ES2539726T3

ES2539726T3 - Método de elaboración de cerveza

Info

Publication number: ES2539726T3
Application number: ES10775833.6T
Authority: ES
Inventors: Anne Mette Bhatia Frederiksen; Lars Beier; Stefan Kreisz
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2015-07-03
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: US20120225164A1; PL2499227T3; BR112012011106C8; WO2011058105A1; CN102639687A; EP2499227A1; BR112012011106B1; BR112012011106B8; DK2499227T3; BR112012011106A2; HUE026116T2; EP2499227B1; ZA201202726B

Abstract

Método de maceración que comprende: a) proporcionar una molienda que comprende malta y aditivo; y b) contactar la molienda con i) una pululanasa; ii) una alfa-amilasa; y iii) una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa para hacer un mosto.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de elaboración de cerveza

Campo de la invención 5

[0001] Esta invención se refiere a la elaboración de cerveza. Se refiere al uso de una combinación de una pululanasa, una alfa-amilasa y una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa para la elaboración de cerveza. También se refiere al uso de una alfa-amilasa maltogénica tolerante a la sacarosa para la elaboración de cerveza.

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Antecedentes de la invención

[0002] Los procesos de elaboración son conocidos en la técnica. Éstos implican los pasos de malteado, maceración y fermentación/maduración. Brevemente; durante el malteado, se permite que los granos germinen y luego se secan y opcionalmente se tuestan. El proceso de malteado causa la activación de varias enzimas en el grano que pueden 15 convertir el almidón en el grano en azúcar. Antes de la trituración, la malta se machaca para formar molienda, que se mezcla con agua para formar una malta remojada y luego se envía para la maceración. La maceración es el proceso de conversión del almidón en la malta remojada en azúcares fermentables y no fermentables. El proceso de maceración se conduce durante un periodo de tiempo a varias temperaturas para activar las enzimas endógenas responsables de la degradación de proteínas y carbohidratos. Las enzimas exógenas también pueden añadirse 20 durante el proceso de trituración para acelerar las reacciones y permitir un mejor control del proceso de elaboración. Hacia el final de la maceración, la temperatura se puede elevar hasta aproximadamente 75 °C (165-170 °F) (conocido como un trasvase). Después de la maceración, el líquido resultante es exprimido de los granos en un proceso conocido como filtración. El líquido resultante de la filtración se conoce como mosto. El mosto que es rico en azúcares es luego hervido con lúpulo, enfriado y entonces fermentado en etanol que usa levadura. La cerveza 25 resultante se acondiciona desde una semana hasta varios meses y luego se envasa.

[0003] Aunque tradicionalmente la cerveza ha sido elaborada sólo a partir de malta de cebada, lúpulos y agua; la malta es una materia prima costosa porque requiere granos de calidad superior, agua para la germinación y energía para el secado/tostado. Generalmente en la molienda también se incluyen alrededor del 25-30% de granos no 30 malteados, también llamados aditivos, tales como maíz, arroz, sorgo y trigo, almidón refinado o carbohidratos fácilmente fermentables tales como azúcar o jarabes. Los aditivos se usan principalmente porque están fácilmente disponibles y proporcionan carbohidratos a un coste inferior del que está disponible la malta de cebada. También se pueden conseguir otras ventajas, por ejemplo estabilidad física mejorada, calidades de refrigeración superiores y mejor brillantez. No obstante cuando se usan aditivos con temperaturas de gelatinización superiores, por ejemplo 35 maíz o arroz, deben cocinarse y gelatinizarse en un "horno de cereales" independiente antes de ser mezclados en la trituración de la malta antes de la sacarificación. Así, mientras el uso de aditivos reduce los costes de precio de las materias primas, requiere una inversión adicional en el horno de cereal al igual que un coste adicional de energía para el calentamiento del aditivo. Estos requisitos de coste adicional han desalentado a cerveceros a la hora de aumentar la proporción de aditivos y también usar diferentes aditivos de elección en su proceso de elaboración. 40

[0004] Últimamente, hay un cambio espectacular en los precios de las materias primas provocado por un aumento en la demanda de granos, la escasez de agua global, el cambio de modelos climáticos etc. Esto ha obligado a la industria cervecera a enfocarse en la eficiencia en la producción al igual que en el ahorro de materias primas.

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[0005] El documento WO 2007/113292 describe un proceso para la producción de mosto y cerveza a partir de una molienda de aditivo de almidón granulado macerada a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización de dicho almidón. El documento WO 2005/121305 describe un proceso para la producción de un mosto adecuado para la fermentación en una cerveza "baja en carbohidratos" o súper atenuada.

50

[0006] El documento WO 2004/011591 describe un proceso para la producción de mosto y cerveza a partir de molienda macerada a alta temperatura.

[0007] El documento US 5 082 781 describe la producción de una beta-amilasa termofílica obtenida de Clostridium thermosulfurogenes en gran escala, especialmente a partir de microorganismos genéticamente modificados, por 55 ejemplo, Bacillus subtilis.

[0008] Existe una necesidad de procesos mejorados en la elaboración que reduzca los costes y/o aumente la eficiencia de producción.

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Resumen de la invención

[0009] Los inventores han descubierto sorprendentemente que una combinación de una pululanasa, una alfa-amilasa y bien una alfa-amilasa maltogénica o una beta-amilasa o ambas puede resultar en rendimientos de producción mejorados. Facilita la inclusión de un porcentaje superior de aditivos durante la elaboración; mejora el 65 perfil de sacarificación y también da como resultado una cerveza esencialmente similar a la cerveza fermentada de

manera tradicional.

