CN113543656A - 用于在辅助酿造中浸出糖化的酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使100％辅助谷物淀粉糖化的方法。更具体地，本公开提供了方法和组合物，其中将α淀粉酶与生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶组合以制备由辅助原料组成的无麦芽的麦芽汁。

Description

用于在辅助酿造中浸出糖化的酶
技术领域
本发明涉及使辅助谷物淀粉糖化的方法。更具体地，本公开提供了方法和组合物，其中在酿造中采用α淀粉酶与生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的组合以提供由辅助原料组成的无麦芽的麦芽汁。
背景技术
酿造通常涉及三个步骤：麦芽制造、淀粉糖化和发酵。麦芽制造步骤的主要目的是开发酶，这些酶在酿造过程期间对淀粉和蛋白质降解具有后续作用。尽管传统上啤酒只从大麦麦芽、啤酒花和水酿造；但是麦芽是一种昂贵的原料，因为它需要优质的谷物、用于发芽的水和用于烘干的能量。为了降低原料的成本，酿造过程中可能包括未发芽的谷物，也称为辅料，例如玉蜀黍、稻、木薯、小麦、大麦、黑麦、燕麦、藜麦和高粱。主要使用辅料是因为它们容易获得，并且以比大麦麦芽更低的成本提供可发酵碳水化合物。
在酿造中使用辅料会使传统酿造过程复杂化。典型地，辅料必须在“谷物蒸煮器”中单独处理以液化淀粉。因此，尽管使用辅料降低了原料的总成本，但是它需要在谷物蒸煮器方面进行额外的投资，以及用于加热和处理辅料以释放出可发酵糖的额外的成本。为了减少这些额外的成本，酿造者倾向于使用低的辅料比率(即辅料与麦芽的比率)。
持续需要将辅料用于啤酒生产且无需使用谷物蒸煮器的方法。
发明内容
根据本发明的一个方面，提出了一种用于100％辅助酿造的淀粉糖化的方法，所述方法具有以下步骤：a.)提供包含辅料的谷物；以及b.)使所述谷物与α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶接触，以制成麦芽汁。
任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶。
任选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性。任选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。任选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。任选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ IDNO:2具有至少95％序列同一性。任选地，所述生麦芽糖α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:2所述的序列的酶。
任选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。任选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。任选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ IDNO:3具有至少90％序列同一性。任选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。任选地，所述葡糖淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:3所述的序列的酶。
在本发明的一个方面，使所述谷物与α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶接触。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ IDNO:2具有至少70％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶，并且所述生麦芽糖α淀粉酶是具有根据SEQID NO:2所述的序列的酶。
在本发明的另一个方面，使所述谷物与α淀粉酶和葡糖淀粉酶接触。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ IDNO:1具有至少90％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。任选地，所述α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶，并且所述葡糖淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:3所述的序列的酶。
任选地，所述谷物选自由以下组成的组：玉米、稻、高粱和木薯或其混合物。任选地，所述谷物是至少10％高粱。任选地，所述谷物是至少25％高粱。任选地，所述谷物是至少50％高粱。任选地，所述谷物是至少75％高粱。任选地，所述谷物是100％高粱。
在本发明的其他方面，所述谷物是至少10％玉米。任选地，所述谷物是至少25％玉米。任选地，所述谷物是至少50％玉米。任选地，所述谷物是至少75％玉米。任选地，所述谷物是100％玉米。
在另一个方面，所述谷物是至少10％稻。任选地，所述谷物是至少25％稻。任选地，所述谷物是至少50％稻。任选地，所述谷物是至少75％稻。任选地，所述谷物是100％稻。
在其他方面，所述谷物是至少10％木薯。任选地，所述谷物是至少25％木薯。任选地，所述谷物是至少50％木薯。任选地，所述谷物是至少75％木薯。任选地，所述谷物是100％木薯。
任选地，将所述麦芽汁转化为啤酒。
在本发明的一个方面，提供了α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在酿造中的用途。
在本发明的另一个方面，提供了具有α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶的酶组合物。
在本发明的又另一个方面，提供了具有α淀粉酶和葡糖淀粉酶的酶组合物。
生物学序列简述
SEQ ID NO:1列出了来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)GsAA1的α淀粉酶变体的成熟氨基酸序列。
SEQ ID NO:2列出了来自嗜热脂肪土芽孢杆菌GsAA2的生麦芽糖α淀粉酶的成熟氨基酸序列。
SEQ ID NO:3列出了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡糖淀粉酶的成熟氨基酸序列。
具体实施方式
除非另有说明，否则本发明教导的实践将使用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。此类技术在以下文献中得到充分解释，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook等人,1989)；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编辑,1984；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学当前方案](F.M.Ausubel等人,编辑,1994)；PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应](Mullis等人,编辑,1994)；Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表 达：实验室手册](Kriegler,1990)，和The Alcohol Textbook[醇教科书](Ingledew等人,编辑,第五版,2009)，以及Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry [碳水化合物化学与生物化学基础](Lindhorste,2007)。
除非在本文中另有定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本发明教导所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology [微生物学和分子生物学词典]，第二版,JohnWiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约(1991)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料可用于本发明教导的实践或测试中。
