ES2542353T3

ES2542353T3 - Proceso de elaboración de cerveza

Info

Publication number: ES2542353T3
Application number: ES08858987.4T
Authority: ES
Inventors: Niels Elvig
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2015-08-04
Anticipated expiration: 2028-12-11
Also published as: EP2222831A2; HUE025290T2; PL2222831T3; EP2222831B1; DK2222831T3

Abstract

Proceso para la producción de un mosto de cerveza, comprendiendo: a. obtener un macerado por maceración de una molienda, del cual al menos 70% en peso es(son) cereal(es) no malteado(s) que comprende β-amilasa y del cual menos del 30%peso es(son) cereal(es) malteado(s), a una temperatura en la que enzimas (añadidas) exógenas y la α-amilasa endógena están activas; b. contactar el macerado con enzimas exógenas comprendiendo: i. una α-amilasa, ii. una pululanasa, iii. una proteasa, iv. una β-glucanasa, v. una lipasa, y vi. una xilanasa; c. fin de la maceración y filtración del macerado para obtener el mosto.

Description

DESCRIPCIÓN Proceso de elaboración de cerveza

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS

5

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador. La forma legible por ordenador está incorporada aquí por referencia.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

10

[0002] La invención se refiere a un procedimiento para la producción de un mosto de cerveza, que incluye un tratamiento enzimático de una molienda que comprende hasta 100% de la forma (en grano) no malteada, y además se refiere al mosto obtenible por el proceso.

[0003] La invención además se refiere al uso de dicho mosto para el tratamiento adicional en productos de bebida de 15 alta calidad y se refiere a un proceso para la producción de una cerveza o producto de cerveza de alta calidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0004] La maceración es el proceso de convertir el almidón de la malta de cebada molida y adjuntos en azúcares 20 fermentables y no fermentables para producir mosto de la composición deseada. La maceración tradicional implica mezclar la malta de cebada molida y adjuntos con agua a una temperatura y volumen establecidos para continuar los cambios bioquímicos iniciados durante el proceso de malteado. El proceso de maceración se realiza en un periodo de tiempo a varias temperaturas para activar las enzimas endógenas responsables de la degradación de proteínas y carbohidratos. Después del proceso de maceración, el macerado se filtra para obtener el mosto para la fermentación de 25 cerveza. Generalmente, la cerveza ha sido fermentada de cebada malteada, lúpulos, levadura y agua. Cereales de malteado tales como la cebada activan las enzimas endógenas necesarias para la degradación del almidón. No obstante, el proceso de malteado requiere mucha energía y tiempo y por lo tanto es más bien costoso. Así, una manera de reducir costes es sustituir parte de la malta con adjuntos fácilmente disponibles tales como almidón refinado o carbohidratos fácilmente fermentables y/o substitución con cereales no malteados, tal como cebada, maíz, arroz, sorgo, 30 y trigo. No obstante, cereales no malteados carecen de enzimas endógenas, que pueden resultar en la sacarificación incompleta, viscosidad del macerado/mosto aumentada, dificultades de filtración, fermentabilidad pobre, dificultades de filtración de cerveza, inestabilidad coloidal y sabor pobre. Enzimas exógenas tales como alfa-amilasa y -glucanasa han sido previamente añadidas para compensar las enzimas carentes de malta. El siguiente estado de la técnica describe la sustitución de parte de los cereales malteados con cereales no malteados y enzimas añadidas exógenamente . 35

[0005] ZA9803237 describe un proceso para producir una cerveza por fermentación de un mosto obtenido de cebada parcialmente no malteada y una mezcla enzimática de alfa-amilasa, -glucanasa y proteinasa. Wieg et.al. Process Biochemistry, 1970 también describen un proceso para elaboración de cerveza con una mezcla de cebada malteada y no malteada y una mezcla enzimática de alfa-amilasa, -glucanasa y proteinasa. Además WO04/011591 describe un 40 proceso para producir un mosto añadiendo una proteasa y una celulasa a un macerado de cebada malteada y no malteada. Un resumen de elaboración de cebada se da por Wieg et.al. Brewing science, 1987.

[0006] Otra vía para producir mosto es conocida de las cervezas japonesas Happoshu. En Japón, las tasas sobre las bebidas alcohólicas que contienen malta son relativamente altas, razón por la cual las cervezas Happoshu se fermentan 45 con tan poco como 25% de cebada malteada. Normalmente, el macerado preparado en un contenido tan bajo de malta es imposible de filtrar para obtener el mosto, ya que el macerado es demasiado espeso para su filtración. Hay solo pocas descripciones técnicas disponibles en lo que se refiere a la composición del macerado de Happoshu. No obstante, es conocido que es preciso añadir enzimas exógenas a la trituración para obtener filtrabilidad, por ejemplo proteinasas, -glucanasa y amilasas. Las cervezas Happoshu tienen características de sabor diferentes incluso en 50 comparación con cervezas tradicionales del tipo lager más sencillas. JP 2004173533 describe la producción de tal cerveza con el uso de cebada prensada y cantidad inferior de malta. Enzimas diferentes se utilizan para ayudar por ejemplo a la sacarificación.

[0007] El mosto obtenido en las referencias del estado de la técnica se basan en molienda que comprende una cantidad 55 considerable de malta. La composición enzimática en cereales crudos es sustancialmente diferente de cereales malteados y las enzimas endógenas y exógenas implicadas en la degradación de almidón están trabajando juntas en una manera compleja durante la maceración y está generalmente asumido que algo de malta debería estar presente en la molienda. Así incluso con enzimas añadidas exógenamente todavía existen algunos de los problemas anteriormente mencionados por ejemplo con la filtrabilidad, fermentabilidad y turbidez de mostos basados en cereales no malteados. 60 En consecuencia, muy pocos intentos se han hecho para substituir la mayor cantidad o todos los cereales malteados por cereales no malteados.

[0008] Un ejemplo es Goode et.al. que describen la producción de un mosto a partir del 100 % de sustrato de cebada crudo y una mezcla enzimática de dos alfa-amilasas diferentes y una beta-glucanasa. La alfa amilasa tiene un efecto 65 positivo en la separación del macerado, pero la velocidad de filtración cayó cuando altas cantidades de cebada no

malteada estaban presentes. También en US 3081172 la producción de un mosto a partir de materia prima no malteada es sugerida no obstante no se menciona nada acerca de FAN (amino nitrógeno libre), la cantidad de azúcares fermentables y otros parámetros cruciales del mosto resultante.

[0009] En consecuencia, problemas tales como la baja fermentabilidad, composición de aminoácidos no óptima y alta 5 viscosidad y turbidez del mosto no son resueltos y estos obstáculos tienden a aumentar con cantidades en aumento de cereales no malteados.

[0010] Otras desventajas con la elaboración de cerveza del estado de la técnica con cereales no malteados es que un tiempo de trituración prolongado se puede necesitar para que las enzimas exógenas y endógenas en la trituración 10 produzcan un mosto que es comparable por ejemplo con respecto a la fermentabilidad a un mosto producido a partir de cereales malteados. El tiempo de trituración prolongado es claramente antieconómico y puede neutralizar las ventajas económicas de substituir cereales malteados con cereales no malteados.

[0011] Así hasta ahora ninguna mezcla enzimática ha compensado completamente las enzimas de malta, de manera 15 que cuando se adicionan juntas con hasta 100 % de cereales no malteados podrían sustituir completamente una molienda basada en cereales malteados.

[0012] Así aunque la producción de mosto a partir de cebada ha sido intentada desde el año 1960 ningún proceso real de elaboración de cerveza basado en materias primas de alta cantidad de cereales no malteados ha sido desarrollado. 20

[0013] Ante el deseo de reducir los costes relacionados con el malteado de cereales, y además obtener un mosto adecuado para producir una cerveza comparable en cuanto a las características de sabor al de las cervezas tradicionales, existe una necesidad de un método para obtener una trituración basada en hasta el 100% de cereales no malteados. El proceso debería ser fácilmente adaptable a los sistemas de elaboración de cerveza usados en la 25 elaboración de cerveza basados en materia prima malteada. Así el macerado debería ser filtrable y además otros parámetros como la composición de aminoácidos y cantidad de azúcares fermentables deberían ser comparables al macerado basado en los cereales malteados correspondientes incluso si el(los) cereal(es) es/son 100% cereal(es) no malteados. Finalmente, el tiempo de maceración debería ser comparable a aquel de la maceración de materia prima malteada mientras todavía mantiene las características buenas por ejemplo el perfil de azúcar del macerado y el 30 producto de cerveza.

[0014] Por lo tanto, es un objeto de la invención desarrollar un proceso para producir un mosto de una molienda que comprende al menos 70%, e incluso hasta 100%, de cereales no malteados.

35

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0015] Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que por adición de una combinación adecuada de enzimas exógenas a la trituración, y por activación/inactivación térmica de enzimas endógenas, es ahora posible obtener un mosto basado en hasta el 100% de cereales no malteados, tales como cebada. 40

[0016] Un proceso para la producción de un mosto de cerveza, comprendiendo:

a. obtener un macerado por maceración de una molienda, de la cual al menos 70% en peso es(son) cereal(es) no malteado(s) que comprende(n) actividad de -amilasa y de la cual menos del 30% en peso es(son) cereal(es) malteado(s), a una temperatura en la que enzimas (añadidas) exógenas y la -amilasa endógena son activas; 45

b. contactar la trituración con enzimas exógenas comprendiendo:

i. una -amilasa,

ii. una pululanasa,

iii. una proteasa,

iv. una -glucanasa, 50

v. una lipasa, y

vi. una xilanasa;

c. fin de maceración y filtración del macerado para obtener el mosto.

[0017] En una forma de realización preferida, el(los) cereal(es) no malteado(s) son de la tribu Triticeae, por ejemplo 55 cebada, espelta, trigo, centeno. En otra forma de realización el(los) cereal(es) no malteado(s) son cualquier cereal no malteado, tal como pero no limitado a cebada, espelta, trigo, centeno, maíz, avena o arroz o cualquier mezcla de los mismos. Así en otra forma de realización de la invención la molienda comprende una mezcla de cereales no malteados, tal como pero no limitado a una mezcla de cebada no malteada y trigo no malteado, una mezcla de arroz no malteado y cebada no malteada. 60

[0018] En una forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento, donde la molienda comprende además otras fuentes de carbohidrato, tales como jarabes de elaboración de cerveza o cualquier mezcla de los mismos.

[0019] En otra forma de realización, las enzimas exógenas del paso b. anterior además comprenden una fitasa. 65

[0020] En una forma de realización preferida, la temperatura de la maceración está en un rango que optimiza la actividad de -amilasa y reduce la actividad de lipoxigenasa.

[0021] Una forma de realización preferida de la invención concierne a un proceso donde la pululanasa es termoestable con una actividad enzimática relativa por encima del 60% sobre un periodo de 30 min, a 65 °C y a nivel de pH 5. 5

[0022] También se describe un mosto producido por el proceso de la invención. Además, la invención se refiere al uso del mosto para la producción de cervezas de cualquier tipo, por ejemplo tipos de cerveza lager clara y oscura, tipos de cerveza ale clara y oscura, cervezas de trigo, todas las porter, stout, hielo concentrado (por ejemplo. eisbock), tipos de vino de cebada o cerveza happoushu. 10

[0023] El mosto producido comprende uno o varios aminoácidos seleccionados de

a. prolina a una concentración a menos de 2 mM, preferiblemente menos de 1 mM, y de la forma más preferible menos de 0.5 mM en el mosto;

b. serina a una concentración por encima de 0.1 mM, preferiblemente por encima de 0.125 mM, y de la forma más 15 preferible por encima de 0.15 mM; y

c. metionina a una concentración por encima de 0.05 mM, preferiblemente por encima de 0.08 mM, y de la forma más preferible por encima de 0.10 mM.

[0024] También se describe una mezcla enzimática que comprende; 20

i. una actividad de -amilasa,

ii. una actividad de pululanasa, donde la pululanasa es termoestable

iii. una actividad proteolítica, y

iv. una actividad de -glucanasa;

una mezcla enzimática que comprende; 25

i. una actividad de -amilasa,

ii. una actividad de pululanasa,

iii. una actividad proteolítica,

iv. una actividad de -glucanasa; y

v. una actividad de xilanasa. 30

[0025] La mezcla enzimática comprende además actividad de lipasa.

FIGURAS

35

[0026]

La Figura 1 muestra la turbidez (NTU) de un mosto producido a partir de la cantidad en aumento de cebada cuando solo Ultraflo Max es exógenamente añadido.

La Figura 2 muestra la fermentabilidad de un mosto producido a partir del 100 % de cebada no malteada o 100 % de cebada malteada. 40

DEFINICIONES

[0027] En toda esta divulgación, se usan varios términos generalmente entendidos por personas expertas en la técnica. Diferentes términos se usan con significados específicos, no obstante, y son entendidos tal y como se define por lo 45 siguiente.

[0028] El término "malteado" es un proceso por el cual los granos son hechos germinar y son luego secados.

[0029] El término "grano malteado" se entiende como cualquier grano de cereal, en particular cebada, que ha sido 50 sometido a un proceso de malteado.

