BR112012011106B1

BR112012011106B1 - Método de mosturação

Info

Publication number: BR112012011106B1
Application number: BR112012011106-0A
Authority: BR
Inventors: Anne Mette Bhatia Frederiksen; Lars Beier; Stefan Kreisz
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2019-09-17
Also published as: PL2499227T3; BR112012011106C8; ES2539726T3; BR112012011106A2; DK2499227T3; US20120225164A1; BR112012011106B8; HUE026116T2; WO2011058105A1; EP2499227A1; ZA201202726B; CN102639687A; EP2499227B1

Abstract

"método de mosturação, uso de uma pululanase, e, composição enzimática" é revelado um método de mosturação que compreende fornecer um grão para moagem compreendendo malte e adjunto, e colocar o grão para moagem em contato com uma pululanase, uma alfa amilase e uma alfa amilase e/ou uma beta amilase maltogênica para preparar um mosto. uma composição enzimática compreendendo uma pululanase, uma alfa amilase e uma alfa amilase e/ou uma beta amilase maltogênica, e o uso destas enzimas na brassagem.

Description

“MÉTODO DE MOSTURAÇÃO”

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível em computador. A forma legível em computador é aqui incorporada 5 pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito à brassagem. Diz respeito ao uso de uma combinação de uma pululanase, uma alfa amilase e uma alfa amilase maltogênica e/ou uma beta amilase para brassagem. Também diz respeito ao 10 uso de uma alfa amilase maltogênica tolerante à sacarose para brassagem.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os processos de brassagem são bem conhecidos na técnica. Envolve as etapas de preparar o malte, mosturação e fermentação/maturação. Resumidamente; durante o preparo do malte, permite-se que os grãos 15 germinem e então sejam secos e opcionalmente torrados. O processo de preparar o malte causa a ativação de inúmeras enzimas no grão que pode converter o amido no grão em açúcar. Antes da mosturação, o malte é esmagado para formar o grão para moagem, que é misturado com água para formar uma mistura e então enviado para a mosturação. A mosturação é o 20 processo de converter amido na mistura em açúcares fermentáveis e não fermentáveis. O processo de mosturação é conduzido por um período de tempo em várias temperaturas, a fim de ativar as enzimas endógenas responsáveis pela degradação de proteínas e carboidratos. As enzimas exógenas também podem ser adicionadas durante o processo de mosturação 25 para acelerar as reações e possibilitar melhor controle no processo de brassagem. Próximo ao final da mosturação, a temperatura pode ser aumentada para cerca de 75 °C (165-170 °F) (conhecida como uma degradação do amido residual). Após a mosturação, o líquido resultante é coado a partir dos grãos em um processo conhecido como filtração da

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 12/40 mistura. O líquido resultante da filtração da mistura é conhecido como mosto. O mosto, que é rico em açúcares, é então fervido com lúpulos, resfriado e então fermentado em etanol usando levedura. A cerveja resultante é condicionada por uma semana a vários meses, e então embalada.

Embora a cerveja tradicionalmente seja fermentada apenas a partir do malte de cevada, lúpulo e água, o malte é uma matéria prima cara em decorrência de exigir grãos de qualidade superior, água para germinação e energia para secagem/torração dos grãos. Tradicionalmente, em torno de 2530 % de grãos não maltados, também denominados adjuntos, tais como milho, 10 arroz, sorgo e trigo, amido refinado ou carboidratos facilmente fermentáveis, tais como açúcar ou xaropes, são também incluídos no grão para moagem. Os adjuntos são usados principalmente em decorrência de serem facilmente disponíveis e fornecerem carboidratos em um custo menor do que é disponível a partir do malte de cevada. Outras vantagens também podem ser 15 atingidas, por exemplo, melhor estabilidade física, qualidades superiores de tratamento para evitar turbidez em exposição ao frio e maior brilho. Entretanto, quando os adjuntos com maiores temperaturas de gelatinização, por exemplo, milho ou arroz, são usados, eles têm que ser cozidos e gelatinizados em um fogão industrial para cereal separado, antes de serem 20 adicionados na mistura de malte e antes da sacarificação. Assim, enquanto o uso de adjunto reduz os custos do preço da matéria prima, este exige investimento adicional no fogão industrial para cereal, bem como um custo adicional com relação à energia para tratar o adjunto. Estas exigências caras adicionais têm desanimado os fabricantes de cerveja de aumentar a razão de 25 adjunto, e também de usar diferentes adjuntos de escolha em seu processo de brassagem.

Atualmente, existe uma mudança acentuada nos preços da matéria prima causada pela demanda aumentada dos grãos, diminuição da água global, mudança nos padrões climáticos, etc. Isto tem forçado a indústria

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 13/40 da brassagem a focar na eficiência de produção, bem como na economia de matéria prima.

Existe uma necessidade de melhores processos na brassagem que reduzirão os custos e/ou aumentarão a eficiência de produção. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores observaram surpreendentemente que uma combinação de uma pululanase, uma alfa amilase, e tanto uma alfa amilase maltogênica quanto uma beta amilase ou ambas podem resultar em melhores eficiências de produção. Isto facilita a inclusão de um maior percentual de adjuntos durante a brassagem, melhora o perfil de sacarificação e também resulta em uma cerveja que é substancialmente similar a uma cerveja fabricada de uma maneira tradicional.

Os inventores também observaram surpreendentemente que, quando uma combinação como esta é usada, existe maior economia de energia em decorrência dos processos poderem ser realizados em uma temperatura inferior e o cozimento do cereal poder ser dispensado.

Os inventores também observaram surpreendentemente que existe maior eficiência de produção e menores custos quando a alfa amilase maltogênica também é tolerante à sacarose.

