KR20230041483A - 에틸카바메이트가 저감화된 막걸리 제조용 개량 효모 균주 및 이를 이용한 막걸리의 제조 방법 - Google Patents
에틸카바메이트가 저감화된 막걸리 제조용 개량 효모 균주 및 이를 이용한 막걸리의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아르기나아제(Arginase) 생성량이 줄어들도록 CAR1를 결손시키고, DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현을 억제하는 GZF3 유전자를 결손시킨 것을 특징으로 하는 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 관한 것으로, 본 발명을 통해 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함유량이 줄어든 발효주를 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 사카로미세스 세리비지애(saccharomyces cerevisiae)를 유전자 재조합하여 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성량이 저감화된 재조합 균주에 관한 것이다.
에틸 카바메이트(Ethyl carbamate)는 발효 음료나 발효 식품에서 자연적으로 발생되는 물질로 사람에게 발암물질로 알려져 있다. 소량 섭취 시 어지러움, 구통 등을 유발하고 과량 섭취 시 장의 건강을 악화시키고 암을 유발한다. 이러한 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate)는 알코올 음료의 발효, 저장 중에 지속적으로 생성되기 때문에, 줄이려는 노력이 필요하다.
미국의 경우 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함유량이 테이블 와인은 15ppb이하, 강화 와인은 60ppb 이하로 권고하고 있으며, 한국의 경우 식품의약품안전처에서 2011년 ‘주류 중 에틸 카바메이트 저감화 매뉴얼’을 발간하여 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 저감화에 힘쓰고 있다.
그동안 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 저감화를 위해서 CAR1 유전자가 결손된 효모사용, 발효 온도 조절, 주류 발효 재료의 아르기닌 또는 요소 제한 등의 방법을 사용했다. 하지만 이와 같은 방법으로는 저감효과가 적어 새롭게 발효능이 뛰어난 주조용 효모를 동정하여 사용할 때, 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성량이 높은 균주일 경우, 실제 주류 발효에 사용하지 못한다는 문제점이 있다.
본 발명은 효모인 사카로미세스 세리비지애(saccharomyces cerevisiae)를 유전자 재조합하여 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성량을 저감화 시킬 수 있는 재조합 사카로미세스 세리비지애(saccharomyces cerevisiae)를 제공하고, 상기 균주를 이용하여 에틸 카바메이트 함유량이 줄어든 발효주를 제공하고자 한다.
본 발명은 아르기나아제(Arginase) 활성을 줄이고자 CAR1 유전자를 결손시키고, DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현의 억제를 해소하고자 GZF3 유전자를 결손시킨 것을 특징으로 하는 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다. 한편, 상기 GZF3 유전자의 결손으로 말미암아, 바람직하게 DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현이 증가하는 특징을 가질 수 있다. 또한, DUR1, DUR2 유전자 발현의 증가로 말미암아, 바람직하게 균체 내에 축적된 요소가 분해되며, DUR3 유전자 발현의 증가로 말미암아 균체 외의 요소가 균체 내부로 유입되어 균체 외부에 존재하는 요소의 양이 줄어드는 특징을 가질 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 발효 균주로 이용하는 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법을 제공한다. 한편, 상기 발효주는, 바람직하게 쌀을 기질로 이용하고 정치배양하여 제조한 막걸리일 수 있다.
본 발명은 상기 발효주의 제조방법에 의해 제조된 막걸리를 제공한다. 한편, 상기 막걸리는, 바람직하게 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함유량이 줄어든 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 효모인 사카로미세스 세리비지애(saccharomyces cerevisiae) 균주를 유전자 재조합하여 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성량이 저감화된 재조합 균주를 통해 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함유량이 저감화된 발효주를 제조할 수 있다.
도 1은 CAR1 및 GZF3 유전자가 균주에서 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 형성에 어떻게 작용하고 있는지를 나타낸다.
도 2는 본 발명 재조합 균주를 제조하는 방법을 설명한 모식도이다.
도 3은 염색체 수가 1개인 1N 균주로 알려진 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) BY4742 균주와 본 발명에서 사용하는 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6 균주를 유세포분석기를 이용하여 염색체 수를 비교하여 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명 재조합 균주에 결손이 잘 일어났는지 확인하기 위한 colony PCR 결과이다.
도 5는 본 발명 재조합 균주의 발효액 성분 함량 비교 결과이다.
도 6은 본 발명 재조합 균주의 RNA 발현량 비교 결과이다.
도 7은 본 발명 재조합 균주를 이용한 막걸리의 에탄올 함량 비교 결과이다.
도 8은 본 발명 재조합 균주를 이용한 막걸리의 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함량 비교 결과이다.