[0030] El término "grano no malteado" se entiende como cualquier grano de cereal, en particular cebada, que no ha sido sometido a un proceso de malteado. Los términos sin maltear y no malteado podrían ser usados de forma intercambiable en el presente contexto. 55

[0031] El término "molienda" se entiende como el material que contiene almidón o que contiene azúcar que es la base para la producción de cerveza. Puede incluir cereal malteado y no malteado al igual que adjunto.

[0032] El término "cereales" se entiende como granos que son cualquier material que contiene almidón usado como 60 materia prima por ejemplo para la producción de cerveza tal como, pero no limitado a, cebada, trigo, sorgo, maíz, arroz, avena y centeno. Los cereales pueden ser malteados o no malteados.

[0033] El término "adjuntos" es normalmente entendido como materia prima que se puede añadir al ingrediente principal de la molienda, que generalmente son cereales malteados. Por tanto debido a que los granos no malteados 65

normalmente solo comprenden una pequeña parte de la molienda, los cereales no malteados son típicamente definidos como un adjunto junto con carbohidratos líquidos tales como azúcares y almíbares. Los adjuntos podrían ser bien sólidos o líquidos o ambos, donde la parte sólida puede ser cereales no malteados, tales como cebada, maíz y arroz mientras que la parte líquida puede ser carbohidratos fácilmente fermentables tales como azúcar y jarabes.

5

[0034] En este contexto no obstante, lo que se puede considerar como adjunto puede ser el ingrediente principal. Así los cereales no malteados que en un contexto tradicional son un adjunto pueden según la presente invención comprender 100 % de la materia prima.

[0035] Por consiguiente, cereales no malteados están normalmente comprendidos en el término adjunto no obstante 10 debido a que los cereales nos malteados preferiblemente comprenden más del 70 % de la materia prima y los cereales malteados preferiblemente son inferiores al 30 % de la materia prima los términos son en estos contextos más fácilmente entendidos puesto que:

[0036] La molienda puede comprender cereales malteados y no malteados y adjuntos. En este contexto los adjuntos se 15 entienden como la parte de la molienda que no está malteada o cereal no malteado. Así los adjuntos según la presente invención son preferiblemente la parte líquida tal como jarabes de elaboración de cerveza y azúcares.

[0037] Cereales no malteados son cualquier cereal no malteado, así cualquier grano que contiene almidón tal como, pero no limitado a, cebada, maíz, arroz, centeno, avena, sorgo y trigo. Por consiguiente molienda a partir del 100 % de 20 granos no malteados puede comprender cebada no malteada y otros cereales sin cebada no malteados tal como arroz y trigo.

[0038] En otra forma de realización de la invención la molienda comprende una mezcla de cereales no malteados, tal como pero no limitado a una mezcla de cebada no malteada y trigo no malteado, una mezcla de arroz no malteado y 25 cebada no malteada. Así la molienda puede comprender 50 % de cebada no malteada y 50 % de otros cereales no malteados, tal como trigo y arroz.

[0039] En una forma de realización especialmente preferida de la invención el(los) cereal(es) no malteado(s) comprende(n) más del 70% de la molienda y los cereales malteados comprenden menos del 30% de la molienda. 30

[0040] El término "macerado" se entiende como un lodo que contiene almidón que comprende malta de cebada molida, otro material que contiene almidón, o una combinación de los mismos, sumergidos en agua para hacer mosto.

[0041] El término "proceso de maceración" o perfil de maceración o simplemente maceración se entiende como el 35 proceso de combinar granos con agua y calentar la mezcla con reposos a ciertas temperaturas para permitir que las enzimas en la trituración descompongan el almidón del grano en azúcares, para crear un mosto.

[0042] Fin de la maceración o "mashing out" es cuando la temperatura del macerado es aumentada. Esto libera aproximadamente un 2% más de almidón, y hace el macerado menos viscoso. 40

[0043] El término "mosto" se entiende como el licor no fermentado resultante después de la extracción de la molienda durante la maceración. Los términos mosto de cerveza y mosto se usan de forma intercambiable por toda la aplicación.

[0044] El término "granos residuales" se entiende como los sólidos drenados restantes cuando la molienda ha sido 45 extraída y el mosto separado.

[0045] El término "cerveza" es aquí entendido como un mosto fermentado.

[0046] El término "producto de cerveza" es aquí entendido como comprendiendo, "macerado", "mosto", "granos 50 residuales" y "cerveza".

[0047] El término "DP1" significa glucosa.

[0048] El término "DP2" significa maltosa. 55

[0049] El término "DP3" significa maltotriosa.

[0050] Los términos "DP4+" o "DP4/4+" significan dextrina, o maltooligosacáridos de un grado de polimerización de 4 o superior. 60

[0051] El término "Fru" significa fructosa.

[0052] El término "RDF" significa grado real de fermentación.

65

[0053] El término "FAN" significa amino nitrógeno libre.

[0054] El término "Plato" (°P) significa gramos de extracto por 100 g de mosto (gramo de extracto/100 g mosto).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

5

[0055] Por la adición de una combinación de enzimas exógenas, por ejemplo -amilasa, isoamilasa/pululanasa, actividad generadora de FAN (proteasas) y actividades promotoras de la filtrabilidad (beta-glucanasa y/o xilanasa), al macerado y por la activación térmica simultánea de la -amilasa endógena generadora de maltosa, es posible obtener un mosto basado en hasta incluso el 100% de cereal(es) no malteado(s).

10

[0056] Así, en un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un mosto de cerveza, comprendiendo:

a. obtener un macerado por maceración de una molienda, de la cual al menos el 70% en peso es(son) cereal(es) no malteado(s) que comprende(n) actividad -amilasa y de la cual menos del 30% en peso es(son) cereal(es) malteado(s), a una temperatura en la que enzimas (añadidas) exógena(s) y la -amilasa endógena son activas; 15

b. contactar el macerado con enzimas exógenas comprendiendo:

i. una -amilasa,

ii. unas pululanas,

iii. una proteasa,

iv. una -glucanasa, 20

v. una lipasa, y

vi. una xilanasa;

c. fin de la maceración y filtración del macerado para obtener el mosto.

[0057] En un aspecto preferido, la invención se refiere a un procedimiento, donde la molienda comprende al menos 70% 25 en peso de cereal(es) no malteado(s), tal como al menos 75% en peso, de forma más preferible al menos 80% en peso, de forma más preferible al menos 85% en peso, de forma más preferible al menos 86% en peso, de forma más preferible al menos 87% en peso, de forma más preferible al menos 88% en peso, de forma más preferible al menos 89% en peso, de forma más preferible al menos 90% en peso, de forma más preferible al menos 91% en peso, de forma más preferible al menos 92% en peso, de forma más preferible al menos 93% en peso, de forma más preferible al 30 menos 94% en peso, de forma más preferible al menos 95% en peso, de forma más preferible al menos 96% en peso, de forma más preferible al menos 97% en peso, de forma más preferible al menos 98% en peso, incluso de forma más preferible 99% en peso, y de la forma más preferible 100% en peso de cereal(es) no malteado(s).

[0058] Debe entenderse que al menos 70 % en peso de cereal(es) no malteado(s) puede ser uno o varios cereal(es) 35 donde al menos uno del(los) cereal(es) contiene actividad β-amilasa.

[0059] En un aspecto de la invención la molienda comprende menos del 30% en peso de cereales malteados, de forma más preferible menos del 25% en peso, de forma más preferible menos del 20% en peso, de forma más preferible menos del 15% en peso, de forma más preferible menos del 10% en peso, de forma más preferible menos del 5% en 40 peso e incluso de forma más preferible menos del 3% en peso, y de la forma más preferible la molienda comprende 0 % en peso de cereales malteados.

[0060] En una forma de realización preferida, el(los) cereal(es) no malteado(s) es(son) del grupo Triticeae. Preferido dentro de este grupo son cebada, espelta, trigo y centeno. Triticeae es un grupo dentro de la subfamilia de hierbas 45 Pooideae que incluye géneros con muchas especies domesticadas, EA Kellogg, R Appels, RJ Mason- Gamer - SYSTEMATIC BOTANY, 1996. Los mayores géneros de cultivo son descubiertas en esta tribu incluyendo trigo, cebada, y centeno. En otra forma de realización preferida la molienda comprende cereales no malteados diferentes de la tribu Triticeae, tal como pero no limitado a arroz, maíz, avena, sorgo.

50

[0061] En otra forma de realización preferida el(los) cereal(es) no malteado(s) es(son) seleccionado(s) del grupo que comprende cebada, espelta, trigo, centeno, maíz, avena o arroz o cualquier mezcla de los mismos.

[0062] Así en una forma de realización, la invención se refiere a un procedimiento, donde la molienda comprende además uno o varios cereal(es) no malteado(s) adicional(es) tal como molienda de maíz, almidón de maíz y arroz. La 55 molienda puede por lo tanto comprender una mezcla de cereales no malteados, tal como pero no limitado a una mezcla de cebada no malteada y trigo no malteado o una mezcla de arroz no malteado y cebada no malteada.

[0063] En una forma de realización preferida particular de la invención el cereal no malteado es cebada.

60

[0064] En otro aspecto la molienda comprende además 0-50 % en peso de otras fuentes de carbohidrato, tales como jarabes de elaboración de cerveza o cualquier mezcla de los mismos.

[0065] La xilanasa exógena del paso b. anterior es preferiblemente familia GH10 (glicosil hidrolasa de familia 10) que puede mejorar la filtración de mosto y cerveza. 65

[0066] La lipasa exógena del paso b. anterior puede mejorar la filtración de mosto y reducir la opacidad.

[0067] En otra forma de realización las enzimas exógenas del paso b. anterior además comprenden una actividad de fitasa. 5

[0068] La temperatura de maceración, es decir la temperatura en la que las enzimas exógenas (añadidas) y la -amilasa endógena son activas, está en un rango que optimiza la actividad de cada enzima diferente, en cada paso de calentamiento. El proceso de maceración es preferiblemente realizado en tres pasos cada uno optimizado para las enzimas diferentes. Estos pasos se pueden referir como restos enzimáticos o pasos enzimáticos. 10

[0069] Así un aspecto especial concierne el perfil de temperatura de un proceso de maceración para producir un mosto de cerveza, donde

Un primer paso se realiza entre 50 y 58 °C,

Un segundo paso se realiza entre 60 y 65 °C, y 15

Un tercer paso se realiza entre 70 y 80 °C.

[0070] Las diferentes enzimas en el proceso de maceración tanto exógenas como endógenas tienen diferente temperatura óptima y el proceso de maceración puede ser ejecutado a temperaturas diferentes durante un periodo de tiempo determinado para dejar reaccionar a las enzimas. Estos periodos son frecuentemente referidos como restos de 20 enzima.

[0071] En el primer paso, que se puede denominar el paso proteolítico, la temperatura está preferiblemente en la gama de optimizar por ejemplo la enzima proteolítica, la temperatura está preferiblemente entre 45°C y 58°C, tal como preferiblemente entre 46°C y 57°C, tal como preferiblemente entre 47°C y 56°C, tal como preferiblemente entre 48°C y 25 55°C, tal como preferiblemente entre 49°C y 54°C, tal como preferiblemente entre 50°C y 54°C, tal como preferiblemente entre 51°C y 54°C, tal como preferiblemente entre 52°C y 54°C, de la forma más preferible entre 53°C y 54°C, tal como 54°C.,

[0072] En el segundo paso la temperatura está preferiblemente en la gama de optimizar por ejemplo las enzimas de 30 conversión de almidón, tal como la -amilasa y pululanasa. Este paso es frecuentemente referido como el paso de sacarificación y la temperatura está preferiblemente entre 60°C y 72°C, tal como preferiblemente entre 60°C y 70°C, tal como preferiblemente entre 62°C y 68°C, tal como preferiblemente entre 63°C y 67°C, tal como preferiblemente entre 64°C y 66°C, y de la forma más preferible entre 64°C y 65 °C, tal como 64°C.

35

[0073] En el tercer paso, que también se puede referir como fin de la maceración o "mashing out", se libera aproximadamente 2% más almidón, y hace el macerado menos viscoso, permitiendo que la filtración se procese más rápido. La temperatura de mashing out es preferiblemente entre 72°C y 82°C, tal como preferiblemente entre 73°C y 81°C, tal como preferiblemente entre 74°C y 80°C, tal como preferiblemente entre 75°C y 79°C, tal como preferiblemente entre 76°C y 78°C, de la forma más preferible la temperatura es entre 78°C-80 °C, tal como 80 °C. 40

[0074] Lipoxigenasa endógena se conoce por ser una fuente de sabor extraño, y en un aspecto preferido la temperatura de maceración, en el primer paso de maceración al que se hace referencia arriba está en un rango que reduce la actividad de lipoxigenasa al menos 50%, preferiblemente 55%, preferiblemente 60%, preferiblemente 65%, preferiblemente 70%, preferiblemente 75%, preferiblemente 80%, preferiblemente 85% de la forma más preferible 90% 45 con respecto a la actividad en la maceración a 54°C.

