된 변화된 단백질 또는 핵산의 서열간의 상동성) 서열들이 최적화되어 정렬되어 있을 때의 유사성이 백분율로 표현될 수 있으며, 서열들간에 정확한 일치의 발생을 의미한다. 유사성의 비교를 위한 서열들의 최적화 정렬은 Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘(the local homology algorithm),1981, Adv. Appl. Math 2: 482, Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘 (the homology alignment algorithm), 1970, J. Mol. Biol. 48:443, Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 방법 (the search for similarity method), 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 및 이러한 알고리즘들의 컴퓨터화된 시행 (GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin genetics Software Package, genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.)과 같은 다양한 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 또한 서열 정렬은 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (using the published default settings) 에 기술된 BLAST 알고리즘을 이용하여 수행될 수도 있다. BLAST 분석을 실행하기 위한 소프트웨어는 the National Center for Biotechnology Information (NCBI, 인터넷 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 이용 가능하다. BLAST 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 같은 길이의 단어와 정렬되었을 때 몇몇의 양(positive)으로 측정된 한계값 T과 일치하거나 이를 만족시키는 의문 서열에서의 길이 W인 짧은 단어를 규명함으로써 HSP 서열(high scoring 서열 pairs)을 우선 규명하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 한계점수(neighbourhood word score threshold )를 말한다. 첫머리의 이웃 단어의 히트수는 더욱 긴 HSP 서열을 찾는 검색을 시작하기 위한 시초가 된다. 단허의 히트수는 누적정렬점수(cumulative alignment score )가 증가될 수 있도록 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 각 방향에서 단어 히트수의 연장은 다음의 파라미터를 만나면 중단된다: 누적정렬점수가 수량 X 에 의해 최대 성취값(achieved value )으로부터 떨어짐; 하나 이상의 음(negative)의 값을 갖는 잔여 정렬의 축적으로 인해 누적점수가 0 이하로 됨; 또는 서열의 양 말단에 도달함. BLAST 알고리즘의 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 핵산의 양가닥의 비교를 위해 디폴트(defaults)를 단어길이(W) 11, the BLOSUM62 scoring matrix (Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) 정렬 (B) 50, 추정값 (E) 10 (대체 가능한 실시예에서 1, 0.1, 0.01, 0.001 또는 0.0001로 바뀔 수 있음; 0.1보다 훨씬 높은 E값이 기능적으로 유사한 서열을 규명하지 않을 것임, 유사성을 갖는 짧은 영역을 위해 E값이 0.1에서 10 사이인 낮은 중요도를 갖는 히트수를 시험하는 것이 유용함), M=5, N=4로 사용할 수 있다. 단백질 비교를 위해, 디폴트와 함께 다음과 같이 BLASTP 를 사용할 수 있다: G=11 (갭을 열기 위한 값); E=1 (갭을 연장하기 위한 값); E=10 (본 세팅에서의 추정값, 정의된 정렬값 S와 같거나 더 나은 점수를 갖는 10 히트수가 데이터베이스 내에서 우연히 검색된 것과 같은 크기로 나타날 것으로 예상됨; E값은 검색의 정도를 변화시키기 위해 증가되거나 감소될 수 있음); 및 W=3 (단어 크기, BLASTN 디폴트11, 다른 blast 프로그램 디폴트 3). BLOSUM matrix는 관련 단백질 내의 컨센서스 블록들 가운데 자주 발생하는 것으로 알려진 치환의 빈도에 근거하여 정렬의 각 위치에 대한 개연성 점수를 부여한다. BLOSUM62 (gap existence cost = 11; per residue gap cost = 1; lambda ratio = 0.85) substitution matrix 는 BLAST 2.0에서 디폴트에 의해 사용된다. 다음의 matrix들을 포함하는 다른 다양한 matrix들이 BLOSUM62를 대신하여 사용될 수 있다: PAM30 (9,1,0.87); PAM70 (10,1,0.87) BLOSUM80 (10,1,0.87); BLOSUM62 (11,1,0.82) 및 BLOSUM45 (14,2,0.87). BLAST 알고리즘을 이용한 두 서열간 통계적 유사성의 한 척도는 가장 작은 개연성의 합이며(the smallest sum probability, P(N)), 이는 우연히 두 핵산 또는 아미노산 서열간의 일치가 발생함으로써 개연성의 징후를 제공한다. 본 발명의 대체 가능한 실시예에에서, 만약 시험 서열의 비교에서 가장 작은 개연성의 합이 약 1보다 작으면, 바람직하게는 약 0.1보다 작으면, 보다 바람직하게는 약 0.01보다 작으면, 가장 바람직하게는 약 0.001보다 작으면, 핵산 또는 아미노산 서열은 대체로 동일한 것으로 간주된다.

일부 실시예에서 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 DUR3p, DUR1,2p, DUR3 또는 DUR1 ,2 핵산서열에 대체로 동일한 것과 같이 대체로 동일한 것일 수 있다. 이러한 서열들의 높은 동일성은 최적으로 정렬되었을 때의 동일성 퍼센트에 반영될 수 있으며, 유전자 타겟팅 기질이 유전자 타겟팅 기질의 일부와 타겟서열 일부의 동일성을 의미할 수 있는 경우에, 예를 들면 50%, 80% 내지 100%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 이상일 수 있다. 이때 상기 동일성 정도는 상동 짝짓기(homologous pairing) 및 재조합 및/또는 복구를 용이하게 할 수 있다. 두 서열이 상당히 동일함을 보여주는 대체 가능한 징후는 적당히 엄격한 조건(moderately stringent conditions )에서, 또는 바람직하게는 엄격한 조건(stringent conditions )에서 두 서열이 서로 혼성화하는 것이다. 적당히 엄격한 조건에서 필터가 결합된(filter-bound) 서열로의 혼성화는, 예를 들면 0.5 M NaHPO4, 7% 소디움 도데실 설페이트 (SDS), 1 mM EDTA (65℃), 그리고 0.2 x SSC/0.1% SDS 세척 (42℃) (see Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3) 조건에서 수행할 수 있다. 이와 대체 가능하게, 엄격한 조건에서 필터가 결합된 서열로의 혼성화는, 예를 들면 0.5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA (65℃), 그리고 0.1 x SSC/0.1% SDS 세척 (68℃) (see Ausubel, et al. (eds), 1989, supra) 조건에서 수행할 수 있다. 혼성화 조건은 관심 서열에 따라 공지된 방법으로 변형될 수 있다 (see Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with 핵산Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of 핵산probe assays", Elsevier, New York). 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온강도 및 pH에서 특정 서열의 녹는점보다 약 5℃ 낮도록 선택할 수 있다. 엄격한 혼성화의 세척 시간은, 예를 들면 적어도 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 75 분, 90 분, 105 분 또는 120 분일 수 있다.

생물학적으로 등가물의 폴리펩타이드를 얻기 위하여 펩타이드의 생물학적 기능을 실질적으로 변화시키지 않고 DUR3 또는 DUR1,2와 같은 폴리펩타이드의 구조에 약간의 변형 및 변화를 가할 수 있음은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 한 측면에서, 우레아 수송 활성을 갖는 단백질은 보존적인 아미노산 치환에 의해 native DUR3 서열과는 다른 단백질을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 우레아 카르복시화효소 /알로파네이트 가수분해효소활성을 갖는 단백질은 보존적인 아미노산 치환에 의해 native DUR1 ,2 서열과는 다른 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 " 보존적인 아미노산 치환"은 단백질의 특정 위치에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 말하며, 이때 상기 치환은 관련 기능의 실질적인 손실 없이 일어날 수 있다. 이러한 변화를 만듦에 있어서 아미노산 잔기의 치환은 곁사슬 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들면 사이즈, 전하, 소수성, 친수성 등에 기반을 두고 만들어지며, 정기 시험에 의해 이러한 치환이 단백질 기능에 미치는 영향을 분석한다.

일부 실시예에서, 보존된 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 친수성 값(예를 들면, 플러스 또는 마이너스 2.0 이내)을 갖는 다른 잔기로 치환되는 곳에서 일어날 수 있으며, 다음에 나타난 것들이 Tyr (-1.3) 또는 Pro (-1.6)이 아미노산 잔기에 부여된 것과 같이 약 -1.6의 수치요법 지수(hydropathic index )를 갖는 아미노산일 수 있다 (미국특허 제 4,554,101호에 개시된 내용이 참고자료로서 본 명세서에 포함된다): Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); 및 Trp (-3.4).

대체가능한 실시예에서, 보존된 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가 유사한 수치요법 지수(예를 들면, 플러스 또는 마이너스 2.0 이내)를 갖는 다른 잔기로 치환되는 곳에서 일어날 수 있다. 이러한 실시예에서, 각 아미노산 잔기는 다음과 같이 소수성 및 전하 특성에 기초하여 수치요법 지수를 부여받을 수 있다: Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); and Arg (-4.5).

대체가능한 실시예에서, 보존된 아미노산 치환은 동일한 분류에서 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 곳에서 일어날 수 있으며, 이때 아미노산은 다음과 같이 비극성, 산성, 염기성 및 중성 분류로 나누어진다: 비극성: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; 산성: Asp, Glu; 염기성: Lys, Arg, His; 중성: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.

대체가능한 실시예에서, 보존된 아미노산 변화는 친수성 또는 소수성, 크기 또는 부피, 또는 전하의 고려에 기초한 변화를 포함한다. 아미노산은 일반적으로 아미노산 곁사슬의 특성에 일차적으로 의존하는 소수성 또는 친수성으로 특징지어진다. Eisenberg 등(J. Mol. Bio. 179:125-142, 184)의 표준화된 컨센서스 소수성 스케일에 기초할 때, 소수성 아미노산은 0 보다 큰 소수성을 나타내며, 친수성 아미노산은 0보다 작은 친수성을 나타낸다. 유전적으로 암호화된 소수성 아미노산은 Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met 및 Trp을 포함하며, 유전적으로 암호화된 친수성 아미노산은 Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser 및 Lys 을 포함한다. 비유전적으로 암호화된 소수성 아미노산은t-부틸알라닌(t-butylalanine)을 포함하며, 반면 비유전적으로 암호화된 친수성 아미노산은 시트룰린(citrulline)과 호모시스테인(homocysteine)을 포함한다.

