JP2022512790A - 副原料醸造におけるインフュージョン・マッシング用の酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号1は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)、GsAA1由来のαアミラーゼ変異体の成熟アミノ酸配列を示す。
ポリペプチドに関する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、1つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
ギャップ開始ペナルティ:10.0
ギャップ伸長ペナルティ:0.05
タンパク質ウエイトマトリックス:BLOSUMシリーズ
DNAウエイトマトリックス:IUB
ディレイ発散配列(%):40
ギャップ分離距離:8
DNAトランジションウエイト:0.50
親水性残基のリスト:GPSNDQEKR
ネガティブマトリックスの使用:オフ
トグル残基特異的ペナルティ:オン
トグル親水性ペナルティ:オン
トグル末端ギャップ分離ペナルティ オフ。
一部の実施形態において、本発明のアミラーゼはさらに、更なる性能又は安定性の利点を提供する1つ又は複数の突然変異を含む。例示的な性能の利点としては、限定されないが、増加した熱安定性、増加した貯蔵安定性、増加した溶解性、変化したpHプロファイル、増加した比活性、改質された基質特異性、改質された基質結合性、改質されたpH依存性活性、改質されたpH依存性安定性、増加した酸化安定性、及び増加した発現が挙げられる。一部の場合には、性能の利点は、比較的低い温度で実現される。一部の場合には、性能の利点は、比較的高い温度で実現される。
本発明のアミラーゼは、例えば分泌又は細胞内発現により、宿主細胞内中で産生され得る。アミラーゼを含む培養細胞材料(例えば、全細胞ブロス)は、アミラーゼの細胞培地への分泌後に得ることができる。任意選択により、アミラーゼを、最終的なアミラーゼの所望の純度に応じて、宿主細胞から単離し得るか、又はさらに細胞ブロスから単離し得る。プロリン特異性アミラーゼをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の方法に従って、クローニングして発現させ得る。好適な宿主細胞としては、細菌、真菌(酵母及び糸状菌を含む)及び植物細胞(藻類を含む)が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、コウジカビ(Aspergillus oryzae)又はトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)又はB.リケニフォルミス(B.licheniformis)、並びにストレプトマイセス属(Streptomyces)、及び大腸菌(E.Coli)が挙げられる。
アミラーゼをコードする核酸を含むDNA構築物は、宿主細胞において発現されるように作成され得る。遺伝子コードの既知の縮重のために、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリヌクレオチドを、通常の技術を用いて設計し、作製し得る。特定の宿主細胞に対してコドン使用を最適化することは当技術分野でよく知られている。アミラーゼをコードする核酸は、ベクターに組み込むことができる。ベクターは、既知の形質転換技術、例えば、下記に開示される技術などを使用して宿主細胞に導入することができる。
DNA構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、アミラーゼの組み換え産生における宿主細胞として有利に使用される。この細胞は、この酵素をコードするDNA構築物で、便宜的にはこのDNA構築物を宿主の染色体に(1つ又は複数のコピー数で)組み込むことにより形質転換され得る。このDNA配列は細胞中で安定して維持され易いことから、この組込みは有利であると一般に考えられている。宿主の染色体へのDNA構築物の組込みを、従来方法に従って実施し得、例えば、相同組み換え又は非相同組み換えにより実施し得る。代替方法としては、細胞は、異なるタイプの宿主細胞と関連した上述の発現ベクターを用いて形質転換させることができる。
アミラーゼを製造する方法は、この酵素の産生を促す条件下で宿主細胞を培養すること、及びこの細胞及び/又は培養培地からこの酵素を回収することを含み得る。
発酵、分離、及び濃縮技術は当技術分野でよく知られており、アミラーゼポリペプチド含有溶液を調製するために、従来の方法を用いることができる。