Assim, em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de mosturação que compreende:

a) fornecer um grão para moagem que compreende malte e adjunto, e

b) colocar o grão para moagem em contato com:

i) uma pululanase;

ii) uma alfa amilase, e iii) uma alfa amilase maltogênica e/ou uma beta amilase para preparar um mosto.

Em um aspecto, o mosto é convertido em cerveja.

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Em um outro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de uma alfa amilase maltogênica tolerante à sacarose na brassagem.

Em um aspecto, a invenção diz respeito ao uso de uma pululanase, uma alfa amilase e uma alfa amilase maltogênica e/ou uma beta amilase na brassagem.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição enzimática compreendendo uma pululanase, uma alfa amilase, e uma alfa amilase maltogênica e/ou uma beta amilase.

Em um aspecto, a amilase maltogênica é uma amilase maltogênica com pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO 1.

Em um outro aspecto, a alfa amilase apresenta pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO 2.

Em um aspecto, a pululanase apresenta pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO 3.

Em um aspecto, a beta amilase apresenta pelo menos 70 % de identidade com SEQ ID NO 4.

Em um outro aspecto, a amilase maltogênica apresenta pelo menos 10 % mais tolerância à sacarose do que a amilase representada em SEQ ID NO 1.

Ainda em um outro aspecto, a amilase maltogênica apresenta pelo menos 10 % mais termoestabilidade do que a amilase representada em SEQ ID NO 1.

Em um aspecto, a amilase maltogênica apresenta substituições em posições específicas quando comparada à amilase representada em SEQ ID NO 1.

Em um aspecto, a pululanase é termoestável.

Em um outro aspecto, a beta amilase é termoestável.

Em um aspecto, o grão para moagem compreende 30-80 % de malte e 30-80 % de adjunto.

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Em um outro aspecto, o adjunto inclui adjuntos que apresentam uma temperatura de gelatinização maior que amido de malte, por exemplo, mas sem limitação, milho e arroz.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de mosturação que compreende:

a) fornecer um grão para moagem que compreende malte e adjunto, e

b) colocar o grão para moagem em contato com:

i) uma pululanase;

ii) uma alfa amilase; e iii) uma alfa amilase maltogênica e/ou uma beta amilase para preparar um mosto.

O termo grão para moagem é entendido como o amido ou açúcar contendo o material que é a base para produção de cerveja, por exemplo, mas sem limitação, malte de cevada e o adjunto.

O termo malte é entendido como qualquer grão de cereal maltado, em particular, cevada.

O termo gelatinização de amido é entendido como a transição ordem-desordem irreversível que o amido se submete quando é aquecido na presença de água. A calorimetria exploratória diferencial (DSC) é uma técnica que pode ser empregada para estudar o processo de gelatinização gradual de amido que descreve a temperatura inicial e de pico (To & Tp) de gelatinização de amido.

O termo temperatura inicial de gelatinização (To) é entendido como a temperatura na qual a gelatinização começa.

O termo temperatura de pico de gelatinização (Tp) é entendido como a temperatura no pico endotérmico.

O termo temperatura de conclusão de gelatinização (Tc) é

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 16/40 entendido como a temperatura na qual a gelatinização terminou.

O termo adjunto é entendido como parte do grão para moagem que não seja malte. O adjunto pode ser qualquer material de planta rico em amido tais como, mas sem limitação, milho, arroz, sorgo e trigo. Os adjuntos preferidos para a invenção incluem adjuntos onde o amido apresenta uma temperatura inicial, de pico e de conclusão de gelatinização (To, Tp, Tc) maior que a cevada ou malte, mais preferivelmente acima de 5 °C maior que o amido de malte. Os adjuntos podem ser gelatinizados antes da mosturação ou podem ser adicionados como tal ao grão para moagem.

Em um aspecto, os adjuntos não são gelatinizados antes da mosturação.

O termo mistura é entendido como um amido que contém lama do grão para moagem que compreende malte de cevada esmagado, grão não maltado esmagado, outro material que contém amido, ou uma combinação destes, imersos em água para preparar o mosto. Mosturação é o processo de converter amido na mistura em açúcares fermentáveis e não fermentáveis

O termo mosto é entendido como o licor não fermentado eliminado após extrair o grão para moagem durante a mosturação.

Uma alfa amilase maltogênica é entendida como uma enzima classificada em EC 3.2.1.133. A atividade enzimática não exige uma finalidade não redutora no substrato, e a principal atividade enzimática resulta na degradação de amilopectina e amilose em maltose e maltodextrinas mais longas. E capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa.

Da maneira aqui usada, o termo tolerância à sacarose é entendido como o % de atividade de alfa-amilase residual de uma enzima, incubada por 15 minutos a 60 °C, em um sistema de tampão (pH 5,0) que compreende 10 % de sacarose. 100 % de tolerância à sacarose é definido

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 17/40 como a atividade de alfa-amilase residual de uma enzima obtida quando nenhuma sacarose é adicionada ao sistema de tampão.

Maquinário, equipamentos e materiais convencionais podem ser usados durante a mosturação. O grão para moagem é misturado com água antes da mosturação. A água, preferivelmente, antes de ser adicionada ao grão para moagem, pode ser pré-aquecida a fim de que a mistura possa atingir a temperatura desejada da mistura no momento de formação da mistura. Se a temperatura da mistura formada for abaixo da temperatura desejada da mosturação, calor adicional é preferivelmente fornecido a fim de atingir a temperatura de processo desejada. Preferivelmente, a temperatura de mosturação desejada é atingida em 15 minutos, ou mais preferivelmente em 10 minutos, tais como em 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos, ou ainda mais preferivelmente em 1 minuto após a formação da mistura, ou acima de tudo preferivelmente a temperatura de mosturação desejada é atingida na formação da mistura. O perfil de temperatura do processo de mosturação pode ser um perfil de um processo de mosturação convencional, em que as temperaturas são ajustadas para atingir a degradação ideal do material seco do grão para moagem pelas enzimas do malte.