소수성 또는 친수성 아미노산은 그들의 곁사슬의 특성에 기초하여 추가로 세분화될 수 있다. 예를 들면, 방향족 아미노산은 적어도 하나의 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 곁사슬을 갖는 소수성 아미노산으로, -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR 등과 같은 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있으며, 여기서 R은 독립적으로 독립적으로 (C1-C6) 알킬, 치환된 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알케닐, 치환된 (C1-C6) 알케닐, (C1-C6) 알키닐, 치환된 (C1-C6) 알키닐, (C5-C20) 아릴, 치환된 (C5-C20) 아릴, (C6-C26) 알카릴, 치환된 (C6-C26) 알카릴, 5-20 원 헤테로아릴, 치환된 5-20 원 헤테로아릴, 6-26 원 알크헤테로아릴 또는 치환된 6-26 원 알크헤테로아릴이다. 유전적으로 암호화된 방향족 아미노산은 Phe, Tyr 및 Tryp 를 포함한다.

무극성 아미노산은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않는 곁사슬을 가진 소수성 아미노산이며 두 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 보통 두 원자 각각에 의해 동등하게 유지되는 결합을 가진다(즉, 곁사슬은 극성을 띄지 않는다). 유전적으로 암호화된 무극성 아미노산은 Gly, Leu, Val, Ile, Ala 및 Met 을 포함한다. 무극성 아미노산은 지방족 아미노산을 포함하도록 추가로 세분화될 수 있으며, 지방족 탄화수소 곁사슬을 갖는 소수성 아미노산이다. 유전적으로 암호화된 지방족 아미노산은 Ala, Leu, Val 및 Ile을 포함한다.

극성 아미노산은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않는 곁사슬을 가진 친수성 아미노산이지만, 두 원자에 의해 공유되는 전자쌍이 하나의 원자에 의해 보다 가깝게 유지되는 하나의 결합을 가진다. 유전적으로 암호화된 극성 아미노산은 Ser, Thr, Asn 및 Gln을 포함한다.

산성 아미노산은 7 미만의 곁사슬 pKa 값을 갖는 친수성 아미노산이다. 산성 아미노산은 수소 이온의 손실 때문에 생리학적 pH에서 전형적으로 음전하를 띄는 곁사슬을 갖는다. 유전적으로 암호화된 산성 아미노산은 Asp 및 Glu을 포함한다. 염기성 아미노산은 7보다 큰 곁사슬 pKa 값을 갖는 친수성 아미노산이다. 염기성 아미노산은 하이드로늄 이온과의 연관성 때문에 생리학적 pH에서 전형적으로 양전하를 띄는 곁사슬을 갖는다. 유전적으로 암호화된 염기성 아미노산은 Arg, Lys 및 His을 포함한다.

전술한 분류가 절대적인 것이 아니며 아미노산은 하나 이상의 카테고리에 포함될 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다. 또한 아미노산은 특정한 분석에 기초한 알려진 행동 및/또는 특징적인 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성에 기초하여 분류하거나 이전에 규명된 아미노산과의 비교를 통해 분류할 수 있다.

본 발명의 다양한 측면에서, 우레아 수송 및 숙주의 분해 활성은 와인 발효 조건과 같은 발효 조건 하에서 기대 수준이 되도록 조절된다. 용어 "발효 조건" 또는 "발효시키는 조건"이란 S. cerevisiae와 같은 개체가 발효에 의해 에너지를 생산하는 조건, 즉 발효가 일어나는 배양 조건을 의미한다. 넓은 의미에서 발효란, 산소의 부재 하에서 미생물의 생장을 위한 에너지를 제공할 수 있는 혐기성 반응의 총합을 의미한다. 발효에서 에너지는 기질 수준의 인산화에 의해 제공된다. 발효에서 유기 화합물(에너지원)은 전자 공여체로 제공되며 또다른 유기 화합물은 전자 수용체이다. 탄수화물, 아미노산, 퓨린 및 피리미딘과 같은 다양한 유기 기질이 발효에 이용될 수 있다. 한 측면에서 본 발명은 효모와 같이 에틸 알코올을 생산하기 위하여 탄수화물 발효를 할 수 있는 개체에 관한 것이다.

와인 발효에서, 머스트의 배양 조건은 출발물질로 사용되는 과일 주스로부터 비롯된다. 예를 들면, 포도주스의 주성분은 글루코스 (보통 약 75 내지 150 g/l), 프럭토스(보통 약 75 내지 150 g/l), 타르타르산 (보통 약 2 내지 10 g/l), 말산 (보통 약 1 내지 8 g/l) 및 프리 아미노산 (보통 약 0.2 내지 2.5 g/l)이다. 그러나 탄수화물을 에틸 알코올로 전환하는 주요 반응을 포함하는 방법에 의해 사실상 어떠한 과일이나 단 식물즙도 알코올성 음료로 가공될 수 있다.

와인 효모는 보통 약 3.2 내지 4.5 의 pH 범위에서 성장하고 발효되며 약 0.85 (또는 상대습도 약 88%)의 최저 수분 활성도를 필요로 한다. 발효는 자발적으로 진행되도록 허용될 수 있으며, 또는 이전에 발효된 머스트의 주입에 의해 시작될 수도 있는데, 이 경우 주스에 약 10⁶ 내지 약 10⁷ cfu/ml 정도의 효모 집단 (population)을 주입할 수 있다. 머스트에 효모 집단을 형성하도록 공기를 주입할 수 있다. 일단 발효가 시작되면 일반적으로 이산화탄소의 급격한 생성이 혐기성 조건을 유지시킨다. 발효 온도는 보통 10^oC 내지 30^oC이며, 발효 절차의 지속기간은, 예를 들면 수일에서 수주까지 연장될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 발효된 알코올 음료에서 에틸카바메이트의 농도를 감소시킬 수 있는 효모 균주를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 40 ppb (㎍/L), 35 ppb, 30 ppb, 25 ppb, 20 ppb, 15 ppb, 10 ppb 또는 5 ppb (또는 50 ppb 및 1 ppb 사이의 임의의 정수값) 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 와인을 제조하는데 사용될 수 있다. 대체 가능한 실시예에서, 본 발명은 약 500 ppb, 400 ppb, 300 ppb, 200 ppb, 150 ppb, 100 ppb, 90 ppb, 80 ppb, 70 ppb, 60 ppb, 50 ppb, 40 ppb, 30 ppb, 20 ppb 또는 10 ppb (또는 500 ppb 및 10 ppb 사이의 임의의 정수값) 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 강화 와인 또는 증류주를 제조하는데 사용될 수 있다.

대체 가능한 실시예에서, 본 발명은 그레이프머스트에서 감소된 우레아 농도를 유지할 수 있는 효모 균주를 제공할 수 있다. 예를 들면, 우레아 농도는 약 15 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 4 mg/l, 3mg/l, 2mg/l 또는 1 mg/l 미만으로 유지될 수 있다.

한 측면에서 본 발명은 발효 조건에서 기대 수준의 우레아 분해 활성을 갖는 발효 개체의 자연 돌연변이를 선별하는 방법을 제공할 수 있다. 예를 들면, DUR3의 NCR이 결핍된 효모 균주가 선별될 수 있다. 효모의 돌연변이 및 선별 프로토콜의 예로서, 2000.10.31에 발행된 Mortimer 등의 미국특허 제6,140,108호를 참고할 수 있다. 상기 방법에서, 효모 균주는 에틸메탄 설포네이트, 아질산 또는 히드록실아민과 같은 돌연변이원으로 처리될 수 있으며, 이는 염기쌍 치환의 돌연변이를 생성한다. 변화된 우레아 분해 활성을 갖는 돌연변이는, 예를 들면 적절한 배지에 플레이팅함으로써 스크리닝할 수 있다.

대체 가능한 실시예에서, site directed 돌연변이는 숙주 내에서 우레아 수송 레벨 또는 우레아 분해 활성을 변화시키는데 쓰일 수 있다. 예를 들면, site directed 돌연변이는 DUR3 또는 DUR1,2 프로모터와 같은 효모의 프로모터로부터 NCR 조정 인자를 제거하는데 쓰일 수 있다. 예를 들면, 도 4에서 보듯이, native DUR1,2 프로모터 서열의 GATAA(G) box는 치환에 의해 제거되거나 변형될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 예를 들면, 하나 또는 모든 GATAA box는 G를 T로 치환됨으로써 변형될 수 있으며, 이에 따라 그 서열은 TATAA가 된다. site directed 돌연변이의 방법은, 예를 들면 Rothstein, 1991; Simon and Moore, 1987; Winzeler et al., 1999; 및 Negrittoet al., 1997 에 개시되어 있다. 대체 가능한 실시예에서, S. cerevisiae 에서 NCR을 조정하는 Gln3p 및 Gat1p 을 암호화하는 유전자는 역시 NCR을 조정하도록 돌연변이 될 수 있다. 그리고 나서 선별되거나 조작된 NCR 결핍 프로모터는, 발효 조건에서 DUR3 의 발현을 조정하기 위해 DUR3 코딩서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 발명에 따른 효모 균주의 상대적인 우레아 수송 또는 분해 효소적 활성은 형질전환 되지 않은 부모 균주에 관련하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 형질전환된 효모 균주는 발효 조건에서 부모 균주보다 높은 우레아 수송 또는 분해 활성을 갖도록 선별될 수 있으며, 또는 부모 균주 활성의 적어도 150%, 200%, 250%, 300%, 400% 또는 500% 와 같이, 동일한 발효 조건에서 부모 균주보다 큰 활성 비율을 갖도록 선별될 수 있다. 이와 유사하게 본 발명의 재조합 핵산에 의해 발현되거나 암호화된 효소의 활성은, 유사한 다중 활성을 이용하여 그들이 유래된 비재조합 서열에 관련하여 결정할 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, DUR3 폴리펩타이드의 조절된 발현(regulated expression)을 조정하는 이종성 프로모터 서열의 지배를 받는 DUR3 코딩 서열을 갖는 재조합 핵산분자를 포함하거나 이의 상동체들을 포함하는 벡터가 제공될 수 있다. 이러한 벡터를 제공하기 위해, S. cerevisiae 유래의 DUR3 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 재조합 DUR3 유전자의 발현을 조절하는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 내로 삽입될 수 있다. 상기 재조합 분자는 변화된 우레아 수송 활성을 갖는 형질전환된 균주를 제공하기 위하여 선별된 효모 균주 내로 도입될 수 있다. 대체 가능한 실시예에서, S. cerevisiae 와 같은 숙주 내에서 native DUR3 코딩 서열 상동체의 발현은 또한 native 프로모터를 다른 프로모터로 대체함으로써 영향을 받을 수 있다. 부가적인 조절 인자가 또한 내재적 코딩 서열을 활용하는 재조합 발현 카세트를 구축하는데 이용될 수 있다. 재조합 유전자 또는 발현 카세트는 S. cerevisiae와 같은 숙주의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.

