KR102510304B1 - 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주 및 이의 용도 - Google Patents
에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소 및 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조한 후, 이를 이용하여 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 균주는 에틸카바메이트 분해 효능이 향상되어, 해당 균주로 식품을 발효하는 경우, 제조된 식품 내 에틸카바메이트의 함량을 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주 의 생산을 위한 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소 및 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열를 이용하여, 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다.
에틸카바메이트(Ethyl carbamate; Urethane)는 식품의 발효 또는 저장과정에서 자연적으로 발생하는 화학적인 반응의 부산물로서, 알코올 음료 및 발효식품 등에 존재한다. 에틸카바메이트(Ethyl carbamate)는 식품 중에 풍부한 아미노산 중의 하나인 아르기닌(arginine)이나 시트룰린 (citrulline)이 발효과정 중, 효모의 발효 대사산물로서 우레아를 방출하게 되고, 이렇게 방출된 우레아가 알코올과 반응하여 생성될 수 있다. 알코올이 반응의 필수 조건인 만큼 주로 청주, 탁주, 와인 등의 자연 발효주에 많이 함유되며, 간장, 요구르트, 된장 등의 발효식품에도 일부 포함될 수 있다.
이러한 에틸카바메이트는 FSA의 2004년 보고에 의하면 섭취후 빠르게 인체에 흡수되며, 대부분 24시간 이내에 대사작용에 의해 이산화탄소와 물과 암모니아로 체외로 배출되기는 하나, 배출되지 않은 에틸카바메이트의 경우 인간에게 암을 유발할 가능성이 있어, 국제 암 연구소에서는 이를 Group 2B(Possible Carcinogenic to Humans: 인간에게 암을 유발할 가능성이 있음)로 분류를 하고 있다.
국제암연구소(IARC)에서는 이러한 동물실험상의 다양한 결과 및 에틸카바메이트의 동물에 대한 발암기작 등이 인체에 대해서도 높은 유사성을 가지고 적용이 가능하다고 판단하여 그 발암위험도를 발암가능물질(그룹2A; 인간에 대한 발암성이 우려되는 물질)로 분류하여 관리하고 있으며, 단기간에 일정농도 이상 노출되면 구토나 출혈을 일으킬 수 있고 다량 섭취하면 신장과 간에 손상을 일으킬 수 있다고 한다.
이에 따라, EU나 미국 등 여러 국가에서 발효식품 중의 에틸카바메이트에 대한 발암성 확인 및 생성원인에 관한 연구를 지속하고 있으며, 2004년 발효식품에 대한 조사연구사업 수행결과, 과실주 등 일부 주류제품에서 에틸카바메이트가 검출됨을 확인하였다. 에틸카바메이트를 과량 포함하고 있는 발효 제품은 캐나다, EU, 미국 등에서는 이를 규제 대상으로 삼고 있으며, 우리나라에서도 최근 식약청이 국내에서 수입, 유통되고 있는 와인들을 조사한 결과, 대부분 에틸카바메이트가 미국 FDA 권고기준인 15 ppb를 평균 7배 이상 초과한 농도로 검출된 것으로 확인되었다고 보고하였다.
상기와 같은 위험성으로 인하여, 주류 중 에틸카바메이트를 저감하기 위해서는 우레아의 생성이 적은 효모를 사용하도록 권장되고 있다. 아울러 숙성 및 저장, 보관시 가급적 온도를 낮추는 등 제조방법을 개선하고, 에틸카바메이트가 이행되는 것을 차단하기 위해서 제조설비의 위생을 유지하는 등 철저한 관리가 요망되고 있다.
그러나 아직까지 발효식품 제조과정에서 에틸카바메이트의 생성을 효과적으로 저감할 수 있는 기술이 전무한 실정이며, 예를들어, 와인, 청주, 탁주 등을 포함하는 발효주 내 에틸카바메이트의 생성을 효과적으로 차단하여 이를 저감시킬 수 있는 기술의 개발이 시급히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 발효능이 우수할 뿐만 아니라, 에틸카바메이트 제거능이 향상된 효모 균주 및 이를 제조하기 위한 플라스미드 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 효모 균주를 이용하여 제조된 약주, 탁주 등의 섭취용 알코올을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소 및 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의) 에틸카바메이트 분해효소를 코딩하는 유전자 서열은, 서열번호 1로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열은, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3 또는 5의 유전자 서열로 이루어지거나, 서열번호 3 또는 서열번호 5의 유전자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 변이주가 제공된다.
본 발명에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 변이주는 에틸카바메이트 분해효소가 세포 표면에 부착된 형태이거나, 에틸카바메이트 분해효소를 세포 외로 방출하는 형태로 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, i) 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 ii) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하는 단계를 포함하고, 상기 숙주 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인, 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1 및 서열번호 2의 유전자 서열을 포함하거나, 상기 재조합 벡터는 서열번호 1 및 서열번호 4의 유전자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 이용하여 발효 식품을 제조하는 방법을 제공하며, 이에 따라 제조된 발효 식품을 제공한다.
