CN110343687A

CN110343687A - 一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用

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Publication number: CN110343687A
Application number: CN201910650235.8A
Authority: CN
Inventors: 段绪果; 朱秋雨; 张心怡; 沈镇炎; 金璐; 栾舒越; 史洁莹; 刘龙
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110343687B

Abstract

本发明公开了一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明普鲁兰酶突变体胞外分泌能力较野生型有了明显的提高，将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd‑306的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达38.9U·mL^‑1，是野生型的2.3倍；将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd‑117的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达49.6U·mL^‑1，是野生型的2.9倍。

Description

一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

淀粉是植物体中贮存的养分，主要贮存在植物种子和块茎中，储量十分丰富。除食用外，淀粉主要被用于糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的制备，应用十分广泛。在利用淀粉制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中，高效水解淀粉中存在的α-1,4-葡萄糖苷键以及α-1,6-葡萄糖苷键十分重要。其中，α-1,6葡萄糖苷键的含量虽然较低，只有6％左右，但是，α-1,6-葡萄糖苷键会使得淀粉形成分支结构，并且，大部分的如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等的淀粉加工用酶都是α-1,4-葡萄糖苷键水解酶，不具有α-1,6-糖苷键水解活力或水解活力极低，这大大降低了淀粉的利用率、增加了淀粉的转化时间，导致利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率低下。

普鲁兰酶，又名普鲁兰多糖-6-葡聚糖水解酶(pullulan-6-glucanohydrolase)，它可以专一性切割支链糊精中的α-1,6葡萄糖苷键，若在利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中将普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等淀粉加工用酶联用，无疑可以大大提高淀粉的利用率，缩短淀粉的转化时间，为提高利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率提供更多可能。

但是，现有的普鲁兰酶仍然存在很多缺陷，其中，较为显著的缺陷是分泌能力差，例如，Ana Chen等人将来源于Bacillus acidopullulyticus的普鲁兰酶在大肠杆菌中表达后，发酵液中几乎检测不到任何胞外酶活(具体可见文献：Microb Cell Fact(2016)15:9)；Xuguo Duan等人将来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶在大肠杆菌中表达后，其胞外酶活只有11.6U·mL^-1，仅占总酶活的1.2％(具体可见文献：Bioresource Technology146(2013)379–385)；Xinye Wang等人将来源于Bacillus naganoensis的普鲁兰酶在大肠杆菌中表达后，其胞外酶活只占总酶活的34.4％(具体可见文献：Protein Expr Purif,2019,155:72-77.)，远远达不到工业生产的要求。

并且，普鲁兰酶胞外表达水平低的问题，会大大提高发酵生产发酵普鲁兰酶时后续产物分离提取的难度，进一步提高工业生产成本，阻碍了普鲁兰酶的进一步推广应用，因此，急需找到一种具有高分泌能力，尤其是高胞外分泌能力的普鲁兰酶，以提高普鲁兰酶的产量，同时，降低普鲁兰酶分离提取的难度。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是得到一种具有高分泌能力，尤其是高胞外分泌能力的普鲁兰酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种普鲁兰酶突变体，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位和/或117位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及天冬氨酸四个氨基酸残基得到的，命名为PulBd-306；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第117位依次插入天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸以及精氨酸四个氨基酸残基得到的，命名为PulBd-117；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸四个氨基酸残基以及第117位依次插入天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸和精氨酸四个氨基酸残基得到的，命名为PulBd-117/306。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶来源于脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了编码上述普鲁兰酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-20b(+)载体。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。

本发明还提供了上述普鲁兰酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的发酵上清液中分离上述普鲁兰酶突变体。

本发明还提供了应用上述方法制备得到的普鲁兰酶突变体。

本发明还提供了上述普鲁兰酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或上述制备得到的普鲁兰酶突变体在水解淀粉方面的应用。

本发明还提供了一种水解淀粉的方法，所述方法为将上述普鲁兰酶突变体或上述宿主细胞与其他淀粉酶同时加入淀粉中进行酶解；所述其他淀粉酶为糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和/或淀粉葡萄糖苷酶。