本発明の態様に従って、αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び/又はグルコアミラーゼとを組み合わせることによって、かかるデンプンタイプに従来から使用される温度よりも低い処理温度で、高いゲル化温度を有する副原料デンプンを効率的に液化し、糖化して、本明細書に記載の、且つ特許請求の範囲に記載の発酵性麦汁を製造することができることを発見した。したがって、内因性モルト酵素なしで、且つ(好ましくは)いわゆるインフュージョン法において事前のゲル化なしに、デンプン供給源の中でもトウモロコシグリスト、トウモロコシデンプン、コメデンプン、モロコシデンプン又はカッサバなどの副原料を処理することができる。かかる副原料デンプンの液化及び糖化には、外因的に供給された酵素組成物によってマッシュを補足することが必要である。これらのデンプン副原料は通常、高い開始ゲル化温度など、高ゲル化温度を特徴とする。意外なことに、酵素の正しい組み合わせによって、前記デンプン材料を高度にデンプン可溶化/液化及び糖化することが可能となり、上昇温度でそのプロセス中に抽出されたデンプンは徐々に、発酵性糖類及びより小さなデキストリンへと加水分解される。好ましくは、最終的なマッシュは、ヨウ素試験に対してデンプンネガティブであり、得られた麦汁において高いエキス濃度値(extract value)とも相関する。酵母発酵によってエタノールへと前記糖類を適切に転化するために、DP4+デキストリンの画分は好ましくは、可溶性糖類の合計の30%未満、又はより好ましくは可溶性糖類の合計の25%未満であるべきである。マッシングは、70℃以上の温度;好ましくは少なくとも80℃でのマッシュアウトによって仕上げられる。
[実施例]
GsAA1:配列番号1に示すアミノ酸配列を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)由来のαアミラーゼ変異体
GsAA2:配列番号2に示すアミノ酸配列を有する、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)由来のマルトジェニックαアミラーゼ
TrGA:配列番号3に示すアミノ酸配列を有する、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)由来のグルコアミラーゼ
Stain Free Imager Criterionによるタンパク質の決定
SDS-PAGEゲル及びGel Doc(商標)EZイメージングシステムを用いた濃度測定により、タンパク質を定量した。この分析で使用した試薬:濃縮(2×)Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad、カタログ番号161-0737);26-ウェルXT4-12%Bis-Tris Gel(Bio-Rad、カタログ番号345-0125);タンパク質マーカー「Precision Plus Protein Standards」(Bio-Rad、カタログ番号161-0363);タンパク質標準BSA(Thermo Scientific、カタログ番号23208)及びSimplyBlue Safestain(Invitrogen、カタログ番号LC 6060。分析は以下のように行った:96ウェルPCRプレート中で、50μLの希釈酵素試料を、2.7mgのDTTを含有する50μLの試料バッファと混合した。プレートをBio-Rad製のMicroseal「B」Filmで密封し、PCR装置に入れ、70°Cまで10分間加熱した。その後、容器をランニングバッファで満たし、ゲルカセットをセットした。次いで、10μLの各試料及び標準(0.125~1.00mg/ml BSA)をゲル上に置き、5μLのマーカーを加えた。その後、200Vで45分間電気泳動を行った。電気泳動に続き、ゲルを水で3回、5分間濯ぎ、その後、Safestain中で終夜染色し、最後に水で脱染した。その後、ゲルをImagerに移した。各バンドの強度計算にImage Labソフトウェアを使用した。BSA(Thermo Scientific,カタログ番号23208)を使用して、較正曲線を作成した。標的タンパク質の量をバンド強度と較正曲線によって決定した。タンパク質定量化法を用いて、その後の実施例に使用される酵素試料を調製した。
すべての標準物質:グルコース、マルトース、マルトトリオース及びマルトテトラオースを再蒸留水(ddH20)中で調製し、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した。各標準物質のセットを10~100,000ppmの濃度範囲で調製した。
糖類:DP1、DP2、DP3、DP4及びDP5+の定量化をUPLCによって実施した。試料の分析を、DGP-3600SD Dual-Gradient分析用ポンプ、WPS-3000TSLサーモスタットオートサンプラ、TCC-3000SDサーモスタットカラムオーブン及びRI-101屈折率検出器(Shodex、JM Science)を備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステム(Thermo Fisher Scientific)で実行した。データの取得及び分析にChromeleonデータシステムソフトウェア(Version 6.80、DU10A Build 2826、171948)を使用した。