[0075] También se describe una mezcla enzimática comprendiendo:

i. una actividad de -amilasa,

ii. una actividad de pululanasa, donde la pululanasa es termoestable 50

iii. una actividad de proteolítica, y

iv. una actividad de -glucanasa;

o una mezcla enzimática que comprende;

v. una actividad de -amilasa,

vi. una actividad de pululanasa, 55

vii. una actividad proteolítica,

viii. una actividad de -glucanasa; y

ix. una actividad de xilanasa.

[0076] Las mezclas enzimáticas pueden comprender además actividad de lipasa. 60

[0077] Los términos mezcla enzimática y combinación enzimática se usan de forma intercambiable en toda la solicitud. Los términos se deben entender como una mezcla o combinación de diferentes enzimas o actividades enzimáticas. Las enzimas en la mezcla o combinación se pueden adicionar en cualquier orden o juntas. Las enzimas si no se adicionan juntas podrían ser añadidas en cualquier orden y no es necesariamente añadida en el orden enumerado arriba. 65

[0078] Las enzimas podrían ser añadidas en cualquier momento de la maceración o antes de la maceración. Así las enzimas se pueden adicionar a los ingredientes de macerado, por ejemplo, el agua y/o la molienda antes, durante o después de la formación del macerado. Las enzimas se pueden adicionar juntas o separadamente.

5

[0079] En un aspecto preferido, la actividad de -amilasa está provista por una -amilasa de origen fúngico, por ejemplo de Aspergillus niger, u origen bacteriano, por ejemplo Bacillus. Así la -amilasa puede ser una variante de -amilasa bacteriana con termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o baja concentración de Ca2+. Preferiblemente, la actividad de -amilasa en el macerado es 0,1-1,0 KNU(S)/g, de forma más preferible 0,2-0,4 KNU(S)/g, y de la forma más preferible 0,25-0,35 KNU(S)/g en peso de cereal(es) en seco. Preferiblemente la -amilasa tiene al menos 50%, de forma más 10 preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, de forma más preferible al menos 90%, preferiblemente al menos 91%, preferiblemente al menos 92%, preferiblemente al menos 93%, preferiblemente al menos 94%, de forma más preferible al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, preferiblemente al menos 97%, de forma más preferible al menos 98%, y de la forma más preferible al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:1 (una variante de 15 la -amilasa de B. stearothermophilus con las mutaciones I181* G182* N193F, descritas en WO99/19467 y disponibles como Termamyl® SC de Novozymes A/S).

[0080] En una forma de realización preferida de la invención, la actividad desramificante de almidón está provista por una pululanasa. Está además descrito que la actividad desramificante está provista por otras enzimas desramificantes 20 tales como pero no limitado a una isoamilasa o dextrinasa límite. En una forma de realización de la invención la actividad desramificante está provista por una mezcla de enzimas desramificantes tal como pero no limitado a una pululanasa y una isoamilasa.

[0081] Así en una forma de realización preferida de la invención, una actividad enzimática de pululanasa (E.C. 3.2.1.41) 25 es exógenamente suministrada y está presente en el macerado. La pululanasa se puede adicionar a los ingredientes de macerado, por ejemplo, el agua y/o la molienda antes, durante o después de la formación del macerado.

[0082] Las pululanasas según la presente invención es preferiblemente pululanasa de p. ej. Pyrococcus o Bacillus, tal como Bacillus acidopulluliticus por ejemplo aquel descrito en FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106, o pululanasa está 30 disponible de Novozymes como Promozyme 400L y con la secuencia mostrada en SEC ID nº: 2. La pululanasa también puede ser de Bacillus naganoencis, o Bacillus deramificans por ejemplo tal como derivada de Bacillus deramificans (patente US 5,736,375) y con la secuencia mostrada en SEC ID nº: 7. La pululanasa también puede ser una pululanasa diseñada a partir de, por ejemplo una cepa de Bacillus.

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[0083] Otras pululanasas se pueden derivar de Pyrococcus woesei descritas en PCT/DK91/00219, o la pululanasa se puede derivar de Fervidobacterium sp. Ven 5 descrita en PCT/DK92/00079, o la pululanasa se puede derivar de Thermococcus celer descrita en PCT/DK95/00097, o la pululanasa se puede derivar de Pyrodictium abissei descrita en PCT/DK95/00211, o la pululanasa se puede derivar de Fervidobacterium pennavorans descrita en PCT/DK95/00095, o la pululanasa se puede derivar de Desulforococcus mucosus descrita en PCT/DK95/00098. 40

[0084] De la forma más preferible la pululanasa es derivada de Bacillus acidopullulyticus. Una enzima de pululanasa preferida para ser usada en los procesos y/o composiciones de la invención es una pululanasa con una secuencia de aminoácidos que es al menos 50%, tal como al menos 55%, tal como al menos 60%, tal como al menos 65%, tal como al menos 66%, tal como al menos 70%, tal como al menos 75%, tal como al menos 80%, tal como al menos 85%, tal 45 como al menos 86%, tal como al menos 87%, tal como al menos 88%, tal como al menos 89%, tal como al menos 90%, tal como al menos 91%, tal como al menos 92%, tal como al menos 93%, tal como al menos 94%, tal como al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal como al menos 99% o incluso 100% idéntica a la secuencia mostrada en la SEC ID NO:8 (NS26062, PulC, de Bacillus acidopullulyticus); en particular cuando se alinean utilizando el programa Needle usando Matrix: BLO-SUM62; penalización de iniciación de gap: 10.0; 50 penalización por extensión de gap: 0.5; matriz de identidad sin gap. Los términos Pul C, NS26062 y pululanasa C se usan de forma intercambiable en toda la aplicación.

[0085] La pululanasa se adiciona en dosificación de 0,1 a 3 PUN/g SS, tal como 0,2 a 2,9, tal como 0,3 a 2,8, tal como 0,3 o 2,7 tal como 0,3 o 2,6 tal como 0,3 a 2,5 tal como 0,3 a 2,4, tal como 0,3 a 2,3, tal como 0,3 a 2,2, tal como 0,3 a 55 2,1, tal como 0,3 a 2,0, tal como 0,3 a 1,9, tal como 0,3 a 1,8, tal como 0,3 a 1,7, tal como 0,3 a 1,6, de la forma más preferible pululanasa se adiciona en dosificación tal como 0,3 a 1,5, preferiblemente 0,4 a 1,4, de forma más preferible 0,5 a 1,3, de forma más preferible 0,6 a 1,2, de forma más preferible 0,7 a 1,1, de forma más preferible 0,8 a 1,0, de forma más preferible 0,9 a 1,0. En una forma de realización particular de la invención la enzima se añade en 0,3 PUN/g de SS, tal como 0,4 PUN/g de SS, tal como 0,5 PUN/g de SS en una forma de realización particularmente preferida de 60 la invención la dosis de enzimas no es mayor que 1 PUN/g de SS. Preferiblemente la isoamilasa y/o actividad de pululanasa en el macerado es 0,1-2,0 PUN/g, de forma más preferible 0,5-1,0 PUN/)/g en peso de cereal(es) en seco.

[0086] La actividad relativa de las enzimas desramificantes, tales como pululanasas, puede variar considerablemente a temperaturas diferentes por ejemplo como se demuestra en el ejemplo 2 de la aplicación. Las enzimas desramificantes 65

están trabajando con las otras enzimas en el macerado, en particular la -amilasa, que es normalmente endógena y la -amilasa que puede ser añadida endógena o exógenamente. Así una enzima desramificante preferida según la invención es una enzima con alta actividad enzimática relativa en el rango de temperatura en el que la -amilasa y la -amilasa es activa.

La -amilasa es normalmente activa a una temperatura más alta que la -amilasa y el paso de sacarificación del 5 proceso de maceración, el paso donde el almidón se convierte en azúcares fermentables por -amilasa, -amilasa y una enzima desramificante, es preferiblemente ejecutado a una alta temperatura, tal como al menos 63 C°. Así la enzima desramificante según la invención es preferiblemente termoestable y termoactiva. Los términos termoestable y termoactiva se usan de forma intercambiable por toda la aplicación.

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[0087] En este contexto una enzima termoestable es una enzima con una actividad enzimática relativa por encima del 60% medido en un periodo de 30 min, a 65 °C y a nivel de pH 5.

[0088] La actividad relativa, que en este contexto es la actividad enzimática relativa, se calcula por ajuste de la actividad máxima al 100% (máximo) y ajustando las actividades a otras temperaturas relativas a la temperatura máxima. 15

[0089] Así preferiblemente la enzima desramificante es una pululanasa e incluso de forma más preferible la actividad de pululanasa está provista por una pululanasa que es termoestable con una actividad enzimática relativa por encima del 60% sobre un periodo de 30 min, a 65 °C y a nivel de pH 5. Un ejemplo de una pululanasa termoestable se da en el ejemplo 2. 20

[0090] En una forma de realización actividad enzimática relativa de la pululanasa está por encima de 60%, tal como por encima de 61%, tal como por encima de 62%, tal como por encima de 63%, tal como por encima de 64%, tal como por encima de 65%, tal como por encima de 66%, tal como por encima de 67%, tal como por encima de 68%, tal como por encima de 69%, tal como por encima de 70%, tal como por encima de 71%, tal como por encima de 72%, tal como por 25 encima de 73%, tal como por encima de 74%, tal como por encima de 75%, tal como por encima de 76%, tal como por encima de 77%, tal como por encima de 78%, tal como por encima de 79%, tal como por encima de 80%, tal como por encima de 81%, tal como por encima de 82%, tal como por encima de 83%, tal como por encima de 84%, tal como por encima de 85%, tal como por encima de 86%, tal como por encima de 87%, tal como por encima de 88%, tal como por encima de 89%, tal como por encima de 90%, tal como por encima de 91%, tal como por encima de 92%, tal como por 30 encima de 93%, tal como por encima de 94%, tal como por encima de 95%, tal como por encima de 96%, tal como por encima de 97%, tal como por encima de 98%, tal como por encima de 99% e incluso 100% a 65°C, cuando se mide en un periodo de 30 minutos, a pH 5,0.

[0091] En una forma de realización preferida particular de la invención una pululanasa termoestable tiene una actividad 35 enzimática relativa por encima del 80% en un periodo de 30 min, a 65 °C y a nivel de pH 5.

[0092] En una forma de realización determinada la pululanasa tiene por encima del 80%, tal como por encima del 85%, tal como por encima del 90% tal como por encima del 95%, o incluso el 100% de actividad enzimática restante en un periodo de 30 min bajo condiciones de maceración con 12 °P de cebada, a temperatura de gelatinización de cebada no 40 malteada, y a pH en el rango de 5,6-6,2, en comparación con la actividad antes de la incubación a la temperatura de gelatinización de cebada no malteada.

[0093] En otra forma de realización la actividad de proteasa está provista por un sistema de enzimas proteolíticas con una actividad de generación de FAN adecuada incluyendo endoproteasas, exopeptidasas o cualquier combinación de 45 estas, preferiblemente una metaloproteasa. Preferiblemente la actividad de proteasa en el macerado es 0,0005-0,002 AU/g, de forma más preferible 0,001-0,0015 AU/g en peso de cereal(es) en seco. Preferiblemente, la proteasa tiene al menos 50%, de forma más preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, de forma más preferible al menos 85%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, de forma más preferible al menos 93%, de forma más preferible al 50 menos 94%, de forma más preferible al menos 95% de forma más preferible al menos 96%, de forma más preferible al menos 97% de forma más preferible al menos 98%, y de la forma más preferible al menos 99% o incluso 100 % de identidad a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:3 (una metaloproteasa de Bacillus amyloliquefaciens, descrita en WO9967370, disponible como Neutrase® de Novozymes A/S).

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[0094] En otra forma de realización, la actividad -glucanasa (E.C3.2.1.4.) se añade al macerado. Preferiblemente la actividad de -glucanasa en el macerado es 0,1-1,5 FBG/g, tal como 0.2-1.2 FBG/g, tal como 0,4-1,0 FBG/g, tal como 0,5-1,0 FBG/g en peso de cereal(es) en seco. -glucanasa también es denominada celulasa y puede ser de origen fúngico o bacteriano. Tal como de Aspergillus orzyae, Aspergillus niger o de Bacillus tal como B subtilis. La actividad -glucanasa añadida también puede originarse de malta. En una forma de realización preferida particular de la invención 60 la -glucanasa se añade junto con xilanasa en una mezcla enzimática denominada Ultraflo Max. Ultraflo Max es una mezcla enzimática de xilanasa y -glucanasa, la mezcla es descrita en la aplicación WO2005/059084 A1.

[0095] En otra forma de realización, la actividad de xilanasa está provista por una xilanasa de glicosil hidrolasa de familia 10. 65

Preferiblemente la actividad de xilanasa en el macerado es 0.02-0.1 FXU, de forma más preferible 0,04-0,08 FXU-S/g en peso de cereal(es) en seco. Preferiblemente, la xilanasa tiene al menos 50%, de forma más preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, de forma más preferible al menos 85%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, de forma más preferible al menos 93%, de forma más preferible al menos 94% de forma más preferible al menos 95%, de 5 forma más preferible al menos 96%, de forma más preferible al menos 97% de forma más preferible al menos 98%, y de la forma más preferible al menos 99% o incluso 100% de identidad a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:4 (descrita en WO 94/21785, disponible como Shearzyme® de Novozymes A/S).