本文提供的数值范围包括限定所述范围的数值在内。
定义：
关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参比”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参比”是指不包含人为核苷酸变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参比多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参比多肽的任何多核苷酸。
对野生型多肽的提及应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中不存在信号序列的多肽或变体，例如，在多肽表达期间或之后从未成熟形式的多肽切割。
关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人为的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的特性将从上下文中显而易见。
当关于主题细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”指示受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或以不同于自然界发现的水平或在不同于自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列不同在于一个或多个核苷酸，和/或有效地连接到异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白质与天然序列的不同可在于一个或多个氨基酸，和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。
术语“回收的”、“分离的”和“单独的”是指从如天然存在的与其天然相关的至少一种其他材料或组分中除去的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或者其他指定材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养液。
术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。
术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则核酸序列以5′-至-3′取向呈现。
关于细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指细胞含有整合到其基因组中或作为通过多代维系的附加体的非天然(例如异源)核酸序列。
在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指不是天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。
“选择性标记”或“可选择标记”是指能够在宿主中被表达以促进选择携带所述基因的宿主细胞的基因。可选择标记的实例包括但不限于在宿主细胞上赋予代谢优势(如营养优势)的抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。
“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够在适合的宿主中影响DNA表达的适合控制序列有效地连接。此类控制序列可以包括影响转录的启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
术语“有效地连接”意指：指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并列)。例如，调控序列与编码序列有效地连接，使得编码序列的表达受调控序列的控制。
“信号序列”是与蛋白质的N-末端部分附接的氨基酸序列，所述氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外的蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。
“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。
术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。
如本文所使用的，“序列同一性百分比”意指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，特定序列具有与指定的参比序列中的氨基酸残基相同的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTALW算法的默认参数是：
Figure BDA0003123994000000081
与参比序列相比，缺失被视为不同一的残基。包括在任一末端发生的缺失。例如，相对于成熟多肽，具有成熟617残基多肽的C-末端的五个氨基酸缺失的变体将具有99％序列同一性百分比(612/617相同的残基×100，四舍五入到最接近的整数)。此类变体将被与成熟多肽具有“至少99％序列同一性”的变体所涵盖。
“融合”多肽序列通过两个受试多肽序列之间的肽键连接，即有效地连接。
术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)，特别是子囊菌亚门(Pezizomycotina)物种。
术语“约”是指参考值的±5％。
额外的突变
在一些实施例中，本发明的淀粉酶进一步包括可提供另外的性能或稳定性益处的一个或多个突变。示例性的性能益处包括但不限于：增加的热稳定性、增加的储存稳定性、增加的溶解度、改变的pH曲线、增加的比活性、经修饰的底物特异性、经修饰的底物结合、经修饰的pH依赖性活性、经修饰的pH依赖性稳定性、增加的氧化稳定性、和增加的表达。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。
此外，本发明的淀粉酶可以包含任何数量的保守氨基酸取代。下表中列出了示例性保守氨基酸取代。
保守氨基酸取代
Figure BDA0003123994000000091
Figure BDA0003123994000000101
读者将理解，一些前述保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用遗传或其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。
本发明的淀粉酶可以是“前体”、“未成熟”或“全长”的，在这种情况下，它们包含信号序列；或“成熟”的，在这种情况下，它们缺乏信号序列。成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，否则本文使用的氨基酸残基编号是指相应淀粉酶多肽的成熟形式。只要所得的多肽保留淀粉酶活性，本发明的淀粉酶多肽也可被截短以除去N或C-末端。
本发明的淀粉酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括第一淀粉酶多肽的至少一部分和第二淀粉酶多肽的至少一部分。本发明的淀粉酶可进一步包含异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)、和链霉菌属(Streptomyces)CelA。
淀粉酶的产生
本发明的淀粉酶可以在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达。在将淀粉酶分泌到细胞培养基中后，可以获得包含淀粉酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，淀粉酶可以从宿主细胞中分离，或甚至从细胞培养液中分离，这取决于最终淀粉酶所需的纯度。可以根据本领域熟知的方法克隆和表达编码脯氨酸特异性淀粉酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，以及链霉菌属(Streptomyces)和大肠杆菌(E.Coli)。