[有益效果]

(1)本发明普鲁兰酶突变体胞外分泌能力较野生型有了明显的提高，将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd-306的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达38.9U·mL^-1，是野生型的2.3倍；将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd-117的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达49.6U·mL^-1，是野生型的2.9倍；

(2)本发明普鲁兰酶突变体的比酶活较野生型有了明显的改善，其中，突变体PulBd-306的比酶活可达506.10U·mg^-1，是野生型的1.13倍；

(3)本发明通过优化普鲁兰酶突变体的发酵条件大大提高了普鲁兰酶突变体的胞外分泌能力，利用本发明的方法将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd-306的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达90.6U·mL^-1；利用本发明的方法将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd-117的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达103.2U·mL^-1。

附图说明

图1：诱导温度对含有编码突变体PulBd-306的基因的重组菌的细胞生长和普鲁兰酶可溶性表达的影响。

图2：诱导温度对含有编码突变体PulBd-117的基因的重组菌的细胞生长和普鲁兰酶可溶性表达的影响。

图3：IPTG浓度对含有编码突变体PulBd-306的基因的重组菌的细胞生长和普鲁兰酶可溶性表达的影响。

图4：IPTG浓度对含有编码突变体PulBd-117的基因的重组菌的细胞生长和普鲁兰酶可溶性表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-20b(+)载体购自Novagen公司。(上述菌株大肠杆菌JM109、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、氨苄青霉素100μg·mL^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g·L^-1、胰蛋白胨10.0g·L^-1、NaCl 10.0g·L^-1、琼脂粉15g/L、氨苄霉素30μg·mL^-1。

TB培养基：甘油5.0g·L^-1、胰蛋白胨12.0g·L^-1、酵母粉24.0g·L^-1、K₂HPO₄·3H₂O16.4g·L^-1、KH₂PO₄2.3g·L^-1、甘氨酸7.5g·L^-1、氨苄青霉素100μg·mL^-1。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

普鲁兰酶酶活的测定方法：

分别取1mL的底物(1.0％普鲁兰溶液)和0.9mL的浓度为50mmol·L^-1、pH为4.5的醋酸缓冲液于试管中，60℃水浴预热10min左右；加入0.1mL稀释的酶液样品，震荡混匀，50℃孵育10min，加入3mLDNS终止反应，沸水浴7min，冰水浴中冷却；向上述反应体系中加入10mL的蒸馏水，颠倒混匀，在540nm下测量其吸光值，同样条件下用以灭活的酶液作为酶液样品的反应体系作为空白。

酶活的(U)定义为：在上述分析测定条件下，每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖还原力的酶量定义为一个活力单位(1U)。

普鲁兰酶比酶活的测定方法：

测定纯化后的普鲁兰酶的酶活(U/mL)，并且，采用Bradford法测定纯化后的普鲁兰酶的蛋白含量(mg/mL)，以计算普鲁兰酶的比酶活；

其中，普鲁兰酶比酶活的计算公式如下：

普鲁兰酶比酶活(U/mg)＝纯化后的普鲁兰酶的酶活(U/mL)/纯化后的普鲁兰酶的蛋白含量(mg/mL)。(Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.(1976)Arapid andsensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry,72,248-254.”中)

菌浓度的测定方法：

使用分光光度计检测发酵液的OD₆₀₀。

实施例1：野生型普鲁兰酶的表达

具体步骤如下：

(1)利用化学合成法合成可编码普鲁兰酶的目的基因(NCBI编号：AX203845)；

(2)将目的基因经过Nco I和Hind III双酶切后与表达载体pET20b(+)连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100μg·mL^-1氨苄霉素的LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入含有100μg·mL^-1氨苄霉素的LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒PulBd-pET20b(+)；

(3)将测序正确的重组质粒PulBd-pET20b(+)热激转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基中于37℃培养8～10h，得到种子液；

(4)将种子液按5％接种量接入TB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，再用0.05mM的异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于37℃继续摇瓶诱导培养44h，得到含有野生型普鲁兰酶的发酵液，命名为发酵液A。