본 발명에 따르면 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소 및 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조한 후, 이를 이용하여 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제조하는 방법이 제공되며, 본 발명에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 균주는 에틸카바메이트 분해 효능이 향상되어, 해당 균주로 식품을 발효하는 경우, 제조된 식품 내 에틸카바메이트의 함량을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 발효능이 우수할 뿐만 아니라, 에틸카바메이트 제거능이 향상된 효모 균주 및 이를 제조하기 위한 플라스미드 벡터를 제공된다.
또한, 상기 효모 균주를 이용하여 제조된 약주, 탁주 등의 섭취용 알코올이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 에틸 카바메이트 제거 방법을 나타내는 모식도이다. 도 1의 A에서는 에틸카바메이트 분해효소가 세포 표면에 고정된 사카로마이세스 세레비지애 변이주, 도 1의 B에서는 에틸카바메이트 분해효소가 세포 외로 발현되는 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 나타낸다. 도 1에서 EC는 에틸 카바메이트를, UreA는 Micrococcus 종의 에틸 카바메이트 분해효소를, SS는 신호 서열(신호 펩티드 서열)를, GPI는 글리코포스파티딜이노시톨(glycophosphatidylinositol)을, CEN은 효모 중심체(yeast centromere)를, ARS는 자율 복제 서열(autonomously replicating sequence)을; TRP1은 포스포리보실란트라닐레이트 이성질화효소(phosphoribosylanthranilate isomerase)를 의미한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 30℃의 온도에서 회분식 발효(Batch fermentations)하였을 때, EBY100/pCTCON(도 2의 A), EBY100/pUreA(도 2의 B), EBY100/pAga2-UreA(도 2의 C) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 2의 D) 각 균주에 의해 조절되는 배지 내 글루코스, 갈락토스, 에탄올, 에틸카바메이트의 함량을 발효 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 도 2에서의 결과는 세번의 실험의 평균을 나타낸다. 도 2를 참조하면, 본 발명에 따라 제조되는 EBY100/pAga2-UreA(도 2의 C) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 2의 D)의 균주를 이용하여 발효하였을 때, 에틸 카바메이트의 함량이 낮아지는 것을 알 수 있다.
도 3은 본 발명에 따라 제조되는 S. cerevisiae의 발효 매개변수를 비교한 그래프이다. 도 3에서는 본 발명에 따른 EBY100/pCTCON, EBY100/pAga2-UreA 및 EBY100/pMFαSP-UreA 균주를 온도에 따라 배양하여 비에틸카바메이트(EC) 감소(단위 g 세포 당 분해된 EC의 mg 양) (도 3의 A), 건조세포중량 (DCW; dry cell weight) (도 3의 B), 감소된 에틸카바메이트(EC)의 양(도 3의 C)을 확인한 그래프이다. 도 3의 결과는 실험 세가지 값의 평균이며, ND는 감지되지 않음을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 발효 적정 pH를 확인한 그래프이다. 도 4에서는 pH 제어가 없는(도 4의 A 및 도 4의 C) 경우 pH 제어가 있는(도 4의 B 및 도 4의 D) 경우, 2.5L 규모 발효기에서 S. cerevisiae EBY100/pAga2-UreA의 회분식 발효(Batch fermentations) 결과를 나타낸다. 도 4의 A 및 B는 글루코스, 갈락토스, 에탄올, 건조 세포 중량(DCW) 및 에틸 카바메이트 농도를 발효 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이며, 도 4의 C 및 D는 발효 시간 경과에 따른 배지 내 pH의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4를 참조하면, pH가 5 정도로 유지되는 경우, 에틸 카바메이트의 제거가 효율적임을 알 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 S. cerevisiae EBY100/pCTCON(도 5의 A), EBY100/pAga2-UreA(도 5의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 5의 C) 균주의 35℃에서 회분식 발효(Batch fermentations)한 결과를 나타낸다. 도 5를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 EBY100/pAga2-UreA(도 5의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 5의 C) 균주의 경우 30℃와 35℃에서 배양 또는 발효되었을 때 에틸 카바메이트 제거 효능이 유사함을 알 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 S. cerevisiae EBY100/pCTCON(도 6의 A), EBY100/pAga2-UreA(도 6의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 6의 C) 균주의 40℃에서 회분식 발효(Batch fermentations)한 결과를 나타낸다. 도 6를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 EBY100/pAga2-UreA(도 6의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 6의 C) 균주의 경우 40℃에서 배양 또는 발효되었을 때 30℃ 또는 35℃와 비교하여 에틸 카바메이트 제거 효능이 감소됨을 알 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 30℃의 온도에서 회분식 발효(Batch fermentations)하였을 때, EBY100/pCTCON(도 2의 A), EBY100/pUreA(도 2의 B), EBY100/pAga2-UreA(도 2의 C) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 2의 D) 각 균주에 의해 조절되는 배지 내 글루코스, 갈락토스, 에탄올, 에틸카바메이트의 함량을 발효 시간에 따라 나타낸 그래프이다. 도 2에서의 결과는 세번의 실험의 평균을 나타낸다. 도 2를 참조하면, 본 발명에 따라 제조되는 EBY100/pAga2-UreA(도 2의 C) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 2의 D)의 균주를 이용하여 발효하였을 때, 에틸 카바메이트의 함량이 낮아지는 것을 알 수 있다.