70℃で操作される、分析ガードカラム(Carbo-Ag+中性,AJ0-4491,Phenomenex,オランダ)を備えた、Ag+ 4%架橋された(Phenomenex,オランダ)RSOオリゴ糖カラムを使用して、試料を分析した。カラムを流量0.3ml/分にて再蒸留水(0.45μmの再生セルロース膜を通して濾過され、ヘリウムガスでパージされた)で溶離した。総実行時間が45分である分析の間中、0.3ml/分のアイソクラチックフロー(isocratic flow)を維持し、注入量を10μLに設定した。恒温自動サンプラー区画内で20℃にて試料を維持した。屈折率検出器(RI-101,Shodex,JM Science)を使用して溶離液をモニターし、所定の標準物質のピーク面積に対するピーク面積によって定量化を行った(DP1:グルコース;DP2:マルトース;DP3:マルトトリオース及び4以上のマルトテトラオースのピークを標準として使用した)。
この実施例の目的は、発酵性糖類を遊離するための酵素のうちの1つのみと比較して、インフュージョンプロセス(単一容器)における副原料の処理中に存在する2種類の酵素(マルトジェニックαアミラーゼ又はグルコアミラーゼ及びαアミラーゼ)を有する利点(放出された発酵性糖及びエキストラクト)を実証することであった。
64℃の水道水12.0gで予めインキュベートされたウィートン(wheaton)カップ(キャップを有するガラス容器)内でトウモロコシグリスト(3.0g)、コメグリスト(粉砕3.0g)、モロコシ(3.0g)又はカッサバ粉(3.0g)を混合し、2.5M硫酸でpH5.4にpH調整した。実施例2に従って決定されたタンパク質mg(合計0.5mL)に基づいて酵素を添加し、酵素なしのコントロールとして水を添加した。GsAA1、GsAA2及びTrGAの添加に加えて、固定濃度の0.5mg/gグリストLaminex(登録商標)750(デュポン社)を使用し、濾過性(B-グルカナーゼ)(発酵性糖類の放出にこれは影響しない)を確実にした。電磁攪拌を備えたドライバス(Drybath)(Thermo Scientific Stem station)にウィートンカップを入れ、以下のマッシングプログラムを適用した:試料を64℃で60分間維持し;80℃で10分間加熱し;最後に80℃で55分間維持してマッシュアウトした。15ml試料をファルコンチューブに移し、Heraeus Multifuge X3Rにおいて4500rpmにて10℃で20分間遠心することによって使用済み穀物を麦汁から分離した。手持ち式Plato屈折計(PAL-PLATO、愛宕(Atago),東京)によって、抽出物を測定した。すべての試料をH2Oで10倍に希釈し、水浴中で20分間煮沸して酵素を不活性化した。HPLC糖分析のために、実施例3に記載のように上清を回収し、濾過した(0.2μm)。
麦汁生成のための、濾過を用いた実験室規模のインフュージョン・マッシング操作
100%ひきわりトウモロコシ(Nordgetreide GmBH Luebec,ドイツ,Batch:01.11.2016.)でのマッシング操作において、水:グリスト比3.8:1を用いて、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼを試験した。
希釈された試料に対する発酵操作
発酵に十分な量の麦汁を提供した実施例7に記載のように、生成された麦汁試料(>100mL)を2.5M硫酸でpH5.2に調整し、Hopfenveredlung,St.Johannから入手したビターホップのペレット:α含有率16,0%(EBC 7.7 0特異的HPLC分析,01.10.2013)を各フラスコに添加した(合計210g)。麦汁試料を煮沸浴で60分間煮沸し、麦汁を17℃に冷却し、濾過した。各麦汁100gを発酵用の500mL三角フラスコに計量し、17℃の麦汁に新たに生成された酵母(0.50g)0.5% W34/70(Weihenstephan)を添加した。酵母を添加した後に、麦汁試料を18℃及び150rpmにて発酵させた。発酵が完了した時に分析を実施した。
麦汁生成のためのマッシング操作
100%ひきわりトウモロコシ(Nordgetreide GmBH Luebec,ドイツ,Batch:01.11.2016)でのマッシング操作において、水:グリスト比3.8:1を用いて、αアミラーゼ、マルトジェニックαアミラーゼ及びグルコアミラーゼをすべて試験した。
Claims (53)
- 100%副原料醸造のマッシング方法であって、
a.)副原料を含むグリストを提供する工程;及び
b.)αアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び/又はグルコアミラーゼと、前記グリストを接触させて、麦汁を生成する工程;
を含む方法。 - 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項3に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項4に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1による配列を有する酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2による配列を有する酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項12に記載の方法。