[0010] Los inventores también han descubierto sorprendentemente que cuando se usa tal combinación, hay mayores ahorros de energía debido a que los procesos pueden hacerse a una temperatura inferior y se puede prescindir del horneado del cereal. 5

[0011] Los inventores también han descubierto sorprendentemente que la eficiencia de producción aumenta y los costes disminuyen cuando la alfa-amilasa maltogénica también es tolerante a la sacarosa.

[0012] Así en un aspecto, la invención se refiere a un método de maceración que comprende: 10

a) proporcionar una molienda que comprende malta y aditivo; y

b) contactar la molienda con

i) una pululanasa;

ii) una alfa-amilasa; y 15

iii) una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa para hacer un mosto.

[0013] En un aspecto, el mosto se convierte en cerveza.

[0014] En un aspecto, la invención se refiere al uso de una pululanasa, una alfa-amilasa y una alfa-amilasa 20 maltogénica y/o una beta-amilasa en la elaboración.

[0015] En un aspecto, la amilasa maltogénica es una amilasa maltogénica con al menos el 70% de identidad a la SEC ID nº 1.

25

[0016] En otro aspecto, la alfa-amilasa tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 2.

[0017] En un aspecto, la pululanasa tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 3.

[0018] En un aspecto, la beta-amilasa tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 4. 30

[0019] En otro aspecto, la amilasa maltogénica tiene al menos un 10% más de tolerancia a la sacarosa que la amilasa denominada en la SEC ID nº 1.

[0020] En un aspecto, la amilasa maltogénica tiene sustituciones en posiciones específicas cuando se compara con 35 la amilasa denominada en la SEC ID nº 1.

[0021] En un aspecto, la pululanasa es termoestable.

[0022] En otro aspecto, la beta-amilasa es termoestable. 40

[0023] En un aspecto, la molienda comprende un 30-80% de malta y un 30-80% de aditivo.

[0024] En otro aspecto, el aditivo incluye aditivos que tienen una temperatura de gelatinización superior al almidón de malta, por ejemplo, pero no se limitan al maíz y arroz. 45

Descripción detallada de la invención

[0025] En un aspecto, la invención se refiere a un método de maceración que comprende:

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a) proporcionar una molienda que comprende malta y aditivo; y

b) contactar la molienda con

i) una pululanasa;

ii) una alfa-amilasa; y

iii) una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa para hacer un mosto. 55

[0026] El término "molienda" se entiende como el almidón o azúcar que contiene el material que es la base para la producción de cerveza, por ejemplo, pero no se limita a malta de cebada y el aditivo.

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[0027] El término "malta" se entiende como cualquier grano de cereal malteado, en particular, cebada.

[0028] El término "gelatinización de almidón" se entiende como la transición irreversible de trastorno del orden que sufre el almidón cuando se calienta en presencia de agua. La Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) en una técnica que se puede emplear para el estudio del proceso gradual de gelatinización de almidón que describe las 65 temperaturas inicial y de valor máximo (To & Tp) de gelatinización de almidón.

[0029] El término "temperatura de gelatinización inicial (To)" se entiende como la temperatura a la que empieza la gelatinización.

[0030] El término "temperatura de gelatinización de valor máximo (Tp)" se entiende como la temperatura a un valor máximo endotérmico. 5

[0031] El término "temperatura de gelatinización final (Tc)" se entiende como la temperatura a la que ha finalizado la gelatinización.

[0032] El término "aditivo" se entiende como esa parte de la molienda que no es malta. El aditivo puede ser cualquier 10 material vegetal rico en almidón tal como, pero no limitado a, maíz, arroz, sorgo y trigo. Los aditivos preferidos para la invención incluyen aditivos donde el almidón tiene una temperatura de gelatinización inicial, de valor máximo y final (To, Tp, Tc) más alta que la cebada o malta, de forma más preferible más de 5 °C superior al almidón de malta. Los aditivos se pueden gelatinizar antes de la maceración o se pueden añadir como tal a la molienda.

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[0033] En un aspecto, los aditivos no son gelatinizados antes de la maceración.

[0034] El término "malta remojada" se entiende como un almidón que contiene lodo de la molienda que comprende malta de cebada molida, grano no malteado molido, otro almidón que contiene material, o una combinación de los mismos, a remojo en el agua para hacer mosto. La "trituración" es el proceso de conversión del almidón en malta 20 remojada en azúcares fermentables y no fermentables.

[0035] El término "mosto" se entiende como el escurrido del licor no fermentado siguiente a la extracción de la molienda durante la maceración.

25

[0036] Una "alfa-amilasa maltogénica" se entiende como una enzima clasificada en EC 3.2.1.133. La actividad enzimática no requiere un final no-reducido en el sustrato y la actividad enzimática primaria produce la degradación de amilopectina y amilosa en maltosa y maltodextrinas más largas. Es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina en maltosa en la configuración alfa.

30

[0037] Como se utiliza por la presente el término "tolerancia a la sacarosa" se entiende como el % de actividad residual de alfa-amilasa de una enzima incubada durante 15 min a 60°C en un sistema tampón (pH 5,0) que comprende un 10% de sacarosa. El 100% de tolerancia a la sacarosa se define como la actividad residual de alfa-amilasa de una enzima obtenida cuando no se añade ninguna sacarosa al sistema de tampón.