宿主细胞还可以表达编码与宿主细胞不同物种的同源或异源淀粉酶或一种或多种其他酶的核酸。所述淀粉酶可以是变体淀粉酶。另外，宿主可以表达一种或多种辅酶、蛋白质、肽。
载体
可以构建包含编码淀粉酶的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中表达。由于遗传密码中熟知的简并性，编码相同氨基酸序列的变体多核苷酸可以用常规技术进行设计和制备。优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域熟知的。可以将编码淀粉酶的核酸掺入载体。可以使用熟知的转化技术(例如以下公开的那些)将载体转移至宿主细胞中。
载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如，包含编码淀粉酶的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到表达宿主中，使得编码核酸可以被表达为功能性淀粉酶。用作表达宿主的宿主细胞可以包括，例如，丝状真菌。
可以将编码淀粉酶的核酸有效地连接到适合的启动子，其允许在宿主细胞中转录。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。用于指导编码淀粉酶的DNA序列的转录(特别是在细菌宿主中)的示例性启动子是大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是衍生自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米氏根瘤菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米氏根瘤菌脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉三糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当编码淀粉酶的基因在细菌物种(如大肠杆菌)中表达时，可以从，例如，包括T7启动子和噬菌体λ启动子的噬菌体启动子中选择适合的启动子。用于在酵母物种中表达的适合的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子以及毕赤酵母(Pichiapastoris)AOX1或AOX2启动子。cbh1是来自里氏木霉(T.reesei)的内源诱导型启动子。参见Liu等人(2008)“Improved heterologous gene expression in Trichoderma reesei bycellobiohydrolase I gene(cbh1)promoter optimization[纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子优化改善里氏木霉中的异源基因表达],”Acta Biochim.Biophys.Sin(Shanghai)[生物化学与生物物理学报(上海)]40(2):158-65。
编码序列可以有效地连接到信号序列。编码信号序列的DNA可以是与待表达的淀粉酶基因天然相关或来自不同属或物种的DNA序列。可以将包含DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列引入真菌宿主细胞，并且可以来源于相同的来源。例如，信号序列是有效地连接到cbh1启动子的cbh1信号序列。
表达载体还可以包含合适的转录终止子，以及在真核生物中，包含有效地连接到编码变体淀粉酶的DNA序列的聚腺苷酸化序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地来源于与启动子相同的来源。
所述载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、和pIJ702的复制起点。
载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可以包含曲霉属选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC，引起潮霉素抗性的标记，或者选择可以通过共转化(如本领域已知的)实现。参见，例如，国际PCT申请WO 91/17243。
细胞内表达在某些方面可能是有利的，例如，当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞产生大量淀粉酶用于随后的富集或纯化时。淀粉酶的细胞外分泌至培养基中可用于制备包含分离的淀粉酶的培养的细胞材料。
表达载体典型地包括克隆载体的组分，例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体通常包含控制核苷酸序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因或一个或多个激活子基因。另外，表达载体可包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将淀粉酶靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样的靶向序列包括但不限于序列SKL。对于在控制序列的指导下进行表达，将淀粉酶的核酸序列以关于表达的适当方式与控制序列有效地连接。
用于分别连接编码淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，并将它们插入到含有复制所需信息的适合的载体中的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室],1989,和第3版,2001)。
宿主细胞的转化和培养
包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生淀粉酶的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一或多个拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便地用编码酶的DNA构建体转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定保持。可以根据常规方法，例如，通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
适合的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性细菌物种，如芽孢杆菌属(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(原嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)物种，如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。可替代地，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种作为宿主生物。
适合的酵母宿主生物可以选自生物技术相关的酵母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种或者酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或者属于裂殖酵母属的物种，例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe)。甲基营养型酵母物种菌种毕赤酵母可以用作宿主生物。可替代地，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适合的宿主生物包括曲霉属(Aspergillus)的物种，例如，黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。可替代地，镰刀菌属(Fusarium)物种(例如，尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum))或根瘤菌属(Rhizomucor)物种(如米氏根瘤菌)的菌种可以用作宿主生物。其他适合的菌株包括嗜热菌属(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。此外，木霉属物种可以用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的适合的程序包括，例如，EP 238023中描述的程序。真菌宿主细胞表达的淀粉酶可以被糖基化，即将包含糖基部分。糖基化模式可以与野生型淀粉酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可能改变酶和/或生化特性。
