CN112111417A - 一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法，属于基因工程以及发酵工程技术领域。本发明提供了一种低产尿素和氨基甲酸乙酯的重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3‑Δcar1，此重组酿酒酵母以酿酒酵母Na为宿主，敲除编码精氨酸酶的基因CAR1，并且，高效表达编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2和编码尿素转运蛋白的基因DUR3；使用此重组酿酒酵母生产得到黄酒发酵液中，尿素的含量低至3.0mg/L，分别较酿酒酵母Na和出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2‑Δcar1降低了92.1％和43.4％。

Description

一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法

技术领域

本发明涉及一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法，属于基因工程以及发酵工程技术领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)是一种潜在致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病，被国际癌症研究机构(International agency for research oncancer，IARC)列为2A类致癌物质。

氨基甲酸乙酯广泛存在于腐乳、酱油等发酵食品及清酒、黄酒、葡萄酒、威士忌、白兰地等酒精饮品中。其中，酒精饮品是人体摄入氨基甲酸乙酯的主要来源，加拿大和捷克等国家纷纷对市场上各类酒精饮品中氨基甲酸乙酯的含量规定了限量标准。2012年，中国香港消费者委员会关于市售酒精饮品中氨基甲酸乙酯含量的调查结果显示，16种黄酒产品中均含有氨基甲酸乙酯，含量最高达到260μg/L，引起了黄酒生产企业和消费者的高度重视。

因此，急需找到一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法以提高黄酒的饮用安全性。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主，敲除编码精氨酸酶的基因CAR1，并且，表达编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2和编码尿素转运蛋白的基因DUR3。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na。

在本发明的一种实施方式中，所述编码精氨酸酶的基因CAR1的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码尿素转运蛋白的基因DUR3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法，所述方法为以上述重组酿酒酵母作为酒母，将酿酒原料经浸米、蒸饭、冷却、拌曲后，将酒母接种到酿酒原料中，经前酵、后酵、过滤澄清，得到黄酒。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：

(1)浸米：取糯米，加水浸过米层进行浸泡，得到浸好的糯米；

(2)蒸煮：蒸煮浸好的糯米，至内无白心、颗粒均匀、软而不烂、熟而不黏，得到蒸熟的糯米；

(3)拌曲：将蒸熟的糯米冷却、摊凉后，添加生麦曲和熟麦曲摊拌均匀，得到拌好的糯米；

(4)前酵：将拌好的糯米与水和酒母混合后进行静置发酵，得到发酵物A；

(5)后酵：前酵结束后，将发酵物A继续静置发酵15d，得到发酵物B；

(6)过滤澄清：后酵结束后，将发酵物B过滤澄清，得到黄酒。

本发明还提供了上述重组酿酒酵母或上述方法在降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量方面的应用。

本发明还提供了一种生产黄酒的方法，所述方法为以上述重组酿酒酵母作为酒母，将酿酒原料经浸米、蒸饭、冷却、拌曲后，将酒母接种到酿酒原料中，经前酵、后酵、过滤澄清，得到黄酒。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包含如下步骤：

(1)浸米：取糯米，加水浸过米层进行浸泡，得到浸好的糯米；

(2)蒸煮：蒸煮浸好的糯米，至内无白心、颗粒均匀、软而不烂、熟而不黏，得到蒸熟的糯米；

(3)拌曲：将蒸熟的糯米冷却、摊凉后，添加生麦曲和熟麦曲摊拌均匀，得到拌好的糯米；

(4)前酵：将拌好的糯米与水和酒母混合后进行静置发酵，得到发酵物A；

(5)后酵：前酵结束后，将发酵物A继续静置发酵15d，得到发酵物B；

(6)过滤澄清：后酵结束后，将发酵物B过滤澄清，得到黄酒。

本发明还提供了上述重组酿酒酵母或上述方法在生产黄酒中的应用。。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种低产尿素和氨基甲酸乙酯的重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1，此重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na为宿主，敲除编码精氨酸酶的基因CAR1，并且，高效表达编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2和编码尿素转运蛋白的基因DUR3；使用此重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1生产得到黄酒发酵液中，尿素的含量低至3.0mg/L，分别较酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1降低了92.1％和43.4％；使用此重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1生产得到黄酒发酵液中，氨基甲酸乙酯的含量低至17.1μg/L，分别较酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiaeNa^DUR1,2-Δcar1降低了58.6％和16.2％。

(2)本发明提供了一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法，此方法为以重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1作为酒母，将酒母添加到蒸煮或糊化好的酿酒原料中，经发酵、压榨、煎酒、陈酿、过滤得到黄酒；利用此方法生产得到的黄酒发酵液中，氨基甲酸乙酯的含量低至17.1μg/L，分别较以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1作为酒母生产得到的黄酒发酵液降低了58.6％和16.2％。

附图说明

图1：CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒的酶切验证结果；其中，M1：DL 15000Marker；泳道1：Not I单酶切验证结果(17903bp)；泳道2：Sph I和Not I的双酶切验证结果(13466bp和4537bp)。