35

[0038] Se puede usar maquinaria convencional, equipamientos y materiales durante la maceración. La molienda se mezcla con agua antes de la maceración. El agua, antes de ser añadida a la molienda, puede ser preferiblemente precalentada para que la malta remojada alcance la temperatura de malta remojada deseada en el momento de la formación de la malta remojada. Si la temperatura de la malta remojada formada es inferior a la temperatura de maceración deseada, preferiblemente se suministra calor adicional para lograr la temperatura de proceso deseada. 40 Preferiblemente, la temperatura de trituración deseada se logra en el intervalo de 15 minutos, o de forma más preferible en el intervalo de 10 minutos, tal como en el intervalo de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos o incluso de forma más preferible en el intervalo de 1 minuto después de la formación de la malta remojada, o de la forma más preferible la temperatura de trituración deseada se logra en la formación de la malta remojada. El perfil de temperatura del proceso de maceración puede ser un perfil de un proceso de maceración convencional donde las 45 temperaturas están fijadas para conseguir la degradación óptima de la sustancia seca de la molienda por las enzimas de malta.

[0039] La malta se deriva preferiblemente de uno o más de los granos seleccionados de la lista que comprende maíz, cebada, trigo, centeno, sorgo, mijo y arroz. Preferiblemente, la malta es malta de cebada. 50

[0040] La molienda comprende preferiblemente del 0,5% al 99%, preferiblemente del 1% al 95%, de forma más preferible del 5% al 90%, de forma más preferible del 10% al 85%, de forma más aún preferible del 30% al 80% de grano malteado, de la forma más preferible del 30% al 60% e incluso de la forma más preferible del 30% al 50%. Además del grano malteado, la molienda puede preferiblemente comprender aditivos tales como maíz no malteado, 55 u otro grano no malteado, tal como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, sorgo en grano, mijo y/o sorgo, o almidón crudo y/o refinado y/o azúcar que contiene material derivado de plantas como trigo, centeno, avena, maíz, arroz, sorgo en grano, mijo, sorgo, patata, batata, mandioca, tapioca, sagú, plátano, remolacha azucarera y/o azúcar de caña. Los aditivos se pueden obtener de tubérculos, raíces, tallos, hojas, legumbres, cereales y/o grano entero. Es preferible el aditivo obtenido de maíz y/o arroz, más preferiblemente el aditivo es maíz. La trituración 60 preferiblemente comprende del 1% al 80%, preferiblemente del 5% al 80%, de forma más preferible del 10% al 80%, y de forma aún más preferible del 30 al 80% de aditivo de almidón, de la forma más preferible del 30 al 60% e incluso de la forma más preferible del 40 al 60%.

[0041] Preferiblemente estos aditivos tienen una temperatura de gelatinización alta. Más particularmente, estos 65 aditivos tienen una temperatura de gelatinización inicial alta.

[0042] En un aspecto el aditivo es una mezcla que comprende tanto aditivos de temperatura de gelatinización altos como bajos.

[0043] Cuando una solución acuosa de gránulos de almidón se calienta, los gránulos se hinchan para formar una pasta. Este proceso se llama "gelatinización". La temperatura a la que ocurre la gelatinización se llama "temperatura 5 de gelatinización". Debido a la compleja naturaleza del almidón en los aditivos y también a las condiciones durante la maceración, la gelatinización en realidad ocurre en un rango de temperatura particular. El rango de temperatura de gelatinización puede caracterizarse así por la "temperatura de gelatinización inicial", la "temperatura de gelatinización de valor máximo" y la "temperatura de gelatinización final". Por ejemplo, para el almidón de maíz, la temperatura de gelatinización inicial es aproximadamente 62°C (valor máximo: 67°C, final: 72°C) y para el almidón 10 de arroz la temperatura de gelatinización inicial es aproximadamente 68°C (valor máximo: 74.5 °C, final: 78°C) (Starch, 2ª ed. Industrial microscopy of starch por Eileen Maywald Snyder). La temperatura de gelatinización inicial puede variar según la especie de la planta, la variedad particular de la especie de la planta al igual que con las condiciones de crecimiento.

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[0044] El aditivo también puede comprender carbohidratos fácilmente fermentables tales como azúcares o jarabes y se pueden añadir a la malta remojada antes, durante o después del proceso de maceración de la invención pero se añade preferiblemente después del proceso de maceración.

[0045] Antes de la formación de la malta remojada, la malta y/o el aditivo es preferiblemente molido y de forma más 20 preferible molido en seco o mojado.

[0046] Las enzimas se pueden añadir como composiciones enzimáticas. Pueden consistir en una enzima o más de una enzima o más de una composición enzimática. La composición enzimática, además de la(s) enzima(s), también puede contener al menos otra sustancia, por ejemplo pero no limitado a, tampón, surfactantes etc. Las 25 composiciones enzimáticas pueden ser de cualquier forma reconocida en la técnica, por ejemplo, sólida, líquida, emulsión, gel, o pasta. Tales formas son conocidas por el experto en la técnica. En un aspecto se puede añadir más de una composición enzimática, cada una contiene enzimas diferentes. En otro aspecto, se puede añadir una composición enzimática que contiene todas las enzimas necesarias. En otro aspecto, se puede añadir una composición enzimática que contiene unas pocas de las enzimas y al menos otra composición que contiene algunas 30 o todas las enzimas restantes.

[0047] En un aspecto, se suministra exógenamente una composición enzimática que comprende una alfa-amilasa, una pululanasa, una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa y se puede añadir a los ingredientes de trituración, por ejemplo el agua o la molienda, antes, durante o después de la formación de la malta remojada, o en 35 cualquier momento durante la maceración.