从表达宿主缺失基因是有利的，其中可以通过转化的表达载体治愈基因缺陷。已知方法可用于获得具有一种或多种失活基因的真菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。已克隆的、来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的基因可以缺失，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。基因缺失可通过本领域已知方法通过将待失活的所需基因的形式插入质粒中来完成。
将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括以下技术，例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导的和DEAE-糊精介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；以及原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见，例如Sambrook等人(2001)，同上。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725。对于曲霉属菌种的转化，还参考了Cao等人(2000)Science[科学]9:991-1001。可以用载体系统构建遗传稳定的转化体，由此编码淀粉酶的核酸被稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择并纯化转化体。
表达
产生淀粉酶的方法可以包括在有利于产生所述酶的条件下如上所述培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收所述酶。
用于培养细胞的培养基可以是适合于所考虑的宿主细胞生长并获得淀粉酶表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。
从宿主细胞中分泌的酶可以用于全培养液制剂中。在本发明的方法中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致淀粉酶的表达。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和允许淀粉酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
从宿主细胞中分泌的酶可方便地通过熟知的程序从培养基中回收，所述程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，并借助于盐(例如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，然后使用色谱程序，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等。
可以将在载体中编码淀粉酶的多核苷酸有效地连接到控制序列，所述控制序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达，即所述载体是表达载体。可以例如通过添加其他转录调控元件来修饰控制序列，以使由控制序列指导的转录水平对转录调节因子更有应答。控制序列尤其可以包含启动子。
宿主细胞可以在允许表达淀粉酶的合适条件下培养。所述酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖来启动蛋白质生产。多肽也可以在体外无细胞系统(例如TNTTM(普洛麦格公司(Promega))兔网织红细胞系统)中重组生产。
富集和纯化淀粉酶的方法
发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备含淀粉酶多肽的溶液。
发酵后，获得发酵肉汤，通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。
期望浓缩含淀粉酶多肽的溶液以优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加孵育时间以收集富集或纯化的酶沉淀物。
使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直至获得所需的酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转鼓式真空过滤和/或超滤。
本发明的优选实施例
根据本发明的一个方面，已经发现，具有高糊化温度的辅助淀粉可以通过α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶的组合，以比传统上用于此类淀粉类型低的处理温度而有效地液化和糖化，从而制成本文所述和要求保护的可发酵麦芽汁。因此，在所谓的浸渍法中，可以在没有内源麦芽酶，并且(优选地)没有先前糊化的情况下，处理辅料，例如玉米谷物、玉米淀粉、稻淀粉、高粱淀粉或木薯等淀粉来源。此类辅助淀粉的液化和糖化要求醪液由外源提供的酶组合物补充。这些淀粉辅料通常特征在于高糊化温度，包括高起始糊化温度。令人惊讶地，酶的正确组合可以使所述淀粉材料高度淀粉溶解/液化和糖化，使得在温度升高的过程期间提取的淀粉逐渐水解成可发酵糖和更小的糊精。优选地，最终的醪液是对碘测试阴性的淀粉，也与所得麦芽汁中的高提取物值相关。为了实现通过酵母发酵将所述糖适当地转化为乙醇，DP4+糊精的比例应优选小于可溶性糖总量的30％，或者甚至更优选小于可溶性糖总量的25％。淀粉糖化是通过在70℃或更高(优选至少80℃)的温度下煮浆(mashing-off)来完成的。
SEQ ID NO:1列出了来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)GsAA1的α淀粉酶变体的成熟氨基酸序列。
SEQ ID NO:2列出了来自嗜热脂肪土芽孢杆菌GsAA2的生麦芽糖α淀粉酶的成熟氨基酸序列。
SEQ ID NO:3列出了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡糖淀粉酶的成熟氨基酸序列。
Figure BDA0003123994000000181
Figure BDA0003123994000000191
根据本发明的一个方面，提出了一种用于100％辅助酿造的淀粉糖化的方法，所述方法具有以下步骤：a.)提供包含辅料的谷物；以及b.)使所述谷物与α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶接触，以制成麦芽汁。
优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性。更优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性。仍更优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。在又更优选的方面，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性。在最优选的方面，所述α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶。
优选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性。更优选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。仍更优选地，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。在又更优选的实施例中，所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性。在最优选的实施例中，所述生麦芽糖α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:2所述的序列的酶。