图2：CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒的质粒图谱。

图3：不同酿酒酵母的PCR验证结果；其中，M2：DL5000 Marker；泳道1和2：重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1的PCR验证结果(4087bp)；泳道3：出发菌株S.cerevisiaeNa^DUR1,2-Δcar1的PCR验证结果(1049bp)。

图4：重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1传代10次后在含有G418的YPD固体培养基和不含G418的YPD固体培养基上的划线培养结果。

图5：不同酿酒酵母在发酵过程中的OD₆₀₀值变化和尿素浓度变化；其中，●：出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1在发酵过程中的OD₆₀₀值变化，■：重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1在发酵过程中的OD₆₀₀值变化，○：出发菌株S.cerevisiaeNa^DUR1,2-Δcar1在发酵过程中的尿素浓度变化，△：重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^{DUR1 ,2/DUR3}-Δcar1在发酵过程中的尿素浓度变化。

图6：不同酿酒酵母发酵得到的黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量。

图7：不同酿酒酵母在发酵过程中的CO₂失重曲线。

具体实施方式

下述实施例中涉及的出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1记载于文献“Wu etal.FEMS Microbiology Letters,2016,363(1):fnv214.”中，基因型为MATa ura3 car1::ura3Φ(DUR1,2-URA3-PGK1p)；下述实施例中涉及的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Na记载于文献“Wu et al.FEMS Microbiology Letters,2016,363(1):fnv214.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株；下述实施例中涉及的Prime STAR DNAPolymerase(2.5U/μL)、Ex Taq(5U/μL)、MiniBEST Universal GenomicDNAExtraction Kit、MiniBEST Agrose Gel DNAExtraction kit、Sph I和Not I限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21、G418硫酸盐和无氨基酵母氮源均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的尿素、盐酸、乙酸钠、正己烷、二氯甲烷和无水硫酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丁酯、9-羟基占吨醇、乙腈和甲醇均购自美国Sigma试剂公司；下述实施例中涉及的CRISPR-SpCas9质粒购自苏州金唯智生物科技有限公司；下述实施例中涉及的蛋白胨和酵母提取物均购自英国Oxoid公司；下述实施例中涉及的糯米、生麦曲和熟麦曲均购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司；下述实施例中涉及的ZORBAX Eclipse XDB C18(250×4.6mm,5μm)液相色谱柱和DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱均购自美国Agilent公司；下述实施例中涉及的硅藻土柱购自上海安谱实验科技股份有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

YPD液体培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L，pH为6.5。

YPD固体培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，pH为6.5。

尿素培养基：葡萄糖20g/L、无氨基酵母氮源1.7g/L、尿素20mmol/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

OD₆₀₀值的测定：

取5mL细胞培养液，以空白培养基作为空白对照，在600nm条件下测定培养液的吸光度值，即为OD₆₀₀。

尿素浓度的测定：

①溶液的配制：

尿素-甲醇储备液：精确称取尿素0.100g于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成浓度为1000mg/L的储备液。

盐酸溶液：量取6.2mL的浓盐酸并用蒸馏水定容于50mL的容量瓶中，浓度为1.5mol/L。

9-羟基占吨醇溶液：精确称取0.198g 9-羟基占吨醇，用甲醇溶解并定容至50mL，浓度为0.02mol/L，于-4℃避光保存。

乙酸钠溶液：准确称取1.640g无水乙酸钠于1000mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，溶度为0.02mol/L，并用1％(v/v)的乙酸溶液将pH调至7.2。

②样品前处理：

取400μL样品，加入600μL的9-羟基占吨醇溶液和100μL的盐酸溶液，混匀后避光反应30min。反应液经过0.45μm滤膜过滤后便可进样分析。

③色谱条件：

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB C18(250×4.6mm,5μm)；柱温为35℃；流速设定为1mL/min；进样量10μL；荧光检测器的激发波长和发射波长分别为213nm和308nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.02mol/L的乙酸钠，梯度洗脱程序如表1所示。

表1流动相洗脱条件

时间(min)	A乙腈(％)	B0.02M乙酸钠(％)
			0.00	20	80
12.00	50	50
			15.60	100	0
22.00	100	0
			23.00	20	80
30.00	20	80

氨基甲酸乙酯含量的测定：

①溶液的配制

氨基甲酸乙酯标准贮备液：准确称取0.1000g氨基甲酸乙酯标准品于100mL容量瓶中，并用甲醇定容，最终浓度为1000mg/L；

氨基甲酸乙酯标准使用液：准确吸取100μL氨基甲酸乙酯标准贮备液于100mL容量瓶中，并用甲醇定容，最终浓度为1.00mg/L；

氨基甲酸丁酯内标贮备液：准确称取0.1000g氨基甲酸丁酯标准品于100mL容量瓶中，并用甲醇定容，最终浓度为1000mg/L；

氨基甲酸丁酯标准使用液：准确吸取1mL氨基甲酸丁酯内标贮备液于100mL容量瓶中，并用甲醇定容，最终浓度为10mg/L；

②酒样预处理

酒样的制备：先量取40mL黄酒样品于100mL容量瓶中，然后加入2mL氨基甲酸丁酯标准使用液，再用黄酒定容，获得内标浓度为200μg/L的酒样；

酒样预处理：量取制备好的黄酒样品20mL，载入硅藻土柱，静置10min以保证黄酒样品和硅藻土充分润湿。后用3×20mL正己烷淋洗，每次间隔1～3min；再用3×40mL二氯甲烷进行洗脱，每次间隔1～3min；洗脱液经装10g无水硫酸钠的漏斗。最后，将洗脱液在30℃下旋转蒸发近干，用甲醇定容至4mL，使用气相色谱(GC)Agilent6890连接质谱(MS)5973进行GC/MS分析。