[0048] Durante el proceso de maceración, el almidón extraído de la molienda se hidroliza gradualmente en azúcares fermentables y dextrinas más pequeñas. Preferiblemente la malta remojada es negativa en almidón en la prueba de yodo, antes de extraer el mosto. La maceración se finaliza por el trasvase a una temperatura de 70°C o más, 40 preferiblemente de al menos 71 °C, de al menos 72°C, de al menos 73°C, de al menos 74°C, de al menos 75°C, de al menos 76°C, de al menos 77°C, de al menos 78°C, mínimo de 79°C, de al menos 80°C y de forma más preferible de al menos 81°C o incluso de al menos 82°C o más.

[0049] La obtención del mosto a partir de la malta remojada incluye normalmente exprimir el mosto a partir de los 45 granos consumidos, es decir el grano insoluble y material de cáscara que forma parte de molienda. Puede dejarse correr agua caliente a través de los granos consumidos para enjuagar, o asperjar, cualquier extracto restante de la molienda. Preferiblemente, la recuperación del extracto es de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 85%, de al menos el 90%. El mosto se puede utilizar como es, o se puede concentrar y/o secar.

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[0050] El mosto también se puede procesar para usarse como jarabe. También se puede usar para producir bebidas no alcohólicas. Estos procesos son conocidos por un experto en la técnica.

[0051] El mosto también se puede fermentar en cerveza. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ales, ales fuertes, cervezas negras robustas, ales tipo porter, lagers, cervezas amargas, cervezas de exportación, licores de 55 malta, cerveza happoushu, cerveza de alta graduación, cerveza de baja graduación, cerveza baja en calorías o cerveza light. La fermentación del mosto también puede incluir cubrir el mosto con un lodo de levadura que comprende levadura fresca, es decir levadura no usada previamente para la invención o la levadura puede ser levadura reciclada. La levadura aplicada puede ser cualquier levadura adecuada para la elaboración de cerveza, especialmente levaduras seleccionadas de Saccharomyces spp. tal como S. cerevisiae y S. uvarum, incluyendo 60 variantes producidas naturalmente o artificialmente de estos organismos. Los métodos para la fermentación de mosto para la producción de cerveza son conocidos por el experto en la técnica. Se puede añadir hidrogel de sílice al mosto fermentado para aumentar la estabilidad coloidal de la cerveza. El proceso puede incluir además la adición de diatomita al mosto fermentado y el filtrado para dejar la cerveza luminosa.

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Enzimas

Alfa-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133)

[0052] La alfa-amilasa maltogénica es una enzima clasificada en EC 3.2.1133. La actividad enzimática no requiere 5 un final no-reducido en el sustrato y la actividad enzimática primaria produce la degradación de la amilopectina y la amilosa en maltosa y maltodextrinas más largas. Es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina en maltosa en la configuración alfa.

[0053] Ejemplos de amilasas maltogénicas incluyen, pero no se limitan a, la amilasa Novamyl® disponible de 10 Novozymes A/S.

[0054] Una alfa-amilasa maltogénica particularmente preferida es la amilasa maltogénica de la SEC ID nº 1.

[0055] En un aspecto de la invención la alfa-amilasa maltogénica tiene al menos un 70% de identidad, tal como al 15 menos un 75%, tal como al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 86%, tal como al menos un 87%, tal como al menos un 88%, tal como al menos un 89%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 91%, tal como al menos un 92%, tal como al menos un 93%, tal como al menos un 94%, tal como al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% o incluso un 100% de identidad a la secuencia mostrada en la SEC ID nº 1. 20

[0056] El término "identidad" es la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos. Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology 25 Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferiblemente versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La producción de Needle etiquetada "identidad más larga" (obtenida utilizando la opción -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera: 30

(Residuos idénticos x 100) / (Longitud de alineamiento - Número total de gaps en alineamiento)

[0057] En un aspecto, la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones de aminoácido en una o varias posiciones específicas en la SEC ID. nº 1. Por ejemplo, las mutaciones pueden estar al menos en una o varias posiciones 35 Y89F, P191S, D261 G, T288P, W93F, F194Y, Y360F o Y360 N. La nomenclatura usada por la presente para la definición de mutaciones es esencialmente como se describe en el documento WO 92/05249. Así Y89F indica una sustitución del aminoácido Y (Tyr) en la posición 89 con el aminoácido F (Phe). Los métodos para la realización de estas mutaciones son conocidos por un experto en la técnica.

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[0058] En un aspecto la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones en Y89F, P191S, D261G y T288P.

[0059] En otro aspecto, la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones adicionales al menos en W93F, F194Y Y360F o Y360N.

45

[0060] En un aspecto la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones en Y89F, W93F, P191 S, D261G y T288P.

[0061] En otro aspecto la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones en Y89F, P191S, F194Y, D261G y T288P.

[0062] En un aspecto la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones en Y89F, P191S, D261G, T288P y Y360F. 50

[0063] En otro aspecto la alfa-amilasa maltogénica tiene mutaciones en Y89F, P191S, D261G, T288P y Y360N.

[0064] En un aspecto, la alfa-amilasa maltogénica tiene al menos un 10% tal como al menos un 15% tal como al menos un 20% tal como al menos un 25% o tal como al menos un 30% o al menos un 35% o al menos un 40% o al 55 menos un 45% o al menos un 50% o al menos un 55% o al menos un 60% o al menos un 65% o al menos un 70% o al menos un 75% más de tolerancia a la sacarosa que la alfa-amilasa maltogénica de la SEC ID nº 1.

[0065] La tolerancia a la sacarosa se determina utilizando el método dado en el ejemplo 5.

60

[0066] En un aspecto, la alfa-amilasa maltogénica es termoestable.