도 3은 본 발명에 따라 제조되는 S. cerevisiae의 발효 매개변수를 비교한 그래프이다. 도 3에서는 본 발명에 따른 EBY100/pCTCON, EBY100/pAga2-UreA 및 EBY100/pMFαSP-UreA 균주를 온도에 따라 배양하여 비에틸카바메이트(EC) 감소(단위 g 세포 당 분해된 EC의 mg 양) (도 3의 A), 건조세포중량 (DCW; dry cell weight) (도 3의 B), 감소된 에틸카바메이트(EC)의 양(도 3의 C)을 확인한 그래프이다. 도 3의 결과는 실험 세가지 값의 평균이며, ND는 감지되지 않음을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 발효 적정 pH를 확인한 그래프이다. 도 4에서는 pH 제어가 없는(도 4의 A 및 도 4의 C) 경우 pH 제어가 있는(도 4의 B 및 도 4의 D) 경우, 2.5L 규모 발효기에서 S. cerevisiae EBY100/pAga2-UreA의 회분식 발효(Batch fermentations) 결과를 나타낸다. 도 4의 A 및 B는 글루코스, 갈락토스, 에탄올, 건조 세포 중량(DCW) 및 에틸 카바메이트 농도를 발효 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이며, 도 4의 C 및 D는 발효 시간 경과에 따른 배지 내 pH의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4를 참조하면, pH가 5 정도로 유지되는 경우, 에틸 카바메이트의 제거가 효율적임을 알 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 S. cerevisiae EBY100/pCTCON(도 5의 A), EBY100/pAga2-UreA(도 5의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 5의 C) 균주의 35℃에서 회분식 발효(Batch fermentations)한 결과를 나타낸다. 도 5를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 EBY100/pAga2-UreA(도 5의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 5의 C) 균주의 경우 30℃와 35℃에서 배양 또는 발효되었을 때 에틸 카바메이트 제거 효능이 유사함을 알 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 S. cerevisiae EBY100/pCTCON(도 6의 A), EBY100/pAga2-UreA(도 6의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 6의 C) 균주의 40℃에서 회분식 발효(Batch fermentations)한 결과를 나타낸다. 도 6를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 EBY100/pAga2-UreA(도 6의 B) 및 EBY100/pMFαSP-UreA(도 6의 C) 균주의 경우 40℃에서 배양 또는 발효되었을 때 30℃ 또는 35℃와 비교하여 에틸 카바메이트 제거 효능이 감소됨을 알 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 발명은 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 균주 제작을 위하여, 에틸카바메이트 분해효소 및 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 에틸카바메이트 분해효소는 미크로코쿠스 종(Micrococcus species)으로부터 유래된 것일 수 있다. 특히, 상기 미크로코쿠스 종(Micrococcus species)은 해양 스펀지(Spirastrella 종)에 존재하는 것으로부터 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 상기 에틸카바메이트 분해효소를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 신호 펩티드는 Aga2 또는 mating factor alpha(MFαSP)일 수 있으며, 각각 서열번호 2 또는 4로 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명의 벡터는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 유전자 서열을 포함하거나 해당 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라, 서열번호 1 및 서열번호 2의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 벡터(pAga2-UreA)로 형질전환된 숙주세포는 세포 표면에 에틸카바메이트 분해효소가 고정될 수 있으며, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 4의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 벡터(pMFαSP-UreA)로 형질전환된 숙주세포는 세포 외부로 에틸카바메이트 분해효소를 분비할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “벡터(vector)”는 적합한 숙주, 특히 재조합 효모 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
본 발명에서 "재조합 벡터"는 목적하는 클로닝된 유전자(들)를 함유하는 임의의 클로닝 또는 발현벡터를 포함한다.
본 발명에서 "발현"은 폴리펩타이드가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 해독을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 형질전환 대상인 숙주 세포는 그 종류가 제한되지 않으나, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.
본 발명에 따라 형절전환된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 변이주는 상기 pAga2-UreA 플라스미드 벡터로 형질전환된 경우, 세포 표면에 에틸카바메이트 분해효소를 고정된 형태로 발현할 수 있으며, 상기 pMFαSP-UreA 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포는 세포 외부로 에틸카바메이트 분해효소를 분비할 수 있다.