본 발명의 대체적인 측면으로 사용하기 위한 프로모터는 PGK1 또는 CAR1 프로모터와 같은 적합한 native S. cerevisiae 프로모터로부터 선별될 수 있다. 이러한 프로모터는 PGK1 및 CAR1처럼 부가적인 조절 인자들과 함께 사용될 수 있다. 다양한 native 프로모터 또는 재조합 프로모터가 이용될 수 있으며, 상기 프로모터는 와인 제조 조건과 같은 선별된 조건 하에서 DUR1,2p 활성과 같은 우레아 분해 활성의 발현을 조정하기 위해 선별되거나 구축될 수 있다. 다양한 구성적 프로모터가, 예를 들면 DUR3 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 숙주의 우레아 수송(흡수) 활성을 조절하는 재조합 핵산으로 형질전환된 효모 균주와 같은 숙주를 이용한 와인 발효방법과 같은 탄수화물 발효 방법이 제공된다. 예를 들면, DUR3 유전자의 NCR은 와인을 제조하는 효모 균주에서 우레아의 흡수를 향상시키도록 조절될 수 있다. 이러한 본 발명의 측면에 따르면, 제한된 양의 에틸카바메이트의 생산을 야기하기 위해서 효모 균주를 이용한 그레이프머스트의 발효가 수행될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시예들이 본 명세서에 기술되었을지라도, 당업계의 일반적인 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 범위 내에서 많은 적용과 변형이 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 실질적으로 동일한 방법으로 동일한 결과를 얻기 위하여, 본 발명의 임의의 측면에 있어서 알려진 등가물의 치환을 포함한다. 수치 범위는 범위를 나타내는 수들을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "포함하는"은 확장 가능한 용어로 사용하였고 실질적으로 "포함하지만, 이에 한정되지 않는" 것과 동등한 의미이며, 그리고 "포함한다"도 이에 상응하는 의미를 갖는다. 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌을 본 발명의 선행기술로 인정하는 것으로 이해되지는 않을 것이다. 특허 및 특허출원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에서 인용된 모든 출판물은, 마치 각 출판물이 구체적이고 개별적으로 본 명세서에 참고문헌으로 편입된 것처럼 이해되고 본 명세서에서 전체적으로 진술된 것처럼 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 본 발명은 전술된 바와 같은 모든 구체예들과 변형을 포함하며 실시예 및 도면을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아 전달체 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 형질전환된 효모 균주를 제공한다. 예를 들면, 상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화될 수 있고, 상기 우레아 전달체는 DUR3p일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아 전달체 발현과 우레아 분해 효소 발현 모두의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 추가로 형질전환된 효모 균주를 제공한다. 상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화될 수 있고, 상기 우레아 분해 효소는 DUR1 ,2에 의해 암호화될 수 있다. 상기 우레아 전달체는 DUR3p일 수 있고, 상기 우레아 분해 효소는 우레아 카르복시화효소 또는 알로파네이트 가수분해효소일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 계속적으로 우레아를 흡수하도록 형질전환된 효모 균주를 제공한다. 상기 효모는, 예를 들면 DUR3를 구성적으로 발현할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아를 계속적으로 흡수하고 분해하도록 형질전환된 효모 균주를 제공한다. 상기 효모 균주는 DUR1 ,2 및 DUR3를 구성적으로 발현할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아 전달체 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 효모 균주를 형질전환하는 것을 포함하는 효모 균주의 변형 방법을 제공한다. 상기 우레아 전달체는, 예를 들면 DUR3에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 우레아 전달체는 DUR3p일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아 전달체 발현 및 우레아 분해 효소 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 효모 균주를 형질전환하는 것을 포함하는 효모 균주의 변형 방법을 제공한다. 상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 우레아 분해 효소는 DUR1 ,2에 의해 암호화될 수 있다. 상기 우레아 전달체는 DUR3p일 수 있고, 상기 우레아 분해 효소는 우레아 카르복시화효소 또는 알로파네이트 가수분해효소 일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR3을 구성적으로 발현하도록 효모 균주를 변형하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 1/2TRP1-PGK _p -DUR3-PGK _t -kanMX-1/2TRP1 카세트의 TRP1 locus로의 통합을 포함한다. 대신에, 상기 방법은 DUR3p를 암호화하는 코딩서열을 포함하는 재조합 핵산으로 효모 균주를 형질전환하는 것을 포함할 수 있다. 대신에, 상기 방법은 질소 이화물질 억제작용에 영향을 받지 않는 프로모터를 포함하는 재조합 핵산으로 효모를 형질전화하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아 전달체 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 형질전환된 효모 균주를 이용한 발효 음료 또는 발효 식품의 제조 방법을 제공한다. 상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 우레아 전달체는 DUR3p일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 발효 조건에서 우레아 전달체 발현과 우레아 분해 효소 발현 모두의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 형질전환된 효모 균주를 이용한 발효 음료 또는 발효 식품의 제조 방법을 제공한다. 상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화될 수 있으며, 상기 우레아 분해 효소는 DUR1,2에 의해 암호화될 수 있다. 상기 우레아 전달체는 DUR3p일 수 있고, 상기 우레아 분해 효소는 우레아 카르복시화효소 또는 알로파네이트 가수분해효소 일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR3을 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주의 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트 농도를 감소시키기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR1 ,2 및 DUR3모두를 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주의 발효 음료 또는 발효 식품에서 에틸카바메이트 농도를 감소시키기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR3을 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주의 30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 와인을 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR1 ,2 및 DUR3 모두를 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주의 30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 와인을 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR3을 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주를 이용하여 생산된 감소된 에틸카바메이트 농도를 갖는 발효 음료 또는 발효 식품을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR1 ,2 및 DUR3 모두를 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주를 이용하여 생산된 감소된 에틸카바메이트 농도를 갖는 발효 음료 또는 발효 식품을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명은 DUR3을 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주를 이용하여 생산된30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 와인을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 DUR1 ,2 및 DUR3 모두를 구성적으로 발현하는 형질전환된 효모 균주를 이용하여 생산된30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 와인을 제공한다.

이하 하기의 비제한적인 실시예를 통하여 본 발명을 추가로 설명한다. 사용된 실험 방법의 기술은 실시예에 뒤따른다.

실시예 1: 와인 균주 Saccharomyces cerevisiae 에서 DUR3 유전자의 클로닝 및 구성적 발현

클론 선별을 위해, 항생제 저항성 마커인 kanMX를 사용하였다. 효모 균주 UC Davis 522 (Montrachet), Prise de Mousse (EC1118) 및 K7-01 (사케 효모)을 DUR3 단독 또는 DUR1 ,2 및 DUR3을 함께 구성적으로 발현하도록 형질전환시켰다. 확장된 실험(extensive testing)은 형질전환된 효모 균주가 부모 균주와 상당히 유사함을 보여주었다. 다시 말해, 유전적이고 대사적인 유일한 변형은 DUR3 또는 DUR1 ,2 및 DUR3의 의도된 구성적 발현이다.

실시예 2: DUR3 유전자 카세트를 이용한 효모의 형질전환

PGK1 프로모터와 터미네이터 시그널의 지배를 받는 DUR3 유전자를 포함하는 재조합 핵산으로 효모를 형질전환하였다. PGK1 프로모터는 NCR의 영향을 받지 않는다. DUR3 유전자 카세트 - 1/2 TRP1 - PGK _p - DUR3 - PGK _t - kanMX -1/2 TRP1.

실시예 3: 감소된 에틸카바메이트의 발생을 수립하기 위한 재조합 효모를 이용한 발효 연구

DUR3 의 구성적 발현은 아르기닌 대사의 부산물로서 분비되는 우레아를 재흡수하는 효모 균주를 만들어낸다. 그러나 그들은 그레이프머스트에 본래부터 존재하는 우레아도 흡수한다. 522 ^DUR3 효모 균주 (~81%)에 노출된 와인에서 상당한 에틸카바메이트의 감소가 관찰되었으며, K7 ^DUR3 및 PDM ^DUR3 효모 균주에 노출된 뒤에는 각각 25% 및 13%가 감소되었다 (표 1). DUR3를 구성적으로 발현하는 효소는 DUR1 , 2 를 구성적으로 발현하는 효소만큼 효과적으로 에틸카바메이트농도를 감소시키는 것이 관찰되었다.

DUR1 ,2 및 DUR3 의 구성적 발현의 조합은 552 및 K7 효모 균주에서 에틸카바메이트를 DUR1 ,2 또는 DUR3 단독인 경우와 거의 동일한 정도로 감소시켰다. 하지만 PDM^{EC - DUR3} (DUR1 ,2 및 DUR3)은 와인 머스트에서 PDM ^DUR3 ( DUR3 ) 또는 PDM^EC (DUR1 ,2) 균주 단독인 경우보다 많은 정도로 에틸카바메이트를 감소시킬 수 있는 효모 균주의 예이다.

실시예 4: 선별마커의 제거를 허용하는 셀프 클로닝 카세트

도 9 및 10은 하기에 기술되는 바와 같이 형질전환된 효모의 선별을 허용하고 이후 동향 반복서열(direct repeats)의 재조합을 통해 항생제 저항성 마커의 제거를 허용하는, 본 실시예에서 사용된 DUR3 유전자 카세트 leu2-PGK1 _p -kanMX-PGK _p -DUR3-PGK1 _t -leu2를 보여준다.

형질전환된 효모의 선별 및 동향 반복서열의 재조합을 통한 항생제 저항성 마커의 제거를 허용하는 PGK1 프로모터 및 터미네이터 시그널의 지배를 받는 DUR3 유전자를 포함하는 재조합 핵산으로 효모를 형질전환하였다. PGK1 프로모터는 NCR의 영향을 받지 않는다. DUR3 유전자 카세트는 leu2 - PGK1 _p - kanMX - PGK _p - DUR3 - PGK1 _t - leu2이다. 네 개의 균주를 leu2 - PGK1 _p - kanMX - PGK _p - DUR3 - PGK1 _t - leu2 카세트로 형질전환하였다: CY3079, Bordeaux Red, DUR1 ,2-형질전환 균주 D80ec- 및 D254ec-. 이로부터 D254ec- 55 균주, D80ec- 125 균주, Bordeaux Red 약 200 균주, 및 CY3079 약 300 균주를 수득하였다. EC 감소를 결정하기 위한 미니 발효에 사용하기 위해 균주당 약 20-60 콜로니를 선택하였다. 실험실 조건에서 두 개의 CY3079 클론이 94.2% 및 46.5%의 EC 감소를 보였고; 세 개의 Bordeaux Red 클론이 57.6% -64.9%의 EC 감소를 보였으며; 하나의 D80ec- 클론이 60.8%-66.1%의 EC 감소를 보였고; 두 개의 D254ec- 클론이 87.5% 및 75.1%의 EC 감소를 보였다.