③色谱条件

GC条件：Agilent DB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度：230℃；柱室温度：初始温度60℃(5min)，以3.5℃/min程序升温至150℃(保持2min)，以10℃/min，升到220℃(保持10min)；载气：高纯氦气，柱前压80kPa，流速1mL/min，不分流，进样量2μL。

MS条件：接口温度：220℃；电离方式：EI；电子能量:70eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃；调谐方式：标准调谐；SIM模式。

定性与定量测定：内标法定量。定量离子62；定性离子74、89。

CO₂失重曲线的测定：

在黄酒发酵过程中，每天同一时间对发酵体系进行称重，以发酵时间(d)为横坐标，以每天失重(g)为纵坐标，绘制CO₂失重曲线。

黄酒发酵液常规理化指标的测定：

黄酒发酵液中总糖、总酸、pH值、乙醇和氨基酸态氮含量的测定参照国家黄酒标准GB/T13662-2018。

实施例1：重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1的构建

具体步骤如下：

(1)DUR3表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的构建

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na的基因组为模板，以HO-L-1和HO-L-2为引物进行PCR扩增，得到HO基因的上游同源臂HOL(HO基因是编码酵母核倍性转换的一个基因)；以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na的基因组为模板，以HO-R-1和HO-R-2为引物进行PCR扩增，得到HO基因的下游同源臂HOR；以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Na的基因组为模板，以PGK1p-F和PGK1p-R为引物进行PCR扩增，得到启动子PGK1p；以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na的基因组为模板，以PGK1t-F和PGK1t-R为引物进行PCR扩增，得到终止子PGK1t；以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na的基因组为模板，以DUR3-F和DUR3-R为引物进行PCR扩增，得到编码尿素转运蛋白的基因DUR3；通过融合PCR将上游同源臂HOL、启动子PGK1p、编码尿素转运蛋白的基因DUR3、终止子PGK1t、下游同源臂HOR依次相连，得到DUR3表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”；

其中，PCR扩增所用引物如下：

HO-L-1：ACGACTATTCTGATGGCTAACGG(SEQ ID No.4)；

HO-L-2：CTTATGATGGTTTTTTGGAATTATTTGAGTTGAAGTCAGGAATCTAAAATA(SEQ IDNo.5)；

HO-R-1：GAGAACAGCTTAAAATATCACAAAATTCTG CGTTCGGT(SEQ ID No.6)；HO-R-2：ACAACTCTTATGAGGCCCGC(SEQ ID No.7)；

PGK1p-F：ATAATTCCAAAAAACCATCATAAGTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTCAA(SEQ IDNo.8)；

PGK1p-R：TGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTGGAGGTTTAAATTCTCCCAT(SEQ ID No.9)；

PGK1t-F：GACAAGTTGATGAAATAATTTAGTTGGAATTATTGGAAGGTAA(SEQ ID No.10)；

PGK1t-R：ACCGAACGCAGAATTTTGTGATATTTTAAGCTGTTCTC(SEQ ID No.11)；DUR3-F：ACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGGGAGAATTTAAACCTCC(SEQ ID No.12)；

DUR3-R：CTAAATTATTTCATCAACTTGTCTTACCTTCCAATAATTCCAA(SEQ ID No.13)。

(2)CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒的构建

合成HO基因的向导RNA(sgRNA)gBlock-HO(SEQ ID No.14)；以步骤(1)获得的DUR3表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”和gBlock-HO为模板，以HO-F和gBlock-R为引物，通过融合PCR将gBlock-HO和DUR3表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”依次相连，得到DUR3基因过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR-sgRNA”；将DUR3基因过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR-sgRNA”和CRISPR-SpCas9质粒经Sph I和Not I双酶切后连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒(质粒图谱见图2)；

其中，融合PCR所用引物如下：

HO-F：ATGCATGCACGACTATTCTGATGGCTAACGG(SEQ ID No.15)；

HO-R：ATACATTATCTTTTCAAAGAACAACTCTTATGAGGCCCGC(SEQ ID No.16)；

gBlock-F：GCGGGCCTCATAAGAGTTGTTCTTTGAAAAGATAATGTAT(SEQ ID No.17)；

gBlock-R：ATGCGGCCGCAGACATAAAAAACAAAAA(SEQ ID No.18)。

(3)重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1的构建

将步骤(2)获得的CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒电转入出发菌株S.cerevisiaeNa^DUR1,2-Δcar1中，得到转化产物；将转化产物涂布在含有350μg/mL G418硫酸盐的YPD固体培养基上，于30℃培养箱静置培养48h，得到转化子；对转化子进行菌落PCR验证(验证结果见图3)，挑取验证正确的转化子转接到不含抗性的YPD液体培养基中，于30℃、200r/min培养48h进行传代，共传代十次，使得CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒丢失，将传代10次后的菌株分别划线于含有350μg/mL G418硫酸盐的YPD固体培养基和不含G418硫酸盐的YPD固体培养基，于30℃培养箱静置培养48h，48h后，丢失了CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒的酵母不具有G418硫酸盐的抗性，因此不能在含有G418的培养基上生长，只能在不含G418硫酸盐的培养基上生长，最终得到不含CRISPR-DUR3-gBlock-HO质粒的得到重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1(验证结果见图4)。