도 9는 본 발명 재조합 균주를 이용한 막걸리의 비교 사진이다.
도 2는 본 발명 재조합 균주를 제조하는 방법을 설명한 모식도이다.
도 3은 염색체 수가 1개인 1N 균주로 알려진 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) BY4742 균주와 본 발명에서 사용하는 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6 균주를 유세포분석기를 이용하여 염색체 수를 비교하여 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명 재조합 균주에 결손이 잘 일어났는지 확인하기 위한 colony PCR 결과이다.
도 5는 본 발명 재조합 균주의 발효액 성분 함량 비교 결과이다.
도 6은 본 발명 재조합 균주의 RNA 발현량 비교 결과이다.
도 7은 본 발명 재조합 균주를 이용한 막걸리의 에탄올 함량 비교 결과이다.
도 8은 본 발명 재조합 균주를 이용한 막걸리의 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함량 비교 결과이다.
도 9는 본 발명 재조합 균주를 이용한 막걸리의 비교 사진이다.
에틸 카바메이트(Ethyl carbamate)는 효모가 배출하는 요소(Urea) 및 외부에 존재하고 있던 요소(Urea)가 효모의 발효 시 생산되는 에탄올과 결합하여 자연적으로 생성된다고 알려져 있다.
한편, 아르기나아제(Arginase)는 아르기닌(Arginine)을 분해하는 효소인데, 아르기닌(Arginine)이 분해되면 요소(Urea)가 생성된다. 균체 내에 생성된 요소의 분해 및 배출과 관련된 대표적 유전자로는 DUR1, DUR2 유전자 및 DUR3 유전자가 있다 (도 1). 이중 DUR1 및 DUR2 유전자는 세포 내에 존재하는 요소(Urea)를 분해하는 유전자이고, DUR3 유전자는 세포 외 요소(Urea)를 흡수하는 유전자로 알려져 있다. 그런데, DUR1, DUR2 유전자 및 DUR3 유전자는 GZF3 유전자에 의해 그 발현이 조절되는데, 통상적인 환경에서는 DUR1, DUR2 유전자 및 DUR3 유전자의 발현이 억제되는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 균체 내에 생성되는 요소의 양을 줄이고, 생성된 요소도 분해를 하여 균체 외에 존재하는 요소의 양을 줄이고자 하였다. 이를 위해 3단계의 전략을 사용하였다. 첫째로는 균체 내에 생성되는 요소의 양을 줄이고자 하는 것인데, 아르기나아제(Arginase)를 암호화는 것으로 알려진 CAR1 유전자 (Arginase 효소를 암호화 함)를 결손시켜 아르기나아제의 활성을 줄여보고자 하였다. 두번째로는 균체 내에 존재하는 요소를 암모니아와 이산화탄소로 분해하고자 DUR1, DUR2 유전자의 발현을 증가시키고자 하였다. 셋째로는 배지에 존재하는 요소를 균체 내로 유입하고자(유입 후에는 암모니아와 이산화탄소로 분해됨) DUR3 유전자 발현을 증가시키고자 하였다. 이때, DUR1, DUR2 유전자와 DUR3 유전자는 GZF3 유전자가 발현하는 단백질(transcriptional inhibitor)에 의해 그 발현이 억제되도록 조절되는데, 본 발명에서는 GZF3 유전자를 결손시킴으로 야생형 대비 DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현량을 증가시킬 수 있었다. 이를 통해 균체 내에 존재하는 요소의 생성을 줄일 수 있었고 또한 균체 내에 존재하는 요소의 분해도 촉진할 수 있었다, 아울러 배지 중 존재하는 요소(Urea)를 균체 내로 유입시켜 분해할 수도 있었다. 이를 통해 궁극적으로 균체 외 배지(예로서, 막걸리)에 존재하는 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성을 감소시킬 수 있었다.
따라서, 본 발명은 아르기나아제(Arginase) 활성을 줄이고자 CAR1 유전자를 결손시키고, DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현의 억제를 해소하고자 GZF3 유전자를 결손시킨 것을 특징으로 하는 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다. 하기 실험예에 의하면, 본 발명의 재조합 균주의 CAR1 유전자가 거의 발현되지 않고, DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성량이 적어진 것을 볼 수 있는데, 이에 따라, 요소(Urea) 분비량이 적어진 것으로 판단할 수 있다.
한편, 상기 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 특별한 것으로 한정되는 것은 아니고, 기존 공지되거나 새롭게 분리한 것을 사용할 수 있는데, 본 발명에서는 누룩에서 분리한 것을 사용하였다.
본 발명은 상기 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 발효 균주로 이용하는 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법을 제공한다. 한편, 상기 발효주는 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하여 발효하는 주류 중 무엇이든 해당할 수 있는데, 일 예로, 와인, 맥주, 청주, 탁주, 약주로 제조할 수 있다.