상기 실시예에 사용된 실험 방법

pHVX2D3 의 구축

DUR3 을 구성적 PGK1 프로모터 및 터미네이터 시그널의 지배 하에 두기 위하여, DUR3 ORF를 pHVX2로 복제하였다. DUR3 ORF는 5' 말단에 도입된 Xho1 제한효소 사이트를 포함하는 다음의 프라이머를 이용하여 522 게놈 DNA로부터 증폭시켰다:

DUR3forXho1 (5'-AAAACTCGAGATGGGAGAATTTAAACCTCCGCTAC-3')(서열번호1)

DUR3revXho1 (5'-AAAACTCGAGCTAAATTATTTCATCAACTTGTCCGAAATGTG-3')(서열번호2).

PCR, 0.8% 아가로스 겔 시각화 및 PCR 정화 (Qiagen, USA-PCR Purification Kit) 후에, PCR 생성물 (인서트) 및 pHVX2 (벡터)를 Xho1 (Roche, Germany)로 절단하였다. 원형으로의 재결합(recircularization)을 막기 위해 절단된 벡터를 SAP (Fermentas, USA)로 처리한 후에, 인서트와 선형으로 된 SAP 처리 벡터를 22℃ (T4 DNA Ligase-Fermentas, USA)에서 밤새 라이게이션 시켰고; 라이게이션 혼합물 (5㎕)을 이용해 DH5α™ 적격세포(competent cell) (Invitrogen, USA)를 형질전환하여 이후 100 ㎍/mL 앰피실린 (Fisher, USA) 첨가된 LB (Difco, USA) 플레이트에서 배양하였다. 형질전환주 콜로니로부터 랜덤으로 선별된 플라스미드를 수득하여 (Qiagen, USA-QIAprep Spin Miniprep kit) EcoR1 (Roche, Germany)으로 절단하였고; 원하는 인서트를 가진 플라스미드를 찾기 위해 인사이드-아웃사이드 프라이머를 이용한 PCR을 수행하였다. PGK1p - DUR3 - PGK1t 를 포함하는 결과물 플라스미드를 pHVX2D3라 명명하였다.

pHVXKD3 의 구축

Xho1 및 Sal1 (fermentas, USA)를 이용한 이중 절단을 통해 pUG6로부터 kanMX 마커를 수득하였다. 절단 후에, 1500bp kanMX 밴드를 겔에서 정제하고 (Qiagen, USA Gel Extraction Kit) 선형으로 된 SAP 처리된 pHVX2D3의 Sal1 사이트로 라이게이션 시켰다. 라이게이션 혼합물(5 ㎕)을 이용하여 LB-앰피실린 (100 ㎍/mL)에서 배양된 DH5α™ 적격세포를 형질전환하였다. 랜덤으로 선별된 24 콜로니로부터 분리된 플라스미드의 HindIII (Roche, Germany) 절단에 의해 재조합 플라스미드를 찾았다. PGK1p - DUR3 - PGK1t-kanMX 를 포함하는 결과물 플라스미드를 pHVXKD3라 명명하였다.

pUCTRP1 의 구축

각각 BamH1을 포함하고 5' 말단에 Apa1 사이트를 포함하는TRP1 특이적 프라이머를 이용하여 522 게놈 DNA로부터 TRP1 코딩 영역을 PCR 증폭시켰다:

BamH1Apa1TRP1ORFfwd

(5'-AAAAAA GGATCC AAAAAA GGGCCC ATGTCTGTTATTAATTTCACAGG-3')(서열번호3)

BamH1Apa1TRP1ORFrev

(5'-AAAAAA GGATCC AAAAAA GGGCCC CTATTTCTTAGCATTTTTGACG-3')(서열번호4).

증폭, 정화 및 정량 후에, 선형으로 된 SAP가 처리된 pUC18의 BamH1 (Roche, Germany) 사이트 내로 ~750 bp 절편을 라이게이션 시켰다. 재조합 플라스미드는 일차적으로 블루/화이트 스크리닝(50 ㎍/mL Xgal 첨가된 LB-앰피실린에서 배양)을 통해 찾아냈으며 다음으로 HindIII/EcoR1 절단으로 확인하였다. TRP1를 포함하는 결과물 플라스미드를 pUCTRP1라 명명하였다.

pUCMD 의 구축

카세트 특이적 프라이머를 이용하여 pHVXKD3으로부터 pHVXKD3 내에 위치한 PGK1p-DUR3-PGK1t-kanMX 카세트를 증폭시켰다:

pHVXKfwdlong (5'-CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAG-3')(서열번호5)

pHVXKrevlong (5'-CTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGG-3')(서열번호6).

증폭, 정화 및 정량 후에, 선형으로 된 SAP가 처리된 pUCTRP1의 blunt EcoRV (Fermentas, USA) 사이트 내로의 라이게이션을 촉진시키기 위해, ~6500bp blunt end PCR 생성 절편을 폴리뉴클레오티드 키나아제 (New England Biolabs, USA)로 처리하였다.

E-lyse 분석을 이용하여 재조합 플라스미드를 일차적으로 찾아냈으며 이후 Apa1(Strata유전자, USA)/Sal1 절단을 통해 확인하였다. 간단하게, E-lyse는 아가로스 겔 웰(well) 내에서 콜로니를 용혈시킴으로써 플라스미드 DNA의 존재를 확인하기 위한 많은 양의 콜로니를 효과적으로 스크린하며, 전기영동이 뒤따른다. 보다 구체적으로, 선별배지로 부착한 후에 콜로니의 작은 일부 표본을 5 ㎕ TBE 버퍼에 서스펜션시켰고, 그 후 10 ㎕ SRL 버퍼 (25% v/v 수크로스, 50 ㎕/mL RNase, 1 mg/mL 리소자임)와 혼합하였다. 피펫팅으로 혼합한 후, 0.2% (w/v) SDS - 0.8% (w/v) 아가로스 겔 웰로 세포 서스펜션을 로딩하였다. 웰의 세포 서스펜션이 세포 용혈(lysis)을 나타내도록 깨끗하게 된 후에 (~ 30 분), DNA를 20 V로 45 분간, 그 후 80 V로 45 분간 전기영동하였다. 마지막으로 상기 겔을 필요한 대로 SYBR™ Safe (Invitrogen, USA)로 염색하였다.

선형 DUR3 카세트의 S. cerevisiae 로의 형질전환 및 형질전환주의 선별

Apa1 (Stratagene, USA)을 이용하여 pUCMD로부터 6536bp DUR3 카세트를 잘랐고, 상기 6536bp DUR3 카세트는 0.8% 아가로스 겔에서 시각화하였다. 겔로부터 예상된 6536bp 밴드를 분해하여 추출하였다 (Qiagen, USA-Gel extraction kit). 추출, 정화 및 Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop, USA)를 이용한 정량 후에, S. cerevisiae 균주 522, 52^{2 EC -}, PDM, PD^{MEC -}, K7 및 K^{7EC -}를 형질전환하기 위해 250 ng 의 선형 카세트를 사용하였다. 리튬 아세테이트/폴리에틸렌글리콜/ssDNA 방법을 이용하여 효모 균주들을 형질전환한 후, 세포를 300 ㎍/mL G418 (Sigma, USA)이 첨가된 YPD 플레이트로 플레이팅 하기 전에 세포가 회복되도록 YPD에 30℃에서 2 시간 동안 두었다. 콜로니가 나타날 때까지 플레이트를 30℃에서 배양하였다.

칼로나 샤르도네 ( Calona Chardonnay )

여과되지 않은 샤르도네 포도 주스 (23.75 Brix, pH 3.41, 암모니아 91.6 mg/L, FAN 309.6 mg/L)는 오카나간 밸리(Okanagan Valley )의 칼로나 포도원에서 얻었고 변형된 효모의 주입에 사용하였다. 부모 균주들 (522, PDM, K7 및 K9) 뿐만 아니라 막 자국을 낸 YPD 플레이트로부터 얻은 적절한 기능 향상 균주들의 단일 콜로니를 5 mL YPD에 주입하였고 밤새 배양하였다 (30℃-rotary wheel). 세포들을 50 mL YPD (OD₆₀₀ = 0.05)로 계대배양 하였고 다시 밤새 배양하였다 (30℃-180 rpm shaker bath). 세포들은 원심분리 (5000 rpm, 4℃, 5 분)를 이용하여 채취하였으며 50 mL 증류수로 한번 세척하였다. 세포 펠렛들을 5 mL 증류수로 재서스펜션하였고 OD₆₀₀ 를 측정하였다. 세포 서스펜션은 캐나다 BC Kelowna의 칼로나 포도원에서 얻은 여과되지 않은 샤르도네 주스 200mL로 채워진 살균한 250mL Schott 보틀에 최종 OD₆₀₀ = 0.1로 주입하는데 사용하였다. 증류수로 채워진 살균된 (70% v/v 에탄올) 베이퍼 록(vapour lock)으로 보틀을 무균적으로 밀봉하였다. 밀봉된 보틀은 20℃에서 배양하였고, CO₂ 생성을 모니터하기 위해 날마다 무게를 쟀다. 데이터는 발효 프로파일을 만들기 위해 엑셀에 나타내었다. 발효의 마지막에, 원심분리로 (5000 rpm, 4℃, 5 분) 세포를 제거하였고, ~ 50 mL 와인을 살균된 50 mL Schott 보틀로 옮겼다. 보틀은 EC 생성을 최대화시키기 위해 70℃의 수조에서 정확히 48 시간 동안 배양하였고, 그 후 GC/MS 분석 때까지 4℃에 보관하였다.