본 발명은 또한, i) 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 ii) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하는 단계를 포함하는 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 제조방법에서 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애 변이주 제조를 위한 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 본 발명의 변이주 제조 시 상기 세포를 30℃ 내지 40℃ (바람직하게는, 30℃ 내지 35℃ 또는 35℃ 내지 40℃)의 온도 및 pH 5 (바람직하게는 pH 3 내지 6, pH 4 내지 6, pH4 내지 5 또는 pH5 내지 6)의 조건에서 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 이용하여 발효 식품을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 발효 식품이란, 젖산균이나 효모 등 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미한다. 본 발명에 따라 제조되는 발효식품에는 사카로마이세스 세레비지애를 효모로 하여 발효될 수 있는 식품이 포함되며, 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 발효 식품에는 빵류, 식초, 콩발효식품(간장, 된장, 고추장 등), 발효유제품(치즈, 버터, 요구르트 등), 소금절임류(김치, 젓갈 등)이 포함되나, 가장 바람직하게는 주류(술)이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 변이주는 주류 제조방법에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명은 사카로마이세스 세레비제를 이용하여 전분질 및 당질 원료를 에탄올 발효시킴으로써 주류를 제조하는데 있어서, 본 발명의 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 이용하여 주류를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 주류 제조방법은 당업자에게 널리 알려진 통상의 방법을 지칭하는 것이며, 통상적인 주류 제조방법에 사용하는 효모인 사카로마이세스 세레비지애 대신에 본 발명의 변이주를 사용하는 것을 의미한다. 한편, 상기 주류는 약주, 청주, 탁주, 과실주 또는 소주인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 제조되는 발효 식품은, 상기 에틸카바메이트의 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 이용하여 발효되는 바, 제조된 발효 식품은 종래의 발효방법에 따라 제조된 발효식품 보다 에틸카바메이트의 함량이 낮다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
1-1. 이용 균주 및 플라스미드
본 발명에서, Escherichia coli TOP10(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)은 유전자 클로닝 및 유전자 조작에 사용되었다. S. cerevisiae EBY100(ATCC MYA-4941)은 UreA를 발현하는 재조합 균주를 구성하는 데 사용되었다.
본 발명에 이용된 균주 및 플라스미드 벡터는 하기 표 1과 같다.
| 명칭 | 설명 |
| 균주 (strains) | |
| E. coli TOP10 | F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 nupG |
| S. cerevisiae EBY100 | MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL |
| S. cerevisiae EBY100/pCTCON | pCTCON 로 형질전환된 EBY100 |
| S. cerevisiae EBY100/pUreA | pUreA 로 형질전환된 EBY100 |
| S. cerevisiae EBY100/pMFαSP-UreA | pMFα-UreA 로 형질전환된 EBY100 |
| S. cerevisiae EBY100/pAga2-UreA | pAga2-UreA 로 형질전환된 EBY100 |
| 플라스미드(Plasmids) | |
| pCTCON | ColE1 ori, Gal1-10 프로모터, AmpR |
| pUreA | UreA, AmpR을 포함하는 발현 벡터 |
| pMFαSP-UreA | MFα-UreA, AmpR을 포함하는 발현 벡터 |
| pAga2-UreA | Aga2-UreA, AmpR을 포함하는 발현 벡터 |
1-2. 유전자 조작(Genetic manipulation)
효모 세포 표면 고정 발현을 위한 pAga2-UreA 플라스미드를 구축하기 위해, pCTCON 플라스미드를 주형으로 사용하여 PstI 제한효소(restriction enzyme) 자리를 포함하는 SH70 (5'-TATACTGCAGAGCGTAGTCTGGAACGT)과 Nhe1 제한효소 자리를 포함하는 SH71 (CTAGCTAGCGGATCCGAACAAAAGCTTATTTCTT-3') 프라이머(primer)로 DNA 단편을 PCR 증폭하였다. 또한, UreA 유전자 서열은 PstI 제한효소 자리를 포함하는 SH56 (5'-TATACTGCAGAATACTTCTGGTTTGGGTTGGA-3')과 Nhe1 제한효소 자리를 포함하는 SH57 (5'-AGCTAGCAGCAACTGGACGTCTATCA-3') 프라이머로 PCR증폭하였다. 이렇게 증폭된 두 개의 DNA 단편을 PstI 및 Nhe1으로 동시에 절단 한 후 T4 DNA 리가아제 (Takara, Shiga, Japan)로 결합하여 pAga2-UreA 플라스미드를 구축하였다.
pAga2-UreA 플라스미드에서 Aga2를 제거하여 UreA를 효모 세포 내 발현하기위해 플라스미드 pAga2-UreA를 주형으로 사용하여 KH22 (5'-AATACTTCTGGTTTGGGTTGGA-3')과 KH23 (5'-CAACCCAAACCAGAAGTATTCTTA ATTGAAAATGTATGAAGTAGGGAATTC-3') 프라이머로 PCR증폭하였다. 이렇게 증폭된 DNA 절편은 NEBuilder HiFi DNA assembly master mix (New England biolabsm lpswich, MA, USA)를 이용해 결합하여 pUreA 플라스미드를 구축하였다.
UreA의 N-말단에 MFαSP 신호 펩티드를 부착하기 위해 pAga2-UreA를 주형으로 사용하여 SH59 (5'-GGAAATCTCATCTTAATTGAAAATGTATGAAGTAGGGAATT-3')과 SH61 (5'-GCTGAAGCTAATACTTCTGGTTTGGGTTGGA-3') 프라이머로 Aga2 염기서열을 제외한 DNA 단편을 PCR증폭하였다. MFαSP 신호 펩티드 염기서열은 pPICZaA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 플라스미드를 주형으로 사용하여 SH58 (5'-ATTTTCAATTAAGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3')과 SH60 (5'-CCAGAAGTATTAGCTTCAGCCTCTCTTTTCT-3') 프라이머로 PCR증폭하였다. 증폭된 두 개의 DNA 절편을 NEBuilder HiFi DNA assembly master mix를 사용해 결합하여 pMFαSP-UreA 플라스미드를 구축하였다.