O malte é preferivelmente derivado de um ou mais dos grãos selecionados da lista que compreende milho, cevada, trigo, centeio, sorgo, milheto e arroz. Preferivelmente, o malte é malte de cevada.

O grão para moagem compreende preferivelmente de 0,5 % a 99 %, preferivelmente de 1 % a 95 %, mais preferivelmente de 5 % a 90 %, mais preferivelmente de 10 % a 85 %, ainda mais preferivelmente de 30 % a 80 % de grão maltado, acima de tudo preferivelmente de 30 %-60 % e ainda acima de tudo preferivelmente de 30 %-50 %. Além do grão maltado, o grão para moagem pode compreender preferivelmente adjunto tal como milho não maltado, ou outro grão não maltado, tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, milo, milheto e/ou sorgo, ou amido bruto e/ou refinado, e/ou

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 18/40 açúcar contendo o material derivado de plantas como trigo, centeio, aveia, milho, arroz, milo, milheto, sorgo, batata, batata doce, mandioca, tapioca, sagu, banana, beterraba e/ou cana de açúcar. Os adjuntos podem ser obtidos de tubérculos, raízes, caules, folhas, legumes, cereais e/ou grão completo. È 5 preferível o adjunto obtido de milho e/ou arroz, é mais preferível o adjunto de milho. A mistura compreende preferivelmente de 1 % a 80 %, preferivelmente de 5 % a 80 %, mais preferivelmente de 10 % a 80 %, e ainda mais preferivelmente de 30 a 80 % de adjunto de amido, acima de tudo preferivelmente de 30-60 % e ainda acima de tudo preferivelmente de 40-60 10 %.

Preferivelmente, estes adjuntos apresentam alta temperatura de gelatinização. Mais particularmente, estes adjuntos apresentam uma alta temperatura inicial de gelatinização.

Em um aspecto da invenção, o adjunto é um mistura que 15 compreende adjuntos tanto com alta quanto baixa temperatura de gelatinização.

Quando uma solução aquosa de grânulos de amido é aquecida, os grânulos incham para formar uma pasta. Este processo é denominado gelatinização. A temperatura na qual a gelatinização ocorre é denominada a 20 temperatura de gelatinização. Em decorrência da natureza complexa do amido nos adjuntos e também das condições durante a mosturação, a gelatinização ocorrem em geral em uma faixa particular de temperatura. a faixa de temperatura de gelatinização pode ser assim caracterizada pela temperatura inicial de gelatinização, temperatura de pico de gelatinização 25 e temperatura de conclusão de gelatinização. Por exemplo, para o amido de milho, a temperatura inicial de gelatinização é aproximadamente 62 °C (pico: 67 °C, conclusão: 72 °C), e para o amido de arroz a temperatura inicial de gelatinização é aproximadamente 68 °C (pico: 74,5 °C, conclusão: 78 °C) (Starch, 2^a ed. Industrial microscopy of starch by Eileen Maywald Snyder). A

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 19/40 temperatura inicial de gelatinização pode variar de acordo com a espécie de planta, com a variedade particular da espécie da planta, bem como com as condições de crescimento.

O adjunto também pode compreender carboidratos facilmente fermentáveis, tais como açúcares ou xaropes, e podem ser adicionados à mistura de malte antes, durante ou após o processo de mosturação da invenção, mas é preferivelmente adicionar após o processo de mosturação.

Antes da formação da mistura, o malte e/ou adjunto é preferivelmente moído, e acima de tudo preferivelmente moído seco ou úmido.

As enzimas podem ser adicionadas às composições enzimáticas. Elas podem consistir em uma enzima ou mais de uma enzima, ou mais de uma composição enzimática. A composição enzimática, além da(s) enzima(s), também pode conter pelo menos uma outra substância, por exemplo, mas sem limitação tampão, agente tensoativo, etc. As composições enzimáticas podem estar em qualquer forma reconhecida na técnica, por exemplo, sólida, líquida, emulsão, gel ou pasta. Tais formas são conhecidas pelos versados na técnica. Em um aspecto da invenção, mais de uma composição enzimática, cada qual contendo enzimas diferentes, pode ser adicionada. Em um outro aspecto da invenção, uma composição enzimática contendo todas as enzimas necessárias pode ser adicionada. Ainda em um outro aspecto da invenção, uma composição enzimática contendo um pouco das enzimas e pelo menos uma outra composição contendo as mesmas o resto das enzimas podem ser adicionadas

Em um aspecto da invenção, uma composição enzimática compreendendo uma alfa amilase, uma pululanase, uma alfa amilase maltogênica e/ou uma beta amilase é fornecida exogenamente e pode ser adicionada aos ingredientes da mistura, por exemplo, à água ou ao grão para moagem antes, durante ou após a formação da mistura, ou em qualquer

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 20/40 período durante a mosturação.

Durante o processo de mosturação, o amido extraído do grão para moagem é gradualmente hidrolisado em açúcares fermentáveis e dextrinas menores. Preferivelmente, a mistura é negativa para amido no teste 5 de iodo antes de extrair o mosto. A mosturação é finalizada pela degradação do amido residual em temperatura de 70 °C ou mais, preferivelmente pelo menos 71 °C, pelo menos 72 °C, pelo menos 73 °C, pelo menos 74 °C, pelo menos 75 °C, pelo menos 76 °C pelo menos 77 °C, pelo menos 78 °C, pelo menos 79 °C, pelo menos 80 °C e mais preferivelmente pelo menos 81 °C ou 10 ainda pelo menos 82 °C ou mais.