[0096] En otra forma de realización, la actividad de lipasa está provista por una lipasa con actividad para triglicéridos y/o 10 galactolípidos y/o fosfolípidos. Preferiblemente, la actividad de lipasa está provista por una lipasa de Fusarium (incluyendo F. oxysporum y F. heterosporum), Aspergillus (incluyendo A. tubigensis), Rhizopus (incluyendo R. oryzae) o Thermomyces (incluyendo T. lanuginosus) o una variante de estas. Un ejemplo es Lipopan X (Lipopan Xtra), una variante de la lipasa de Thermomyces lanuginosus con las sustituciones G91A +D96W +E99K +P256V +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N +270A +271 G +272G +273F (+274S), descrito en WO2004099400A2. 15 Preferiblemente, la lipasa tiene al menos 50%, de forma más preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, de forma más preferible al menos 85%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, de forma más preferible al menos 93%, de forma más preferible al menos 94%, de forma más preferible al menos 95%, de forma más preferible al menos 96%, de forma más preferible al menos 97% de forma más preferible al menos 98%, y de la forma más preferible al 20 menos 99% o incluso 100 % de identidad a residuos 1-316 o 1-273 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:5 (lipasa/fosfolipasa de Fusarium oxysporum, descritos en EP 869167, disponibles de Novozymes A/S como Lipopan® F). Preferiblemente, la actividad de lipasa en el macerado es 0-50 LU/g, tal como 0-40 LU/g, tal como 0-30 LU/g, tal como 0-20 LU/g en peso de cereal(es) en seco. En una forma de realización especialmente preferida de la invención la lipasa es Lipozyme TL o lipolasa, esta lipasa tiene un efecto significativamente bueno en la velocidad de 25 filtración y reducción de neblina. Así en una forma de realización preferida especial de la invención la lipasa tiene al menos 50%, de forma más preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, de forma más preferible al menos 85%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, de forma más preferible al menos 93%, de forma más preferible al menos 94%, de forma más preferible al menos 95%, de forma más preferible al menos 96%, de forma más preferible al 30 menos 97% de forma más preferible al menos 98%, y de la forma más preferible al menos 99% o incluso 100 % de identidad a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 9. La lipasa también puede ser Lipex, una variante de Lipozyme teniendo al menos 50%, de forma más preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, de forma más preferible al menos 95%, de forma más preferible al menos 98%, y de la forma más preferible al menos 99% o incluso 100 % de identidad a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC 35 ID nº: 10. Las lipasas degradan el lípido de cebada por ejemplo los triglicéridos en glicéridos parciales y ácidos grasos libres. Esto lleva a una turbidez inferior y muy mejorada filtración de macerado y propiedades de filtración.

[0097] En otra forma de realización, la actividad de fitasa está provista por una fitasa de Aspergillus niger, Peniophora o Citrobacter. Preferiblemente, la actividad de fitasa en el macerado es 0-5 FYT / g, de forma más preferible 0.5-1.5 FYT/g 40 en peso de cereal(es) en seco. Preferiblemente, la fitasa tiene al menos 50%, de forma más preferible al menos 60%, de forma más preferible al menos 70%, de forma más preferible al menos 80%, de forma más preferible al menos 85%, de forma más preferible al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, de forma más preferible al menos 93%, de forma más preferible al menos 94%, de forma más preferible al menos 95%, de forma más preferible al menos 96%, de forma más preferible al menos 97%, de forma más preferible al menos 98%, y 45 de la forma más preferible al menos 99% o incluso 100 % de identidad a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:6 (una variante de fitasa de Peniophora lycii, descrita en WO 2003/066847).

[0098] En alguna forma de realización de la invención se añade Flavourzyme. Flavourzyme es una composición enzimática obtenida de la cepa NN000562 de A. oryzae originalmente obtenida como ATCC 20386. FLAVOURZYME 50 contiene actividades de proteasa ácida y alcalina.

[0099] También se describe un mosto producido por el proceso de la invención, y el uso del mosto para la producción de cervezas de cualquier tipo, por ejemplo tipos de cerveza lager clara y oscura, tipos de cerveza ale clara y oscura, cervezas de trigo, todas las porter, stout, hielo concentrado (por ejemplo eisbock), tipos de vino de cebada o cerveza 55 happoushu.

[0100] Los componentes que contienen nitrógeno son importantes componentes del mosto porque ellos afectan el carácter de la cerveza, tal como el sabor y modelo de fermentación. Los compuestos que contienen nitrógeno son importantes nutrientes para la levadura con la excepción de prolina que es difícilmente asimilada por la levadura por 60 tanto es favorable tener una pequeña cantidad de prolina o ninguna prolina en el mosto. El mosto comprende uno o varios aminoácidos seleccionados de

a. prolina a una concentración menor que 2 mM, preferiblemente menor que 1 mM, y de la forma más preferible menor que 0,5 mM en el mosto;

b. serina a una concentración por encima de 0,1 mM, preferiblemente por encima de 0,125 mM, y de la forma más 65 preferible por encima de 0-15 mM; y

c. metionina a una concentración por encima de 0,05 mM, preferiblemente por encima de 0,08 mM, y de la forma más preferible por encima de 0,10 mM.

[0101] Así en un aspecto la concentración de prolina está por debajo de 2 mM, tal como por debajo de 1,5 mM, tal como por debajo de 1 mM, tal como por debajo de 0,5 mM, tal como por debajo de 0,25 mM. 5

[0102] En otro aspecto la concentración de serina está por encima de 0,1 mM, tal como 0,125 mM, tal como 0,15 mM, tal como 0,2 mM.

[0103] En otro aspecto la concentración de metionina está por encima de 0,005 mM, tal como 0,008 mM, tal como 0,1 10 mM, tal como 0,125 mM, tal como 0,15 mM.

[0104] Los inventores han descubierto sorprendentemente que incluso con cantidades muy altas por ejemplo por encima del 80 % de cereales no malteados tal como cebada no malteada un mosto podría ser producido con una cantidad alta de azúcares fermentables, que en este contexto es DP1-DP3 (glucosa, maltosa y maltotriosa) y en un aspecto preferido 15 particular de la invención la cantidad de maltosa es alta en comparación con la cantidad de glucosa, lo que es favorable porque impide la presión osmótica en la levadura y regula la producción de éster y por lo tanto el perfil de sabor y aroma de la cerveza final.

[0105] Así en un aspecto, en el mosto la concentración de maltosa está por encima de 45%, preferiblemente por encima 20 de 50%, preferiblemente por encima de 55%, preferiblemente por encima de 56%, preferiblemente por encima de 57%, preferiblemente por encima de 58%, preferiblemente por encima de 59%, preferiblemente por encima de 60%, preferiblemente por encima de 61%, preferiblemente por encima de 62%, preferiblemente por encima de 63%, preferiblemente por encima de 64%, preferiblemente por encima de 65%, de la forma más preferible la concentración de maltosa es por encima de 70% de la concentración total de carbohidratos. 25

[0106] En otro aspecto, en el mosto la concentración de glucosa está por debajo de 10%, preferiblemente por debajo de 9%, preferiblemente por debajo de 8%, preferiblemente por debajo de 7%, preferiblemente por debajo de 6%, preferiblemente por debajo de 5% de la forma más preferible por debajo de 4%.

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[0107] Otro aspecto en el mosto: el total de la glucosa, maltosa y concentración de maltotriosa está por encima de 50%, preferiblemente por encima de 55%, preferiblemente por encima de 60%, preferiblemente por encima de 61%, preferiblemente por encima de 62%, preferiblemente por encima de 63%, preferiblemente por encima de 64%, preferiblemente por encima de 65%, preferiblemente por encima de 66%, preferiblemente por encima de 67%, preferiblemente por encima de 68%, preferiblemente por encima de 69%, preferiblemente por encima de 70%, 35 preferiblemente por encima de 71%, preferiblemente por encima de 72%, preferiblemente por encima de 73%, preferiblemente por encima de 74%, preferiblemente por encima de 75%, preferiblemente por encima de 76%, preferiblemente por encima de 77%, preferiblemente por encima de 78%, preferiblemente por encima de 79% y preferiblemente por encima de 80% de la concentración total de carbohidratos.

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[0108] RDF (grado real de fermentación) se calcula como RDF% = 100*(OE%P - ER%) / OE%P mientras que OE significa extracto Original en %P y ER significa extracto real % P medido por un densitómetro (referencia Analytica EBC).

[0109] Así en un aspecto el RDF en el mosto es mayor que 60%, tal como al menos 65%, tal como al menos 70%, tal 45 como al menos 75%, tal como al menos 76%, tal como al menos 77%, tal como al menos 78%, tal como al menos 79%, tal como al menos 80%, tal como al menos 81%, tal como al menos 82%, tal como al menos 83%, tal como al menos 84%, tal como al menos 85%, tal como al menos 86%, tal como al menos 87%, tal como al menos 88%, tal como al menos 89%, tal como al menos 90%, tal como al menos 91%, tal como al menos 92%, tal como al menos 93%, tal como al menos 94%, tal como al menos 95%, tal como al menos 96%, tal como al menos 97%, tal como al menos 98%, tal 50 como al menos 99%, tal como al menos 100%.

[0110] Algunas fábricas de cerveza añaden jarabe de cervecería, por ejemplo, jarabe de elaboración de cerveza alto en maltosa a la caldera de mosto que puede aumentar la cantidad de azúcares fermentables. No obstante, aunque jarabe de elaboración de cerveza se puede adicionar según la invención no es necesario aumentar la cantidad de azúcares 55 fermentables o RDF.

[0111] También se describe un proceso, donde la proporción de maltosa:glucosa en el mosto es superior a 5:1, tal como superior a 6:1, tal como superior a 7:1, preferiblemente superior a 8:1, preferiblemente superior a 9:1, preferiblemente superior a 10:1, preferiblemente superior a 11:1 en una forma de realización preferida particular la proporción de 60 maltosa:glucosa en el mosto es superior a 12:1.

[0112] Durante el proceso de maceración el almidón se degrada en azúcares fermentables y no fermentables y el material proteico se convierte los aminoácidos libres que se usan por la levadura. Según la invención la materia prima usada para maceración puede ser hasta 100 % de cereales no malteados, tal como cebada no malteada sin reducir la 65 fermentabilidad del mosto o reduciendo la cantidad de aminoácidos disponibles para la levadura.

[0113] Además, la elaboración de cerveza en cereales no malteados puede dar problemas con filtrabilidad debido al exceso de almidón no convertido y -glucano o xilano, que pueden también causar la opacidad de la cerveza. La adición de enzimas ayudantes de la filtración tal como -glucanasa puede aumentar la filtrabilidad del mosto. No obstante, cuando el cereal no malteado comprende la parte esencial de la molienda, la -glucanasa sola no es suficiente para 5 proporcionar mosto filtrable.

[0114] Los inventores han descubierto sorprendentemente que la adición de enzimas exógenas según la invención, que comprenden actividad -amilasa, actividad de pululanasa, actividad proteolítica, actividad de lipasa y actividad de -glucanasa; al macerado preparado de una molienda que comprende al menos 70 % de cereal(es) no malteados 10 produjeron un mosto que es comparable o aún mejor con respecto a por ejemplo FAN, azúcares fermentables (DP1-DP3) y que es filtrable y también tiene una turbidez baja aceptable cuando se compara con un mosto producido de una molienda malteada.

[0115] El tiempo en cuba de filtración, el tiempo que emplea para filtrar el macerado en la cuba de filtración, si está en 15 un vaso separado, está influido por ejemplo por la turbidez. Así en un aspecto de la invención el mosto es filtrable y tiene una turbidez baja y en una forma de realización de la invención la turbidez está por debajo de 20 NTU (las unidades de turbidez de un nefelómetro calibrado, unidades de turbidez nefelométrica), tal como por debajo de 19 NTU, tal como por debajo de 18 NTU, tal como por debajo de 17 NTU, tal como por debajo de 16 NTU, tal como por debajo de 15 NTU, tal como por debajo de 14 NTU, tal como por debajo de 13 NTU, tal como por debajo de 12 NTU, tal como por 20 debajo de 11 NTU, tal como por debajo de 10 NTU.

[0116] Una manera de aumentar la cantidad de azúcares fermentables es mediante el aumento del tiempo de maceración por ejemplo mediante el aumento del paso de sacarificación. No obstante, en otro aspecto importante de la invención el tiempo de maceración necesitado para producir un mosto que es altamente fermentable no se aumenta en 25 comparación con el tiempo de maceración para producir un mosto igualmente fermentable basado en la misma cantidad de malta.

[0117] Esto es sorprendente puesto que generalmente se necesita un tiempo de maceración más largo cuando el macerado se basa en una alta cantidad de cereales no malteados por ejemplo 70% de cebada para dar la misma 30 fermentabilidad y FAN como en un mosto producido en cantidades correspondientes (70%) de malta.