와인에서 SPME 및 GC - MS 에 의한 에틸카바메이트의 정량

에틸카바메이트 생성을 촉진시키기 위해 샤르도네 와인을 70℃에서 48 시간 동안 가열하였다. 10-mL 와인 샘플을 20-mL 샘플 유리병으로 피펫팅하였다. 작은 마그네틱 스터링 바(magnetic stirring bar) 및 3 g의 NaCl을 첨가하고 유리병을 PTFE/실리콘 격막으로 씌웠다. 상기 유리병을 22℃의 교반기에 두었고 15분 동안 교반하면서 평형화되도록 했다. SPME 파이버 (65 ㎛ 카보왁스/디비닐벤젠)를 사용 전 30분 동안 250℃에서 유지시켰다. 샘플 평형화 후에, 상기 파이버(fiber)를 병의 상부 헤드스페이스로 삽입하였다. 30분 후에, 상기 파이버를 샘플 유리병으로부터 제거하였고 주입부(injection port)로 15분 동안 삽입하였다. 각 샘플의 실행 전에 블랭크 실행(blank run)을 수행하였다. 정량은 외부 표준 방법(external standard method)을 이용하여 수행하였다. 12% (v/v) 에탄올 및 pH 3.1의 1 mM 타르타르산을 포함하는 증류수에서 에틸카바메이트(Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI) 표준 원액을 0.1 mg/mL로 제조하였다. 보정 표준(calibration standard)은 EC 농도 5, 10, 20, 40, 90 ㎍/L로 만들었다. 표준 용액은 4℃의 냉장기에 보관하였다. 와인 내의 에틸카바메이트는 5973N Mass Selective Detector에 인터페이스된 Agilent 6890N GC 를 이용하여 정량하였다. 60 m x 0.25 mm i.d., 0.25 ㎛ 두께의 DBWAX fused-silica open tubular column (J&W Scientific, Folsom, CA)을 사용하였다. 정격 유량(constant flow) 36 cm/s에서 운반 가스는 초고순도 헬륨이었다. 주입기 및 전이 선의 온도는 250℃로 세팅하였다. 오븐 온도는 초기에 70℃ 에서 2 분, 이후에 180℃에서 8℃ /분으로 올렸고 3분간 유지했다. 그리고 나서 온도를 220℃까지 20℃/분씩 증가시키도록 프로그래밍 하였고, 220℃에서 15분간 유지하였다. 전체 실행 시간은 35.75분이었다. 주입 모드는 5분 동안 쪼갤 수 없었다 (배출 유량: 5 mL/분, 배출 시간: 5분). MS는 선택이온검출(selected ion monitoring, SIM) 모드에서 전자 충돌 이온화(electron impact ionization)로 작동하였다; MS 쿼드 온도 150℃ 및 MS 소스 온도 230℃. solvent delay는 8분이었다. 특이 이온 44, 62, 74, 89는 드웰 시간(dwell time) 100 msec 으로 모니터하였다. 인증된 EC 표준의 질량 스펙트럼에 대비한 정량화에 질량 62를 사용하였다.

도 8은 발효 프로파일을 나타낸다. 기능적으로 향상된 균주 및 대조군 균주에 의해 생산된 에탄올의 최종 양은 표 2에 나타내었다.

표 1

와인 제조 중 에틸카바메이트 감소의 요약. 칼로나 샤르도네 머스트로부터 얻은 사케 효모 균주 (K7,K7^{EC -} (8),^,K7^DUR3, K7^{EC - DUR3}) 및 와인 효모 균주 (522,522 ^{EC -,},522 ^DUR3,522 ^{EC - DUR3},PDM, PDM ^{EC -,}, PDM ^DUR3, PDM ^{EC - DUR3})에 의해 생산된 샤르도네 와인에서 에틸카바메이트(mg/L)는 GC/MS에 의해 정량하였다. 발효는 완성될 때까지 20℃에서 배양하였다.

^{EC -} DUR1 ,2의 구성적 발현

^DUR3 DUR3의 구성적 발현

^{EC - DUR3} DUR1 ,2 및 DUR3의 조합된 구성적 발현

표 2

샤르도네 와인에서 와인 효모 균주 (522, 522DUR1,2 [522^{EC -} 의 대체 명칭] 522^DUR3, 및 522^{DUR1 ,2/ DUR3} [522^{EC - DUR3} 의 대체 명칭])에 의해 에탄올을 생성하였다. 에탄올 함량(%v/v)은 발효 마지막에 LC에 의해 측정하였다. 발효 프로파일은 도 3에 나타내었다. 두 인자 ANOVA 분석을 이용하여 통계적 유의성(p=0.05) 데이터를 분석하였다.