[0067] En otro aspecto, la alfa-amilasa maltogénica tiene al menos un 10% o al menos un 15 % o al menos un 20 % o al menos un 25 % o al menos un 30 % o al menos un 35% o al menos un 40% o al menos un 45% o al menos un 50% o al menos un 55% o al menos un 60% o al menos un 65% o al menos un 70% o al menos un 75% más termo 65 estabilidad que la alfa-amilasa maltogénica de la SEC ID nº 1.

[0068] La termoestabilidad de una enzima es la capacidad de la enzima de resistir la inactivación térmica irreversible. Para la amilasa maltogénica, se determina encontrando la cantidad de actividad de la enzima restante tras la incubación de la enzima en un tampón (pH6) durante 10 minutos ambos a 25°C y a 72°C.

[0069] La alfa-amilasa maltogénica se puede incluir en el rango de 1-30, preferiblemente 2-25, de forma más 5 preferible 5-20, o de la forma más preferible 8-13 MANU/g de sustancia seca del aditivo.

[0070] Una Unidad Novo de Amilasa Maltogénica (MANU) es la cantidad de enzima que bajo el estándar disociará un pmol de maltotriosa por minuto. Las condiciones estándar son 10 mg/ml maltotriosa, 37°C, pH 5,0, 30 minutos tiempo de reacción. 10

Alfa-amilasa (EC 3.2.1.1)

[0071] Una enzima de alfa-amilasa también puede ser exógena, microbiana y añadida a los procesos y/o composiciones de la invención. La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa de Bacillus. Las alfa-amilasas de Bacillus 15 bien conocidas incluyen alfa-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus.

[0072] En un aspecto, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa de la SEC ID nº 2.

20

[0073] En un aspecto de la invención la alfa-amilasa tiene al menos un 70% identidad, tal como al menos un 75%, tal como al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 86%, tal como al menos un 87%, tal como al menos un 88%, tal como al menos un 89%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 91%, tal como al menos un 92%, tal como al menos un 93%, tal como al menos un 94%, tal como al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% o incluso un 25 100% de identidad a la secuencia mostrada en SEC ID nº 2.

[0074] La alfa-amilasa se puede añadir en el rango de 0,001 a 10 KNU, preferiblemente de 0,01 a 5 KNU, incluso de forma más preferible entre 0,1 y 2 KNU por gramo de sustancia seca del aditivo.

30

[0075] Una Kilo Unidad Novo de alfa-amilasa (KNU) equivale a 1000 NU. Un KNU se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándar (es decir a 37°C +/- 0,05; 0,0003 M Ca2+; y pH 5,6) dextriniza 5,26 g de sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.

Pululanasa (E.C. 3.2.1.41) 35

[0076] Las pululanasas usadas en los procesos según la presente invención son preferiblemente pululanasas de las especies por ejemplo Pyrococcus o Bacillus, tales como Bacillus acidopullulyticus (por ejemplo, aquella descrita en FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106) o Bacillus deramificans, o Bacillus nagano-encis. La pululanasa también puede ser una pululanasa manipulada a partir de, por ejemplo, una cepa de Bacillus. 40

[0077] Otras pululanasas que son usadas preferiblemente en los procesos según la invención incluyen: Bacillus deramificans (patente estadounidense nº 5,736,375), o la pululanasa se puede derivar de Pyrococcus Woesei descrita en el documento PCT/DK91/00219 (WO 92/02614), o la pululanasa se puede derivar de Fervidobacterium sp. Ven 5 descrita en el documento PCT/DK92/00079 (WO 92/16617), o la pululanasa se puede derivar de 45 Thermococcus celer descrita en el documento PCT/DK95/00097 (WO 95/23852), o la pululanasa se puede derivar de Pyrodictium abyssei descrita en el documento PCT/DK95/00211 (WO 95/34644), o la pululanasa se puede derivar de Fervidobacterium pennavorans descrita en el documento PCT/DK95/00095 (WO 95/23850), o la pululanasa se puede derivar de Desulforococcus mucosus descrita en el documento PCT/DK95/00098 (WO 95/23853). 50

[0078] De la forma más preferible la pululanasa se deriva de Bacillus acidopullulyticus.

[0079] Una enzima de pululanasa preferida para su uso en los procesos y/o composiciones de la invención es una pululanasa con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 3. 55

[0080] En un aspecto de la invención la pululanasa tiene al menos un 70%, tal como al menos un 75%, tal como al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 86%, tal como al menos un 87%, tal como al menos un 88%, tal como al menos un 89%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 91%, tal como al menos un 92%, tal como al menos un 93%, tal como al menos un 94%, tal como al menos un 95%, tal como al 60 menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% o incluso un 100% de identidad a la secuencia mostrada en la SEC ID nº 3.

[0081] En un aspecto de la invención, la pululanasa es termoestable. Un ejemplo de tal pululanasa es una pululanasa descrita en el documento WO2009075682. 65

[0082] Para la pululanasa, la termoestabilidad se determina encontrando la cantidad de actividad de la enzima restante después de la incubación de la enzima en un tampón (pH 5) durante 10 minutos ambos a 25°C y a 64°C.