优选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。更优选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。仍更优选地，所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性。在又更优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶与SEQ IDNO:3具有至少95％序列同一性。在最优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶是具有根据SEQ IDNO:3所述的序列的酶。
在本发明的优选的方面，使所述谷物与α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶接触。优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQID NO:2具有至少70％序列同一性。更优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。仍更优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。在又更优选的实施例中，所述α淀粉酶与SEQ IDNO:1具有至少95％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性。在最优选的实施例中，所述α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶，并且所述生麦芽糖α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:2所述的序列的酶。
在本发明的另一个优选的实施例中，使所述谷物与α淀粉酶和葡糖淀粉酶接触。优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQID NO:3具有至少70％序列同一性。更优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。仍更优选地，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性。在又更优选的实施例中，所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。在最优选的实施例中，所述α淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶，并且所述葡糖淀粉酶是具有根据SEQ ID NO:3所述的序列的酶。
优选地，所述谷物选自由以下组成的组：玉米、稻、高粱和木薯或其混合物。更优选地，所述谷物是至少10％高粱。更优选地，所述谷物是至少25％高粱。仍更优选地，所述谷物是至少50％高粱。在又更优选的实施例中，所述谷物是至少75％高粱。在最优选的实施例中，所述谷物是100％高粱。
在其他优选的实施例中，所述谷物是至少10％玉米。更优选地，所述谷物是至少25％玉米。仍更优选地，所述谷物是至少50％玉米。在又更优选的实施例中，所述谷物是至少75％玉米。在最优选的实施例中，所述谷物是100％玉米。
在其他优选的实施例中，所述谷物是至少10％稻。更优选地，所述谷物是至少25％稻。仍更优选地，所述谷物是至少50％稻。在又更优选的实施例中，所述谷物是至少75％稻。在最优选的实施例中，所述谷物是100％稻。
在其他优选的实施例中，所述谷物是至少10％木薯。更优选地，所述谷物是至少25％木薯。仍更优选地，所述谷物是至少50％木薯。在又更优选的实施例中，所述谷物是至少75％木薯。在最优选的实施例中，所述谷物是100％木薯。
优选地，将所述麦芽汁转化为啤酒。
在本发明的一个方面，提供了α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在酿造中的用途。
在本发明的另一个方面，提供了具有α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶的酶组合物。
在本发明的又另一个方面，提供了具有α淀粉酶和葡糖淀粉酶的酶组合物。
提供下列实例以说明但不限制所要求保护的公开内容。
实例
实例1-酶
GsAA1：来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的α淀粉酶变体，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
GsAA2：来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的生麦芽糖α淀粉酶，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
TrGA：来自里氏木霉的葡糖淀粉酶，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
作为α淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司(DuPont)的
Figure BDA0003123994000000221
5T(A 5T)。作为生麦芽糖α淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司的
Figure BDA0003123994000000222
MA(D MA)。作为葡糖淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司的
Figure BDA0003123994000000223
TGA(D TGA)。
实例2-蛋白质测定方法
通过Stain Free Imager Criterion进行蛋白质测定
使用Gel DocTMEZ成像系统通过SDS-PAGE凝胶和光密度法量化蛋白质。测定中使用的试剂：浓缩的(2x)Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号161-0737)；26孔XT4-12％Bis-Tris凝胶(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号345-0125)；蛋白质标记“精密加蛋白质标准(Precision Plus Protein Standards)”(伯乐公司(Bio-Rad)，目录号161-0363)；蛋白质标准BSA(赛默科技公司(Thermo Scientific)，目录号23208)和SimplyBlueSafestain(英杰公司(Invitrogen)，目录号LC 6060)。如下进行测定：在96孔PCR板中，将50μL经稀释的酶样品与含有2.7mg DTT的50μL样品缓冲液混合。将板用来自伯乐公司(Bio-Rad)的Microseal‘B’膜密封并放入PCR机器中加热至70℃持续10分钟。之后，通过运行缓冲液填充腔室，设置凝胶盒。然后将10μL的各个样品和标准品(0.125-1.00mg/mL BSA)装在凝胶上，并装入5μL的标记物。之后，将电泳在200V下运行45min。电泳后，将凝胶在水中漂洗3次5min，然后在Safestain中染色过夜，并最后在水中脱色。然后，将凝胶转移到成像仪中。使用Image Lab软件来计算每个条带的强度。使用BSA(赛默科技公司(ThermoScientific)，目录号23208)制作校准曲线。通过条带强度和校准曲线来确定靶蛋白的量。采用蛋白质定量方法来制备用于随后实例的酶样品。
实例3-通过HPLC的糖分析
所有标准：在双蒸水(ddH20)中制备葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖，并且通过0.45μm注射器式过滤器过滤。制备了浓度范围从10至100,000ppm的每种标准品系列。
将含有活性酶的所有麦芽汁样品通过将样品加热至95℃持续10min来失活。随后在96孔MTP板(康宁公司(Corning)，纽约州，美国)中制备麦芽汁样品，并且在ddH20中稀释至少4次，并且在分析前通过0.20μm 96孔板式过滤器过滤(康宁过滤板，PVDF亲水膜，纽约州，美国)。所有样品均一式两份进行分析。