<110> The University of British Columbia <120> Functional Enhancement of Yeast to Minimize Production of Ethyl Carbamate via Modified Transporter Expression <130> 80021-1094 <150> US 61/071,138 <151> 2008-04-14 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUR3forXho1 <400> 1 aaaactcgag atgggagaat ttaaacctcc gctac 35 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DUR3revXho1 <400> 2 aaaactcgag ctaaattatt tcatcaactt gtccgaaatg tg 42 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamH1Apa1TRP1ORFfwd <400> 3 aaaaaaggat ccaaaaaagg gcccatgtct gttattaatt tcacagg 47 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamH1Apa1TRP1ORFrev <400> 4 aaaaaaggat ccaaaaaagg gcccctattt cttagcattt ttgacg 46 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHVXKfwdlong <400> 5 ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHVXKrevlong <400> 6 ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 40 <210> 7 <211> 735 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Gly Glu Phe Lys Pro Pro Leu Pro Gln Gly Ala Gly Tyr Ala Ile 1 5 10 15 Val Leu Gly Leu Gly Ala Val Phe Ala Gly Met Met Val Leu Thr Thr 20 25 30 Tyr Leu Leu Lys Arg Tyr Gln Lys Glu Ile Ile Thr Ala Glu Glu Phe 35 40 45 Thr Thr Ala Gly Arg Ser Val Lys Thr Gly Leu Val Ala Ala Ala Val 50 55 60 Val Ser Ser Trp Ile Trp Cys Ser Thr Leu Leu Thr Ser Ser Thr Lys 65 70 75 80 Glu Tyr Ala Asp Gly Ile Phe Gly Gly Tyr Ala Tyr Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Cys Phe Gln Ile Ile Ala Phe Ala Ile Leu Ala Ile Lys Thr Lys Gln 100 105 110 Met Ala Pro Asn Ala His Thr Tyr Leu Glu Leu Val Arg Thr Arg Tyr 115 120 125 Gly Lys Ile Gly His Gly Cys Tyr Leu Phe Tyr Ala Ile Ala Thr Asn 130 135 140 Ile Leu Val Thr Ser Met Leu Leu Thr Ser Gly Ser Ala Val Phe Ser 145 150 155 160 Asp Leu Thr Gly Met Asn Thr Ile Ala Ser Cys Phe Leu Leu Pro Val 165 170 175 Gly Val Val Val Tyr Thr Leu Phe Gly Gly Ile Lys Ala Thr Phe Leu 180 185 190 Thr Asp Tyr Met His Thr Cys Val Ile Ile Ile Ile Val Leu Val Phe 195 200 205 Ala Phe Lys Val Tyr Ala Thr Ser Asp Val Leu Gly Ser Pro Gly Lys 210 215 220 Val Tyr Asp Leu Val Arg Glu Ala Ala Lys Arg His Pro Val Asp Gly 225 230 235 240 Asn Tyr Gln Gly Glu Tyr Met Thr Met Thr Ser Lys Ser Ala Gly Ile 245 250 255 Leu Leu Ile Ile Asn Leu Ile Gly Asn Phe Gly Thr Val Phe Leu Asp 260 265 270 Asn Gly Tyr Trp Asn Lys Ala Ile Ser Ala Ser Pro Ala Ala Ser Leu 275 280 285 Lys Ala Tyr Ala Ile Gly Gly Leu Ala Trp Phe Ala Val Pro Ser Leu 290 295 300 Ile Ser Leu Thr Met Gly Leu Ala Cys Leu Ala Val Glu Thr Ser Pro 305 310 315 320 Asn Phe Pro Thr Tyr Pro Asp Pro Leu Thr Ser Phe Gln Ala Asn Ser 325 330 335 Gly Leu Val Leu Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ile Met Gly Lys Gly Gly 340 345 350 Ala Val Ala Ser Leu Leu Met Ile Phe Met Ala Val Thr Ser Ala Met 355 360 365 Ser Ala Glu Leu Ile Ala Val Ser Ser Val Phe Thr Tyr Asp Ile Tyr 370 375 380 Arg Glu Tyr Ile Asp Pro Arg Ala Ser Gly Lys Lys Leu Ile Tyr Thr 385 390 395 400 Ser His Val Ala Cys Ile Phe Phe Gly Leu Ala Met Ser Gly Phe Ser 405 410 415 Val Gly Leu Tyr Tyr Gly Gly Ile Ser Met Gly Tyr Ile Tyr Glu Met 420 425 430 Met Gly Ile Ile Ile Ser Ser Ala Val Leu Pro Val Val Leu Thr Leu 435 440 445 Cys Ser Lys Asp Met Asn Leu Val Ala Ala Val Val Ser Pro Ile Leu 450 455 460 Gly Thr Gly Leu Ala Ile Met Ser Trp Leu Val Cys Thr Lys Ser Leu 465 470 475 480 Tyr Lys Glu Leu Thr Val Asp Thr Thr Phe Met Asp Tyr Pro Met Leu 485 490 495 Thr Gly Asn Leu Val Ala Leu Leu Ser Pro Ala Ile Phe Ile Pro Ile 500 505 510 Leu Thr Tyr Val Phe Lys Pro Gln Asn Phe Asp Trp Glu Lys Met Lys 515 520 525 Asp Ile Thr Arg Val Asp Glu Thr Ala Glu Leu Val Gln Ala Asp Pro 530 535 540 Asp Ile Gln Leu Tyr Asp Ala Glu Ala Asn Asp Lys Glu Gln Glu Glu 545 550 555 560 Glu Thr Asn Ser Leu Val Ser Asp Ser Glu Lys Asn Asp Val Arg Val 565 570 575 Asn Asn Glu Lys Leu Ile Glu Pro Asn Leu Gly Val Val Ile Ser Asn 580 585 590 Ala Ile Phe Gln Glu Asp Asp Thr Gln Leu Gln Asn Glu Leu Asp Glu 595 600 605 Glu Gln Arg Glu Leu Ala Arg Gly Leu Lys Ile Ala Tyr Phe Leu Cys 610 615 620 Val Phe Phe Ala Leu Ala Phe Leu Val Val Trp Pro Met Pro Met Tyr 625 630 635 640 Gly Ser Lys Tyr Ile Phe Ser Lys Lys Phe Phe Thr Gly Trp Val Val 645 650 655 Val Met Ile Ile Trp Leu Phe Phe Ser Ala Phe Ala Val Cys Ile Tyr 660 665 670 Pro Leu Trp Glu Gly Arg His Gly Ile Tyr Thr Thr Leu Arg Gly Leu 675 680 685 Tyr Trp Asp Leu Ser Gly Gln Thr Tyr Lys Leu Arg Glu Trp Gln Asn 690 695 700 Ser Asn Pro Gln Asp Leu His Val Val Thr Ser Gln Ile Ser Ala Arg 705 710 715 720 Ala His Arg Gln Ser Ser His Phe Gly Gln Val Asp Glu Ile Ile 725 730 735 <210> 8 <211> 2208 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 atgggagaat ttaaacctcc gctacctcaa ggcgctgggt acgctattgt attgggccta 60 ggggccgtat ttgcaggaat gatggttttg accacttatt tactgaaacg ttatcaaaag 120 gaaatcatca cagcagaaga attcaccacc gccggtagat ctgtaaaaac cggcttagtg 180 gctgcagccg tggtttctag ttggatctgg tgttctacat tgttaacgtc gtcaacaaag 240 gaatatgcag acggtatatt tggcggttat gcgtacgctg ctggcgcatg cttccaaatt 300 attgcattcg caattttggc aattaaaacc aagcaaatgg ctcccaatgc gcacacatat 360 ttagaattag tgagaacaag atatggtaag atcggccatg gttgctactt gttttatgcc 420 atcgcgacga atattttagt cacttcaatg cttttaactt caggttctgc tgtctttagt 480 gatttaaccg ggatgaacac tatcgcatca tgttttttac tgcctgtggg tgttgttgtt 540 tatactctat ttggtgggat taaagcaact ttcttaacgg actatatgca cacatgtgtc 600 attatcatca ttgtcctcgt atttgccttt aaagtttatg cgactagtga tgttttaggc 660 tcaccgggaa aagtttatga cttagttcgt gaagccgcca agaggcatcc agtagacggt 720 aactatcagg gtgaatatat gaccatgaca tccaaatccg ctggtatttt attaattatt 780 aacctgattg gaaatttcgg caccgttttc cttgataatg gttattggaa taaagcgatt 840 tctgctagtc ccgcagcgag tttgaaagca tatgccatcg gtgggttagc atggtttgca 900 gtaccttctt tgatttcatt gaccatggga ttagcatgtc ttgcggtgga aacgtctccg 960 aacttcccca cctatcctga tccacttact tcgttccagg caaattctgg gttagtcttg 1020 ccggcagctg caattgctat catgggtaag gggggtgctg tggcatcgct gctaatgatt 1080 ttcatggccg tcacatctgc tatgtctgct gaactaattg ccgtttcatc tgttttcact 1140 tacgatatct atagagaata tattgatcct cgtgcaagcg gtaagaaatt gatttacaca 1200 tcacacgttg cttgtatctt ttttggtctt gccatgagtg gattttcggt tggtttatac 1260 tatggtggta tttctatggg ttatatctat gaaatgatgg gtataattat tagtagtgca 1320 gtattacctg tcgttttgac cttatgttcc aaagacatga atttggtggc cgctgtagtg 1380 tcgcctattt tgggcacagg actggctata atgtcatggc ttgtctgtac caaatccctt 1440 tataaagaat tgaccgtgga tactacgttc atggattatc caatgttaac aggtaacttg 1500 gtggctttgc tatcaccagc catttttatt cctattttaa cgtatgtgtt taagccacaa 1560 aattttgact gggagaaaat gaaagatatt actagagttg acgaaactgc agagttagtt 1620 caggctgacc ctgatatcca gctttacgat gctgaagcta acgataagga acaagaagaa 1680 gaaacaaatt ctctggtctc agatagtgaa aaaaacgatg ttagagtaaa taatgaaaaa 1740 ttgattgagc ctaaccttgg tgttgtaata agtaatgcca tttttcaaga agatgacaca 1800 cagttacaaa atgaattaga cgaagaacaa agagaactag cacgtggttt aaaaattgca 1860 tacttcctat gtgttttttt cgctttggca tttttggtag tttggcccat gcccatgtat 1920 ggttccaaat atatcttcag taaaaaattc tttaccggtt gggttgttgt gatgatcatc 1980 tggctttttt tcagtgcgtt tgccgtttgt atttatccac tctgggaagg taggcatggt 2040 atatatacca ctttgcgagg cctttactgg gatctatctg gtcaaactta taaattaagg 2100 gaatggcaaa attcgaaccc acaagatctg catgtagtaa caagccaaat tagtgcgaga 2160 gcacatagac aatcatcaca tttcggacaa gttgatgaaa taatttag 2208 <210> 9 <211> 375 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> Upstream region of the DUR1,2 gene ending at the DUR1,2 start codon ATG <400> 9 tcccctattt catagggcac tctgttcgca gttagcgcaa gccattgaga taagacacgc 60 agatgttttg ctttttcctg cttcttaatt tgaatcgagc tttgttagac gttgttggaa 120 attgaatgtt tgtatttaaa cactagagca gatgaggtgt gagatttgta tactcgctca 180 cttctgaata tcaggctctc ttagctaagc tttttttttc taggatcata taggctcaag 240 tttttataag cttatattaa tatatcagtg gagcagctga tatacaccaa atttcaattt 300 acattaatat aaaagataaa aaatagaaat atctttttta tagtcacaat aaatttcagt 360 tttgattaaa aaatg 375 <210> 10 <211> 489 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(489) <223> Portion of the upstream region of the DUR3 gene <400> 10 ctcttaaaga tgcaaaagca gtcatacagg tatttgtttt atgcagcaag gctgactcaa 60 actaggcatt ccaattctgt ttatctattg gtgccgcacc ttttttccga tgatgaaatg 120 aggcggcgca catttgggtg ttatcttatc gggatatttt atgatagcaa atgcgacaga 180 caataatgct cgagagtgga caggccaata gtcagttgca gcatagaaac aagcaggcgt 240 acctatggga aaggtgtaac tcatcattgc gctttctacg gtacggttat ccttagataa 300 caggcaagat gtgctctatt catcggtgtt gcatgaagat acgtcttgtt cgccaagtat 360 ataaaatgaa gcagtagtat agccgtagct ttactattgt tagcagtttc ccttgtctag 420 attcttaaat tgggttcatc caagaaaaag taataacata aatttgtcat tgttatagta 480 tgggagaat 489 <210> 11 <211> 664 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 11 Met Val Gln Pro Glu Leu Thr Gln Ser Val Gly Tyr Gly Ile Val Val 1 5 10 15 Gly Leu Gly Leu Gly Phe Ala Ala Leu Met Ile Phe Val Ser Trp Ser 20 25 30 Leu Lys Lys Phe Asn Asn Glu Asn Gln Thr Ser Glu His Phe Asn Thr 35 40 45 Ala Ser His Ser Val Arg Thr Gly Leu Val Ala Ser Ala Val Val Ser 50 55 60 Ser Trp Thr Trp Ala Ser Thr Leu Leu Thr Ser Ala Gln Lys Thr Tyr 65 70 75 80 Gln Tyr Gly Val Ser Gly Ala Phe Trp Tyr Ala Ser Gly Ala Cys Val 85 90 95 Gln Ile Leu Leu Phe Thr Val Leu Ala Ile Glu Leu Lys Arg Lys Ala 100 105 110 Pro Asn Ala His Thr Phe Leu Glu Val Val Arg Ala Arg Cys Gly Pro 115 120 125 Ile Ala His Gly Val Phe Leu Val Phe Ala Tyr Ile Thr Asn Ile Leu 130 135 140 Val Met Ala Met Leu Leu Cys Gly Gly Ser Ala Thr Ile Ser Ser Val 145 150 155 160 Thr Gly Met Asn Thr Val Ala Val Cys Phe Leu Leu Pro Val Gly Val 165 170 175 Ile Ile Tyr Thr Met Phe Gly Gly Ile Lys Ala Thr Phe Leu Thr Asp 180 185 190 Tyr Ile His Thr Val Ile Ile Leu Val Ile Leu Ile Met Phe Ser Leu 195 200 205 Ala Thr Tyr Ser Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ser Pro Gly Lys Leu Tyr 210 215 220 Asp Met Leu Lys Glu Ala Gly Asp Ala His Pro Val Ala Gly Asn Ala 225 230 235 240 Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Met Arg Ser Gln Glu Gly Ala Ile Phe Phe 245 250 255 Ile Ile Asn Leu 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<400> 12 Met Ala Val Met Glu Ala Pro Leu Pro Gln Gly Ala Gly Tyr Ala Val 1 5 10 15 Val Val Gly Leu Gly Phe Val Phe Ala Phe Ala Met Ile Leu Thr Thr 20 25 30 Tyr Val Leu Arg Arg Tyr Gln Lys Glu Ile Ile Thr Ala Glu Glu Phe 35 40 45 Ala Thr Ala Gly Arg Ser Val Lys Thr Gly Leu Ile Ala Ala Ala Val 50 55 60 Val Ser Ser Trp Thr Trp Ala Ala Thr Leu Leu Gln Ser Thr Thr Met 65 70 75 80 Val Tyr Lys Val Gly Ile Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Ala Ala Gly Ala 85 90 95 Gly Tyr Gln Val Ile Leu Phe Ser Ala Leu Ala Ile Lys Cys Lys Gln 100 105 110 Arg Ala Pro Asn Ala His Thr Tyr Leu Glu Ile Ile Lys Ala Arg Tyr 115 120 125 Gly Thr Ile Gly His Phe Cys Tyr Met Phe Tyr Ala Leu Ala Thr Asn 130 135 140 Val Leu Val Thr Ala Met Leu Leu Thr Gly Gly Ser Ala Val Val Ser 145 150 155 160 Asp Leu Thr Gly Met His Thr Val Ala Ala Cys Phe Leu Leu Pro Val 165 170 175 Gly Val Val Leu Tyr Thr Ile Phe Gly Gly Ile Lys Ala Thr Phe Leu 180 185 190 Thr Asp Tyr Val His Thr Ile Val Ile Ile Val Ile Ile Met Ile Phe 195 200 205 Ala Phe Thr Val Tyr Ala Thr Asn Ser Gln Leu Gly Ser Pro Lys Ala 210 215 220 Val Tyr Asp Leu Val Arg Glu Ala Ala Lys Ala His Pro Ile Glu Gly 225 230 235 240 Asn Ala Gly Gly Glu Tyr Leu Thr Met Arg Ser Arg Ser Gly Gly Ile 245 250 255 Phe Phe Val Ile Asn Ile Val Gly Asn Phe Gly Thr Val Phe Leu Asp 260 265 270 Ala Gly Tyr Trp Asn Lys Ala Ile Ser Ser Ser Pro Ala Ala Ala Leu 275 280 285 Pro Gly Tyr Val Leu Gly Gly Leu Ser Trp Ile Ala