(4)重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1的验证

以出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1为对照，将步骤(3)获得的重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1在不含G418的YPD固体培养基上培养得到的单菌落，将单菌落接种至YPD液体培养基中，于30℃、200r/min培养48h，得到种子液；将种子液按照5％(v/v)的接种量接种至尿素培养基中，于30℃、200r/min培养48h，得到培养液。

培养过程中，间隔6h检测培养液中的OD₆₀₀值和尿素浓度，检测结果见图5。

由图5可知，出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1和重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1在培养过程中，OD₆₀₀值变化趋势基本一致，但是，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1培养得到的培养液中尿素的含量明显低于出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1，其中，培养48h时，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^{DUR1 ,2/DUR3}-Δcar1对尿素的利用率为95.3％，显著高于出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1的81.7％，可见，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1对尿素的吸收能力远优于出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1。

实施例2：黄酒的酿造

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1为对照，使用重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3-Δcar1进行黄酒的酿造具体步骤如下：

(1)酵母种子液扩培

蘸取实施例1获得的重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1的菌液划线于YPD固体培养基上，于30℃培养箱静置培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，于30℃、200r/min培养12h，得到一级种子液；将一级种子液按照10％(v/v)的接种量接种至YPD液体培养基中，于30℃、200r/min培养12h，得到二级种子液；将二级种子液按照10％(v/v)的接种量接种至YPD液体培养基中，于30℃、200r/min培养12h，得到三级种子液。

(2)黄酒发酵

黄酒发酵工艺流程：浸米→蒸饭→冷却→拌曲→接种→前酵→后酵→过滤澄清；

其中，浸米：取100g糯米，加水浸过米层10cm，室温(27℃)浸泡2～3d，得到浸好的糯米；

蒸煮：采用常压蒸煮的方式蒸煮浸好的糯米，待有大量蒸汽冒出后维持20min，至内无白心、颗粒均匀、软而不烂、熟而不黏，得到蒸熟的糯米；

拌曲：将蒸熟的糯米放置在通风处冷却、摊凉至室温(27℃)后，添加13g生麦曲(13％)和4g熟麦曲(4％)与糯米摊拌均匀，得到拌好的糯米；

前酵：将拌好的糯米转入500mL的三角瓶，加入170mL水，按照5％(v/v)的接种量接入步骤(1)获得的三级种子液，加发酵栓，摇匀，置于30℃静置发酵；发酵期间，每日称重三角瓶，当CO₂日失重量小于0.2g时结束前酵；

后酵：前酵结束后，将三角瓶置于15℃生化培养箱，静置发酵15d；

过滤澄清：后酵结束后，使用三十二折滤纸过滤三角瓶中的发酵物，得到黄酒发酵液。

检测黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量，检测结果见图6。

由图6可知，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量分别为3.0mg/L和17.1μg/L，显著低于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na发酵得到的黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量(38.0mg/L和41.3μg/L)，并且，显著低于出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量(5.3mg/L和20.4μg/L)。

检测黄酒发酵液的CO₂失重曲线，检测结果见图7。

由图7可知，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1的CO₂失重曲线基本一致，说明3个菌株的生长性状相似。

检测黄酒发酵液中总糖、乙醇、氨基酸态氮和总酸的含量，并且，检测黄酒发酵液的pH，检测结果见表2。

由表2可知，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiaeNa^DUR1,2-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液中总糖、乙醇、氨基酸态氮和总酸的含量无明显差异，并且，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na和出发菌株S.cerevisiae Na^DUR1,2-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液的pH也无明显差异，说明对重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1的改造并不会影响其生长和发酵性能。

表2不同酿酒酵母发酵得到的黄酒发酵液的理化指标

对比例1：黄酒的酿造

具体步骤如下：

在实施例1的基础上，将引物DUR3-F/DUR3-R替换为引物DUR3-F/DUR3-RX，得到CRISPR-DUR3X-gBlock-HO质粒和重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3X-Δcar1；

其中，PCR扩增所用引物如下：

DUR3-RX：TTACCTTCCAATAATTCCAAGAATATTATATTTTGAAAGC(SEQ ID No.19)。

在实施例2的基础上，将重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3-Δcar1替换为重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3X-Δcar1，得到黄酒发酵液。