[0118] El proceso de maceración se completa dentro de 160 minutos, preferiblemente dentro de 120 minutos.

[0119] El proceso de maceración que comprende todas las enzimas reposa y todos los pasos de calentamiento, se 35 completa dentro de 180 minutos, tal como dentro de 170 minutos, tal como dentro de 160 minutos, tal como dentro de 155 minutos, tal como dentro de 150 minutos, tal como dentro de 145 minutos, tal como dentro de 140 minutos, tal como dentro de 135 minutos, tal como dentro de 130 minutos, tal como dentro de 125 minutos, tal como dentro de 120 minutos, tal como dentro de 115 minutos, tal como dentro de 110 minutos, tal como dentro de 105 minutos, tal como dentro de 100 minutos, tal como dentro de 95 minutos, tal como dentro de 90 minutos, tal como dentro de 85 minutos, 40 tal como dentro de 80 minutos, tal como dentro de 75 minutos, tal como dentro de 70 minutos, tal como dentro de 65 minutos, tal como dentro de 60 minutos.

[0120] Cuando la malta se sustituye con granos tales como arroz y maíz la molienda puede necesitar ser tratada por decocción o maceración de decocción o decocción de adjuntos, que es un proceso donde una proporción de los granos 45 se hierve separadamente con -amilasa termoestable y luego son devueltos al macerado. Este proceso es frecuentemente necesitado para estos tipos de granos puesto que la temperatura de gelatinización es superior a la de cebada, malta, y por ejemplo trigo. Así se necesita la pregelatinización para hacer el almidón accesible para todas las enzimas endógenas necesitadas y añadidas. El proceso también se puede usar para dar un sabor malteado a la cerveza. 50

[0121] Cereales no malteados, tal como la cebada muestra un comportamiento diferente general en la trituración al de los cereales malteados, como ejemplo, la cebada tiene contenido de agua más alto, no se modifica y es mucho más dura que la malta.

55

[0122] Para ejecutar una cuba de filtración con malta y conseguir un rendimiento aceptable (rendimiento y tiempo de filtración) una determinada composición de molienda es necesaria, la composición de molienda se puede medir por una prueba de tamizado.

[0123] La composición de molienda hecha por molinos de rodillo está principalmente influida por el espacio entre el(los) 60 par(es) de rodillos (dos molinos de rodillos = un par, cuatro molinos de rodillos = dos pares). El primer par tiene siempre un espacio más amplio que el segundo. Para obtener un rendimiento de filtración en comparación con una molienda hecha de malta los inventores han cambiado, este(estos) espacio(s) de rodillos.

[0124] Los inventores descubrieron que un molino de cuatro rodillos y un molino de seis rodillos (tres pares) podrían 65

triturar con espacios de rodillos ajustados son bien adecuados para triturar la cebada en la molienda utilizable. Esto es importante puesto que unos buenos rendimientos de filtración solo se pueden conseguir con una composición de molienda optimizada es decir diferente a la composición de molienda óptima de malta.

[0125] La prueba de tamizado fue realizada según la prueba de tamizado descrita en Anger, H.: MEBAK Band 5 Rohstoffe. 1. Auflage Brautechnische Analysenmethoden. 2006, Freising: Selbstverlag der MEBAK.

Tabla 1

Cebada molida en comparación con malta

: Cebada Malta

Criba 1: 25% 18%

Criba 2: 15% 8%

Criba 3: 38% 33%

Criba 4: 10% 21%

Criba 5: 3% 10%

Fondo: 9% 11%

[0126] Los resultados muestran que para una molienda 100 % exitosa un rendimiento de filtración de la cebada la 10 molienda más gruesa con más foco en la criba 1-3 lleva a un buen rendimiento de filtración. Podría también verse que la molienda de cebada es significativamente diferente de la molienda de malta.

EJEMPLOS:

15

MATERIALES Y MÉTODOS

Enzimas

Actividad de alfa-amilasa (KNU) 20

[0127] La actividad amilolítica se puede determinar usando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción es seguida de muestras de mezcla de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, un color azul negruzco es formado, no obstante, durante la descomposición del almidón el color azul se vuelve más débil y gradualmente se convierte en un marrón 25 rojizo, que se compara con un estándar de vidrio coloreado.

[0128] Una Unidad Kilo Novo de amilasa alfa (KNU) es igual a 1000 NU. Una KNU se define como la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándares (es decir a 37°C +/- 0,05; 0,0003 M Ca2+; y pH 5,6) convierte 5,26 g de sustancia seca de almidón (Merck Amylum soluble) en dextrinas suficientemente pequeñas para no hacer una reacción 30 de color con yodo.

Actividad desramificante (PUN)

[0129] Actividad de pululanasa se puede determinar con respecto a un sustrato de pululano. Pululano es un polímero de 35 D-glucosa lineal que consiste sustancialmente en unidades de maltotriosilo unidas por enlaces 1,6-alfa. Endopululanasas hidrolizan los enlaces 1,6- al azar, liberando maltotriosa, 63-alfa-maltotriosil maltotriosa, 63- alfa -(63- alfa -maltotriosil-maltotriosil)-maltotriosa, etc. El número de enlaces hidrolizados se determina como carbohidrato de reducción que utiliza un método Somogyi-Nelson modificado.

40

[0130] Una unidad pululanasa (PUN) es la cantidad de enzima que, bajo condiciones estándares (es decir después 30 minutos de tiempo de reacción a 40°C y pH 5,0; y con 0,2% de pululano como sustrato) hidroliza pululano, liberando carbohidrato de reducción con una potencia de reducción equivalente a 1 micromol de glucosa por minuto.

Actividad proteolítica (AU) 45

[0131] La actividad proteolítica se puede determinar usando hemoglobina desnaturalizada como sustrato. En el método Anson-Hemoglobin para la determinación de actividad proteolítica, la hemoglobina desnaturalizada es digerida, y la hemoglobina no asimilada se precipita con ácido tricloroacético (TCA). La cantidad del producto soluble TCA es determinada usando reactivo de fenol, que da un color azul con tirosina y triptófano. 50

[0132] Una unidad de Anson (AU) es definida como la cantidad de enzima que bajo condiciones estándares (es decir 25°C, pH 7,5 y 10 min. tiempo de reacción) digiere hemoglobina a un nivel inicial de manera que allí se libera una cantidad de producto soluble TCA por minuto que da el mismo color con reactivo de fenol que un miliequivalente de tirosina. 55

Actividad de -glucanasa (FBG)

[0133] Una unidad beta glucanasa fúngica (FBG) es la cantidad de enzima, que, según las condiciones estándares indicadas más abajo, libera oligosacáridos reducibles o reduce carbohidrato con una capacidad de reducción equivalente a 1 mol de glucosa por minuto.

5

[0134] Beta glucanasa fúngica reacciona con beta glucano durante el proceso de formación en glucosa o carbohidrato de reducción que se determina como azúcar reductor según el método Somogyi Nelson.

[0135] La muestra debería ser diluida para dar una actividad entre 0,020,10 FBG/ml. Las condiciones de reacción estándares son: sustrato: 0,5% de beta glucano de cebada, temperatura: 30°C, pH: 5,0 y el tiempo de reacción 30 min. 10

[0136] No obstante la actividad celulítica en el producto comercial se mide en unidades de endoglucanasa (EGU), que se puede convertir en FBG. Para celluclast la EGU se puede convertir en FBG multiplicando la EGU por un factor 3.2.

Xilanasa (FXU(S)) 15

[0137] La actividad xilanolítica se puede expresar en unidades FXU(S), determinadas a pH 6,0 con remazol-xilano (4-O-metil-D-glucurono-D-xilan teñido con Remazol Brilliant Blue R, Fluka) como sustrato.

[0138] Una muestra de xilanasa se incuba con el sustrato de remazol-xilano. El fondo de sustrato teñido no degradado 20 se precipita por etanol. El color azul restante en el sobrenadante (como se determina espectrofotométricamente a 585 nm) es proporcional a la actividad de xilanasa, y las unidades de xilanasa son luego determinadas con respecto a una enzima estándar a condiciones de reacción estándares, es decir concentración de sustrato 0,45% p/v, concentración enzimática 0.04 - 0.14 FXU(S)/ml a 50.0 °C, pH 6.0, y en 30 minutos de tiempo de reacción. Actividad de xilanasa en FXU(S) se mide con respecto a una enzima estándar de Novozymes FXU(S) (obtenible de Novozymes), comprendiendo 25 la preparación de xilanasa monocomponente Shearzyme de Aspergillus aculeatus.

Lipasa (LU)

[0139] Una unidad de lipasa (LU) es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ácido butírico titulable por minuto a 30 30.0°C; pH 7,0; con goma arábiga como emulsionante y tributirina como sustrato.

Fitasa (FYT)

[0140] Una unidad de fitasa (FYT) es la cantidad de enzima que libera 1 micro-mol de ortofosfato inorgánico por min. 35 bajo las siguientes condiciones: pH 5,5; temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C6H6O24P6Na12) a una concentración de 0,0050 mol/l.

Unidad de Leucina Amino Peptidasa (LAPU)

40

[0141] 1 Unidad de Leucina Amino Peptidasa (LAPU) es la cantidad de enzima, que descompone 1 micro-M de sustrato por minuto a las siguientes condiciones: 26 mM de L-leucina-p-nitroanilida como sustrato, 0,1 M Tris tampón (pH 8,0), 40°C, 10 minutos de tiempo de reacción.

Método de maceración en laboratorio 45

[0142] A menos que se declare lo contrario, el método de maceración usado en los ejemplos fue realizado de la siguiente manera:

[0143] Primero, la cebada se tritura en molienda fina (Bühler Unirvisale gab 0,2 mm), luego 50 g de cebada molida se 50 añade a una cápsula de maceración y se añaden 200 g de agua precalentada (con cloruro de calcio). La copa se coloca en el baño de maceración (Lochner LB 12 Electronic con 12 copas), el diagrama de maceración se fija (por ejemplo maceración a 50°C o 54°C, mantener temperatura durante 20-30 minutos, aumento de 1°C/minuto hasta 64°C, mantener durante 40-60 minutos, aumento de 1°C/minuto 78 o 80°C, mantener durante 10-20 minutos y reducir la temperatura a 20°C). La solución enzimática se añade al principio a las copas y la maceración es iniciada dando un 55 periodo de maceración total de 140-160 minutos. Después de añadir agua de maceración a un total de 300 g en la copa y de que el macerado es filtrado con un filtro plegado Whatman 597 1/2 (Schleicher & Schuell) para obtener el mosto, después el mosto puede ser analizado.

[0144] Las concentraciones de azúcar/dextrina de mosto (carbohidrato) fueron analizadas en un Sistema de HPLC de 60 Waters (método de Novozymes: 345-SM-2004,01/01) con pre-columna (catión H refill cat. 1250129) dos columnas BoiRad Aminex HPX 87 H calentadas hasta 60°C y flujo de 0,4 ml/minutos con detección RI (detector RI de Waters 2410).

[0145] RDF: Real grado de fermentación, fue determinado por el método descrito en método MEBAK: 2.9.2. Principal: 65 reducción de sustancia seca de mosto, en %, por fermentación en alcohol y CO2

[0146] NTU: opacidad en el mosto fue analizada por método MEBAK 2.15.1

[0147] En general las dosis enzimáticas son calculadas de la siguiente manera:

5

Dosificación enzimática en la dosificación meta

[0148]

Enzima: Dosificación meta / g ss Actividad específica g de proteína enzimática (EP) / 1000 kg de cebada ss.

Termamyl SC: 0,3 KNU(S)/g 43 KNU(S)/mg 6.98 g

Ultraflo Max: 300 ppm 4000 EGU/g proteína 52. 5 g

30 FXU/mg: 2.5 g

Pululanasa NS26062: 1.0 PUN/g 57 PUN(G)/mg 17.54 g

Neutrasa: 0.001 AU/g 60 AU/g 33.3 g

Lipozyme TL: 20 LU/g 6100 LU/mg 3.28 g

10

Ejemplo 1

[0149] El propósito de este ejemplo fue seleccionar la pululanasa más adecuada para la producción de mosto basado en RDF y DP2 (maltosa). Una molienda que comprende 100% de cebada no malteada se preparó como se ha descrito anteriormente. 15

[0150] A todas las copas se añadió después 50 ppm de Na2SO3 y las enzimas:

-amilasa (Termamyl SC): 0.3 KNU(S)/g,

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max/Viscoflow XL): 300 ppm, proteasa (Neutrasa 0.8) 0,002 AU/g,

Flavourzyme™ 1000 L: 0.1 LAPU/g, y 20

[0151] Pululanasa como se describe en la tabla 2:

[0152] La maceración fue realizada y a las copas se les añadió agua de ciudad a un total de 300 g después de la maceración. El macerado fue filtrado, y los resultados en la tabla 1 más abajo fueron obtenidos por análisis del mosto: 25

Tabla 1 100% cebada: RDF, % y azúcar de mosto.