1-3. 형질전환 및 균주 배양(culture)
UreA 발현을 위한 플라스미드는 리튬아세테이트 방법을 이용해 사카로마이세스 세레비지애 EBY100균주에 형질전환하였다. 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 균주는 트립토판을 포함하지 않는 선택배지(SC-TRP 선택배지)[6.8 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.92 g/L synthetic complete supplement without tryptophan, 20 g/L glucose]에 접종하여 30℃, 250 rpm 조건에서 48시간동안 전배양하였다.
전배양된 사카로마이세스 세레비지애 균주는 1 g/L의 에틸카바메이트와 20 g/L의 갈락토오스(galactose)를 포함하는 SC-TRP 선택배지 100 mL에 광학밀도(OD600)가 1.0에 도달하도록 접종하였다. 회분식 진탕배양은 30℃, 35℃, 또는 40℃의 다양한 온도 조건에서 250 rpm의 교반 속도로 84시간 동안 진행하였다.
pH를 일정하게 조정하기 위해 2.5 L 규모 발효기를 이용한 경우에도 상기에 언급한 방법과 마찬가지로 1 g/L의 에틸카바메이트와 20 g/L의 갈락토오스(galactose)를 포함하는 SC-TRP 선택배지 1 L에 광학밀도(OD600)가 1.0이 되도록 전배양된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 접종하였다.pH를 조정하기 위해 0.5 N 농도의 염산(HCl)과 0.5 N 농도의 수산화나트륨(NaOH)을 이용하였으며, 교반속도와 공기주입속도는 각각 700 rpm과 2 vvm으로 유지하였다.
1-4. 분석방법
포도당, 갈라토오스, 에탄올의 배지 중 농도는 Rezex ROA-organic acid H+ 컬럼 (Phenomenex, Torrance, CA) 및 RI (Refractive index) 검출기가 장착된 HPLC (High performance liquid chromatography) (Thermo fisher Ultimate 3000)를 이용해 측정하였다. 컬럼 온도는 60℃로 유지하였으며 이동상으로 5 mM의 황산(H2SO4)용액을 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주어 대사체의 농도를 측정하였다.
에틸카바메트 분석을 위해 먼저 1 mL의 효모 배양액을 10배 희석하였다. 이렇게 희석된 배양액 1 mL에 30 mL의 증류수, 5 g의 염화나트륨(NaCl) 및 50 ng의 d5-EC를 첨가하였다. 이 혼합물을 30 g의 하이드로매트릭스(hydromatrix)로 채워진 유리 컬럼에 흡착시킨 후 160 mL의 다이클로로메탄(dichloromethane) 을 초당 1방울의 속도로 흘려주어 용출하였다. 용출액은 회전증발기(N-1300, EYELA, Tokyo, Japan)와 질소 농축기(MG-2200, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 1 mL로 농축시켰다. 에틸카바메이트의 배지 중 농도는 DB-WAX 컬럼(30 m 길이 × 0.25 mm i.d., 0.25μm 필름 두께, Agilent Technologies)이 장착된 Agilent 7890B gas chromatograph를 이용하여 측정하였다. 헬륨을 이동상으로 이용하여 1 mL/min의 유속으로 흘려주었다. 주입구(injector)의 온도는 210℃로 유지하였으며, 컬럼 오븐 온도는 초기 60℃에서 시작하여 10℃/min의 증가속도로 90℃까지 증가시킨 후, 2℃/min의 증가속도로 130℃까지 증가시켰다. 130℃의 온도를 5분동안 유지한 후에 20℃/min의 증가속도로 온도를 최종적으로 220℃까지 상승시킨 후 3분동안 유지하였다. 질량분석기(mass spectrometer)는 selected ion monitoring (SIM) 모드로 작동하였으며, 전자 충격 이온화는 70eV의 이온화 에너지를 이용하여 수행하였다. 이온 소스(ion source) 및 매스 전달(mass transfer) 라인(line)의 온도는 각각 230℃, 240℃로 유지하였다.
2-1. UreA를 세포 표면 고정 또는 세포 외 분비 형태로 발현하는 재조합
S. cerevisiae
균주 구축
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 에틸 카바메이트 제거 방법을 나타내는 모식도이다. 본 발명에 따라 재조합된 pAga2-UreA 플라스미드로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 변이주는 세포 표면에 고정된 형태로 UreA를 발현하여 에틸카바메이트를 분해하며(도 1의 A), pMFαSP-UreA플라스미드로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 변이주는 세포 외부에 UreA를 분비하여 에틸카바메이트를 분해(도 1의 B)한다.