Obter o mosto da mistura inclui tipicamente coar o mosto a partir dos grãos exauridos, isto é, o grão insolúvel e material da casca que formam parte do grão para moagem. A água quente pode ser corrida por meio dos grãos exauridos para rinsar, ou borrifar, qualquer extrato remanescente do 15 grão para moagem. Preferivelmente, a recuperação do extrato é pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 85 %, pelo menos 90 %. O mosto pode ser usado como tal, ou pode ser concentrado e/ou seco.

O mosto também pode ser processado para ser usado como xarope. Ele também pode ser usado para produzir bebidas não alcoólicas. 20 Estes processos são conhecidos pelos versados na técnica.

O mosto também pode ser fermentado em cerveja. Os tipos preferidos de cerveja compreendem as cervejas de alta fermentação, de alta fermentação forte, preta forte, escura, de baixa fermentação, amargas, de exportação, licores de malte, alcoólica espumante do tipo happoushu, cerveja 25 com alto teor alcoólico, cerveja com baixo teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja leve. A fermentação do mosto também pode incluir inocular o mosto com uma lama de levedura que compreende levedura fresca, isto é, levedura que não foi previamente usada para a invenção ou a levedura pode ser levedura reciclada. A levedura aplicada pode ser qualquer levedura

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 21/40 adequada para a brassagem, especialmente as leveduras selecionadas de Saccharomyces spp. tais como S. cerevisiae e S. uvarum, incluindo os variantes naturais ou produzidos artificialmente destes organismos. Os métodos de fermentação do mosto para a produção de cerveja são bem conhecidos pelos versados na técnica. A sílica hidrogel pode ser adicionada ao mosto fermentado para aumentar a estabilidade coloidal da cerveja. O processo pode incluir adicionalmente acrescentar o filtro kieselguhr ao mosto fermentado e filtrar para tornar a cerveja brilhante.

ENZIMAS

Alfa amilase maltogênica (EC 3.2.1.133)

A alfa-amilase maltogênica é uma enzima classificada em EC 3.2.1.133. A atividade enzimática não exige um terminal não redutor no substrato e a principal atividade enzimática resulta na degradação de amilopectina e amilose em maltose e maltodextrinas mais longas. É capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa.

Os exemplos de amilases maltogênicas incluem, mas sem limitação, a amilase Novamyl® disponível pela Novozymes A/S.

Uma alfa-amilase maltogênica particularmente preferida é a amilase maltogênica de SEQ ID NO: 1.

Em um aspecto da invenção, a alfa amilase maltogênica apresenta pelo menos 70 % de identidade, tal como pelo menos 75 %, tal como pelo menos 80 %, tal como pelo menos 85 %, tal como pelo menos 86 %, tal como pelo menos 87 %, tal como pelo menos 88 %, tal como pelo menos 89 %, tal como pelo menos 90 %, tal como pelo menos 91 %, tal como pelo menos 92 %, tal como pelo menos 93 %, tal como pelo menos 94 %, tal como pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, tal como pelo menos 98 %, tal como pelo menos 99 % ou ainda 100 % de identidade com a sequência mostrada em SEQ ID NO 1.

O termo identidade é a relação entre duas sequências de

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 22/40 aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos. Com o propósito da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276277), preferivelmente a versão 3.0.0 ou superior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSU M62). O rendimento de Needle marcado como maior identidade (obtida usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir:

(Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento - Número total de intervalos no alinhamento)

Em um aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta mutações de aminoácido em uma ou mais posições específicas em SEQ ID. No 1. Por exemplo, as mutações podem ser pelo menos em uma ou mais posições Y89F, P191 S, D261 G, T288P, W93F, F194Y, Y360F ou Y360N. A nomenclatura aqui usada para definir mutações é essencialmente da maneira descrita em WO 92/05249. Assim, Y89F indica uma substituição do aminoácido Y (Tyr) na posição 89 com o aminoácido F (Phe). Os métodos para preparar estas mutações são conhecidos pelos versados na técnica.

Em um aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta mutações em Y89F, P191 S, D261 G e T288P.

Em um outro aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta as mutações adicionais pelo menos em W93F, F194Y, Y360F ou Y360N.

Em um aspecto a alfa amilase maltogênica apresenta mutações em Y89F, W93F, P191S, D261G e T288P.

Em um outro aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 23/40 mutações em Y89F, P191S, F194Y, D261G e T288P.

Em um aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta mutações em Y89F, P191S, D261G, T288P e Y360F.

Em um outro aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta mutações em Y89F, P191S, D261G, T288P e Y360N.

Em um aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta pelo menos 10 %, tal como pelo menos 15 %, tal como pelo menos 20 %, tal como pelo menos 25 %, ou tal como pelo menos 30 %, ou pelo menos 35 %, ou pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 75 % de mais tolerância à sacarose do que a alfa amilase maltogênica de SEQ ID NO. 1.

A tolerância à sacarose é determinada usando o método fornecido no exemplo 5.

Em um aspecto, a alfa amilase maltogênica é termoestável.

Em um outro aspecto, a alfa amilase maltogênica apresenta pelo menos 10 %, ou pelo menos 15 %, ou pelo menos 20 %, ou pelo menos 25 %, ou pelo menos 30 %ou pelo menos 35 %, ou pelo menos 40 %, ou pelo menos 45 %, ou pelo menos 50 %, ou pelo menos 55 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 65 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 75 % mais termoestabilidade do que a alfa amilase maltogênica de SEQ ID NO. 1.

A termoestabilidade de uma enzima é a capacidade da enzima resistir à inativação térmica irreversível. Para a amilase maltogênica, é determinada encontrando a quantidade de atividade da enzima que permanece após incubar a enzima em um tampão (pH 6) por 10 minutos, tanto a 25 °C quanto a 72 °C.

A alfa amilase maltogênica pode ser incluída na faixa de 1 -30, preferivelmente 2-25, mais preferivelmente 5-20, ou acima de tudo preferivelmente 8-13 MANU/g de peso seco do adjunto.