Ile Pro Asn Leu 290 295 300 Ile Ser Leu Ala Met Gly Leu Ala Cys Val Ala Leu Glu Ser Ser Pro 305 310 315 320 Asn Phe Pro Thr Tyr Pro Glu Arg Leu Thr Ala Glu Gln Val Ser Ala 325 330 335 Gly Leu Val Leu Pro Thr Ala Ala Val Thr Leu Leu Gly Lys Gly Gly 340 345 350 Ala Val Ala Ser Leu Leu Leu Val Phe Met Ala Val Thr Ser Ala Met 355 360 365 Ser Ala Glu Leu Ile Ala Val Ser Ser Ile Phe Thr Tyr Asp Ile Tyr 370 375 380 Arg Ser Tyr Leu Lys Pro Lys Ala Thr Gly Lys Gln Leu Ile Phe Ser 385 390 395 400 Ser His Ile Ser Cys Ile Val Phe Gly Leu Ile Met Ser Gly Phe Ala 405 410 415 Thr Gly Leu Tyr Tyr Ala Gly Ile Ser Met Gly Tyr Leu Tyr Glu Leu 420 425 430 Met Gly Ile Ile Ile Ser Ser Ala Val Ile Pro Cys Ala Leu Ser Leu 435 440 445 Phe Trp Asp Ala Gln Asn Leu Val Ala Val Val Ala Ser Pro Ile Ile 450 455 460 Gly Thr Ser Leu Ala Ile Met Ser Trp Leu Val Cys Thr Lys Ser Leu 465 470 475 480 Tyr Gly Glu Ile Thr Val Ser Thr Thr Phe Glu Asp Asp Pro Met Leu 485 490 495 Thr Gly Asn Ile Val Ala Leu Leu Ser Pro Leu Ile Thr Ile Pro Leu 500 505 510 Leu Thr Tyr Ile Phe Lys Pro Gln Asn Phe Asp Trp Glu Ile Leu Lys 515 520 525 Thr Ile Thr Arg Ala Asp Glu Glu Glu Glu Leu Leu Glu Ala Glu Gly 530 535 540 Asn Glu Val Ser Val Ser Asp Ser Asp Ser Val Gly Asn Asn Gln Asp 545 550 555 560 Ala Glu Lys Leu Gln Ala Val Lys Thr Val Ile Thr Thr Val Asp Glu 565 570 575 Ile Pro Arg Glu Thr Ile Glu Arg Met Ala Glu Glu Glu Ser Gln Tyr 580 585 590 Leu Ser Arg Ala Ser Lys Ile Ala Gly Tyr Leu Ala Ile Phe Phe Ala 595 600 605 Ile Ser Phe Met Val Leu Trp Pro Met Pro Met Tyr Gly Thr Gly Tyr 610 615 620 Ile Phe Ser Glu 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Gly Met His Thr 165 170 175 Ile Ala Ala Ile Tyr Leu Leu Pro Val Gly Val Val Ala Tyr Thr Leu 180 185 190 Val Gly Gly Leu Lys Ala Thr Ile Leu Thr Asp Trp Ile His Thr Phe 195 200 205 Ile Leu Leu Ile Ile Ile Ile Val Phe Ala Leu Ser Ala Tyr Ala Ser 210 215 220 Ser Glu Val Leu Gly Ser Pro Ser Ala Val Tyr Asp Leu Leu Val Lys 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala His Pro Val Asp Gly Asn His Glu Gly Ser Tyr Leu 245 250 255 Thr Met Arg Ser Arg Glu Gly Ala Ile Phe Phe Val Ile Asn Ile Val 260 265 270 Gly Asn Phe Gly Thr Val Phe Leu Asp Asn Gly Tyr Tyr Asn Lys Ala 275 280 285 Ile Ala Ala Ser Pro Val His Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Leu Gly Gly 290 295 300 Leu Cys Trp Phe Ala Ile Pro Trp Leu Thr Ala Thr Thr Met Gly Leu 305 310 315 320 Ser Gly Leu Ala Leu Glu Ser Ser Pro Arg Phe Pro Thr Tyr Pro Asn 325 330 335 Arg Met Pro Glu Ala Asp Val Ser Ala Gly Leu Val Leu Pro Tyr Ala 340 345 350 Ala Val Ala Leu Leu Gly Lys Gly Gly Ala Ala Ala Thr Leu Leu Ile 355 360 365 Val Phe Met Ala Val Thr Ser Ala Thr Ser Ser Gln Leu Ile Ala Val 370 375 380 Ser Ser Ile Ile Val Tyr Asp Leu Tyr Arg Thr Tyr Ile Lys Pro Glu 385 390 395 400 Ala Ser Gly Lys Arg Leu Ile Tyr Met Ser His Val Ile Val Cys Ala 405 410 415 Tyr Ala Leu Phe Ile Ala Ser Phe Ser Val Gly Leu Trp Tyr Ala Gly 420 425 430 Ile Ser Met Gly Tyr Leu Tyr Val Met Met Gly Val Ile Ile Ser Ser 435 440 445 Ala Val Leu Pro Ala Ala Leu Val Leu Thr Trp Ser Gly Leu Asn Lys 450 455 460 Trp Ala Ala Ala Leu Ser Pro Val Leu Gly Leu Cys Val Ala Leu Val 465 470 475 480 Ala Trp Leu Val Thr Ala Lys Lys Glu Cys Gly Glu Met Ser Val Ala 485 490 495 Cys Thr Gly Ser Asn Met Pro Met Leu Ala Gly Asn Val Ala Ala Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Val Val Phe Val Pro Val Leu Thr Leu Val Phe Gly Lys 515 520 525 Ala Lys Tyr Asp Trp Lys Ser Met Met Ala Ile Ser Arg Gly Asp Asp 530 535 540 His Asp Val Ala Gly Glu Ala Gly Val Asp Leu Glu Glu Val Pro Gly 545 550 555 560 Gly Arg Glu Glu Ser Glu Arg Glu Met Glu Glu Glu Gln Lys Lys Leu 565 570 575 Arg Arg Ala Ser Lys Ile Ser Lys Thr Met Thr Ala Val Leu Thr Leu 580 585 590 Ala Leu Leu Ile Leu Trp Pro Met Pro Leu Tyr Gly Thr Gly Tyr Ile 595 600 605 Phe Ser Lys Pro Phe Phe Thr Gly Trp Val Val Val Gly Ile Ile Trp 610 615 620 Ile Phe Leu Ser Phe Ile Gly Val Gly Leu Phe Pro Ile Tyr Glu Gly 625 630 635 640 Arg Glu Thr Leu Ile Arg Thr Cys Lys Tyr Ile Trp Trp Asp Ile Thr 645 650 655 Gly Lys Gly Val Lys Ala Ile His Ala Asp Gln Ala Lys His Ala Gly 660 665 670 Glu Val Val Val Thr Glu Gly Lys Thr Pro Gly Asp Gln Thr Pro Glu 675 680 685 Glu Lys Ser Val Lys Gly Glu Lys Val Arg Glu Gly Ile Asp Ser Ser 690 695 700 <210> 16 <211> 694 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 16 Met Ala Thr Cys Pro Pro Phe Asp Phe Ser Thr Lys Tyr Tyr Asp Gly 1 5 10 15 Asp Gly Gly Cys Gln Arg Gln Ser Ser Phe Phe Gly Gly Thr Thr Val 20 25 30 Leu Asp Gln Gly Val Gly Tyr Ala Val Ile Leu Gly Phe Gly Ala Phe 35 40 45 Phe Ala Val Phe Thr Ser Phe Leu Val Trp Leu Glu Lys Arg Tyr Val 50 55 60 Gly Ala Arg His Thr Ser Glu Trp Phe Asn Thr Ala Gly Arg Asn Val 65 70 75 80 Lys Thr Gly Leu Ile Ala Ser Val Ile Val Ser Gln Trp Thr Trp Ala 85 90 95 Ala Thr Ile Leu Gln Ser Ser Asn Val Ala Trp Gln Tyr Gly Val Ser 100 105 110 Gly Pro Phe Trp Tyr Ala Ser Gly Ala Thr Ile Gln Val Leu Leu Phe 115 120 125 Gly Val Met Ala Ile Glu Ile Lys Arg Lys Ala Pro Asn Ala His Thr 130 135 140 Val Cys Glu Ile Val Lys Ala Arg Trp Gly Thr Ala Thr His Ile Val 145 150 155 160 Phe Leu Val Phe Cys Leu Ala Thr Asn Val Val Val Thr Ala Met Leu 165 170 175 Leu Leu Gly Gly Ser Ala Val Val Asn Ala Leu Thr Gly Val Asn Leu 180 185 190 Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Ile Pro Leu Gly Val Val Val Tyr Thr Leu 195 200 205 Ala Gly Gly Leu Lys Ala Thr Phe Leu Ala Ser Tyr Val His Ser Val 210 215 220 Ile Val His Val Ala Leu Val Val Phe Val Phe Leu Val Tyr Thr Ser 225 230 235 240 Ser Lys Glu Leu Gly Ser Pro Ser Val Val Tyr Asp Arg Leu Lys Asp 245 250 255 Met Val Ala Lys Ser Arg Ser Cys Thr Glu Pro Leu Ser His His Gly 260 265 270 Gln Ala Cys Gly Pro Val Asp Gly Asn Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Thr 275 280 285 Met Leu Ser Ser Gly Gly Ala Val Phe Gly Leu Ile Asn Ile Val Gly 290 295 300 Asn Phe Gly Thr Val Phe Val Asp Asn Gly Tyr Trp Val Ser Ala Ile 305 310 315 320 Ala Ala Arg Pro Ser Ser Thr His Lys Gly Tyr Leu Leu Gly Gly Leu 325 330 335 Val Trp Phe Ala Val Pro Phe Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Leu Gly 340 345 350 Ala Leu Ala Leu Asp Leu Pro Ile Ser Lys Asp Glu Ala Asp Arg Gly 355 360 365 Leu Val Pro Pro Ala Thr Ala Ile Ala Leu Met Gly Lys Ser Gly Ser 370 375 380 Leu Leu Leu Leu Thr Met Leu Phe Met Ala Val Thr Ser Ala Gly Ser 385 390 395 400 Ser Glu Leu Ile Ala Val Ser Ser Leu Phe Thr Tyr Asp Ile Tyr Arg 405 410 415 Thr Tyr Ile Asn Pro Arg Ala Thr Gly Arg Gln Ile Leu Lys Ile Ser 420 425 430 Arg Cys Ala Val Leu Gly Phe Gly Cys Phe Met Gly Ile Leu Ala Val 435 440 445 Val Leu Asn Lys Ala Gly Val Ser Leu Gly Trp Met Tyr Leu Ala Met 450 455 460 Gly Val Leu Ile Gly Ser Ala Val Ile Pro Ile Ala Phe Met Leu Leu 465 470 475 480 Trp Ser Lys Ala Asn Ala Phe Gly Ala Ile Leu Gly Ala Thr Ser Gly 485 490 495 Cys Val Phe Gly Ile Ile Thr Trp Leu Thr Thr Ala Lys Thr Gln Tyr 500 505 510 Gly Arg Val Asp Leu Asp Ser Thr Gly Lys Asn Gly Pro Met Leu Ala 515 520 525 Gly Asn Leu Val Ala Ile Leu Thr Val Arg Pro Gln Asn Tyr Asp Trp 530 535 540 Ser Thr Thr Arg Glu Ile Lys Val Val Glu Ala Tyr Ala Ser Gly Asp 545 550 555 560 Glu Asp Val Asp Val Pro Ala Glu Glu Leu Arg Glu Glu Lys Leu Arg 565 570 575 Arg Ala Lys Ala Trp Ile Val Lys Trp Gly Leu Val Phe Thr Ile Leu 580 585 590 Ile Val Val Ile Trp Pro Val Leu Ser Leu Pro Ala Arg Val Phe Ser 595 600 605 Arg Gly Tyr Phe Trp Phe Trp Ala Ile Val Ala Ile Ala Trp Gly Thr 610 615 620 Ile Gly Ser Ile Val Ile Ile Gly Leu Pro Leu Val Glu Ser Trp Asp 625 630 635 640 Thr Ile Lys Ser Val Cys Met Gly Met Phe Thr Asn Asp Arg Val Met 645 650 655 Lys Lys Leu Asp Asp Leu Asn His Arg Leu Arg Ala Leu Thr Met Ala 660 665 670 Val Pro Glu Ala Glu Lys Ile Tyr Leu Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys 675 680 685 Lys Asn Asp Glu Glu Gly 690 <210> 17 <211> 721 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 17 Met Ala Ser Gly Val Cys Pro Pro Ala Glu Leu Gly Phe Gly Ala Glu 1 5 10 15 Tyr Tyr Ser Val Val Asn Gly Val Cys Ser Arg Ala Gly Ser Tyr Phe 20 25 30 Gly Gly Arg Pro Val Leu Thr Gln Ala Val Gly Tyr Ala Val Val Leu 35 40 45 Gly Phe Gly Ala Phe Phe Ala Leu Phe Thr Ser Phe Leu Val Trp Leu 50 55 60 Glu Lys Arg Tyr Val Gly Ser Gln His Thr Ser Glu Trp Phe Asn Thr 65 70 75 80 Ala Gly Arg Ser Val Lys Thr Gly Leu Ile Ala Ser Val Ile Val Ser 85 90 95 Gln Trp Thr Trp Ala Ala Thr Ile Leu Gln Ser Ser Asn Val Ala Trp 100 105 110 Gln Tyr Gly Val Ser Gly Pro Phe Trp Tyr Ala Ser Gly Ala Thr Ile 115 120 125 Gln Val Leu Leu Phe Gly Val Met Ala Ile Glu Ile Lys Arg Lys Ala 130 135 140 Pro Asn Ala His Thr Val Cys Glu Ile Val Arg Ala Arg Trp Gly Thr 145 150 155 160 Pro Ala His Leu Val Phe Leu Thr Phe Cys Leu Leu Thr Asn Val Ile 165 170 175 Val Thr Ala Met Leu Leu Leu Gly Gly Ser Ala Val Val Asn Ala Leu 180 185 190 Thr Gly Val Asn Val Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Ile Pro Leu Gly Val 195 200 205 Val Val Tyr Thr Leu Ala Gly Gly Leu Lys Ala Thr Phe Leu Ala Ser 210 215 220 Tyr Ile His Ser Val Val Val His Ala Val Leu Val Val Phe Val Phe 225 230 235 240 Leu Val Tyr Thr Ser Ser Ser Lys Leu Gly Ser Pro Arg Val Val Tyr 245 250 255 Asp Arg Leu Met Ala Val Ala Ser Ala Ala Arg Asp Cys Ser Ala Asp 260 265 270 Leu Ser Arg Asn Gly Gln Ala Cys Gly Pro Val Ala Gly Asn Phe Lys 275 280 285 Gly Ser Tyr Leu Thr Met Leu Ser Ser Gly Gly Leu Val Phe Gly Ile 290 295 300 Ile Asn Ile Val Gly Asn Phe Gly Thr Val Phe Val Asp Asn Gly Tyr 305 310 315 320 Trp Met Ser Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ser Ser Thr His Lys Gly Tyr 325 330 335 Leu Leu Gly Gly Leu Val Trp Phe Ala Val Pro Phe Ser Leu Ala Thr 340 345 350 Ser Leu Gly Leu Gly Ala Leu Ala Leu Asp Leu Pro Leu Thr Ala Ala 355 360 365 Glu Ala Ala Lys Gly Leu Val Pro Pro Ala Thr Ala Thr Ala Leu Met 370 375 380 Gly Lys Ser Gly Ser Val Leu Leu Leu Thr Met Leu Phe Met Ala Val 385 390 395 400 Thr Ser Ala Gly Ser Ala Glu Leu Val Ala Val Ser Ser Leu Cys Thr 405 410 415 Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Tyr Leu Asn Pro Gly Ala Ser Gly Lys Gln 420 425 430 Ile Leu Arg Val Ser Arg Ala Val Val Leu Gly Phe Gly Cys Phe Met 435 440 445 Gly Val Leu Ala Val Val Leu Asn Val Ala Gly Val Ser Leu Gly Trp 450 455 460 Met Tyr Leu Ala Met Gly Val Ile Val Gly Ser Ala Val Ile Pro Ile 465 470 475 480 Ala Leu Leu Leu Leu Trp Ser Lys Ala Asn Ala Val Gly Ala Met Gly 485 490 495 Gly Ala Val Ser Gly Cys Ala Leu Gly Val Ala Val Trp Leu Thr Val 500 505 510 Ala Lys Val Gln Tyr Gly Arg Val Asn Leu Asp Thr Thr Gly Arg Asn 515 520 525 Ala Pro Met Leu Ala Gly Asn Leu Val Ser Ile Leu Val Gly Gly Ala 530 535 540 Val His Ala Ala Cys Ser Leu Leu Arg Pro Gln His Tyr Asp Trp Gly 545 550 555 560 Thr Ser Arg Glu Met Ile Thr Thr Val Glu Ser Val His Ala Ala Leu 565 570 575 Asp Asp Glu Leu Lys Glu Glu Arg Leu Val His Ala Lys Arg Trp Ile 580 585 590 Val Arg Trp Gly Leu Val Phe Thr Ala Val Ile Val Val Ala Trp Pro 595 600 605 Ala Leu Ser Leu Pro Ala Arg Arg Tyr Ser Leu Gly Tyr Phe Thr Leu 610 615 620 Trp Ala Ala Val Ala Ile Ala Trp Gly Thr Val Gly Ser Val Val Ile 625 630 635 640 Ile Leu Leu Pro Val Ala Glu Ser Trp Thr Thr Ile Thr Lys Val Cys 645 650 655 Ala Gly Met Phe Thr Asn Asp Ala Val Tyr Asp Arg Leu Asp Asp Val 660 665 670 Asn Leu Arg Leu Arg Ala Ile Met Gly Ala Met Pro Glu Ala Glu Lys 675 680 685 Arg Tyr Arg Gln Leu His Glu Thr Glu Met His Pro Ala Gly Thr His 690 695 700 Pro Ala Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asn Asn Asn Gln Met Met His 705 710 715 720 Ser