바람직하게는 쌀을 기질로 이용하고 정치배양하여 막걸리로 제조할 수 있는데, 더욱 바람직하게 첫 22 내지 26시간 동안 24 내지 26℃에서 정치 배양하고, 이후에 150 내지 180시간까지 19 내지 21℃에서 정치 배양하여 막걸리를 제조할 수 있다. 하기 실험예에 따르면, 본 발명의 재조합 균주 및 쌀을 기질로 이용하고 정치배양하여 막걸리를 제조하였을 경우 기존 야생형 균주와 비교하여 에탄올 생산성에 유의적인 차이를 보이지 않았고, 색, 향 및 맛이 모두 유사한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함유량이 우수하게 저감화된 것을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예, 실험예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용된 균주를 하기 표 1, 플라스미드를 하기 표 2, 프라이머를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
| 균주 이름 | 관련특징 | 출처 |
| S. cerevisiae GRL6 | Industrial yeast strain (unknown genotype) | 본 발명 |
| ΔCAR1 | S. cerevisiae GRL6 ΔCAR1 | 본 발명 |
| ΔGZF3 | S. cerevisiae GRL6 ΔGZF3 | 본 발명 |
| ΔCAR1ΔGZF3 | S. cerevisiae GRL6 ΔCAR1 ΔGZF3 | 본 발명 |
| E. coli TOP10 | F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG | Invitrogen (CA, USA) |
| 플라스미드 이름 | 관련특징 | 출처 |
| pRS42K-gDNA-HXK2 | HXK2 guide RNA expression plasmid, Geneticin marker | Production of 1-butanol and butanol isomers by metabolically engineered Clostridium beijerinckii and Saccharomyces cerevisiae Seung-Oh Seo, 2017, Ph.D. Thesis, University of Illinois at Urbana-Champaign |
| pRS42K-gRNA-CAR1 | Replacement of gRNA cassette for deletion of HXK2 with gRNA cassette for deletion of CAR1 | 본 발명 |
| pRS42K-gRNA-GZF3 | Replacement of gRNA cassette for deletion of HXK2 with gRNA cassette for deletion of GZF3 | 본 발명 |
| pCas9-NAT | Cas9 expression plasmid, Nourseothricin marker | Addgene (#43802) |
| pRS42H | Yeast episomal plasmid, Hygromycin B marker | System of centromeric, episomal, and integrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae Christof Taxis and Michael Knop BioTechniques 2006 40:1, 73-78 |
| pCas9-Hyg | Replacement of Nourseothricin marker with Hygromycin B marker | 본 발명 |
| 프라이머 명칭 | 서열번호 |
| ITS1 | 서열번호 1 |
| ITS4 | 서열번호 2 |
| SDM-gRNA-CAR1-F | 서열번호 3 |
| SDM-gRNA-CAR1-R | 서열번호 4 |
| SDM-gRNA-GZF3-F | 서열번호 5 |
| SDM-gRNA-GZF3-R | 서열번호 6 |
| Hyg-insert-F | 서열번호 7 |
| Hyg-insert-R | 서열번호 8 |
| Cas9-NAT-backbone-F | 서열번호 9 |
| Cas9-NAT-backbone-R | 서열번호 10 |
| Donor-CAR1-F | 서열번호 11 |
| Donor-CAR1-R | 서열번호 12 |
| Donor-GZF3-F | 서열번호 13 |
| Donor-GZF3-R | 서열번호 14 |
| Check-CAR1-F | 서열번호 15 |
| Check-CAR1-R | 서열번호 16 |
| Check-GZF3-F | 서열번호 17 |
| Check-GZF3-R | 서열번호 18 |
| 프라이머 명칭 | 서열번호 |
| DUR1, 2-F | 서열번호 19 |
| DUR1, 2-R | 서열번호 20 |
| DUR3-F | 서열번호 21 |
| DUR3-R | 서열번호 22 |
| CAR1-F | 서열번호 23 |
| CAR1-R | 서열번호 24 |
| ACT1-F | 서열번호 25 |
| ACT1-R | 서열번호 26 |
[실시예 1 : 본 발명의 재조합 사카로미세스 세리비지애(
Saccharomyces cerevisiae
) 제작]
1) 개요
본 실시예에서는 CAR1 및 GZF3 유전자를 결손시킨 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 제작하고자 했다. 상기 유전자들이 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성에 어떻게 작용하는지 도 1에 나타내었고, 재조합 균주를 제작하는 모식도를 도 2에 나타내었다.