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Uma unidade de amilase maltogênica Novo (MANU) é a quantidade de enzima que em condição padrão clivará um pmol de maltotriose por minuto. As condições padrões são 10 mg/mL de maltotriose, 37 °C, pH 5,0, 30 minutos de período de reação.

Alfa-amilase (EC 3.2.1.1)

Uma enzima alfa-amilase também pode ser exógena, microbiana e adicionada aos processos e/ou composições da invenção. A alfaamilase pode ser uma alfa-amilase de Bacillus. As alfa-amilases de Bacillus incluem alfa-amilase derivadas de uma cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens e B.stearothermophilus. Uma alfa amilase preferível é uma alfa-amilase de B. stearothermophilus com a sequência de aminoácidos, revelada como SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467, com as mutações: 1181*+ G182* + N193F.

Em um aspecto, a alfa amilase é uma alfa amilase de SEQ ID NO.2.

Em um aspecto da invenção, a alfa amilase apresenta pelo menos 70 % de identidade, tal como pelo menos 75 %, tal como pelo menos 80 %, tal como pelo menos 85 %, tal como pelo menos 86 %, tal como pelo menos 87 %, tal como pelo menos 88 %, tal como pelo menos 89 %, tal como pelo menos 90 %, tal como pelo menos 91 %, tal como pelo menos 92 %, tal como pelo menos 93 %, tal como pelo menos 94 %, tal como pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, tal como pelo menos 98 %, tal como pelo menos 99 % ou ainda 100 % de identidade com a sequência mostrada em SEQ ID NO 2.

A alfa amilase pode ser adicionada na faixa de 0,001 a 10

KNU, preferivelmente 0,01 a 5 KNU, ainda mais preferivelmente entre 0,1 a

KNU por grama de material seco do adjunto.

Uma unidade por Kilo Novo de alfa amilase (KNU) é igual a

1.000 NU. Uma KNU é definida como a quantidade de enzima que, em

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 25/40 condições padrões (isto é, a 37 °C +/- 0,05; Ca2⁺ 0,0003 M; e pH 5,6) dextriniza 5,26 g de amido por substância seca de amido solúvel Merck. Pululanase (E.C. 3.2.1.41)

A pululanase usada nos processos de acordo com a presente invenção é preferivelmente pululanase, por exemplo, de Pyrococcus ou Bacillus sp, tal como Bacillus acidopullulyticus (por exemplo, aquele descrito em FEMS Microbiol. Letters 1 15: 97-106) ou Bacillus deramificans, ou Bacillus naganoencis. A pululanase também pode ser uma pululanase geneticamente modificada, por exemplo, de uma cepa de Bacillus.

Outras pululanases que são preferivelmente usadas nos processos de acordo com a invenção incluem: pululanase de Bacillus deramificans (patente U.S. 5.736.375), ou a pululanase pode ser derivada de Pyrococcus Woesei descrita em PCT/DK91/00219, ou a pululanase pode ser derivada de Fervidobacterium sp. Ven 5, descrita em PCT/DK92/00079, ou a pululanase pode ser derivada de Thermococcus celer descrita em PCT/DK95/00097, ou a pululanase pode ser derivada de Pyrodictium abyssei descrita em PCT/DK95/0021 1, ou a pululanase pode ser derivada de Fervidobacterium pennavorans descrita em PCT/DK95/00095, ou a pululanase pode ser derivada de Desulforococcus mucosus descrita em PCT/DK95/00098.

Acima de tudo preferivelmente, a pululanase é derivada de Bacillus acidopullulyticus.

Uma enzima pululanase preferida para ser usada nos processos e/ou composições da invenção é uma pululanase com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO.3.

Em um aspecto da invenção, a pululanase apresenta-se pelo menos 70 %, tal como pelo menos 75 %, tal como pelo menos 80 %, tal como pelo menos 85 %, tal como pelo menos 86 %, tal como pelo menos 87 %, tal como pelo menos 88 %, tal como pelo menos 89 %, tal como pelo menos 90

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 26/40 %, tal como pelo menos 91 %, tal como pelo menos 92 %, tal como pelo menos 93 %, tal como pelo menos 94 %, tal como pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, tal como pelo menos 98 %, tal como pelo menos 99 % ou ainda 100 % idêntica à sequência mostrada em SEQ ID NO: 3.

Em um aspecto da invenção, a pululanase é termoestável. Um exemplo de uma pululanase como esta é uma pululanase descrita em WO2009075682.

Para a pululanase, a termoestabilidade é determinada encontrando a quantidade de atividade da enzima que permanece após incubar a enzima em um tampão (pH 5) por 10 minutos, tanto a 25 °C quanto a 64 °C.

A pululanase é adicionada em uma dosagem de 0,1 a 3 PUN/g de material seco (DM) de adjunto, tal como 0,2 a 2,9, tal como 0,3 a 2,8, tal como 0,3 a 2,7, tal como 0,3 a 2,6, tal como 0,3 a 2,5, tal como 0,3 a 2,4, tal como 0,3 a 2,3, tal como 0,3 a 2,2, tal como 0,3 a 2,1, tal como 0,3 a 2,0, tal como 0,3 a 1,9, tal como 0,3 a 1,8, tal como 0,3 a 1,7, tal como 0,3 a 1,6, acima de tudo preferivelmente a pululanase é adicionada em uma dosagem tal como 0,3 a 1,5, preferivelmente 0,4 a 1,4, mais preferivelmente 0,5 a 1,3, mais preferivelmente 0,6 a 1,2, mais preferivelmente 0,7 a 1,1, mais preferivelmente 0,8 a 1,0, mais preferivelmente 0,9 a 1,0. Em uma modalidade particular da invenção, a enzima é adicionada em 0,3 PUN/g DM de adjunto, tal como 0,4 PUN/g DM de adjunto, tal como 0,5 PUN/g de DM adjunto, tal como 0,6 PUN/g DM de adjunto, tal como 0,7 PUN/g DM de adjunto. Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, as doses de enzima não são maiores que 1 PUN/g DM de adjunto.