Claims (28)

1. 발효 조건에서 우레아 전달체 단백질 유전자 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 형질전환된 효모 균주.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화되는 것인 효모 균주.
3. 제1항에 있어서,
   상기 우레아 전달체는 DUR3p인 효모 균주.
4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,
   발효 조건에서 우레아 분해 효소 유전자 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 추가로 형질전환된 효모 균주.
5. 제4항에 있어서,
   상기 우레아 분해 효소는 DUR1 ,2에 의해 암호화되는 것인 효모 균주.
6. 제4항에 있어서,
   상기 우레아 분해 효소는 우레아 카르복시화효소, 알로파네이트 가수분해효소 또는 우레아 아미도리아제인 효모 균주.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   발효 조건에서 계속적으로 우레아를 흡수하도록 형질전환된 효모 균주.
8. 제7항에 있어서,
   상기 효모는 DUR3를 구성적으로 발현하도록 형질전환된 효모 균주.
9. 제4항에 있어서,
   발효 조건에서 우레아를 계속적으로 흡수하고 분해하도록 형질전환된 효모 균주.
10. 제9항에 있어서,
    상기 효모 균주는 DUR1 ,2 및 DUR3를 구성적으로 발현하도록 형질전환된 효모 균주.
11. 발효 조건에서 우레아 전달체 유전자 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 효모 균주를 형질전환하는 것을 포함하는 효모 균주의 변형 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 우레아 전달체는 DUR3에 의해 암호화되는 것인 방법.
    
13. 제11항에 있어서,
    상기 우레아 전달체는 DUR3p인 방법.
    
14. 제 11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 균주는 발효 조건에서 우레아 분해 효소 유전자 발현의 질소 이화물질 억제작용을 감소시키도록 추가로 형질전환된 방법.
    
15. 제14항에 있어서,
    상기 우레아 분해 효소는 DUR1 ,2에 의해 암호화되는 것인 방법.
    
16. 제14항에 있어서,
    상기 우레아 분해 효소는 우레아 카르복시화효소, 알로파네이트 가수분해효소 또는 우레아 아미도리아제인 방법.
    
17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 균주는 구성적으로 발현하도록 형질전환된 것인 방법.
18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 균주는 DUR3p을 암호화하는 코딩서열을 포함하는 재조합 핵산으로 형질전환된 것인 방법.
19. 제18항에 있어서,
    상기 DUR3p을 암호화하는 코딩서열은 질소 이화물질 억제작용에 영향을 받지 않는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
20. 에틸카바메이트의 농도가 감소된 발효 음료 또는 발효 식품의 생산을 위해 제1항 내지 제10항 중 어느 한항의 효모 균주를 발효 조건에서 유지하는 것을 포함하는 발효 음료 또는 발효 식품의 제조 방법.
21. 에틸카바메이트의 농도가 감소된 발효 음료 또는 발효 식품의 생산을 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한항의 형질전환된 효모 균주의 용도.
22. 제20항에 있어서,
    상기 발효 음료 또는 발효 식품은 30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 것인 방법.
23. 제21항에 있어서,
    상기 발효 음료 또는 발효 식품은 30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 것인 용도.
24. 제20항 또는 제22항에 있어서,
    상기 발효 음료 또는 발효 식품은 와인인 방법.
25. 제21항 또는 제23항에 있어서,
    상기 발효 음료 또는 발효 식품은 와인인 용도.
    
26. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 효모 균주를 이용하여 생산된 감소된 에틸카바메이트 농도를 갖는 발효 음료 또는 발효 식품.
27. 제26항에 있어서,
    상기 발효 음료 또는 발효 식품은 와인인 발효 음료 또는 발효 식품.
28. 제27항에 있어서,
    상기 와인은 30 ppb 미만의 에틸카바메이트 농도를 갖는 것인 발효 음료 또는 발효 식품.
    

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