实施例2：普鲁兰酶突变体的制备及表达

具体步骤如下：

(1)利用全质粒PCR技术，以实施例1获得的重组质粒PulBd-pET20b(+)为模板进行定点突变，获得突变体PulBd-306(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)、PulBd-117(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、PulBd-117/306(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、PulBd-500、PulBd-714以及PulBd-905；

其中，突变体PulBd-306是通过在野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及天冬氨酸四个氨基酸残基得到的，所用引物如下：

PulBd-306-For：5’-AATTATCATCGTTCTAACCAGGTGCTGGTTAAACTGTC-3’(SEQ IDNo.5)；

PulBd-306-Rev：5’-GTTAGAACGATGATAATTAGCATCCAGATACGCGTTGC-3’(SEQ IDNo.6)；

突变体PulBd-117是通过在野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第117位依次插入天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸以及精氨酸四个氨基酸残基得到的，所用引物如下：

PulBd-117-Fro：5’-GCAAAGAATTTGATTCTCAGTACTACTATTCCGGTGACGC-3’(SEQ IDNo.7)；

PulBd-117-Rev：5’-GAGAATCAAATTCTTTGCTGTTCAGCACGTTACGCG-3’(SEQ IDNo.8)；

突变体PulBd-117/306是通过在野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸四个氨基酸残基以及第117位依次插入天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸和精氨酸四个氨基酸残基得到的，所用引物如下：

PulBd-306-For：5’-AATTATCATCGTTCTAACCAGGTGCTGGTTAAACTGTC-3’(SEQ IDNo.5)；

PulBd-306-Rev：5’-GTTAGAACGATGATAATTAGCATCCAGATACGCGTTGC-3’(SEQ IDNo.6)；

PulBd-117-Rev：5’-GAGAATCAAATTCTTTGCTGTTCAGCACGTTACGCG-3’(SEQ IDNo.8)；

突变体PulBd-500是通过在野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第500位依次插入天冬氨酸和谷氨酸氨基酸残基得到的；

PulBd-500-For：5’-CTGTAGACGAAACTGATCCGAATGAAACCCAAtATAAC-3’(SEQ IDNo.9)；

PulBd-500-Rev：5’-GTTATaTTGGGTTTCATTCGGATCAGTTTCGTCTACAG-3’(SEQ IDNo.10)；

突变体PulBd-714是通过在野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第714位依次插入甘氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸五个氨基酸残基得到的；

PulBd-714-For：5’-GGCATTGATTATGATCGTATCAACGACTTCACCTCTTCTCC-3’(SEQ IDNo.11)；

PulBd-714-Rev：5’-ACGATCATAATCAATGCCGGAACCCTCAACGCCGTTC-3’(SEQ IDNo.12)；

突变体PulBd-905是通过在野生型普鲁兰酶(SEQ ID No.1)的第905位插入天冬酰胺残基得到的；

PulBd-905-For：5’-CCTGGGTCAGGCAGAGGGCAATTCCGTCCAGGTACCAGG-3’(SEQ IDNo.13)；

PulBd-905-Rev：5’-CCTGGTACCTGGACGGAATTGCCCTCTGCCTGACCC-3’(SEQ IDNo.14)；

PCR反应体系均为：5×PSbuffer 10μL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimeStarHS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL；

PCR扩增条件均为：94℃预变性8min；随后进行30个循环(94℃10s，58℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min；

(2)PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将DpnI处理后的扩增产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100μg·mL^-1氨苄霉素的LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入含有100μg·mL^-1氨苄霉素的LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的含有编码突变体PulBd-306、PulBd-117、PulBd-117/306、PulBd-500、PulBd-714或PulBd-905的基因的重组质粒PulBd-pET20b(+)；

(3)将测序正确的含有编码突变体PulBd-306、PulBd-117、PulBd-117/306、PulBd-500、PulBd-714或PulBd-905的重组质粒PulBd-pET20b(+)热激转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基中于37℃培养8～10h，得到种子液；