[0083] La pululanasa se adiciona en dosis de 0,1 a 3 PUN/g de aditivo de sustancia seca (DM), tal como de 0,2 a 2,9, tal como de 0,3 a 2,8, tal como de 0,3 a 2,7, tal como de 0,3 a 2,6, tal como de 0,3 a 2,5, tal como de 0,3 a 2,4, 5 tal como de 0,3 a 2,3, tal como de 0,3 a 2,2, tal como de 0,3 a 2,1, tal como de 0,3 a 2,0, tal como de 0,3 a 1,9, tal como de 0,3 a 1,8, tal como de 0,3 a 1,7, tal como de 0,3 a 1,6, de la forma más preferible se añade pululanasa en dosis tal como de 0,3 a 1,5, preferiblemente de 0,4 a 1,4, de forma más preferible de 0,5 a 1,3, de forma más preferible de 0,6 a 1,2, de forma más preferible de 0,7 a 1,1, de forma más preferible de 0,8 a 1,0, de forma más preferible de 0,9 a 1,0. En unas formas de realización particulares la enzima se añade en 0,3 PUN/g de aditivo de 10 DM, tal como en 0,4 PUN/g de aditivo de DM, tal como en 0,5 PUN/g de aditivo de DM, tal como en 0,6 PUN/g de aditivo de DM, tal como en 0,7 PUN/g de aditivo de DM. En una forma de realización particularmente preferida la dosis de enzimas no es mayor que 1 PUN/g de aditivo de DM.

[0084] Una unidad de pululanasa (PUN) es la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándar (es decir después 15 de 30 minutos de tiempo de reacción a 40°C y pH 5,0; y con 0,2% pululano como sustrato) hidroliza pululano, liberando carbohidrato reductor con una poder reductor equivalente a 1 micromol de glucosa por minuto.

[0085] La actividad de pululanasa se mide mediante detección de la capacidad de azúcar reductora aumentada (reacción So-mogyi-Nelson) en las siguientes condiciones: Sustrato: 0,2% pululano, pH 5,0, tiempo de reacción 30 20 minutos. Las muestras se analizan por espectrofotómetro a OD 520 nm.

Beta-amilasa (E.C 3.2.1.2)

[0086] Beta-amilasa es el nombre dado generalmente a las amilasas maltogénicas exo, que catalizan la hidrólisis de 25 enlaces 1,4-alfa-glucosídicos en la amilosa, la amilopectina y los polímeros de glucosa relacionados.

[0087] Se han aislado beta-amilasas de varias plantas y microorganismos (W. M. Fogarty y C. T. Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology, 15: 112-115). Estas beta-amilasas se caracterizan por el hecho de tener temperaturas óptimas en el rango de 40 grados C a 65 grados C y un pH óptimo en el rango de 4,5 a 7,0. 30

Las beta-amilasas contempladas incluyen la beta-amilasa de cebada Spezyme.RTM. BBA 1500, Spezyme.RTM. DBA y Optimalt.TM. ME, Optimalt.TM. BBA de Genencor Int. al igual que Novozym.TM. WBA de Novozymes A/S.

[0088] Las beta-amilasas se incluyen generalmente en el rango de 1 a 25 BAMU/g de aditivo de DM, tal como de 1 a 20 BAMU/g de aditivo de DM, tal como de 1 a 15 BAMU/g de aditivo de DM, tal como de 1 a 10 35

[0089] BAMU/g de aditivo de DM, tal como de 2 a 7 BAMU/g de aditivo de DM, tal como de 2 a 6 BAMU/g de aditivo de DM, tal como de 4 a 6 BAMU/g de aditivo de DM.

[0090] Una unidad de beta-amilasa (BAMU) se define como la cantidad de enzima que degrada un µmol de 40 maltohexaosa por minuto bajo las siguientes condiciones (37°C, pH 5,5, 200 seg incubación, 0,856 mM sustrato de maltotexaosa, actividad suficiente de una enzima oxidativa de maltosa que libere H2O2 por ejemplo 4,8 LOXU/mL lactosa oxidasa, 1,7 mM 4-aminoantipirina (AA), 4,3 mM N-etil-N sulfopropil-m-toluidina (TOPS), 2,1 U/mL peroxidasa (Sigma).

45

[0091] La beta-amilasa actúa en el final no-reducido de maltohexaosa (G6) para formar maltosa (G2) y maltotetraosa (G4), la hidrólisis se mide con un método que cuantifica el final reductor, tal como el uso de carbohidratos o lactosa oxidasa y O2 para formar H2O2. El H2O2 formado activa en presencia de peroxidasa la condensación oxidativa de 4-aminoantipirina (AA) y N-etil-N sulfopropil-m-toluidina (TOPS), para formar un producto morado que se puede cuantificar por su absorbancia a 540 nm. La reacción es iniciada por maltohexaosa (G6). Cuando todos los 50 componentes excepto la beta-amilasa se encuentran en exceso, el índice del aumento de absorbancia es proporcional a la actividad de la beta-amilasa presente.

[0092] En un aspecto, la beta-amilasa es termoestable. Un ejemplo de una beta-amilasa termoestable es la beta-amilasa de Clostridium thermosulfurogenes. Un ejemplo de tal beta-amilasa se encuentra en Kitamoto et al., 1988, J. 55 Bacteriol, 170 (12) 5848-5854.

[0093] En un aspecto, la beta-amilasa es una beta-amilasa con una secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 4.

[0094] En un aspecto de la invención la beta-amilasa tiene al menos un 70% de identidad, tal como al menos un 60 75%, tal como al menos un 80%, tal como al menos un 85%, tal como al menos un 86%, tal como al menos un 87%, tal como al menos un 88%, tal como al menos un 89%, tal como al menos un 90%, tal como al menos un 91%, tal como al menos un 92%, tal como al menos un 93%, tal como al menos un 94%, tal como al menos un 95%, tal como al menos un 96%, tal como al menos un 97%, tal como al menos un 98%, tal como al menos un 99% o incluso un 100% de identidad a la secuencia mostrada en la SEC ID nº 4. 65

Ejemplos

Ejemplo 1:

[0095] El objetivo de este ejemplo es demostrar el beneficio de tener las 3 enzimas (pululanasa, alfa-amilasa 5 maltogénica y una alfa-amilasa) presentes durante la maceración en comparación con tener sólo 2 de ellas en diferentes combinaciones y dosis.