Uma unidade de pululanase (PUN) é a quantidade de enzima que, em condições padrões (isto é, após 30 minutos de tempo de reação, a 40 °C e pH 5,0; e com 0,2 % pululano como substrato) hidrolisa pululano, liberando carboidrato reduzido com um pó reduzido equivalente a 1 micromol

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 27/40 de glicose por minuto.

A atividade da pululanase é medida pela detecção de maior redução da capacidade do açúcar (reação de Somogyi-Nelson) nas seguintes condições: Substrato: pululano 0,2 %, pH 5,0, tempo de reação 30 minutos. As amostras são analisadas por espectrofotômetro em OD 520 nm.

Beta Amilase (E.C 3.2.1.2)

Beta-amilase é o nome tradicionalmente fornecido às amilases maltogênicas de ação exo, que catalisam a hidrólise de ligações 1,4-alfaglicosídicas em amilose, amilopectina e polímeros relacionados à glicose.

As beta-amilases foram isoladas de várias plantas e microrganismos (W. M. Fogarty e C. T. Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology, 15:112-115). Estas beta-amilases são caracterizadas por apresentar temperaturas ideais na faixa de 40 graus C a 65 graus C, e pH idela na faixa de 4,5 a 7,0. As beta-amilases contempladas incluem a beta-amilase de cevada Spezyme.RTM. BBA 1500, Spezyme.RTM. DBA e Optimalt.TM. ME, Optimalt.TM. BBA da Genencor Int., bem como Novozym.TM. WBA da Novozymes A/S.

As beta amilases são incluídas em geral na faixa de 1 a 25 BAMU/g DM de adjunto, tal como de 1 a 20 BAMU/g DM de adjunto, tal como de 1 a 15 BAMU/g DM de adjunto, tal como de 1 a 10 BAMU/g DM de adjunto, tal como de 2 a 7 BAMU/g DM de adjunto, tal como de 2 a 6 BAMU/g DM de adjunto, tal como de 4 a 6 BAMU/g DM de adjunto.

Uma unidade de beta-amilase (BAMU) é definida como a quantidade de enzima que degrada um pmol de maltoexaose por minuto nas condições a seguir (37 °C, pH 5,5, 200 segundos de incubação, substrato maltotexaose 0,856 mM, atividade suficiente de uma enzima que oxida a maltose liberado H2O2, por exemplo, 4,8 LOXU/mL de lactose oxidase, 4aminoantipirina (AA) 1,7 mM, N-Etil-N-sulfopropil-m-toluidina (TOPS) 4,3 mM, peroxidase 2,1 U/mL (Sigma).

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A beta Amilase age no terminal não redutor de maltoexaose (G6) para formar maltose (G2) e maltotetraose (G4), a hidrólise é medida com um método que quantifica o terminal redutor, tal como o uso de carboidrato ou lactose-oxidase e O2 para formar H2O2. O H2o2 formado ativa na presença 5 de peroxidase a condensação oxidativa de 4-aminoantipirina (AA) e N-etil-Nsulfopropil-m-toluidina (TOPS), para formar um produto roxo que pode ser quantificado por sua absorbância em 540 nm. A reação é iniciada por maltoexaose (G6). Quando todos os componentes, menos beta amilase, estão em excesso, a taxa de aumento da absorbância é proporcional à atividade de 10 beta amilase presente.

Em um aspecto, a beta amilase é termoestável. Um exemplo de uma beta amilase termoestável é a beta amilase de Clostridium thermosulfurogenes. Um exemplo de uma beta amilase como esta é encontrada em Kitamoto et al., 1988, J. Bacteriol, 170 (12) 5848-5854.

Em um aspecto, a beta amilase é uma beta amilase com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 4.

Em um aspecto da invenção, a beta amilase apresenta pelo menos 70 % de identidade, tal como pelo menos 75 %, tal como pelo menos 80 %, tal como pelo menos 85 %, tal como pelo menos 86 %, tal como pelo 20 menos 87 %, tal como pelo menos 88 %, tal como pelo menos 89 %, tal como pelo menos 90 %, tal como pelo menos 91 %, tal como pelo menos 92 %, tal como pelo menos 93 %, tal como pelo menos 94 %, tal como pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, tal como pelo menos 98 %, tal como pelo menos 99 % ou ainda 100 % de identidade com a 25 sequência mostrada em SEQ ID NO 4.

EXEMPLOS

Exemplo 1:

O objetivo deste exemplo é demonstrar o benefício de ter todas as 3 enzimas (pululanase, alfa-amilase maltogênica e uma alfa amilase)

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 29/40 presente durante a mosturação, do que ter apenas 2 delas em diferentes combinações e dosagens.

Um grão para moagem que compreende 50 % de grãos para moagem de milho não pré-gelatinizado e 50 % de malte bem modificado (WM) foi moído (abertura de 0,2 mm em um moinho de disco) e amassado na presença de uma pululanase de SEQ ID NO. 3, uma alfa-amilase de SEQ ID NO. 2, e uma alfa-amilase maltogênica de SEQ ID NO.1. O milho e o malte foram misturados em uma razão de 1:5 (gravidade normal) e a temperatura do perfil de mosturação consistiu em início da mosturação a 52 °C por 30 minutos, aumentada para 62 °C (1 °C/min), mantida a 62 °C por 30 minutos, aumentada para 72 °C (1 °C/min), mantida a 72 °C por 30 minutos, aumentada para 78 °C (1 °C/min), seguido por resfriamento imediato para 20 °C (tempo de mosturação total de 131 minutos). O mosto e o mosto fermentado (um dia de fermentação no laboratório em temperatura ambiente) foram analisados por HPLC (perfil de açúcar) e Anton Paar (% de grau real de fermentação, RDF e extrato, Ea). As atividades da enzima a seguir foram dosadas em todas as diferentes combinações: 0 ou 0,7 PUN de pululanase, 0 ou 0,5 KNU de alfa- amilase e 0 ou 11,0 MANU de alfa-amilase maltogênica por g de material seco de adjunto.