仪器
糖的定量：通过UPLC进行DP1、DP2、DP3、DP4和DP5+。样品分析在装备有DGP-3600SD双梯度分析泵、WPS-3000TSL恒温自动进样器、TCC-3000SD恒温柱温箱和RI-101折光率检测器(昭和公司(Shodex)，JM科学公司(JM Science))的Dionex Ultimate 3000UPLC系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))上进行。使用Chromeleon数据系统软件(6.80版，DU10A Build 2826，171948)进行数据采集和分析。
色谱条件
使用装备有在70℃操作的分析保护柱(Carbo-Ag+中性，AJ0-4491，菲罗门公司(Phenomenex)，荷兰)的RSO寡糖柱(Ag+4％交联的(菲罗门公司，荷兰))分析样品。以0.3ml/min的流速用双蒸水(通过0.45μm的再生纤维素膜过滤并用氦气吹扫)洗脱柱。在整个分析中保持0.3ml/min的等度流速，总运行时间为45min，并且注射体积设定为10μL。将样品保持在20℃恒温自动进样器隔室中。通过折光率检测器(RI-101，昭和公司，JM科学公司)监测洗脱液，并且通过相对于给定标准品(DP1：葡萄糖；DP2：麦芽糖；DP3：麦芽三糖，和具有四度或更高度麦芽四糖的峰用作标准品)的峰面积的峰面积进行定量。
实例4-使用酶对玉米、稻、高粱和木薯进行低温浸出糖化以获得提取物和可发酵糖
此实例的目的是证明与仅具有一种释放可发酵糖的酶相比，在浸渍法(单个容器)的辅料处理期间存在两种酶(生麦芽糖α淀粉酶或葡糖淀粉酶和α淀粉酶)的益处(可发酵糖和提取物释放)。
在用于麦芽汁生产的淀粉糖化操作模型系统中测试了酶，其中使用玉米谷物(Nordgetreide GmBH Lübec，德国)、稻谷物(柬埔寨，湄公河亚洲市场(MEKONG AsianMarket)，达格罗布拉勃朗(Dagrofa Brabrand))、高粱(白色未研磨高粱-帝亚吉欧公司(Diageo)，爱尔兰)和木薯粉(乌干达)，并且水与谷物的固定比率为4:1。在布勒公司(Buhler Miag)麦芽研磨机上以0.5mm设置研磨稻谷物，并且以1.6mm设置研磨高粱。
用于麦芽汁生产的淀粉糖化操作
将玉蜀黍谷物(3.0g)、稻谷物(研磨的3.0g)、高粱(3.0g)或木薯粉(3.0g)在wheaton杯(带盖的玻璃容器)中混合，在64℃用12.0g自来水预孵育，用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4。基于根据实例2确定的mg蛋白(总计0.5mL)添加酶，并且添加水作为无酶对照。除了添加GsAA1、GsAA2和TrGA以外，还使用固定浓度的0.5mg/g谷物
Figure BDA0003123994000000251
750(杜邦公司)来确保可滤性(B-葡聚糖酶)(这对可发酵糖的释放没有影响)。将wheaton杯置于Drybath(赛默科技公司主工作台(Thermo Scientific Stem station))中，磁力搅拌并且应用以下淀粉糖化程序；将样品保持在64℃持续60分钟；加热至在80℃持续10分钟；并且最后在80℃煮浆55分钟。将15ml样品转移至Falcon管中，并且通过在10℃、在HeraeusMultifuge X3R中以4500rpm离心20分钟，将麦糟与麦芽汁分离。通过手持式柏拉图(Plato)折射仪(PAL-PLATO，爱宕株式会社(Atago)，东京)测量提取物。将所有样品在H2O中10x稀释，并且在水浴中煮沸20分钟以灭活酶。如实例3中所述，收集上清液并且过滤(0.2μm)，用于HPLC糖分析。
表1至表4分别示出了使用玉米、稻、高粱和木薯的结果。与不使用酶(对所有辅料类型而言均为不可处理的(n.p.))或单独使用生麦芽糖α淀粉酶或葡糖淀粉酶(显著降低)相比，观察到添加内切作用α-淀粉酶会增加麦芽汁的提取物。在当前实例中，通过按给定顺序添加TrGA、GsAA2和GsAA1，麦芽汁中剩余的不可发酵糖的量减少。因此，通过GsAA2和TrGA获得不可发酵糖(DP4+)的最大减少，并且对于一些辅料，其单独与GsAA1一起观察到累加效果。总之，具有高提取物(>15°P)和高度的可发酵糖(<30％DP4+)的浸出麦芽汁与通过添加内切作用α淀粉酶(GsAA1)和生麦芽糖α淀粉酶(GsAA2)或内切作用α淀粉酶(GsAA1)和葡糖淀粉酶(TrGA)产生的原料类型(玉米、稻、高粱和木薯)无关。
表6中示出了使用原料的共混物(50％高粱和50％玉米；50％高粱和50％稻；50％稻和50％玉米)的结果。与在浸出糖化中从单个原料生产麦芽汁相比，在实现高提取物(>15°P)和高度的可发酵糖(<30％DP4+)方面观察到了酶的类似作用。
表1 100％玉米辅料。麦芽汁不可发酵糖(总糖的DP4+％)和以柏拉图度计的麦芽汁提取物。α淀粉酶(GsAA1)、生麦芽糖α淀粉酶(GsAA2)和葡糖淀粉酶(TrGA)的剂量(以蛋白质mg/g DM谷物的量给出)。
Figure BDA0003123994000000261
表2 100％稻辅料。麦芽汁不可发酵糖(总糖的DP4+％)和以柏拉图度计的麦芽汁提取物。α淀粉酶(GsAA1)、生麦芽糖α淀粉酶(GsAA2)和葡糖淀粉酶(TrGA)的剂量(以蛋白质mg/g DM谷物的量给出)。
Figure BDA0003123994000000262
Figure BDA0003123994000000271
表3 100％高粱。麦芽汁不可发酵糖(总糖的DP4+％)和以柏拉图度计的麦芽汁提取物。α淀粉酶(GsAA1)、生麦芽糖α淀粉酶(GsAA2)和葡糖淀粉酶(TrGA)的剂量(以蛋白质mg/g DM谷物的量给出)。
Figure BDA0003123994000000272
表4 100％木薯。麦芽汁不可发酵糖(总糖的DP4+％)和以柏拉图度计的麦芽汁提取物。α淀粉酶(GsAA1)、生麦芽糖α淀粉酶(GsAA2)和葡糖淀粉酶(TrGA)的剂量(以蛋白质mg/g DM谷物的量给出)。
Figure BDA0003123994000000281
表5 50％高粱-50％玉米和50％高粱-50％稻和50％稻-50％玉米。麦芽汁不可发酵糖(总糖的DP4+％)和以柏拉图度计的麦芽汁提取物。α淀粉酶(GsAA1)、生麦芽糖α淀粉酶(GsAA2)和葡糖淀粉酶(TrGA)的剂量(以蛋白质的量给出)。
Figure BDA0003123994000000282
Figure BDA0003123994000000291
实例5-α淀粉酶、生麦芽糖α淀粉酶和葡糖淀粉酶用于麦芽汁生产的应用
具有过滤的实验室规模的浸出糖化操作，用于麦芽汁生产
在淀粉糖化操作中测试了α淀粉酶、生麦芽糖α淀粉酶和葡糖淀粉酶，其中使用100％玉米谷物(Nordgetreide GmBH Lübec，德国；批次：01.11.2016.)，使用的水与谷物的比率为3.8:1。
按如下方式处理玉米辅料：将玉米谷物(70.0g)和自来水(263g)在淀粉糖化浴(Lockner，LG电子公司(LG-electronics))杯中混合，并且用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4。用程序将玉米辅料淀粉糖化；加热至63℃并且应用酶；在63℃保持76分钟，进行淀粉糖化和糖化；通过以2℃/分钟升高温度，加热至80℃，持续8.5分钟；在80℃保持35.5分钟，并且煮浆。
淀粉糖化结束时，将醪液用自来水补足至350克，并且将内容物分为麦芽汁和玉米糟。分离30分钟后，测量麦芽汁体积，并且分析不同溶解糖类型的提取物和分布，测量为DP1、DP2、DP3和DP4+的百分比。
测试了一种α淀粉酶(AA)、一种生麦芽糖α淀粉酶(MA)和一种葡糖淀粉酶(GA)。作为α淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司(DuPont)的
Figure BDA0003123994000000302
5T(A 5T)。作为生麦芽糖α淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司的
Figure BDA0003123994000000303
MA(D MA)。作为葡糖淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司的
Figure BDA0003123994000000304