Dosificación enzimática: PUN/g DP2 % de total DP4+ % de total RDF%

-: 0.00 48.7 33.2 62.0

Promozyme: 0.1 49.4 31.6 64.0

Promozyme: 0.2 49.7 30.6 65.0

Promozyme: 0.3 50.3* 29.6* 65.8*

Promozyme: 0.5 51.6 27.6 67.0

-: 0.00 48.7 33.2 62.0

NS26062: 0.1 50.0 30.2 64.6

NS26062: 0.2 50.8 28.4 66.1

NS26062: 0.3 51.3* 27.3* 67.3*

NS26062: 0.5 52.4 25.0 69.5

* estimado por regresión lineal

[0153] El RDF está por encima del 60 % con ambas pululanasas, no obstante RDF es más alto cuando se añade NS26062 (PUL C). La cantidad de maltosa (DP2) respecto a la cantidad de dextrinas (DP4) fue también más alta para 30 ambas pululanasas pero de nuevo la cantidad de maltosa con respecto a dextrinas son más altas para NS26062 (PUL C). Así en conclusión: NS26062 (pululanasa C o PulC) mostró el mejor rendimiento, en comparación con Promozyme (Promozyme 400 L) en la actividad de PUN, en la generación de RDF% y maltosa (DP2). En este experimento la ventaja del NS26062 termoestable (pululanasa C o PULC) está claramente demostrada.

35

Ejemplo 2

[0154] El siguiente ejemplo demuestra la temperatura diferente óptima y la actividad relativa a temperaturas diferentes. La actividad enzimática relativa de tres pululanasas diferentes fue analizada. El método de análisis de la actividad de pululanasa es por detección de la capacidad aumentada de azúcar reductora (reacción Somogyi-Nelson) en las 40 siguientes condiciones:

[0155] Sustrato: 0,2% pululano, pH 5,0, tiempo de reacción 30 minutos, parada de reacción de enzima añadiendo reactivo de cobre Somogyi, seguido de reactivo de color de Nelson y ebullición en 20 minutos. Muestras fueron

incubadas a 30°C, 45°C, 55°C, 60°C, 62. 5°C, 65°C y 70°C en 30 minutos. Las muestras fueron analizadas por espectrofotómetro a OD520 nm, y la diferencia entre muestra y blanco (aumentada por la actividad enzimática) fueron usadas en el cálculo de los resultados.

[0156] La máxima actividad fue establecida al 100% (máximo) y actividades a otras temperaturas se ajustan 5 relativamente al máximo de temperatura.

Tabla 2 Actividad relativa de diferentes pululanasas a temperaturas diferentes

Temperatura en 30 minutos: PulC/NS26062 % Promozyme 400 L % Promozyme D2/ Optimax 1000 L %

30°C: 19,7 20,1 34,4

45°C: 47,3 56,8 68,1

55°C: 76,8 100,0 100,0

60°C: 86,8 87,9 80,0

62.5°C: 92,8 76,9 58,4

65°C: 100,0 37,2 51,1

70°C: 75,6 8,3 11,9

[0157] Este ejemplo demuestra claramente que PUL C es la más termoestable y termoactiva de las tres pululanasas 10 puesto que tiene una significativa actividad relativa más alta por encima de 62,5 °C y puesto que la máxima actividad fue medida pasados 30 minutos a 65°C. La pululanasa PUL C tiene la actividad máxima de las tres pululanasas entre 62,5°C y 65°C, que es la temperatura preferida para maceración por tanto la utilización de PUL C como enzima desramificante en un proceso de maceración, es claramente ventajosa.

15

Ejemplo 3

[0158] El propósito de este experimento fue evaluar la dosificación eficaz de proteína enzimática (EP) por g de ss (gramo de sustancia seca) de 3 de diferentes pululanasas (NS26062/PulC, Promozyme 400 L y Promozyme D2 (Optimax 1000 L) en la sacarificación de bien 100% de cebada no malteada o 100% de cebada malteada cuando se 20 aplica en la maceración de infusión durante 2 horas.

[0159] A todas las copas se les añadió mezcla de enzimas 2 kg /1000 kg cebada:

-amilasa (Termamyl SC) 0.3 KNU(S)/g,

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max/Viscoflow XL) 300 ppm, 25

Proteasa (Neutrasa) 0.001 AU/g,

Lipasa (Lipozyme TL 20 LU/g)

[0160] Dosificaciones de pululanasas diferentes fueron añadidas.

30

[0161] Actividad específica:

NS26062: 57 PUN/mg EP.

Promozyme 400 L: 136 PUN/mg EP

Promozyme D2:236 NPUN/mg EP 35

Isoamilasa de Hayashibara Co Ltd: actividad específica desconocida

[0162] Las actividades específicas fueron medidas después de que las pululanasas fueron purificadas por técnicas cromatográficas estándares

40

[0163] Condiciones de maceración: 54°C en 30 minutos, aumento a 64°C en 10 minutos y mantener 45 minutos, aumento a 80°C en 16 minutos y mantener 10 minutos, produciendo mosto con 12,6 Plato.

Tabla 3: Efecto de pululanasa en la degradación de dextrina en 100% de maceración de cebada no malteada: que muestra % de carbohidrato no fermentable en el mosto (dextrina/DP4+) con dosificaciones diferentes (g 45 (gramo) EP (proteína enzimática) / 1000 kg cebada no malteada. Algunos experimentos fueron hechos varias veces.

gEP/1000 kg ss cebada no malteada: NS26062 PULC Promozyme 400 L Promozyme D2 Isoamilasa Hayashibara

0(control): 30,5 - 30,8% 30,5 - 30,8% 30,5 - 30,8% 30,5 - 30,8%

8,77: 20,1 - 21,4% - - -

: 22,3%

17,5: 15,4-18,8% 19,8-20,4% 27,4-27,5% -

: 17,9-18,3%

26,3: 13,6-16,1% - - -

: 16,0-16,7%

35,0: 14,9-15,5% 17,1% - -

52,5: 13,2%

87,5: - 13,2- 13,7% 21,9-22,4% -

175: - 11,8- 12,3% 18,7-19,3% -

[0164] Tabla 3 muestra que las tres pululanasas pero no la isoamilasa Hayashibara podrían reducir la cantidad de azúcares no fermentables (dextrina DP4+) y por tanto aumentar la cantidad de azúcares fermentables. No obstante, la mejor realización es claramente la pululanasa NS26062 (PUL C), que redujo la cantidad de azúcares no fermentables relativos a la cantidad de enzimas añadidas mucho más que la pululanasa 400 L y la pululanasa D2. Esta es una 5 demostración clara de la ventaja del uso de PULC termoestable. Es además demostrado que un DP4+ inferior a 20%, que corresponde a más del 80% de glucosa, maltosa y maltotriosa se puede alcanzar en 120 minutos de maceración.

[0165] Así la elección de pululanasa es importante para controlar la cantidad de azúcares fermentables y para probablemente reducir las dextrinas DP4+ no fermentables. Esto es importante desde un buen perfil de azúcar (muchos 10 azúcares fermentables en comparación con azúcares no fermentables) promueven una buena fermentación del mosto.

Ejemplo 4

[0166] El propósito de este ejemplo fue evaluar el efecto de la pululanasa NS26062 en la formación de DP2 (maltosa) en 15 el mosto. Una molienda que comprende 100% de cebada no malteada se preparó como se ha descrito anteriormente.

[0167] A todas las copas se les añadió luego 50 ppm Na2SO3 + 3,0 ml 1 M H3PO4 y enzimas:

-amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g,

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max/Viscoflow XL): 300 ppm 0,23 EGU/g, 20

Proteasa (Neutrasa 0,8 L): 0,002 AU/g,

[0168] Pululanasas como se describe en la tabla 4:

[0169] La maceración fue realizada y a las copas se les añadió agua de ciudad hasta un total de 300 g después de la 25 maceración. El macerado fue filtrado, y los resultados en la tabla 4 más abajo fueron obtenidos por análisis del mosto:

Tabla 4. 100% cebada: RDF, % y azúcar de mosto.

Dosificación enzimática: PUN/g (NS26062) DP1 % de total DP2 % de total DP4+ % de total RDF %

-: 0 3,8 47,5 34,0 61,2

NS26062: 0,1 3,8 48,2 32,0 63,2

NS26062: 0,3 3,8 49,8 28,8 65,7

NS26062: 0,5 3,7 26,4 68,6

NS26062: 1 3,7 52,6 23,9 71,0

NS26062: 2 3,6 55,6 20,1 74,3

[0170] La concentración de maltosa (DP2) fue aumentada mediante el aumento de la dosificación de NS26062 (PUL C), 30 y el aumento en % de maltosa fue seguido de un aumento en la atenuación (RDF%). La fracción de dextrina (Análisis de HPLC DP4/4+) fue al mismo tiempo decreciente.

[0171] Solo -amilasa de cebada podría producir maltosa en esta reacción, y NS26062 (PUL C) facilitó la acción de la beta-amilasa de cebada. 35

[0172] Así el NS26062 (PUL C) fue una pululanasa adecuada, proporcionando un mosto con alto RDF y glucosa baja.

Ejemplo 5

40

[0173] El propósito de este ejemplo fue evaluar las tres proteasas Neutrasa 0.8 L, Alcalase y Flavourzyme para desarrollo de FAN y formación de maltosa. Una molienda que comprende 100% de cebada no malteada se preparó como se ha descrito anteriormente. Luego a todas las copas (ensayos 1-3 más abajo) se les añadió enzimas como se indica en las tablas 5-7 más abajo. La maceración fue realizada y a las copas se les añadió agua de ciudad hasta un total de 300 g después de la maceración. El macerado fue filtrado, y los resultados en las tablas 5-7 fueron obtenidos 45 por análisis del mosto:

Prueba 1:

[0174] A todas las muestras se les añadió: -amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g, -glucanasa y xilanasa (Ultraflo 50 Max): 300 ppm (0,23 EGU/g) y actividades diferentes de las proteasas Alcalasa y Neutrasa 0,8 L como se indica en la tabla 5.

Tabla 5. FAN y % azúcar de mosto en dosificaciones diferentes de Alcalasa y Neutrasa 0.8 L (actividad enzimática por g ss de macerado)

Copa nº.: Alcalasa AU/g Neutrasa 0.8 L AU/g FAN mg/l/Plato DP2 % de total DP4/4+ % de total

1: - - 5,05 42,2 37,4

2: - 0,0005 6,73 45,4 35,5

3: - 0,001 7,32 44,6 35,8

4: - 0,0015 7,92 46,5 34,4

5: - 0,002 8,33 46,0 34,7

6: - 0,003 9,00 46,1 34,6

7: 0,001 0,002 8,59 46,1 34,6

8: 0,002 0,002 8,38 45,9 34,7

9: 0,0025 0,002 8,35 46,5 34,3

10: 0,003 0,002 8,59 46,9 34,1

11: 0,004 0,002 8,92 46,6 34,2

12: 0,005 0,002 9,29 47,1 34,0

Prueba 2: 5

[0175] A todas las muestras se les añadió: -amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g, -glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max): 300 ppm (0,23 EGU/g), Flavourzyme: 0,1 LAPU/g,y las proteasas Alcalasa y/o neutrasa 0,8 L como en la tabla indicada 6.

10

Tabla 6. FAN y % azúcar de mosto a dosificaciones diferentes de Alcalasa y Neutrasa 0.8 L (actividad enzimática por g ss de macerado)

1: - - 5,47 43,8 36,0

2: - 0,0005 6,75 46,4 34,3

3: - 0,001 7,20 47,5 33,7

4: - 0,0015 7,57 47,1 33,8

5: - 0,002 8,26 47,3 33,7

6: - 0,003 8,64 47,3 33,6

7: 0,001 0,002 9,09 47,1 33,9

8: 0,002 0,002 8,46 48,2 33,1

9: 0,0025 0,002 8,64 47,9 33,4

10: 0,003 0,002 8,49 47,3 33,8

11: 0,004 0,002 8,96 47,5 33,6

12: 0,005 0,002 10,15 47,4 33,7

Prueba 3:

15

[0176] A todas las muestras se les añadió: -amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g, -glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max): 300 ppm0,23 EGU/g, Flavourzyme: 0,1 LAPU/g, y las proteasas Alcalasa o Neutrasa 0,8 L como se indica en la tabla 7.

Tabla 7. FAN y % azúcar de mosto a dosificaciones diferentes de Alcalasa y Neutrasa 0.8 L (actividad enzimática 20 por g ss de macerado)

1: - - 5,24 44,8 35,3

2: 0,001 5,37 44,8 35,3

3: 0,002 5,02 44,6 35,4

4: 0,0025 5,20 45,7 34,6

5: 0,003 5,29 44,2 35,7

6: 0,004 5,66 44,4 35,0

7: 0,005 5,91 45,0 35,0

8: - 0,002 5,66 44,4 35,5

9: 0,004 0,001 8,45 47,1 33,9

10: 0,004 0,0015 8,96 47,7 33,4

11: 0,004 0,002 9,65 48,3 33,0

12: 0,004 0,003 10,25 48,7 32,6

[0177] Estos ejemplos claramente demuestran que la adición de las proteasas Alcalasa y Neutrasa pero no Flavorzyme tiene un efecto positivo en la generación de amino nitrógeno libre disponible particular (FAN) y que la Neutrasa tuvo el efecto más positivo en la generación de FAN. Así la elección de proteasa es un parámetro crítico para generación de FAN.