检测黄酒发酵液中总糖、乙醇、氨基酸态氮和总酸的含量，并且，检测黄酒发酵液的pH，检测结果见表3。

由表3可知，与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na相比，重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3X-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液中乙醇的含量明显较低，说明重组酿酒酵母S.cerevisiae Na^DUR1,2/DUR3X-Δcar1发酵不完全，所以其发酵液中残糖含量也显著高于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na发酵得到的黄酒发酵液。可见，DUR3X在酵母中的表达，影响了酿酒酵母的发酵性能。并且，重组酿酒酵母S.cerevisiaeNa^DUR1,2/DUR3X-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量分别为5.5mg/L和20.0μg/L，与出发菌株Na^DUR1,2-Δcar1发酵得到的黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量(5.3mg/L和20.4μg/L)相比，无明显差异。可见，DUR3X在酵母中的表达并未降低酿酒酵母产尿素和氨基甲酸乙酯含量的能力。

表3不同酿酒酵母发酵得到的黄酒发酵液的理化指标

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1002

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atggaaacag gacctcatta caactactac aaaaatcgcg aattgtccat cgttctggct 60

ccattcagcg gcggtcaggg taagcttggt gtcgagaagg gccctaaata catgcttaag 120

catggtctgc aaacaagcat agaggatttg ggctggtcta cggaattaga gccctcaatg 180

gacgaggccc aatttgtggg aaagttgaaa atggagaagg actccacaac tgggggttcc 240

tctgttatga tagacggtgt caaggctaaa agagcagatt tggttggtga agccaccaag 300

ttggtgtaca actccgtgtc gaaagtggtc caggcgaaca gattcccctt gaccttgggt 360

ggtgatcatt caatagccat tggtactgta tccgcggttt tggacaaata ccccgatgct 420

ggtcttttat ggatagacgc ccacgctgat ataaacacca tagaaagcac cccctctgga 480

aacttgcacg gctgtcccgt gtcattccta atgggtttga acaaggatgt cccacattgt 540

cccgagtcgc tcaaatgggt tccaggcaac ttgagcccaa aaaagatcgc gtatattggg 600

ttgagagatg ttgatgccgg agaaaagaaa atcttgaaag atctgggtat cgccgccttt 660

tccatgtacc acgttgacaa atacggcatc aacgctgtca ttgaaatggc aatgaaagcc 720

gtgcacccag aaacaaacgg tgaaggtccc attatgtgct cctatgacgt cgatggtgta 780

gacccattat acattcctgc tacaggtact ccagtgagag gtgggttgac cttgagagaa 840

ggtcttttct tggtggaaag attggccgaa tccggtaatt taattgcgct agacgttgtt 900

gaatgtaacc ctgatctggc tattcatgat atccatgttt caaacaccat ctctgcaggt 960

tgcgccattg caaggtgtgc attgggtgaa accttattgt ag 1002

<210> 2

<211> 5508

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

atgacagtta gttccgatac aactgctgaa atatcgttag gttggtcaat ccaagactgg 60

attgatttcc acaagtcatc aagctcccag gcttcactaa ggcttcttga atcactacta 120

gactctcaaa atgttgcgcc agtcgataat gcgtggatat cgctaatttc aaaggaaaat 180

ttactgcacc aattccaaat tttaaagagc agagaaaata aagaaactct acctctctac 240

ggtgtcccta ttgctgttaa ggacaacatc gacgttagag gtctacccac caccgctgca 300

tgtccatcct ttgcatatga gccttccaaa gactctaaag tagtagaact actaagaaat 360

gcaggtgcga taatcgtggg taagacaaac ttggaccaat ttgccacagg attagtcggc 420

acacggtctc catatgggaa aacaccttgc gcttttagca aagagcatgt atctggtggt 480

tcctccgctg ggtcagcatc ggtggtcgcc agaggtatcg taccaattgc attgggtact 540

gatacagcag gttctggtag agtcccagcc gccttgaaca acctgattgg cctaaagcca 600

acaaagggcg tcttttcctg tcaaggtgta gttcccgctt gtaaatcttt agactgcgtc 660

tccatctttg cattaaacct aagtgatgct gaacgctgct tccgcatcat gtgccagcca 720

gatcctgata atgatgaata ttctagaccc tatgtttcca accctttgaa aaaattttca 780

agcaatgtaa cgattgctat tcctaaaaat atcccatggt atggtgaaac caagaatcct 840

gtactgtttt ccaatgctgt cgaaaatcta tcaagaacgg gcgctaacgt catagaaatt 900

gattttgagc ctcttttaga gttagctcgc tgtttatacg aaggtacttg ggtggccgag 960

cgttatcaag ctattcaatc gtttttggac agtaaaccac caaaggaatc tttggaccct 1020

actgttattt caattataga aggggccaag aaatacagtg cagtagactg cttcagtttt 1080

gaatacaaaa gacaaggcat cttgcaaaaa gtgagacgac ttctcgaatc agtcgatgta 1140

ttgtgtgtgc ccacatgtcc tttaaatcct actatgcaac aagttgcgga tgaaccagtc 1200

ctagtcaatt caagacaagg cacatggact aattttgtca acttggcaga tttggcagcc 1260

cttgctgttc ccgcagggtt ccgagacgat ggtttgccaa atggtattac tttaatcggt 1320

aaaaaattca cagattacgc actattagag ttggctaacc gctatttcca aaatatattc 1380