Todos os resultados são sumarizados na tabela 1.

Tabela 1:

Unidades/g de DM de adjunto	% DP4+ (Δ%)	% RDF (Δ%)
Nenhuma enzima dosada (controle)	31,7	57,0
0.5 KNU	28,6 (Δ 3,1)	59,9 (Δ 2,9)
0.5 KNU + 11 MANU	22,2 (Δ 9,5)	65,9 (Δ 8,9)
0.5 KNU + 0.7 PUN	26,7 (Δ 5,0)	61,4 (Δ 4,4)
11 MANU + 0.7 PUN	21,2 (Δ 10,5)	67,6 (Δ 10,6)
0.5 KNU + 0.7 PUN + 11 MANU	20,0 (Δ11,7)	68,6 (Δ 11,6)

Os dados anteriores mostram que a combinação de uma alfa amilase, uma pululanase e uma alfa amilase maltogênica resulta em melhores características do mosto do que o uso das enzimas sozinhas, em combinação única ou dupla.

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Exemplo 2

O objetivo foi avaliar a temperatura ideal de beta-amilase de Clostridium thermosulfurogenes.

A temperatura ideal de beta-amilase de SEQ ID NO. 4 obtida de Clostridium thermosulfurogenes foi determinada pela liberação de maltose a partir da amilopectina, medindo os terminais redutores pelo reagente PHABH. 1 mL de substrato (1 % p/v de amilopectina de batata em NaOAc 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 4,5) foi pré-incubado a 60 °C por 10 minutos. Como um controle, 150 gL foram retirados antes da adição da enzima e misturados 10 com 75 gL de reagente de finalização (0,75 g de PHABH (Sigma), 2,5 g de

K-Na-tartarato (Merck) e 50 mL de NaOH 2 %). Para as incubações de enzima, 150 gL de solução de enzima foram adicionados ao substrato e incubados por 10 minutos a 30, 40, 50, 60, 70, ou 80 °C. 75 gL de reagente de finalização foram adicionados e a solução foi incubada a 100 °C por 15 15 minutos. 200 gL foram transferidos para tubos de PCR e a absorbância foi medida em 410 nm. O experimento foi realizado em triplicata. O pH ideal de beta-amilase de Clostridium thermosulfurogenes foi determinado de acordo com o procedimento anterior com as seguintes modificações. A incubação foi realizada a 60 °C em pH 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

Tabela 2:. Temperatura ideal

°C	Abs410
30	0,255
40	0,325
50	0,329
60	0,414
70	0,470
80	0,471

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Tabela 3: pH ideal

pH	Abs410
4	0,402
5	0,524
6	0,631
7	0,595
8	0,354
9	0,140

A beta-amilase de Clostridium thermosulfurogenes apresenta temperatura ideal a 70-80 °C e pH ideal em torno de pH 5-7 (Tabela 2 e 3). Em comparação, a beta-amilase de cevada apresenta temperatura ideal a 6065 °C em condições de mistura (pH 5,8) (Kunze (1999), Technology Brewing and Malting, VLB Verlag, Berlim).

Exemplo 3

O objetivo deste exemplo foi demonstrar o benefício de apresentar uma beta-amilase termoestável presente durante a mosturação e filtração da mistura, em combinação com uma pululanase e alfa-amilase.

Um grão para moagem, que compreende 50 % de grãos para moagem de milho não pré-gelatinizado e 50 % de malte bem modificado (WM), foi moído (abertura de 0,2 mm em um moinho de disco) e foi misturado na presença de uma pululanase de SEQ ID NO.3, uma alfa-amilase de SEQ ID NO 2 e beta amilase de SEQ ID NO. 4. O milho e o malte foram misturados em uma razão de 1:5 (gravidade normal) e o perfil de temperatura de mosturação consistiu em mosturação inicial a 52 °C por 30 minutos, aumentada para 62 °C (1 °C/min), mantida a 62 °C por 30 minutos, aumentada para 72 °C (1 °C/min), mantida a 72 °C por 30 minutos, aumentada para 78 °C (1 °C/min), seguido por incubação por 2 horas a 78 °C (filtração da mistura estimulada), seguido por resfriamento imediato a 20 °C. O mosto e o mosto fermentado (fermentação de um dia em laboratório, em temperatura ambiente) foram analisados por HPLC (perfil de açúcar) e Anton Paar (% de grau real de fermentação, RDF e extrato, Ea). As atividades da enzima a seguir foram dosadas em todas as combinações diferentes: 0 ou 0,7 PUN de pululanase, 0

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 32/40 ou 0,15 KNU de alfa-amilase e 0 ou 2,5 BAMU de beta-amilase por g de material seco de adjunto. Os resultados são fornecidos na tabela 4 abaixo: Tabela 4: Perfil de açúcar do mosto (% de açúcares totais) e % RDF (grau real de fermentação) no mosto fermentado. Pululanase (PUN), alfa-amilase (KNU), beta-amilase (BAMU).

Dosagem de enzima (Unidades/g de DM de adjunto)	% DP4+	% RDF
PUN	KNU	BAMU
-	-	-	26,6	57,4
0,7	-	-	23,3	60,0
0,7	0,15	-	20,8	62,6
0,7	0,15	2,5	14,2	69,8

A tabela 4 demonstra o benefício de ter uma beta-amilase termoestável presente durante a mosturação, em combinação com uma pululanase e alfa-amilase. Um nível acentuadamente maior foi obtido, resultando em um nível menor de açúcares não fermentáveis (DP4+) e que corresponde a um % de RDF maior do mosto fermentado.