5

Ejemplo 6

[0178] Una molienda que comprende 0-90% de cebada no malteada se preparó como se ha descrito anteriormente. Luego a todas las copas se añadieron las enzimas -glucanasa y xilanasa. La maceración fue realizada y a las copas se les añadió agua de ciudad a un total de 300 g después de la maceración. El macerado fue filtrado, y los resultados en la 10 tabla 8 fueron obtenidos por análisis del mosto:

[0179] El siguiente experimento es demostrar el efecto en la turbidez (NTU) con el aumento de la cantidad de cebada no malteada, cuando solo se añade mezcla de enzimas de filtración -glucanasa y xilanasa (UI-traflo Max 300 ppm).

15

Tabla 8. NTU cuando la cantidad en aumento de cebada de malta se sustituye con cebada no malteada, del 0 % de cebada no malteada al 90 % de cebada no malteada.

: % de cebada NTU

1: 0 19.8

2: 8 19.7

3: 16 15.3

4: 24 12.4

5: 32 12

6: 40 10.2

7: 48 10.8

8: 56 8.43

9: 64 10.9

10: 72 21

11: 80 35.7

12: 90 56.2

[0180] El resultado está también mostrado en la figura 1. Es evidente de este experimento que el macerado de cebada 20 no malteada con mezclas de enzimas simples (sólo enzimas de filtración) se vuelve cada vez más difícil con cantidad en aumento de cebada no malteada se sustituye por cebada malteada y cuando la cantidad excede 80 % la turbidez es tan alta que el mosto es difícil de filtrar. Así cuando se tiene alta cantidad de cebada no malteada solo la adición de enzimas de filtración no es suficiente para obtener un mosto que es filtrable.

25

Ejemplo 7

[0181] El propósito de este ejemplo fue evaluar la turbidez (NTU) y la filtración de mosto de 100% maceración de infusión de cebada con una dosificación diferente de Lipopan F, Lipopan X y -glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max). El estudio comprendió dos ensayos independientes para Lipopan F y Lipopan X, respectivamente, es decir 2 x 12 copas 30 como se indica en la tabla 9 más abajo. Una molienda que comprende 100% de cebada no malteada se preparó como se describe previamente. Luego a todas las copas se les añadió enzimas.

[0182] A cada copa se añadió:

- 3.0 ml 1 M H3PO4. 35

- 0.3 KNU(S)/g -amilasa (Termamyl SC),

- 0.002 AU/g proteasa (Neutrasa 0.8 L),

- 0.5 PUN/g de pululanasa (NS26062), y las enzimas en la tabla 9.

[0183] La maceración fue realizada y a las copas se les añadió agua de ciudad hasta un total de 300 g después de la 40 maceración. El macerado fue filtrado, y los resultados en la tabla 9 más abajo fueron obtenidos por análisis del mosto:

Tabla 9. Dosis de enzima actividad/g SS en la maceración

Copa nº.: Ultraflo Max EGU/g Lipopan F LU/g Lipopan X LU/g NTU Filtración ml/10 min Filtración ml final

1: 0,24 - 116 105 194

2: 0,24 1 120 86,0 165

3: 0,24 5 78,3 110 195

4: 0,24 10 66,1 131 195

5: 0,24 20 50,1 168 210

6: 0,24 50 22,7 190 210

7: 0,16 50 19,7 170 208

8: 0,08 50 19,8 178 205

9: - 50 18,5 142 195

10: 0,16 10 67,8 114 200

11: 0,08 10 69,2 130 200

12: - 10 49,7 95 180

1: 0,24 - 110 105 200

2: 0,24 1 92,0 70,0 165

3: 0,24 5 50,0 100 200

4: 0,24 10 107 94,0 198

5: 0,24 20 5,91 135 205

6: 0,24 50 3,36 160 210

7: 0,16 50 3,53 150 205

8: 0,08 50 3,84 151 205

9: - 50 4,96 100 200

10: 0,16 10 24,9 110 200

11: 0,08 10 21 110 200

12: - 10 8,9 75 180

[0184] Ambas lipasas Lipopan F y Lipopan X redujeron marcadamente la turbidez (NTU) del mosto. Lipopan X es la más eficaz (en la actividad enzimática LU(g)) para la reducción de la turbidez en el mosto, pero Lipopan F puede reducir la turbidez a un nivel en la especificación de mosto. La cantidad de enzimas de filtración se puede reducir a 100 ppm en presencia de lipasa sin reducir la velocidad de filtración significativamente. 5

Ejemplo 8

[0185] El propósito de este ejemplo fue evaluar el efecto de la proteasa Neutrasa 0,8,L, fitasa y la pululanasa NS26062 (Pul C) en la generación de FAN y el perfil de azúcar de mosto en una maceración estándar. Una molienda que 10 comprende 100% de cebada no malteada se preparó como se ha descrito anteriormente. Luego a todas las copas se les añadió -amilasa (Termamyl SC) 0.3 KNU(S)/g, 300 ppm -glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max), ajustadas a pH 5.3, y las enzimas proteasa Neutrasa 0.8, la fitasa y la pululanasa NS26062 (Pul C), se añadieron como se indica en las Tablas 10A y 10B más abajo, y los resultados obtenidos:

15

Tabla 10A. 100% cebada: generación de FAN en el mosto. Las dosificaciones es la unidad de actividad enzimática y ppm (100 ppm=100g/1000 kg cebada no malteada). FYT es unidad de fitasa, PUN es actividad de pululanasa y AU es actividad proteolítica.

Dosificaciones enzimáticas: FAN mg/l/Plato

0: 5,09

1,5 FYT: 5,09

0,5 PUN: 5,11

1,5 FYT + 0,5 PUN: 5,22

0,002 AU: 8,58

0,002 AU + 1,5 FYT: 7,53

0,002 AU + 0,5 PUN: 7,85

0,002 AU + 1,5 FYT + 0,5 PUN: 7,91

0,002 AU + 0,5 PUN + 0,5 FYT: 7,87

0,002 AU + 0,5 PUN + 5 FYT: 7,77

0,001 AU + 0,5 PUN + 5 FYT: 7,35

Tabla 10B. 100% cebada: perfil de azúcar de mosto. 20

Dosificación enzimática Neutrasa 0.8 L (AU): DP1 % DP2 % DP3 % DP4/4+ % Fru %

0: 4,15 31,80 14,82 38,13 1,82

0,002 AU: 3,81 46,61 12,79 34,97 1,82

1,5 FYT: 4,13 42,11 14,78 37,14 1,85

0,5 PUN: 4,06 44,28 18,28 31,55 1,82

0: 4,15 31,80 14,82 38,13 1,82

5,0 FYT + 0,5 PUN: 4,14 47,01 18,17 28,82 1,86

5,0 FYT + 0,5 PUN + 0,001 AU: 3,84 50,67 17,42 26,25 1,80

5,0FYT+0,5PUN+ 0,002 AU: 3,88 49,26 17,61 27,41 1,83

0: 4,15 31,80 14,82 38,13 -

0,002 AU: 3,81 46,61 12,79 34,97 -

0,002 AU + 0,5 PUN: 3,81 47,78 17,74 28,87 -

0,002 AU + 0,5 PUN + 0,5 FYT: 3,88 49,26 17,61 27,41 -

0,002 AU + 0,5 PUN + 1,5 FYT: 3,91 50,12 17,56 26,58 -

0,001 AU + 0,5 PUN + 5,0 FYT: 3,84 50,67 17,42 26,25 -

[0186] Tabla 10 A muestra que la proteasa aumenta FAN en el mosto, y tabla 10 B muestra que cuando se añade fitasa y pululanasa a la proteasa una cantidad alta comparable de DP1-DP3 podría ser generada con concentraciones de proteasa de 0,001 y 0,002 AU respectivamente. Así la concentración de proteasa podría ser reducida en la producción de mosto de maltosa cuando la fitasa y pululanasa está presente sin reducir la cantidad de azúcares fermentables (DP1-DP3). 5

Ejemplo 9

[0187] El propósito de este ejemplo fue dilucidar algunos parámetros generales referentes al mosto preparado en 100% de cebada no malteada para identificar cuestiones fundamentales en comparación con el mosto preparado en la cebada 10 malteada.

[0188] Maceración de malta (100%) sin enzima añadida y maceración de cebada no malteada (100%), con mezcla enzimática. El mosto fue hervido, y la fermentación de cerveza ufe realizada con 100% de malta (cebada) y un 100% de mosto de cebada no malteada. 15

Datos:

[0189] Maceración:

20

Cebada: escarlata y malta del mismo lote de escarlata.

Macerado: 10 kg de malta o cebada, + 35 l de licor de macerado y burbujeos 25 l hasta un total de 60 L.

Perfil: 54°C 30 minutos, aumento a 64°C (1 °C/minuto) y mantener durante 60 minutos, aumentar a 80°C (1 °C/minuto) y mantener durante 10 minutos y transferir para filtración.

25

[0190] Mezcla de enzimas en 100% de macerado de cebada:

-amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g ss

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max): 300 ppm

Proteasa (Neutrasa 0.8 L): 0,0015 AU/g ss

Pululanasa (NS26062, Pul C): 1,0 PUN/g ss 30

[0191] Composición del aminoácido de mosto (Tabla 11) analizado:

[0192] El aminoácido libre analizado en el mosto se organiza según el papel "Elucidation of the Role of Nitrogenous Wort Components in yeast Fermentation," (J. Inst. Brew. 113(1), 3-8,2007) 35

Tabla 11. FAN en el mosto

: Mosto de cebada malteado Mosto de cebada no malteado

Grupo A, absorción rápida:: nM nM

ácido aspártico: 0,076 0,151

ácido glutámico: 0,244 0,210

Asparagina: 0,310 0,273

Serina: 0,007 0,187

Glutamina: 0,074 0,048

Treonina: 0,210 0,188

Arginina: 0,149 0,265

Lisina: 0,216 0,354

Suma: 1,286 1,675 (130%)

Grupo B, absorción intermedia:

Valina: 0,245 0,252

Metionina: 0,047 0,111

Leucina: 0,236 0,446

Isoleucina: 0,114 0,163

Histidina: 0,157 0,091

Suma: 0,798 1,064 (133%)

Grupo C, absorción lenta:

Glicina: 0,149 0,158

Fenilalanina: 0,196 0,206

Tirosina: 0,131 0,158

Triptófano: 0,087 0,062

Alanina: 0,312 0,361

Suma: 0,875 0,945 (108%)

40

Grupo D, poca o ninguna absorción

Prolina: 2,500 0,413 (16,5%)

Total - suma: 5,458 4,098

[0193] Tabla 11 muestra que cuando la maceración con 100 % cebada no malteada y una mezcla enzimática que comprende actividad de -amilasa, actividad de -glucanasa, actividad de proteasa y una actividad de pululanasa un mosto se puede producir que tiene considerablemente menos que para la prolina de aminoácido inutilizable de levadura, 5 que es claramente ventajosa puesto que la presencia de este aminoácido en un producto de cerveza da un sabor desagradable. Además, la cantidad de aminoácidos en los grupos A y B, que podría ser rápidamente metabolizada por la levadura, es considerablemente aumentada cuando la maceración de cebada no malteada y la mezcla enzimática que comprende actividad de -amilasa, actividad -glucanasa, actividad de proteasa y una pululanasa. Así está claro de este ejemplo que la concentración de prolina es inferior a 2 mM, y la concentración de serina y de metionina está por 10 encima de 0,1 mM y 0,05 mM respectivamente.

Ejemplo 10

[0194] El siguiente experimento analiza el mosto obtenido de molienda comprendiendo el 100 % de cebada no malteada 15 y 100 % de malta. Los ensayos han sido ejecutados en Ziemann GmbH, Ludwigburg, Alemania. Todo análisis ha sido hecho según el Analytica EBC o MEBAK respectivamente. (van Erde, P., Analytica-EBC. 1998, Nürnberg: Verlag Hans Carl.; Anger, H., MEBAK Band Rohstoffe. 1. Auflage ed. Brautechnische Analysenmethoden. 2006, Freising: Selbstverlag der MEBAK).

20

[0195] La cebada usada fue una cebada de primavera de dos carreras de cosecha de Alemania 2008.

[0196] Las enzimas añadidas fueron:

-amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g cereal 25

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max): 300 ppm

Proteasa (Neutrasa 0.8 L): 0.001 AU/g ss

Pululanasa (NS26062, Pul C): 2.0 PUN/g ss

Lipasa (Lipozyme TL 100): 20 LU/g ss

30

[0197] El perfil de maceración usado fue 54 °C a 30 min; aumentar la temperatura 1°C/min hasta 64°C y reposar durante 60 min aumentar la temperatura 1°C/min hasta 78 °C y reposar durante 30min, tiempo de maceración total 144 min.