cccaacggtt ccagaacata cggtactttt acctcttctt cagtaaagcc agcaaacgat 1440

caattagtgg gaccagacta tgacccatct acgtccataa aattggctgt tgtcggtgca 1500

catcttaagg gtctgcctct acattggcaa ttggaaaagg tcaatgcaac atatttatgt 1560

acaacaaaaa catcaaaagc ttaccagctt tttgctttgc ccaaaaatgg accagtttta 1620

aaacctggtt tgagaagagt tcaagatagc aatggctctc aaatcgaatt agaagtgtac 1680

agtgttccaa aagaactgtt cggtgctttt atttccatgg ttcctgaacc attaggaata 1740

ggttcagtgg agttagaatc tggtgaatgg atcaaatcct ttatttgtga agaatctggt 1800

tacaaagcca aaggtacagt tgatatcaca aagtatggtg gatttagagc atattttgaa 1860

atgttgaaga aaaaagagtc ccaaaagaag aagttatttg ataccgtgtt aattgccaat 1920

agaggtgaaa ttgccgttcg tattatcaag acattaaaaa aattgggtat tagatcagtt 1980

gcagtttatt ccgaccctga taaatattct caacacgtta ctgatgcaga tgtttctgta 2040

ccccttcatg gcacaaccgc agcccaaact tatttagaca tgaataagat catagatgcc 2100

gctaagcaaa ctaatgcaca ggccattatt cctggttatg gtttcttgtc ggaaaatgcg 2160

gatttttctg atgcgtgcac cagtgctggc attacctttg ttggtccttc gggagatatt 2220

atcagaggtt tagggttaaa acattctgct agacagattg cacagaaggc tggcgttcct 2280

ctagtgccag gctctttgct tatcacatca gttgaagagg ctaagaaagt cgcagcggaa 2340

ttggaatacc cagttatggt gaagtcaact gctggtggcg gtggtattgg tttgcagaaa 2400

gtcgattctg aagaggacat cgagcatatt tttgagactg tgaaacatca aggtgaaaca 2460

tttttcggtg acgctggtgt atttctggaa cggtttatcg aaaatgccag gcatgttgaa 2520

gtccaactta tgggagatgg ttttggtaag gccattgctt tgggcgaacg tgattgttct 2580

ttacagcgtc gtaaccaaaa agttatcgaa gaaactcctg caccaaattt gccagaaaag 2640

acgaggttgg cgttaagaaa ggcagctgaa agtttgggat ctttattgaa ttacaagtgt 2700

gctggtacgg ttgaatttat ttacgatgag aaaaaggacg agttttactt tttagaagtt 2760

aatacaagat tacaagttga acatccaata acagaaatgg ttacagggtt agacttggtc 2820

gagtggatga tcaggattgc cgctaatgat gcacctgatt ttgattctac aaaggtagaa 2880

gtcaatgggg tttcaatgga ggcacgttta tatgctgaaa atccattgaa aaatttcaga 2940

ccttctccag gtttacttgt cgatgtgaaa tttcctgatt gggcaagagt ggatacttgg 3000

gttaagaaag gtactaatat ttctcccgaa tatgatccaa cattggccaa aattatcgtt 3060

catgggaaag accgtgatga tgcaatttcc aagttaaatc aagcgttaga agaaacaaaa 3120

gtttacggat gtattactaa cattgactac ctgaagtcta tcattaccag tgatttcttt 3180

gctaaagcaa aagtttctac aaacattttg aactcttatc aatatgagcc taccgccatc 3240

gaaattactt tgcccggtgc acacactagt attcaggatt accccggtag agttgggtac 3300

tggagaattg gtgttccgcc ctctggtcca atggacgcat attcgtttag attggcgaac 3360

agaattgttg gtaatgacta caggactcct gccattgaag taacgttgac tggtccatcc 3420

atcgttttcc attgtgaaac tgtcattgcc attactggtg gtaccgctct atgtacatta 3480

gacggccaag aaattcccca acacaaaccg gtcgaagtta agaggggatc tactttatcc 3540

attggcaagt tgacaagcgg ctgtagagca tacttaggta tcaggggtgg cattgatgtg 3600

cctaaatact tgggctctta ttctactttc actctaggaa atgtcggtgg atacaatgga 3660

agggtgctaa aacttggaga cgtactattc ttaccaagca atgaagaaaa taaatcagtt 3720

gagtgccttc cacagaatat tcctcaatca ttaattcctc aaatttccga aactaaggaa 3780

tggagaattg gtgtaacatg tggtccccat gggtctccag atttttttaa acctgagtcc 3840

atcgaagaat ttttcagtga gaagtggaag gttcattaca actccaatag atttggtgtc 3900

cgtttgattg gacctaaacc taagtgggca agaagtaatg gtggtgaagg tggtatgcat 3960

ccttcaaaca ctcacgatta cgtttattct ctgggtgcaa ttaatttcac gggtgatgag 4020

ccagttatta ttacttgcga tggtccttcc ttaggtggtt ttgtgtgtca agctgttgtc 4080

ccagaagcag aactgtggaa ggttggacag gttaaacccg gtgattccat tcagtttgtg 4140

ccactttctt acgaaagctc gagatcctta aaggaatctc aggatgttgc aattaaatca 4200

ttggatggta ctaagttaag gcgcttagac tctgtttcaa ttttaccatc attcgaaacg 4260

cctattcttg cacaaatgga aaaagtgaat gagctttcac caaaggttgt atacagacaa 4320

gcaggtgatc gttatgtttt ggtggaatac ggtgataatg aaatgaattt taatatttcc 4380

tatagaattg aatgcctgat ctcccttgtg aaaaagaata agactattgg tattgttgaa 4440