(4)将种子液按5％接种量接入TB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀为0.6，再用0.05mM的异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于37℃继续摇瓶诱导培养44h，得到含有突变体PulBd-306、PulBd-117、PulBd-117/306、PulBd-500、PulBd-714或PulBd-905的发酵液，分别命名为发酵液B、C、D、E、F、G。

实施例3：不同普鲁兰酶分泌能力的检测

具体步骤如下：

1、样品处理

将实施例1获得的发酵液A以及实施例2获得的发酵液B、C、D、E、F、G分别于4℃、10000g离心10min，收集发酵上清液以及沉淀；将沉淀用等体积的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，功率采用130KW，超声3s，间歇5s，共20min，获得细胞破碎液。

2、样品检测

检测发酵上清液、细胞破碎液中的普鲁兰酶酶活，检测结果如下：

发酵液A中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为16.9U·mL^-1和19.1U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的46.93％；

发酵液B中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为38.9U·mL^-1和20.5U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的67.96％；

发酵液C中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为49.6U·mL^-1和22.5U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的68.83％；

发酵液D中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为11.3U·mL^-1和21.0U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的35％；

发酵液E中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为12.9U·mL^-1和18.1U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的41.6％；

发酵液F中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为1.3U·mL^-1和2.7U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的26.1％；

发酵液G中的发酵上清液以及细胞破碎液的酶活力分别为2.8U·mL^-1和4.7U·mL^-1，其中，胞外酶活力占总酶活力的37.2％；

可见，普鲁兰酶突变体PulBd-306以及PulBd-117的胞外分泌能力较野生型有了显著的提升；而普鲁兰酶突变体PulBd-500、PulBd-714或PulBd-905的胞外分泌能力与野生型相比，有所下降。

实施例4：不同普鲁兰酶的分离纯化

具体步骤如下：

将实施例1获得的发酵液A以及实施例2获得的发酵液B、C、D分别于4℃、10000g离心10min，收集发酵上清液；调节发酵上清液的pH到4.5后将发酵上清液置于55℃的水浴锅中热处理1h，1h后，将水浴处理后的发酵上清液于4℃、10000g离心20min，收集上清液；往上清液中缓慢加入70％的(NH₄)₂SO₄，于4℃放置盐析8～12h，得到盐析液；将盐析液于4℃、10000g离心20min，收集沉淀；将沉淀用20mmol/L磷酸缓冲液复溶后，在20mmol/L磷酸缓冲液中透析8～12h，期间更换2～3次透析缓冲液，得到透析液；将透析液通过0.22μm膜过滤，制成上样样品；采用AKTA蛋白纯化仪对上样样品进行纯化，获得洗脱液；将洗脱液在50mM的pH为4.5醋酸缓冲液中透析8～12h后，得到纯化后的野生型普鲁兰酶以及突变体PulBd-306、PulBd-117和PulBd-117/306，分别命名为野生型、PulBd-306、PulBd-117和PulBd-117/306；

其中，整个纯化过程在层析柜中进行，控制温度为4℃，阴离子交换色谱纯化步骤包括：(1)平衡：用5倍体积的20mmol/L磷酸缓冲液平衡DEAE阴离子交换色谱柱；(2)上样：预先处理好的样品以1mL/min的流速上样；(3)洗脱，流速1.0mL/min，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分部收集含普鲁兰酶酶活的洗脱液。

实施例5：不同普鲁兰酶比酶活的检测

具体步骤如下：

对实施例3获得的野生型、PulBd-306、PulBd-117和PulBd-117/306进行比酶活的检测，检测结果为：野生型的比酶活为449.80U·mg^-1，PulBd-306的比酶活为506.10U·mg^-1，PulBd-117的比酶活为378.53U·mg^-1，PulBd-117/306的比酶活为410.6U·mg^-1，可见，PulBd-306的比酶活较野生型有了明显的改善。

实施例6：普鲁兰酶突变体发酵条件的优化

具体步骤如下：

在实施例2的基础上，将发酵生产突变体PulBd-306以及PulBd-117过程中的诱导温度分别改成25℃、30℃和37℃，获得发酵液；将发酵液分别于4℃、10000g离心10min，收集发酵上清液；检测不同温度下获得的发酵上清液中的普鲁兰酶酶活，检测结果如图1-2。