Tabla 12 Composición de mosto de 100 % de fermentaciones de cebada en comparación con todas las especificaciones de malta 35

Análisis: Unidad Método 100% cebada no malteada 100 % cebada malteada

Viscosidad (1,2 %): MPas MEBAK II 1,76 < 1.8

Valor de yodo: MEBAK II 0,28 < 0.35

RDF: % MEBAK II 69,2 68- 72

sol Nitrógeno (12 %): Mg/100 ml MEBAK II 102,5

FAN (12 %): ppm MEBAK II 180

Turbidez: EBC MEBAK II < 80 NTU < 80 NTU

[0198] Los resultados muestran 100 % de cebada no malteada en combinación con la mezcla enzimática que comprende actividad de -amilasa, actividad de -glucanasa, actividad proteolítica y actividad desramificante de pululanasa puede completamente corresponder con toda la especificación de malta en todos los parámetros clave como viscosidad, turbidez, suministro de amino nitrógeno libre, rendimiento y atenuación final están dentro de todas las 40 especificaciones de malta (100 % malta).

[0199] El rendimiento de filtración fue también investigado. La turbidez en el mosto de filtración describe la calidad del rendimiento de filtración. El componente de lipasa en la mezcla enzimática fue capaz de reducir el nivel de neblina más alto normalmente significativo de métodos de cebada no malteada hasta niveles de opacidad por debajo de 80 NTU 45 dentro de un tiempo de filtración comparable.

[0200] También el rendimiento de fermentación fue evaluado: 8 hl de mosto de 100 % malta y 8 hl de mosto de 100 % de cebada no malteada fueron fermentados. El resultado se demuestra en figura 2.

50

[0201] Ambos mostos han sido fermentados con cepa de levadura de fermentación de fondo W34, La Figura 2 muestra la caída de extracto comparable de ambas fermentaciones. Además, no se encontraron diferencias en la producción de etanol.

[0202] Finalmente la cerveza de cebada ha sido probada por un grupo profesional de catadores en el instituto para 55

tecnología de elaboración de cerveza 1 en Weihenstephan, Alemania. Los resultados muestran el resultado comparable a una cerveza estándar de fermentación baja con indicaciones de estabilidad de sabor mejorada.

Tabla 13. Evaluación de sabor Weihenstephan de 100 % cerveza de cebada no malteada

: 100 % cebada no malteada 100 % cebada no malteada 100 % cebada no malteada 100 % cebada no malteada

Fresco: Envejecido forzado Fresco Envejecido forzado

Sabor: 4,0 3,5 3,8 3,5

Sabor: 4,0 3,4 3,8 3,4

Cuerpo: 4,0 3,8 4,0 3,8

Total de amargura: 4,1 3,9 4,1 3,9

Total: 4,03 3,61 3,91 3,56

5

Evaluación General: DLG 5 = muy buena, 1 inaceptable.

Ejemplo 11

[0203] Los siguientes ejemplos fueron para evaluar parámetros importantes diferentes cuando la maceración en una 10 molienda que comprende 30% de molienda de maíz o arroz (no malteado) con 70% de macerado principal de cebada no malteada y una mezcla enzimática que comprende actividad -amilasa, actividad de -glucanasa, actividad de proteasa y una pululanasa.

[0204] El proceso usado fue maceración, decocción donde el arroz o parte de molienda de maíz fueron hervidos con -15 amilasa termoestable y luego mezclados con el macerado que comprende cebada no malteada. Las enzimas añadidas al 70% de macerado de cebada + 30 % de molienda de maíz o arroz:

-amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g ss

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max): 300 ppm (0,23 EGU/g)

Proteasa (Neutrasa 0.8 L): 0,001 y 0,002 AU/g ss 20

[0205] Pululanasa fue también añadida al macerado de cebada no malteado y la concentración fue variada, ver tabla 14 y 15, la pululanasa añadida es (NS26062, Pul C).

[0206] La maceración fue realizada de la siguiente manera: la cebada molida se añadió a la maceración, la copa (40,0 g 25 como está) y se añadieron 115 g de agua a 60°C, CaCl (330 g/1000 kg cebada) se añadió además con la mezcla enzimática indicada arriba. La mezcla fue mantenida a 54°C durante 30 minutos, luego se agregó el macerado de decocción (15,4 g ss) y la temperatura fue mantenida a 64°C en 60 minutos, aumentada a 80°C y mantenida 10 minutos, enfriada y filtrada. Todas las maceraciones podrían ser filtradas sin problema ni ninguna diferencia significativa entre la dosificación de enzimas diferentes. 30

[0207] La preparación del macerado de decocción fue realizada de la siguiente manera: el arroz o molienda de maíz fue mezclado con agua (5,66 parte) a una temperatura de 60°C - 70°C, CaCl2 (220 g/1000 kg molienda) fue añadido además con una -amilasa (Termamyl SC 0,600 kg/1000 kg molienda). La mezcla fue calentada a 85°C y mantenida a esta temperatura durante 20 minutos, el calor fue aumentado 100°C (de ebullición) y mantenido a esta temperatura 35 (hirviendo) durante 15 minutos. La mezcla fue enfriada a 80°C y mezclada con el macerado que contiene cebada.

[0208] La maceración fue realizada y a las copas se les añadió agua de ciudad hasta un total de 300 g después de la maceración. El macerado fue filtrado, y los resultados en la Tabla 14 más abajo fueron obtenidos por análisis del mosto. En algunos ejemplos el mosto fue hervido 10 minutos diluido 9.7 Plato y fermentado por fermentación forzada, Analytica 40 - EBC nr. 8.6.

Tabla 14: FAN, RDF y contenido de azúcar de un mosto de macerado basado en decocción de 30 % molienda de maíz y 70 % de macerado de cebada no malteada que se mezclan.

Copa Nº: Neutrasa AU/g NS26 062 PUN / 9 Perfil de carbohidrato de mosto en% Plato° FAN ppm RDF%

DP1:: DP2: DP3: DP4+:

1: 0,001 - 5,17 54,31 12,02 28,50 14,48 106 64,4

2: 0,001 0,5 5,47 58,23 14,73 21,56 14,45 106 70,7

3: 0,001 1,0 5,48 60,48 15,79 18,25 14,54 107 73,6

4: 0,001 1,5 5,59 61,77 16,35 16,29 14,45 107 75,3

5: 0,001 2,0 5,57 62,88 16,66 14,89 14,49 108 76,5

6: 0,001 2,5 5,60 63,35 16,96 14,09 14,46 106 77,2

7: 0,002 - 5,54 54,29 12,50 27,67 14,28 131 64,6

8: 0,002 0,5 5,60 58,37 15,13 20,90 14,34 131 70,8

9: 0,002 1,0 5,53 60,43 16,10 17,93 14,83 129 73,8

10: 0,002 1,5 5,66 61,83 16,58 15,93 14,34 130 75,3

11: 0,002 2,0 5,66 62,71 16,92 14,70 14,33 131 76,4

12: 0,002 2,5 5,73 63,21 17,18 13,88 14,31 130 77,3

Tabla 15: FAN, RDF y contenido de azúcar de un mosto de macerado basado en decocción del 30 % de molienda de arroz y 70 % de macerado de cebada no malteada que se mezclan.

Copa nº: Neutrasa AU/g NS26 062 PUN / g Perfil de carbohidrato de mosto en % Plato° FAN ppm RDF%

DP1:: DP2: DP3: DP4+:

1: 0,001 - 5,37 53,14 12,33 29,16 14,37 103 62,0

2: 0,001 0,5 5,40 57,06 15,03 22,50 14,75 104 68,8

3: 0,001 1,0 5,57 59,18 16,02 19,24 14,53 106 72,1

4: 0,001 1,5 5,57 60,72 16,65 17,15 14,61 1,04 74,1

5: 0,001 2,0 5,59 61,64 17,00 15,77 14,51 104 75,5

6: 0,001 2,5 5,65 62,38 17,28 14,67 14,52 105 76,6

7: 0,002 - 5,50 53,23 12,79 28,48 14,45 125 62,4

8: 0,002 0,5 5,55 57,09 15,28 22,08 14,45 124 69,0

9: 0,002 1,0 5,65 59,17 16,32 18,86 14,44 126 72,1

10: 0,002 1,5 5,68 60,38 16,95 16,99 14,45 127 73,9

11: 0,002 2,0 5,67 61,37 17,38 15,58 14,45 126 75,3

12: 0,002 2,5 5,72 62,11 17,56 14,59 14,39 127 76,7

[0209] Tabla 14 y 15 muestran el perfil de azúcar, Plato, FAN y RDF del mosto basado en maceración de una molienda 5 que comprende 30 % de maíz o arroz y 70 % de cebada no malteada (100 % granos no malteados). El resultado muestra claramente que la cantidad de azúcares fermentables (DP1-3) es muy alta (encima del 80 %), el RDF está por encima del 60 % y en aumento con concentración de pululanasa en aumento y FAN es alto y en aumento con concentración de proteasa en aumento, cuando el mosto se produce del 100 % de granos no malteados comprendiendo 70 % de cebada no malteada y 30 % de molienda de maíz no malteada o arroz y una mezcla enzimática que comprende 10 actividad de -amilasa, actividad de -glucanasa, actividad de proteasa y una pululanasa. No había ninguna diferencia significativa entre usar arroz o molienda de maíz.

Ejemplo 12

15

[0210] Los siguientes ejemplos fueron para evaluar parámetros importantes diferentes en la maceración en una molienda que comprende 50% cebada + 50% macerado de trigo y las siguientes enzimas.

-amilasa (Termamyl SC): 0,3 KNU(S)/g ss (sustancia seca)

-glucanasa y xilanasa (Ultraflo Max): 300 ppm/0,23 EGU/g ss

Proteasa (Neutrasa): 0,001 AU/g ss 20

Lipasa (Lipozyme TL): 20 LU/g ss

Pululanasa (NS26062, Pul C): 0-3,0 PUN/g ss

[0211] En un ejemplo la concentración de pululanasa fue variada, ver tabla 17, la pululanasa añadida es (NS26062, Pul C). 25

[0212] En los otros dos ejemplos la concentración de mezcla enzimática pr kg de materia prima fue variada, ver tabla 18.

[0213] El macerado se preparó mediante la mezcla de cebada molida y trigo (25 g de cada uno (total 50,0 g) con 200 g de agua añadido a las copas de maceración, luego Ca2+ y la mezcla enzimática arriba indicada fueron añadidas y la 30 maceración comenzó.

[0214] El perfil de maceración fue de la siguiente manera: el macerado fue calentado a 54°C (1°C/min.) y mantenido a esa temperatura durante 30 minutos, la temperatura fue aumentada a 64°C dentro de 10 minutos y mantenido a esa temperatura durante 45 minutos, la temperatura fue aumentada a 80°C dentro de 16 minutos y mantenido a esa 35 temperatura durante 10 minutos. Agua hasta 300 g total fue añadido y el macerado fue filtrado.

[0215] El mosto fue filtrado y en algunos ejemplos el mosto fue hervido 10 minutos diluido 9,7 Plato y fermentado por fermentación forzada.

40

[0216] Los resultados se muestran en la figura 3 y en la tabla 16 y 17.

Tabla 16: la mezcla enzimática fue como se ha descrito anteriormente Termamyl SC, Ultraflo Max, Neutrasa, y Lipozyme TL con concentraciones diferentes (PUN/g) de pululanasa (NS26062) añadidas.

Enzimas: Filtración Plato pH NTU RDF%

ml después 10 minutos: ml total

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la producción de un mosto de cerveza, comprendiendo:

a. obtener un macerado por maceración de una molienda, del cual al menos 70% en peso es(son) cereal(es) no malteado(s) que comprende -amilasa y del cual menos del 30%peso es(son) cereal(es) malteado(s), a una 5 temperatura en la que enzimas (añadidas) exógenas y la -amilasa endógena están activas;

b. contactar el macerado con enzimas exógenas comprendiendo:

i. una -amilasa,

ii. una pululanasa,

iii. una proteasa, 10

iv. una -glucanasa,

v. una lipasa, y

vi. una xilanasa;

c. fin de la maceración y filtración del macerado para obtener el mosto.

15
2. Proceso según la reivindicación 1, donde la molienda comprende al menos 75% en peso de cereal(es) no malteado(s).
3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, donde el(los) cereal(s) no malteado(s) son cebada, espelta, trigo, centeno, maíz, avena o arroz o cualquier mezcla de los mismos. 20
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde el cereal no malteado es cebada.
5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molienda comprende además otras fuentes de carbohidratos tales como, jarabes de elaboración de cerveza. 25
6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las enzimas exógenas del paso b. en la reivindicación 1 además comprenden una fitasa.
7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la temperatura de maceración está en una gama 30 que optimiza la -amilasa.
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteasa está provista por un sistema de enzimas proteolíticas, incluyendo endoproteasas, exopeptidasas o cualquier combinación de las mismas.

35
9. Proceso según la reivindicación 1, donde la lipasa está provista por una lipasa de Fusarium, Aspergillus o Rhizopus.
10. Uso de un proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la producción de cerveza.