Exemplo 4

Um grão para moagem, que compreende 50 % de grãos para moagem de milho não pré-gelatinizado e 50 % de malte bem modificado (WM), foi moído (abertura de 0,2 mm em um moinho de disco) e misturado na presença de uma alfa-amilase maltogênica de SEQ ID NO. 1, uma alfaamilase de SEQ ID NO. 2 e uma pululanase de SEQ ID NO.3. O milho e o malte foram misturados em uma razão de 1:3 (gravidade elevada) e o perfil de temperatura de mosturação consistiu em início da mosturação a 52 °C por 30 minutos, aumentada para 62 °C (1 °C/min), mantida a 62 °C por 30 minutos, aumentada para 72 °C (1 °C/min), mantida a 72 °C por 30 minutos, aumentada para 78 °C (1 °C/min), e a seguir resfriamento imediato para 20 °C (3,9 °C/min), resultando em um período total de mosturação de 131 minutos. O mosto e o mosto fermentado (fermentação de um dia em laboratório, em temperatura ambiente) foram analisados por HPLC (perfil de açúcar) e Anton Paar (% de grau real de fermentação, RDF e extrato, Ea). As atividades da

Petição 870180067427, de 03/08/2018, pág. 33/40 enzima a seguir foram dosadas: 0,7 PUN de pululanase, 0,5 KNU de alfaamilase e 11,0 MANU de alfa-amilase maltogênica por grama de material seco de adjunto.

Os resultados são sumarizados na tabela 5, demonstrando que a combinação de uma amilase maltogênica, uma alfa amilase e uma pululanase resultam em melhoria na hidrólise do amido, formação da maltose e % de RDF.

Tabela. 5. Dosagem de enzima, perfil de açúcar do mosto (% de açúcar total), nível do extrato do mosto (g/100 mL) e % de RDF obtido para os 4 variantes de enzima em comparação com o tipo selvagem.

Alfa-amilase maltogênica	% DP1	% DP2	% DP3	% DP4+	Extrato (g/ioo mL)	% RDF
Seq ID No 1	16.7	42.1	14.8	25.1	20.6	65.4
Variante 1	18.7	43.6	13.4	23.3	20.6	70.3
Variante 2	20.6	45.3	13.5	19.4	20.6	69.8
Variante 3	18.4	43.5	14.0	22.9	20.7	67.1
Variante 4	18.3	43.3	14.3	22.9	20.6	67.4

Os variantes são definidos no exemplo 5, tabela 6 a seguir.

O termo DP1 ’’ (grau de polimerização 1 ) representa glicose, DP2 representa maltose e DP3 representa maltotriose. Os termos DP4+ ou DP4/4+ representam dextrina, ou malto-oligosacarídeos de uma polimerização grau de 4 ou superior.

O termo RDF significa grau real de fermentação. O RDF (grau real de fermentação) é calculado como % de RDF = 100*(OE % de P % de ER) / OE % de P, ao passo que OE significa extrato original em % de P e ER significa extrato real em % de P medido por um densitômetro (referência Analytica EBC). RDF: grau real de fermentação, foi determinado pelo método descrito no método de MEBAK: 2.9.2. Principal: redução de material seco do mosto, em %, por fermentação em álcool e CO₂.

A tabela anterior demonstra que os variantes fornecem um

RDF maior que a enzima de SEQ ID NO 1. Entre os variantes, o variante 2 parece ser o melhor.

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Exemplo 5

A tolerância à sacarose dos variantes de 4 alfa-amilase maltogênica foi estudada.

A tolerância à sacarose foi determinada incubando a dada enzima em um tampão (pH 5,0) contendo 10 % de sacarose (% p/v) por 15 minutos a 60 °C. Imediatamente após a incubação, a atividade residual da enzima foi determinada pelo ensaio Phadebas (atividade alfa-amilase do tipo endo). 100 % de tolerância à sacarose corresponde à atividade residual obtida da alfa-amilase maltogênica, quando nenhuma sacarose está presente no tampão de tampão.

Os resultados são sumarizados na tabela 6, demonstrando que os variantes de 4 alfa-amilase maltogênica são mais tolerantes à sacarose do que o tipo selvagem.

Tabela 6. Modificações de aminoácido e tolerância à sacarose dos variantes da enzima alfa-amilase em comparação com o tipo selvagem.

Alfa-amilase maltogênica	Modificações de aminoácidos	% de tolerância à sacarose
Seq IDNo 1.	-	12
Variante 1	Y89F, W93F, P191S, D261G, T288P	70
Variante 2	Y89F, P191S, F194Y, D261G, T288P	53
Variante 3	Y89F, P191S, D261G, T288P, Y360F	40
Variante 4	Y89F, P191S, D261G, T288P, Y360N	40

A partir da tabela, é evidente que o variante 1 é 58 %, o variante 2 é 41 % e os variantes 3 e 4 são 28 % mais tolerantes à sacarose do que SEQ ID NO.l, respectivamente.

Claims

1. Método de mosturação, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) fornecer um grão para moagem que compreende malte e adjunto, e

b) contatar o grão para moagem com:

i) uma pululanase;

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adjunto apresenta uma temperatura de gelatinização maior que o amido de malte.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adjunto é milho ou arroz.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a alfa amilase maltogênica é SEQ ID NO 1.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a alfa amilase é SEQ ID NO 2.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pululanase é SEQ ID NO 3.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a beta amilase é SEQ ID NO 4.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pululanase é termoestável, em que a termoestabilidade é medida encontrando a quantidade de atividade da enzima que permanece após incubar a enzima em um tampão em pH 5,0 por 10 minutos, tanto a 25 °C quanto a 64 °C.