- 前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項13に記載の方法。
- 前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記グルコアミラーゼが配列番号3による配列を有する酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程b.)において、前記グリストをαアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼと接触させる、請求項1に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項17に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有し、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項20に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1による配列を有する酵素を含み、且つ前記マルトジェニックαアミラーゼが、配列番号2による配列を有する酵素を含む、請求項21に記載の方法。
- 工程b.)において、前記グリストをαアミラーゼ及びグルコアミラーゼと接触させる、請求項1に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも70%の配列同一性を有し、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項23に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有し、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項24に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項25に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1と少なくとも95%の配列同一性を有し、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号3と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記αアミラーゼが、配列番号1による配列を有する酵素を含み、且つ前記グルコアミラーゼが、配列番号3による配列を有する酵素を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記グリストが、トウモロコシ、コメ、モロコシ及びカッサバ又はその混合物からなる群から選択される、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グリストが、モロコシを少なくとも10%含む、請求項29に記載の方法。
- 前記グリストが、モロコシを少なくとも25%含む、請求項30に記載の方法。
- 前記グリストが、モロコシを少なくとも50%含む、請求項31に記載の方法。
- 前記グリストが、モロコシを少なくとも75%含む、請求項32に記載の方法。
- 前記グリストが、モロコシを100%含む、請求項33に記載の方法。
- 前記グリストが、トウモロコシを少なくとも10%含む、請求項29に記載の方法。
- 前記グリストが、トウモロコシを少なくとも25%含む、請求項35に記載の方法。
- 前記グリストが、トウモロコシを少なくとも50%含む、請求項36に記載の方法。
- 前記グリストが、トウモロコシを少なくとも75%含む、請求項37に記載の方法。
- 前記グリストが、トウモロコシを100%含む、請求項38に記載の方法。
- 前記グリストが、コメを少なくとも10%含む、請求項29に記載の方法。
- 前記グリストが、コメを少なくとも25%含む、請求項35に記載の方法。
- 前記グリストが、コメを少なくとも50%含む、請求項36に記載の方法。
- 前記グリストが、コメを少なくとも75%含む、請求項37に記載の方法。
- 前記グリストが、コメを100%含む、請求項38に記載の方法。
- 前記グリストが、カッサバを少なくとも10%含む、請求項29に記載の方法。
- 前記グリストが、カッサバを少なくとも25%含む、請求項35に記載の方法。
- 前記グリストが、カッサバを少なくとも50%含む、請求項36に記載の方法。
- 前記グリストが、カッサバを少なくとも75%含む、請求項37に記載の方法。
- 前記グリストが、カッサバを100%含む、請求項38に記載の方法。
- 前記麦汁がビールへと転化される、請求項1から49のいずれか一項に記載の方法。
- 醸造におけるαアミラーゼと、マルトジェニックαアミラーゼ及び/又はグルコアミラーゼと、の使用。
- αアミラーゼ及びマルトジェニックαアミラーゼを含む酵素組成物。
- αアミラーゼ及びグルコアミラーゼを含む酵素組成物。
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