[0096] Una molienda que comprende 50% sémola de maíz no pregelatinizada y 50% malta bien manipulada (WM) fue molida (0,2 mm gap en un triturador de disco) y macerada en presencia de una pululanasa de la SEC ID nº 3, 10 una alfa-amilasa de la SEC ID nº 2 y una alfa-amilasa maltogénica de la SEC ID nº 1. El maíz y la malta se maceraron en una proporción de 1:5 (gravedad normal) y el perfil de temperatura de maceración consistía en maceración a 52°C durante 30 min, aumento a 62°C (1°C/min), mantenimiento a 62°C durante 30 min, aumento a 72°C (1°C/min), mantenimiento a 72°C durante 30 min, aumento a 78°C (1°C/min) seguido de enfriamiento inmediato a 20°C (tiempo de maceración total de 131 minutos). El mosto y el mosto fermentado (un día de 15 fermentación en lab. a temperatura ambiente) fueron analizados mediante HPLC (perfil de azúcar) y Anton Paar (% grado real de fermentación, RDF y extracto, Ea).

Las siguientes actividades enzimáticas se dosificaron en todas combinaciones diferentes: 0 o 0,7 PUN pululanasa, 0 o 0,5 KNU alfa-amilasa y 0 o 11,0 MANU alfa-amilasa maltogénica por g de aditivo de sustancia seca (DM).

20

[0097] Todos resultados se resumen en la tabla 1.

Tabla 1:

Unidades/g de aditivo de DM: % DP4+ (%) % RDF (%)

Sin dosis de enzimas (control): 31,7 57,0

0,5 KNU: 28,6 ( 3,1) 59,9 ( 2,9)

0,5 KNU + 11 MANU: 22,2 ( 9,5) 65,9 ( 8,9)

0,5 KNU + 0,7 PUN: 26,7 ( 5,0) 61,4 ( 4,4)

11 MANU + 0,7 PUN: 21,2 ( 10,5) 67,6 ( 10,6)

0,5 KNU + 0,7 PUN + 11 MANU: 20,0 ( 11,7) 68,6 (11,6)

25

[0098] Los datos anteriores muestran que la combinación de una alfa-amilasa, una pululanasa y una alfa-amilasa maltogénica produce mejores características de mosto que el uso de las enzimas solas en una combinación única o en combinaciones dobles.

Ejemplo 2 30

[0099] El objetivo era valorar la temperatura óptima de la beta-amilasa de Clostridium thermosulfurogenes.

[0100] La temperatura óptima de beta-amilasa de la SEC ID nº 4 obtenible de Clostridium thermosulfurogenes se determinó mediante la liberación de maltosa a partir de amilopectina que mide los extremos de reducción por 35 reactivo PHABH. Se pre-incubó 1 mL sustrato (1% p/v amilopectina de patata en 50 mM NaOAc, 1 mM CaCl2, pH 4,5) a 60°C durante 10 minutos. Como control se retiraron 150 µL antes de la adición enzimática y se mezclaron con 75 µL reactivo de parada (0,75 g PHABH (Sigma), 2,5 g K-Na tartrato (Merck) y 50 ml a 2% NaOH). Para incubaciones enzimáticas, se añadieron 150 µL solución enzimática al sustrato y se incubaron durante 10 min a 30, 40, 50, 60, 70, o 80°C. Se añadieron 75 µL reactivo de parada y la solución se incubó a 100°C durante 15 min. Se 40 transfirieron 200 µL a tubos de PCR y se midió la absorbancia a 410 nm. El experimento se llevó a cabo por triplicado. El pH óptimo de la beta-amilasa de Clostridium thermosulfurogenes fue determinado según el procedimiento anterior con las siguientes modificaciones. La incubación se llevó a cabo a 60°C a pH 4, 5, 6, 7, 8 o 9.

Tabla 2: temperatura óptima 45

ºC: Abs410

30: 0,255

40: 0,325

50: 0,329

60: 0,414

70: 0,470

80: 0,471

Tabla 3: pH óptimo

pH: Abs410

4: 0,402

5: 0,524

6: 0,631

7: 0,595

8: 0,354

9: 0,140

[0101] La beta-amilasa de Clostridium thermosulfurogenes tiene su temperatura óptima a 70-80°C y su pH óptimo alrededor de pH 5-7 (tabla 2 y 3). 5

En comparación, la beta-amilasa de cebada tiene la temperatura óptima a 60-65°C en condiciones de trituración (pH 5,8) (Kunze (1999), Technology Brewing and Malting, Editorial VLB, Berlín).

Ejemplo 3

10

[0102] El objetivo de este ejemplo era demostrar el beneficio de tener una beta-amilasa termoestable presente durante la maceración y filtración en combinación con una pululanasa y alfa-amilasa.