2-2. UreA를 세포 표면에 고정된 형태로 발현하는 재조합
S. cerevisiae
균주에 의한 향상된 EC 분해 확인
도 2는 본 실시예에 따라 30℃의 온도에서 회분식 발효를 수행하였을 때, 균주별 에틸카바메이트 분해 결과를 나타낸다. UreA가 도입되지 않은 대조군(도 2의 A)의 경우 배지 중에 첨가된 에틸카바메이트를 전혀 분해하지 못한데 반해, UreA를 세포 내 분획에서 발현하는 EBY100/pUreA 균주(도 2의 B)의 경우 미량의 에틸카바메이트를 분해할 수 있는 것으로 나타났다. 효모의 에틸카바메이트 분해능은 UreA를 세포 외 분획으로 분비 발현하는 시스템을 활용하면서 크게 증가되었다. 구체적으로, EBY100/pMFαSP-UreA 균주(도 2의 D)의 경우 84시간 동안 341 mg/L의 에틸카바메이트를 분해하여 EBY100/pUreA 균주 대비 7.7배 향상된 에틸카바메이트 분해능을 보였다. 또한, UreA를 세포 표면에 고정된 형태로 발현하는 EBY100/pAga2-UreA 균주(도 2의 C)의 경우에 에틸카바메이트 분해능이 더욱 증가하여 EBY100/pUreA 균주 대비 35% 향상된 에틸카바메이트 분해능을 나타냈다.
즉, 본 발명에 따라 제조된 재조합 S. cerevisiae 균주는 에틸카바메이트 분해능이 향상됨을 알 수 있다.
2-3. 재조합
S. cerevisiae
에 의한 UreA 매개 EC 분해 효율에 대한 온도의 영향
선행연구에 따르면 UreA의 최적 활성온도는 45℃이므로 효모의 최적 생장 온도인 30℃보다 15℃ 가량 높은 것으로 확인되었다. 이에 따라, 다양한 온도별(30℃, 35℃, 40℃, 45℃) 재조합 효모 균주의 에틸카바메이트 분해능을 확인해 보고자 하였다. 도 3은 본 발명에 따라 제작된 EBY100/pCTCON, EBY100/pAga2-UreA 및 EBY100/pMFαSP-UreA 균주를 다양한 온도조건에서 배양하여 비에틸카바메이트(EC) 감소(단위 g 세포 당 분해된 EC의 mg 양)(도 3의 A), 건조세포중량 (DCW; dry cell weight) (도 3의 B), 감소된 에틸카바메이트(EC)의 양(도 3의 C) 결과를 나타낸다. 35℃ 조건에서 효모의 전체적인 발효 양상과 건조세포중량은 30℃ 조건과 거의 동일 하였다(도 3, 도 5). 이에 따라, EBY100/pAga2-UreA와 EBY100/pMFαSP-UreA 균주의 35℃에서의 에틸카바메이트 분해능은 30℃ 조건과 유사하였다. 반면에 배양온도가 40℃로 증가됨에 따라 효모의 건조세포중량은 35℃ 조건과 비교하여 균주별로 51-72% 가량 감소하였다(도 3, 도 6). 이에 따라, EBY100/pAga2-UreA와 EBY100/pMFαSP-UreA 균주의 40℃에서의 에틸카바메이트 분해능은 35℃ 조건과 비교하여 각각 66%, 35% 감소하였다. 또한, 배양온도가 45℃까지 증가되었을 때에는 모든 효모 균주가 생장하지 못하였고, 이에 따라 에틸카바메이트의 분해는 관찰되지 않았다.
본 실시예를 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 재조합 균주의 에틸카바메이트 분해를 위한 최적온도는 30℃ 이상 45℃ 미만이며, 30℃ 이상 40℃ 미만 또는 30℃ 이상 35℃미만임을 알 수 있으며, 가장 바람직하게는 30℃ 이상 35℃이하이다.
[2-4.] 재조합
S. cerevisiae
에 의한 UreA 매개 EC 분해 효율에 대한 pH의 영향
도 4는 본 실시예에 따라 pH 제어가 없는(도 4의 A 및 도 4의 C) 경우 pH 제어가 있는(도 4의 B 및 도 4의 D) 경우, 2.5 L 규모 발효기에서 S. cerevisiae EBY100/pAga2-UreA의 회분식 발효(Batch fermentations) 결과를 나타낸다. 도 4를 참조하면, pH가 5 정도로 유지되는 경우에 에틸카바메이트의 제거 정도가 향상됨을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따라 제조된 재조합 S. cerevisiae는, 발효 시 pH 5 (pH4 내지 pH6)으로 유지되었을 때, 에틸카바메이트의 제거 정도가 향상된다.
본 발명에서 이용된 유전자의 서열의 정보는 하기 내용을 참고할 수 있다.