atgtcccaag gtgttagatc tgtattgata gaatttgatg gttacaaagt cactcaaaaa 4500

gaattgctta aagtattggt ggcatatgaa acagaaatcc agtttgatga aaattggaag 4560

ataacttcta atataataag attaccgatg gctttcgaag actcgaagac tttggcatgt 4620

gttcaaaggt atcaagaaac aattcgttcg tctgctccat ggttgccaaa taacgttgat 4680

ttcattgcca atgtaaatgg aatttcaagg aatgaagttt atgatatgtt gtattctgcc 4740

agatttatgg ttttaggttt aggtgatgtc ttcctagggt cgccttgtgc tgttccatta 4800

gatcctcgtc acagattttt gggaagcaag tacaacccaa gtagaacata tacagaaaga 4860

ggtgcagtcg gtattggcgg tatgtatatg tgcatatatg ctgctaacag tcctggtggg 4920

taccaattag tgggtagaac aataccaatt tgggacaaac tatgtctggc cgcatcttct 4980

gaggttccgt ggttgatgaa cccatttgac caagtcgaat tttacccagt ttctgaagaa 5040

gatttggata aaatgactga agattgtgat aatggtgttt ataaagtcaa tatcgaaaag 5100

agtgtttttg atcatcaaga atacttgaga tggatcaacg caaacaaaga ttccatcaca 5160

gcattccagg agggccagct tggtgaaaga gcagaggaat ttgccaaatt gattcaaaat 5220

gcaaactctg aactaaaaga aagtgtcaca gtcaaacctg acgaggaaga agacttccca 5280

gaaggtgcag aaattgtata ttctgagtat tctgggcgtt tttggaaatc catagcatct 5340

gttggagatg ttattgaagc aggtcaaggg ctactaatta ttgaagccat gaaagcggaa 5400

atgattatat ccgctcctaa atcgggtaag attatcaaga tttgccatgg caatggtgat 5460

atggttgatt ctggtgacat agtggccgtc atagagacat tggcatga 5508

<210> 3

<211> 2208

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 3

atgggagaat ttaaacctcc gctacctcaa ggcgctgggt acgctattgt attgggccta 60

ggggccgtat ttgcaggaat gatggttttg accacttatt tactgaaacg ttatcaaaag 120

gaaatcatca cagcagaaga attcaccacc gccggtagat ctgtaaaaac cggcttagtg 180

gctgcagccg tggtttctag ttggatctgg tgttctacat tgttaacgtc gtcaacaaag 240

gaatatgcag acggtatatt tggcggttat gcgtacgctg ctggcgcatg cttccaaatt 300

attgcattcg caattttggc aattaaaacc aagcaaatgg ctcccaatgc gcacacatat 360

ttagaattag tgagaacaag atatggtaag atcggccatg gttgctactt gttttatgcc 420

atcgcgacga atattttagt cacttcaatg cttttaactt caggttctgc tgtctttagt 480

gatttaaccg ggatgaacac tatcgcatca tgttttttac tgcctgtggg tgttgttgtt 540

tatactctat ttggtgggat taaagcaact ttcttaacgg actatatgca cacatgtgtc 600

attatcatca ttgtcctcgt atttgccttt aaagtttatg cgactagtga tgttttaggc 660

tcaccgggaa aagtttatga cttagttcgt gaagccgcca agaggcatcc agtagacggt 720

aactatcagg gtgaatatat gaccatgaca tccaaatccg ctggtatttt attaattatt 780

aacctgattg gaaatttcgg caccgttttc cttgataatg gttattggaa taaagcgatt 840

tctgctagtc ccgcagcgag tttgaaagca tatgccatcg gtgggttagc atggtttgca 900

gtaccttctt tgatttcatt gaccatggga ttagcatgtc ttgcggtgga aacgtctccg 960

aacttcccca cctatcctga tccacttact tcgttccagg caaattctgg gttagtcttg 1020

ccggcagctg caattgctat catgggtaag gggggtgctg tggcatcgct gctaatgatt 1080

ttcatggccg tcacatctgc tatgtctgct gaactaattg ccgtttcatc tgttttcact 1140

tacgatatct atagagaata tattgatcct cgtgcaagcg gtaagaaatt gatttacaca 1200

tcacacgttg cttgtatctt ttttggtctt gccatgagtg gattttcggt tggtttatac 1260

tatggtggta tttctatggg ttatatctat gaaatgatgg gtataattat tagtagtgca 1320

gtattacctg tcgttttgac cttatgttcc aaagacatga atttggtggc cgctgtagtg 1380

tcgcctattt tgggcacagg actggctata atgtcatggc ttgtctgtac caaatccctt 1440

tataaagaat tgaccgtgga tactacgttc atggattatc caatgttaac aggtaacttg 1500

gtggctttgc tatcaccagc catttttatt cctattttaa cgtatgtgtt taagccacaa 1560

aattttgact gggagaaaat gaaagatatt actagagttg acgaaactgc agagttagtt 1620

caggctgacc ctgatatcca gctttacgat gctgaagcta acgataagga acaagaagaa 1680

gaaacaaatt ctctggtctc agatagtgaa aaaaacgatg ttagagtaaa taatgaaaaa 1740

ttgattgagc ctaaccttgg tgttgtaata agtaatgcca tttttcaaga agatgacaca 1800

cagttacaaa atgaattaga cgaagaacaa agagaactag cacgtggttt aaaaattgca 1860

tacttcctat gtgttttttt cgctttggca tttttggtag tttggcccat gcccatgtat 1920