[0103] Una molienda que comprende 50% sémola de maíz no pregelatinizada y 50% malta bien modificada (WM) fue molida (0,2 mm gap en un triturador de disco) y macerada en presencia de una pululanasa de la SEC ID nº 3, 15 una alfa-amilasa de la SEC ID nº 2 y beta-amilasa de la SEC ID nº 4. El maíz y malta se maceraron en una proporción de 1:5 (gravedad normal) y el perfil de temperatura de maceración consistía en maceración a 52°C durante 30 min, aumento a 62°C (1°C/min), mantenimiento a 62°C durante 30 min, aumento a 72°C (1°C/min), mantenimiento a 72°C durante 30 min, aumento a 78°C (1°C/min) seguido de incubación durante 2 horas a 78°C (filtración simulada) seguido de enfriamiento inmediato a 20°C. El mosto y mosto fermentado (un día de 20 fermentación de laboratorio a temperatura ambiente) fueron analizados mediante HPLC (perfil de azúcar) y Anton Paar (% grado real de fermentación, RDF y extracto, Ea). Las siguientes actividades enzimáticas fueron dosificadas en todas las combinaciones diferentes: 0 o 0,7 PUN pululanasa, 0, 0,15 KNU alfa-amilasa y 0 o 2,5 BAMU beta-amilasa por g aditivo de sustancia seca. Los resultados se dan en la tabla 4 a continuación:

25

Tabla 4: perfil de azúcar de mosto (% azúcares totales) y % RDF (grado real de fermentación) en el mosto fermentado. Pululanasa (PUN), alfa-amilasa (KNU), beta-amilasa (BAMU).

Dosis enzimática (unidades/g de aditivo de DM): % DP4+ % RDF

PUN: KNU BAMU

-
-
-: 26,6 57,4

0,7: - - 23,3 60,0

0,7: 0,15 - 20,8 62,6

0,7: 0,15 2,5 14,2 69,8

[0104] La tabla 4 demuestra el beneficio de tener una beta-amilasa termoestable presente durante la maceración en 30 combinación con una pululanasa y alfa-amilasa. Un nivel marcadamente más alto de maltosa se obtuvo dando como resultado un nivel inferior de azúcares no fermentables (DP4+) y en consecuencia un %RDF más alto del mosto fermentado.

Ejemplo 4 35

[0105] Una molienda que comprende 50% sémola de maíz no pregelatinizada y 50% malta bien modificada (WM) fue molida (0,2 mm gap en un triturador de disco) y macerada en presencia de una alfa-amilasa maltogénica de la SEC ID nº 1, una alfa-amilasa de la SEC ID nº 2 y una pululanasa de la SEC ID nº 3. El maíz y malta fueron macerados en una proporción de 1:3 (gravedad alta) y el perfil de temperatura de maceración consistió en 40 maceración a 52°C durante 30 min, aumento a 62°C (1°C/min), mantenimiento a 62°C durante 30 min, aumento a 72°C (1°C/min), mantenimiento a 72°C durante 30 min, aumento a 78°C (1°C/min) y luego inmediatamente enfriamiento a 20°C (3,9°C/min) dando como resultado un tiempo de maceración de total de 131 minutos. El mosto y mosto fermentado (un día de fermentación en lab a temperatura ambiente) se analizaron mediante HPLC (perfil de azúcar) y Anton Paar (% grado real de fermentación, RDF y extracto, Ea). Las siguientes actividades enzimáticas 45 fueron dosificadas: 0,7 PUN pululanasa, 0,5 KNU alfa-amilasa y 11,0 MANU alfa-amilasa maltogénica por gramo de aditivo de sustancia seca.

[0106] Los resultados están resumidos en la tabla 5, demostrando que la combinación de una amilasa maltogénica, una alfa-amilasa y una pululanasa produce una mejora en la hidrólisis del almidón, la formación de maltosa y el % 50 RDF.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método de maceración que comprende:

a) proporcionar una molienda que comprende malta y aditivo; y 5

b) contactar la molienda con

i) una pululanasa;

ii) una alfa-amilasa; y

iii) una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa para hacer un mosto.

10
2. Método según la reivindicación 1, donde el aditivo tiene una temperatura de gelatinización superior al almidón de malta.
3. Método según la reivindicación 1, donde el aditivo es maíz o arroz.

15
4. Método según la reivindicación 1, donde la alfa-amilasa maltogénica tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 1.
5. Método según la reivindicación 1, donde la alfa-amilasa tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 2.

20
6. Método según la reivindicación 1, donde la pululanasa tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 3.
7. Método según la reivindicación 1, donde la beta-amilasa tiene al menos un 70% de identidad a la SEC ID nº 4.
8. Método según la reivindicación 1, donde la pululanasa es termoestable donde la termoestabilidad se mide 25 encontrando la cantidad de actividad de la enzima que permanece después de la incubación de la enzima en un tampón a pH 5,0 durante 10 minutos ambos a 25°C y a 64°C.
9. Método según la reivindicación 1, donde la alfa-amilasa maltogénica es al menos un 10% más tolerante a la sacarosa que la SEC ID nº 1 donde la tolerancia a la sacarosa se mide en un tampón que contiene un 10% sacarosa 30 (%p/v) a pH 5,0 durante 15 minutos a 60°C conforme al ejemplo 5.
10. Método según la reivindicación 1 donde la beta-amilasa tiene una temperatura óptima de 70-80°C donde la temperatura óptima se mide de acuerdo al ejemplo 2.

35
11. Método según la reivindicación 4, donde la alfa-amilasa maltogénica comprende las sustituciones en las posiciones Y89F, P191S, D261G y T288P en la SEC ID nº 1.
12. Método según la reivindicación 4, donde la alfa-amilasa maltogénica comprende una o más de las sustituciones W93F, Y360F, Y360N y F194Y en la SEC ID nº 1. 40
13. Método según la reivindicación 1, donde la molienda comprende un 30-80% de malta y un 30-80% de aditivo.
14. Método según la reivindicación 1, donde el mosto se convierte en cerveza.

45
15. Uso de una pululanasa, una alfa-amilasa y una alfa-amilasa maltogénica y/o una beta-amilasa termoestable en la elaboración de cerveza, donde la beta-amilasa termoestable tiene al menos un 70% de identidad a la secuencia mostrada en la SEC ID nº 4.

50

55