<서열번호 1>
Urethanase (UreA)
aatacttctggtttgggttggatgtccgctactgaaatggctgctcaagttgcttccaagaagttgtcccctaacgaaattgctgaagaaatgattagaagagttggtgaagttaacccatccgttaatgctatcgttcatttcgatgccgatcaagttagacgtgatgccggtgaattaactcgtgctcaagattctggtgaaccattgggtccattgcatggtgtcccattcaccattaaggatttgactgacgtccgtggtttgccaaccactttcggtttgaagccaatgcgtgacaacatcgctgagagagatgctgtcattgttaccagattgagacaagctggtggattgtacttgggtaaaactaacactccagaatccggttactacggtggtactgataatcacttgttcggtccaacacataatccttggaagccaggtcactctgctggtggtagttctggtggtgctgccgctgctgttgctgctggtttaggtccacttgctgaaggttctgatggtgccggttctgttcgtattccatctgctttgtgtggagttgttggtttgaagccaactaccggtgttattccacaaaccattttgccaggtagatacaataactgggcttatcatggtccaattaccagaaccgtcgctgataacgctttgatgttggacgttttagctggtcctgaccactctgatccattgagtatcgaaagagttgaatcttcttatgtcgaagctgctagaggtggtattgatggtttgagagttgcctggtctccaaacttgggtttgggtcacgttgaacctgacgtcgctgccgtttgtgctgaagctgttgcatgttttgaggatatgggtgctaaggttgtcgaagctactcctgactggggtgacccatctgaggctatgtggcacggtatttgggttccaggtttcgctggtgaacatgacatgttagattgggattctttgcatggtcaagttgatgataacttaattgaactgatccatgaaggtagaagattgaccggtgtcgattacggtagagctgatgctttcagaggtagaatgtgggatacttggaccgagtttatgaacgattacgacgttttgatctccccaaccttagcttctgccaccttcccattgacccaattcgctccagattggttgcaaggtaaatctttgagagaacaattgttggattggttattgacctacccatacaacatgttgaacaacccagctattactgttccagctggttttaccgctgacggtagaccagttggtttgcaaatcgctgctagacatagacaagacgctttggtcttgagagttgctgctaacttggaacaagctagaccttgggctgatagacgtccagttgct
<서열번호 2>
signal peptide (Aga2)
atgcagttacttcgctgtttttcaatattttctgttattgcttcagttttagcacaggaactgacaactatatgcgagcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccgtactctttgtcaacgactactattttggccaacgggaaggcaatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtttgtcagtaattgcggttctcacccctcaacaactagcaaaggcagccccataaacacacagtatgttttt
<서열번호 3>
Plasmids for Aga2-UreA Expression
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttaggacggatcgcttgcctgtaacttacacgcgcctcgtatcttttaatgatggaataatttgggaatttactctgtgtttatttatttttatgttttgtatttggattttagaaagtaaataaagaaggtagaagagttacggaatgaagaaaaaaaaataaacaaaggtttaaaaaatttcaacaaaaagcgtactttacatatatatttattagacaagaaaagcagattaaatagatatacattcgattaacgataagtaaaatgtaaaatcacaggattttcgtgtgtggtcttctacacagacaagatgaaacaattcggcattaatacctgagagcaggaagagcaagataaaaggtagtatttgttggcgatccccctagagtcttttacatcttcggaaaacaaaaactattttttctttaatttctttttttactttctatttttaatttatatatttatattaaaaaatttaaattataattatttttatagcacgtgatgaaaaggacccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggtacccgacaggttatcagcaacaacacagtcatatccattctcaattagctctaccacagtgtgtgaaccaatgtatccagcaccacctgtaaccaaaacaattttagaagtactttcactttgtaactgagctgtcatttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttaataatcatattacatggcattaccaccatatacatatccatatacatatccatatctaatcttacttatatgttgtggaaatgtaaagagccccattatcttagcctaaaaaaaccttctctttggaactttcagtaatacgcttaactgctcattgctatattgaagtacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagatcgaattccctacttcatacattttcaattaagatgcagttacttcgctgtttttcaatattttctgttattgcttcagttttagcacaggaactgacaactatatgcgagcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccgtactctttgtcaacgactactattttggccaacgggaaggcaatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtttgtcagtaattgcggttctcacccctcaacaactagcaaaggcagccccataaacacacagtatgtttttaaggacaatagctcgacgattgaaggtagatacccatacgacgttccagactacgctctgcagaatacttctggtttgggttggatgtccgctactgaaatggctgctcaagttgcttccaagaagttgtcccctaacgaaattgctgaagaaatgattagaagagttggtgaagttaacccatccgttaatgctatcgttcatttcgatgccgatcaagttagacgtgatgccggtgaattaactcgtgctcaagattctggtgaaccattgggtccattgcatggtgtcccattcaccattaaggatttgactgacgtccgtggtttgccaaccactttcggtttgaagccaatgcgtgacaacatcgctgagagagatgctgtcattgttaccagattgagacaagctggtggattgtacttgggtaaaactaacactccagaatccggttactacggtggtactgataatcacttgttcggtccaacacataatccttggaagccaggtcactctgctggtggtagttctggtggtgctgccgctgctgttgctgctggtttaggtccacttgctgaaggttctgatggtgccggttctgttcgtattccatctgctttgtgtggagttgttggtttgaagccaactaccggtgttattccacaaaccattttgccaggtagatacaataactgggcttatcatggtccaattaccagaaccgtcgctgataacgctttgatgttggacgttttagctggtcctgaccactctgatccattgagtatcgaaagagttgaatcttcttatgtcgaagctgctagaggtggtattgatggtttgagagttgcctggtctccaaacttgggtttgggtcacgttgaacctgacgtcgctgccgtttgtgctgaagctgttgcatgttttgaggatatgggtgctaaggttgtcgaagctactcctgactggggtgacccatctgaggctatgtggcacggtatttgggttccaggtttcgctggtgaacatgacatgttagattgggattctttgcatggtcaagttgatgataacttaattgaactgatccatgaaggtagaagattgaccggtgtcgattacggtagagctgatgctttcagaggtagaatgt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<서열번호 4>