由图1-2可知，当诱导温度为25℃时，发酵上清液中的可溶性普鲁兰酶的活力最高，此时，重组菌的菌体浓度也最高；随着温度的升高，发酵上清液中的可溶性普鲁兰酶的活力开始下降，此时，重组菌的菌体浓度也在逐渐降低。因此，为了增加普鲁兰酶的表达效率，提高重组普鲁兰酶的质量，应选择25℃作为诱导温度。

实施例7：普鲁兰酶突变体发酵条件的优化

具体步骤如下：

在实施例5的基础上，将发酵生产突变体PulBd-306以及PulBd-117过程中的诱导温度改为25℃，IPTG终浓度分别改为0mmol·L^-1、0.025mmol·L^-1、0.05mmol·L^-1、0.1mmol·L^-1和0.2mmol·L^-1，获得发酵液；将发酵液分别于4℃、10000g离心10min，收集发酵上清液；检测不同IPTG终浓度下获得的发酵上清液中的普鲁兰酶酶活，检测结果如图3-4。

由图3-4可知，当不添加IPTG诱导时，发酵上清液中的普鲁兰酶酶活很低，重组菌的菌体浓度很高；随着IPTG浓度的升高，发酵上清液中的普鲁兰酶酶活逐渐升高，重组菌菌体浓度逐渐降低；当IPTG浓度为0.025mmol·L^-1时，含有突变体PulBd-306的发酵液上清液中的普鲁兰酶酶活达61.6U·mL^-1，含有突变体PulBd-117的发酵液上清液中的普鲁兰酶酶活达75.3U·mL^-1，说明突变体PulBd-306和PulBd-117在很低的IPTG浓度下也能够很好的表达并分泌到胞外，进一步说明突变体PulBd-306和PulBd-117具有良好的胞外分泌能力；当IPTG浓度为0.1mmol·L^-1时，发酵上清液中的普鲁兰酶酶活达到最高，其中，含有突变体PulBd-306的发酵液上清液中的普鲁兰酶酶活达90.6U·mL^-1，含有突变体PulBd-117的发酵液上清液中的普鲁兰酶酶活达103.2U·mL^-1；当IPTG浓度超过0.1mmol·L^-1时，发酵上清液中的普鲁兰酶酶活开始下降。因此，为了增加普鲁兰酶的表达效率，提高重组普鲁兰酶的质量，应选择将IPTG终浓度控制为0.1mmol·L^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 928

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly

20 25 30

Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala

35 40 45

Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg

50 55 60

Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu

65 70 75 80

Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe

85 90 95

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<400> 13

cctgggtcag gcagagggca attccgtcca ggtaccagg 39

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cctggtacct ggacggaatt gccctctgcc tgaccc 36

Claims

1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位和/或117位氨基酸进行突变得到的。

2.如权利要求1所述的一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及天冬氨酸四个氨基酸残基得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第117位依次插入天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸以及精氨酸四个氨基酸残基得到的；

或者，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸四个氨基酸残基以及第117位依次插入天冬酰胺、酪氨酸、组氨酸和精氨酸四个氨基酸残基得到的。

3.编码权利要求1或2所述普鲁兰酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。

6.携带权利要求3所述基因或权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌。

8.权利要求1或2所述普鲁兰酶突变体的制备方法，其特征在于，将权利要求6或7所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的发酵上清液中分离权利要求1或2所述的普鲁兰酶突变体。

9.权利要求1或2所述普鲁兰酶突变体或权利要求3所述基因或权利要求4或5所述重组质粒或权利要求6或7所述宿主细胞或权利要求8所述制备方法在水解淀粉方面的应用。

10.一种水解淀粉的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述普鲁兰酶突变体或权利要求6或7所述宿主细胞与其他淀粉酶同时加入淀粉中进行酶解；所述其他淀粉酶为糖化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶和/或淀粉葡萄糖苷酶。