ggttccaaat atatcttcag taaaaaattc tttaccggtt gggttgttgt gatgatcatc 1980

tggctttttt tcagtgcgtt tgccgtttgt atttatccac tctgggaagg taggcatggt 2040

atatatacca ctttgcgagg cctttactgg gatctatctg gtcaaactta taaattaagg 2100

gaatggcaaa attcgaaccc acaagatctg catgtagtaa caagccaaat tagtgcgaga 2160

gcacatagac aatcatcaca tttcggacaa gttgatgaaa taatttag 2208

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgactattc tgatggctaa cgg 23

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttatgatgg ttttttggaa ttatttgagt tgaagtcagg aatctaaaat a 51

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagaacagct taaaatatca caaaattctg cgttcggt 38

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acaactctta tgaggcccgc 20

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ataattccaa aaaaccatca taagtatttt agattcctga cttcaactca a 51

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgttttatat ttgttgtaaa aagtggaggt ttaaattctc ccat 44

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacaagttga tgaaataatt tagttggaat tattggaagg taa 43

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

accgaacgca gaattttgtg atattttaag ctgttctc 38

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

actttttaca acaaatataa aacaatggga gaatttaaac ctcc 44

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctaaattatt tcatcaactt gtcttacctt ccaataattc caa 43

<210> 14

<211> 391

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctttgaaaa gataatgtat gattatgctt tcactcatat ttatacagaa acttgatgtt 60

ttctttcgag tatatacaag gtgattacat gtacgtttga agtacaactc tagattttgt 120

agtgccctct tgggctagcg gtaaaggtgc gcattttttc acaccctaca atgttctgtt 180

caaaagattt tggtcaaacg ctgtagaagt gaaagttggt gcgcatgttt cggcgttcga 240

aacttctccg cagtgaaaga taaatgatca cattcccaat gacagttgaa gggttttaga 300

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 360

gtcggtggtg ctttttttgt tttttatgtc t 391

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgcatgcac gactattctg atggctaacg g 31

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atacattatc ttttcaaaga acaactctta tgaggcccgc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcgggcctca taagagttgt tctttgaaaa gataatgtat 40

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgcggccgc agacataaaa aacaaaaa 28

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttaccttcca ataattccaa gaatattata ttttgaaagc 40

Claims (10)

1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为宿主，敲除编码精氨酸酶的基因CAR1，并且，表达编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2和编码尿素转运蛋白的基因DUR3。

2.如权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Na。

3.如权利要求1或2所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述编码精氨酸酶的基因CAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述编码脲基酰胺酶的基因DUR1,2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.如权利要求1-4任一所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述编码尿素转运蛋白的基因DUR3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.一种降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1-5任一项所述的重组酿酒酵母作为酒母，将酿酒原料经浸米、蒸饭、冷却、拌曲后，将酒母接种到酿酒原料中，经前酵、后酵、过滤澄清，得到黄酒。

7.权利要求1-5任一项所述的重组酿酒酵母或权利要求6所述的方法在降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量方面的应用。

8.一种生产黄酒的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1-5任一项所述的重组酿酒酵母作为酒母，将酿酒原料经浸米、蒸饭、冷却、拌曲后，将酒母接种到酿酒原料中，经前酵、后酵、过滤澄清，得到黄酒。

9.如权利要求8所述的一种生产黄酒的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：

(1)浸米：取糯米，加水浸过米层进行浸泡，得到浸好的糯米；

(2)蒸煮：蒸煮浸好的糯米，至内无白心、颗粒均匀、软而不烂、熟而不黏，得到蒸熟的糯米；

(3)拌曲：将蒸熟的糯米冷却、摊凉后，添加生麦曲和熟麦曲摊拌均匀，得到拌好的糯米；

(4)前酵：将拌好的糯米与水和酒母混合后进行静置发酵，得到发酵物A；

(5)后酵：前酵结束后，将发酵物A继续静置发酵15d，得到发酵物B；

(6)过滤澄清：后酵结束后，将发酵物B过滤澄清，得到黄酒。

10.权利要求1-5任一项所述的重组酿酒酵母或权利要求8或9所述的方法在生产黄酒中的应用。

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