signal peptide (mating factor alpha; MFαSP)
atgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagct
<서열번호 5>
Plasmids for MFα
SP
-UreA Expression
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttaggacggatcgcttgcctgtaacttacacgcgcctcgtatcttttaatgatggaataatttgggaatttactctgtgtttatttatttttatgttttgtatttggattttagaaagtaaataaagaaggtagaagagttacggaatgaagaaaaaaaaataaacaaaggtttaaaaaatttcaacaaaaagcgtactttacatatatatttattagacaagaaaagcagattaaatagatatacattcgattaacgataagtaaaatgtaaaatcacaggattttcgtgtgtggtcttctacacagacaagatgaaacaattcggcattaatacctgagagcaggaagagcaagataaaaggtagtatttgttggcgatccccctagagtcttttacatcttcggaaaacaaaaactattttttctttaatttctttttttactttctatttttaatttatatatttatattaaaaaatttaaattataattatttttatagcacgtgatgaaaaggacccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggtacccgacaggttatcagcaacaacacagtcatatccattctcaattagctctaccacagtgtgtgaaccaatgtatccagcaccacctgtaaccaaaacaattttagaagtactttcactttgtaactgagctgtcatttatattgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttaataatcatattacatggcattaccaccatatacatatccatatacatatccatatctaatcttacttatatgttgtggaaatgtaaagagccccattatcttagcctaaaaaaaccttctctttggaactttcagtaatacgcttaactgctcattgctatattgaagtacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagatcgaattccctacttcatacattttcaattaagatgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagctaatacttctggtttgggttggatgtccgctactgaaatggctgctcaagttgcttccaagaagttgtcccctaacgaaattgctgaagaaatgattagaagagttggtgaagttaacccatccgttaatgctatcgttcatttcgatgccgatcaagttagacgtgatgccggtgaattaactcgtgctcaagattctggtgaaccattgggtccattgcatggtgtcccattcaccattaaggatttgactgacgtccgtggtttgccaaccactttcggtttgaagccaatgcgtgacaacatcgctgagagagatgctgtcattgttaccagattgagacaagctggtggattgtacttgggtaaaactaacactccagaatccggttactacggtggtactgataatcacttgttcggtccaacacataatccttggaagccaggtcactctgctggtggtagttctggtggtgctgccgctgctgttgctgctggtttaggtccacttgctgaaggttctgatggtgccggttctgttcgtattccatctgctttgtgtggagttgttggtttgaagccaactaccggtgttattccacaaaccattttgccaggtagatacaataactgggcttatcatggtccaattaccagaaccgtcgctgataacgctttgatgttggacgttttagctggtcctgaccactctgatccattgagtatcgaaagagttgaatcttcttatgtcgaagctgctagaggtggtattgatggtttgagagttgcctggtctccaaacttgggtttgggtcacgttgaacctgacgtcgctgccgtttgtgctgaagctgttgcatgttttgaggatatgggtgctaaggttgtcgaagctactcctgactggggtgacccatctgaggctatgtggcacggtatttgggttccaggtttcgctggtgaacatgacatgttagattgggattctttgcatggtcaagttgatgataacttaattgaactgatccatgaaggtagaagattgaccggtgtcgattacggtagagctgatgctttcagaggtagaatgtgggatacttggaccgagtttatgaacgattacgacgttttgatctccccaaccttag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이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (12)
- 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소; 및
신호 펩티드;를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는, 재조합 벡터. - 제1 항에 있어서,
상기 에틸카바메이트 분해효소를 코딩하는 유전자 서열은, 서열번호 1로 표시되는 것인, 재조합 벡터. - 제1 항에 있어서,
상기 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 서열은, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 것인, 재조합 벡터. - 제1 항에 있어서,
상기 벡터는 서열번호 3 또는 5의 유전자 서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터. - 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 변이주.
- 제5 항에 있어서,
에틸카바메이트 분해효소가 표면에 부착된, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 변이주. - 제5 항에 있어서,
에틸카바메이트 분해효소를 세포 외로 방출하는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 변이주. - i) 미크로코쿠스 종(Micrococcus species) 유래의 에틸카바메이트 분해효소를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
ii) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하는 단계를 포함하고,
상기 숙주 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인, 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 제조방법. - 제8 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 1 및 서열번호 2의 유전자 서열을 포함하는 것인, 에틸카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 제조방법. - 제8 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 1 및 서열번호 4의 유전자 서열을 포함하는 것인, 에틸 카바메이트 분해능이 향상된 사카로마이세스 세레비지애 변이주의 제조방법. - 제5 항의 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 이용하여 발효 식품을 제조하는 방법.
- 제11 항의 방법에 따라 제조된 발효 식품.
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