TGA(D TGA)。测试了以下剂量和组合：无酶；
Figure BDA0003123994000000305
5T(2.5kg/t的玉米)；
Figure BDA0003123994000000306
MA(1.5kg/t的玉米)；
Figure BDA0003123994000000307
5T(2.5kg/t的玉米)和
Figure BDA00031239940000003010
MA(1.5kg/t的玉米)；
Figure BDA0003123994000000308
TGA(3.0kg/t的玉米)；
Figure BDA00031239940000003011
5T(2.5kg/t的玉米)和
Figure BDA0003123994000000309
TGA(3.0kg/t的玉米)，如表6中显示。
表6在用于麦芽汁生产的淀粉糖化期间，单独或组合使用的酶产品的浓度(以kg/t的玉米计)
Figure BDA0003123994000000301
麦芽汁分析：遵循杜邦公司标准酿造说明(Dupont Standard InstructionBrewing)23.8580-B11，在醪液分离30分钟后，测量每个样品的麦芽汁体积。简而言之，将样品通过装有滤纸(VWR公司，欧洲目录号516-0310，尺寸320mm，折叠定性滤纸，酿造厂等级(Brewery grade)307，中等过滤速率)的塑料漏斗过滤，所述滤纸放在250ml玻璃量筒的顶部，并且记录时间。30min后，测量通过过滤器进入玻璃量筒的液体量(滤液)。遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B28(基于EBC 8.3，麦芽汁提取物(Extract of Wort))，使用安东帕公司(Anton Paar)Lovis测量淀粉糖化后的初始提取物(OE)，麦芽汁样品中的提取物。遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B20(基于EBC 8.7，通过HPLC确定的麦芽汁中可发酵碳水化合物(Fermentable Carbohydrates in Wort by HPLC)(IM))，在淀粉糖化后通过HPLC确定可发酵糖(％总计+g/100mL)DP1、DP2、DP3和DP4+。
麦芽汁体积、提取物和可发酵糖的度数(表示为淀粉糖化期间，通过单独或组合应用不同的酶而释放的％DP1至DP3的总和)示于下表7中。
表7麦芽汁体积、麦芽汁提取物和相对浓度(以DP1至DP3总和的％计)。
Figure BDA0003123994000000311
从实现的麦芽汁的量(表7)可以看出，如果不应用任何外源酶或仅应用葡糖淀粉酶，不可能用给定的淀粉糖化方案处理100％玉米。为了实现可接受的麦芽汁和提取物的量，在淀粉糖化期间需要α淀粉酶。然而，如果仅应用α淀粉酶(内切作用)，则可发酵糖类型的相对浓度(由DP1至DP3总和表示)对于任何啤酒风格的可接受稀释而言都太低了。为了实现高百分比的DP1至DP3(可发酵糖)，α淀粉酶需要与生麦芽糖α淀粉酶或葡糖淀粉酶组合。
实例6-来自实例5的麦芽汁的实验室规模的可发酵性
用于稀释的样品的发酵操作
将如实例7中所述生产的、提供了足够量的麦芽汁用于发酵(>100mL)的麦芽汁样品用2.5M硫酸调节至pH 5.2，并且将一粒α含量(Alpha content)16.0％(EBC 7.7 0特定HPLC分析，01.10.2013)的苦啤酒花(Bitter hops)(来自Hopfenveredlung,St.Johann)添加至每个烧瓶中(总计210g)。将麦芽汁样品在沸腾浴中煮沸60分钟，并且将麦芽汁冷却至17℃并且过滤。将100g的每种麦芽汁称取到500mL锥形瓶中进行发酵，将0.5％W34/70(唯森啤酒(Weihenstephan))新鲜生产的酵母(0.50g)添加至17℃的麦芽汁中。酵母添加后，将麦芽汁样品在18℃和150rpm下发酵。在发酵结束时进行分析。
啤酒分析：遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B28(基于EBC 8.3，麦芽汁提取物)，使用安东帕公司DMA 5000测量RDF，并且通过杜邦公司标准酿造说明23.8580-B28(基于EBC 8.3，麦芽汁提取物)测量醇。
实际发酵度(RDF)值可根据下式计算：
Figure BDA0003123994000000321
其中：RE＝实际提取物＝(0.1808×°P初始)+(0.8192×°P最终)，°P初始是发酵前的标准化麦芽汁的比重，并且°P最终是以柏拉图度表示的发酵的麦芽汁的比重。
在本上下文中，从比重和醇浓度确定实际发酵度(RDF)。
使用Beer Alcolyzer Plus和DMA 5000密度计(都来自安东帕公司，格拉茨(Gratz)，澳大利亚)，针对发酵的样品确定比重和醇浓度。基于这些测量，实际发酵度(RDF)值根据下式计算：
Figure BDA0003123994000000322
其中：E(r)是以柏拉图度(°P)计的实际提取物，并且OE是以°P计的初始提取物。
遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B28(基于EBC 8.3，麦芽汁提取物)，使用安东帕公司DMA 5000测量淀粉糖化后的初始提取物(OE)，啤酒样品中的提取物。按体积计的醇(％V/V)遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B28(基于EBC 8.3，麦芽汁提取物)，使用安东帕公司DMA5000测量实现的按体积计的醇(ABV)。
在淀粉糖化期间与单独的生麦芽糖α淀粉酶或葡糖淀粉酶组合应用α淀粉酶，麦芽汁发酵后的实际发酵度(RDF)示于下表8中。
表8用单独的α淀粉或与生麦芽糖α淀粉酶或葡糖淀粉酶组合产生的麦芽汁发酵后的RDF。
100％玉米谷物 ％RDF
2.5A 5T 29,3
2.5A 5T+1.5D MA 60,8
2.5A 5T+3.0D TGA 64,5
获得的RDF值与所用麦芽汁中糖组成的分析相对应，因此麦芽汁中相对更高的DP1至DP3(可发酵)糖的含量导致发酵的更高％RDF值。与仅应用α淀粉酶相比，α淀粉酶和葡糖淀粉酶或α-淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶的组合显示出增加的RDF值。因此，α淀粉酶需要与生麦芽糖α淀粉酶或葡糖淀粉酶组合才能实现对于一些啤酒风格而言令人满意的稀释。
实例7-α淀粉酶、生麦芽糖α淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合用于麦芽汁生产的应用
用于麦芽汁生产的淀粉糖化操作
在淀粉糖化操作中测试了α淀粉酶、生麦芽糖α淀粉酶和葡糖淀粉酶，其中使用100％玉米谷物(Nordgetreide GmBH Lübec，德国；批次：01.11.2016.)，使用的水与谷物的比率为3.8:1。
按如下方式处理玉米辅料：将玉米谷物(70.0g)和自来水(263g)在淀粉糖化浴(Lockner，LG电子公司(LG-electronics))杯中混合，并且用2.5M硫酸将pH调节至pH 5.4。用程序将玉米辅料淀粉糖化；加热至63℃并且应用酶；在63℃保持60分钟，进行淀粉糖化和糖化；通过以1.5℃/分钟升高温度，加热至75℃，持续8分钟；在75℃保持20分钟；通过以1.5℃/分钟升高温度3分钟，加热至80℃，持续3分钟；在80℃保20分钟，并且然后煮浆。
淀粉糖化结束时，将醪液用自来水补足至350克，并且将内容物分为麦芽汁和玉米糟。分离30分钟后，测量麦芽汁体积，并且分析不同溶解糖类型的提取物和分布，测量为DP1、DP2、DP3和DP4+的百分比。
测试了一种α淀粉酶(AA)、一种生麦芽糖α淀粉酶(MA)和一种葡糖淀粉酶(GA)。在所有实验中，按0.5kg/吨的玉米应用
Figure BDA0003123994000000342
750，以确保适当的过滤，其中对于可发酵糖的分布没有显著影响。
作为α淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司(DuPont)的
Figure BDA0003123994000000343
5T(A 5T)。作为生麦芽糖α淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司的
Figure BDA0003123994000000344
MA(D MA)。作为葡糖淀粉酶的实例，使用来自杜邦公司的
Figure BDA0003123994000000345
TGA(D TGA)。使用的剂量和组合示于表9中。
表9在用于麦芽汁生产的淀粉糖化期间，单独或组合使用的酶产品的浓度(以kg/t的玉米计)
Figure BDA0003123994000000341
Figure BDA0003123994000000351
麦芽汁分析：遵循杜邦公司标准酿造说明(Dupont Standard InstructionBrewing)23.8580-B11，在醪液分离30分钟后，测量每个样品的麦芽汁体积。简而言之，将样品通过装有滤纸(VWR公司，欧洲目录号516-0310，尺寸320mm，折叠定性滤纸，酿造厂等级(Brewery grade)307，中等过滤速率)的塑料漏斗过滤，所述滤纸放在250ml玻璃量筒的顶部，并且记录时间。30min后，测量通过过滤器进入玻璃量筒的液体量(滤液)。遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B28(基于EBC 8.3，麦芽汁提取物)，使用安东帕公司Lovis测量淀粉糖化后的初始提取物(OE)，麦芽汁样品中的提取物。遵循杜邦公司标准酿造说明23.8580-B20(基于EBC 8.7，通过HPLC确定的麦芽汁中可发酵碳水化合物(FermentableCarbohydrates in Wort by HPLC)(IM))，在淀粉糖化后通过HPLC确定可发酵糖(％总计+g/100mL)DP1、DP2、DP3和DP4+。
麦芽汁体积、提取物和可发酵物的度数(表示为淀粉糖化期间，通过组合应用不同的酶而释放的％DP1至DP3的总和)示于下表10中。
表10麦芽汁体积、麦芽汁提取物和相对浓度(以DP1至DP3总和的％计)。
Figure BDA0003123994000000352
Figure BDA0003123994000000361
从分离后实现的麦芽汁的量(表10)可以看出，所有样品都可能用所应用的酶进行处理。与实例4和5相比，提取物降低，这可能是由于(内切作用)α淀粉酶的量降低。值得注意的是，如由高百分比的DP1至DP3(可发酵糖)所示，除了内切作用α淀粉酶以外，还可以将生麦芽糖α淀粉酶与葡糖淀粉酶组合。这些酶的组合均能实现良好的可滤性、高提取物和高度的可发酵糖。
虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述发明进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。此外，本文提供的每个参考文献出于所有目的通过引用以其全文并入，其程度如同每个参考文献通过引用单独并入一样。在任何引用文献(包括网站或登录号)可能会随时间而变化的范围内，意指在本申请的申请日有效的版本。除非从上下文另外可见，否则可以将任何步骤、要素、方面、特征实施例与任何其他组合使用。
Figure IDA0003267820420000011

Claims (53)

1.一种用于100％辅助酿造的淀粉糖化的方法，所述方法包括：
a.)提供包含辅料的谷物；以及
b.)使所述谷物与α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶接触，以制成麦芽汁。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述α淀粉酶包含具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生麦芽糖α淀粉酶包含具有根据SEQ ID NO:2所述的序列的酶。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶包含SEQ ID NO:3。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b.)中，使所述谷物与α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶接触。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性，并且所述生麦芽糖α淀粉酶与SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述α淀粉酶包含具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶，并且所述生麦芽糖α淀粉酶包含具有根据SEQ ID NO:2所述的序列的酶。
23.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b.)中，使所述谷物与α淀粉酶和葡糖淀粉酶接触。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述α淀粉酶与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性，并且所述葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述α淀粉酶包含具有根据SEQ ID NO:1所述的序列的酶，并且所述葡糖淀粉酶包含具有根据SEQ ID NO:3所述的序列的酶。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述谷物选自由以下组成的组：玉米、稻、高粱和木薯或其混合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述谷物包含至少10％高粱。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述谷物包含至少25％高粱。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述谷物包含至少50％高粱。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述谷物包含至少75％高粱。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述谷物包含100％高粱。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述谷物包含至少10％玉米。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述谷物包含至少25％玉米。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述谷物包含至少50％玉米。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述谷物包含至少75％玉米。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述谷物包含100％玉米。
40.根据权利要求29所述的方法，其中所述谷物包含至少10％稻。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述谷物包含至少25％稻。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述谷物包含至少50％稻。
43.根据权利要求37所述的方法，其中所述谷物包含至少75％稻。
44.根据权利要求38所述的方法，其中所述谷物包含100％稻。
45.根据权利要求29所述的方法，其中所述谷物包含至少10％木薯。
46.根据权利要求35所述的方法，其中所述谷物包含至少25％木薯。
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述谷物包含至少50％木薯。
48.根据权利要求37所述的方法，其中所述谷物包含至少75％木薯。
49.根据权利要求38所述的方法，其中所述谷物包含100％木薯。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述麦芽汁转化为啤酒。
51.α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶在酿造中的用途。
52.一种酶组合物，所述酶组合物包含α淀粉酶和生麦芽糖α淀粉酶。
53.一种酶组合物，所述酶组合物包含α淀粉酶和葡糖淀粉酶。
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