2) 균주 분리
본 발명에서는 누룩으로부터 효모를 분리하여 사용하였다. 분리된 효모에 ITS1, ITS4 프라이머를 이용하여 Colony PCR한 후 서열 결정을 통해 분리한 균주가 주류 제조에 흔히 쓰는 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주임을 동정할 수 있었다. 본 실험에서 분리한 균주는 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6로 명명하였다. 이후 유세포 분석기를 통하여 동정한 균주의 염색체 수를 확인하고자 했다. 염색체 수가 1개인 1N 균주로 알려진 S. cerevisiae BY4742 균주와 누룩에서 동정한 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6 균주를 동시에 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide) 염색약으로 염색한 후 유세포분석기를 이용하여 형광의 세기를 측정하였다. 이에 따른 결과를 도 3에 나타내었다. 유세포분석기를 이용하여 두 균주의 형광량을 비교한 결과 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6의 형광량이 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) BY4742 형광량의 2배인 것을 확인하였다. 결과적으로 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6는 염색체가 2개인 2N 균주임을 알 수 있었다.
3) 플라스미드 제작
효모에서 Cas9 단백질을 발현하기 위한 pCas-Hyg 플라스미드를 제작하고자 했다. 기존 pCas-NAT 플라스미드의 경우 Nourseothricin을 마커로 이용하였는데, Nourseothricin 항생제는 비용이 높기 때문에, 보다 효율적이고 경제적인 실험을 위하여 Hygromycin B 항생제를 마커로 사용하는 pCas-Hyg 플라스미드를 제작하고자 했다. pRS42H 플라스미드에서 Hyg-insert 프라이머를 통해 Hygromycin B 유전자를 PCR하였으며, pCas-NAT 플라스미드에서 Cas9-NAT-backbone 프라이머를 통해 Nourseothricin 관련 유전자를 제외한 모든 부분을 PCR하였다. 자세한 실험방법은 Gibson Assembly Kit 프로토콜을 따라 제작하였다.
한편, 결손시킬 CAR1, GZF3 유전자를 타겟하는 gRNA 발현을 위한 pRS42K-gRNA-CAR1, pRS42K-gRNA-GZF3 플라스미드를 제작하고자 했다. NEB (MA, USE)사의 Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 pRS42K-gRNA-HXK2 플라스미드에서 HXK2 유전자를 타겟으로 하는 20bp의 gRNA 서열부분을 CAR1 또는 GZF3 유전자에 맞게 변경하는 방식을 이용하였다. pRS42K-gRNA-HXK2 플라스미드와 SDM-gRNA-CAR1-R, SDM-gRNA-CAR1-B 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 pRS42K-gRNA-CAR1 플라스미드를 제작하였고, pRS42K-gRNA-HXK2 플라스미드와 SDM-gRNA-GZF3-F와 SDM-gRNA-GZF3-R 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 pRS42K-gRNA-GZF3 플라스미드를 제작하였다. 자세한 실험방법은 Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit 프로토콜을 따라 제작하였다.
한편, 상기 모든 플라스미드의 cloning과 복제에는 E.coli TOP10 균주를 사용했다.
4) Donor DNA제작
Cas9과 gRNA를 이용하여 타겟 유전자를 절단한 후 상동 재조합을 일으키기 위한 Donor DNA를 제작하고자 했다. 유전자 당 90 bp의 Donor DNA를 제작하였으며, 사용한 프라이머는 Donor-CAR1-F, Donor-CAR1-R, Donor-GZF3-F, Donor-GZF3-R 이다. 각각의 60 bp의 forward, reverse 프라이머는 서로 상보적인 30 bp의 상응하는 부위가 있으며 2회 PCR을 통해 이중 가닥의 Donor DNA를 제작하였다.
5) 재조합 균주 제작
효모의 유전자 결손을 위한 CRISPR/Cas9을 실시하였다. 정확한 유전자 절단을 위한 Cas9 단백질을 발현하는 pCas-Hyg 플라스미드와 CAR1, GZF3 유전자를 타겟팅을 위한 gRNA를 발현하는 pRS42K-gRNA-CAR1 및 pRS42K-gRNA-GZF3 플라스미드를 절단 하고, 상동 재조합을 일으키기 위한 CAR1, GZF3 유전자 Donor DNA를 준비한 후 형질전환을 시도하였다. 형질 전환은 방법은 'High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method'(R Daniel Gietz & Robert H Schiestl, 2007, NATURE PROTOCOLS)를 따랐다.
형질전환 후에는 colony PCR을 통하여 유전자 결손을 확인하였다. Colony PCR에는 Check-CAR1-R, Check-CAR1-B, Check-GZF3-R, Check-GZF3-B 프라이머를 사용하였고, 이에 따른 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 1~4번 라인은 CAR1 유전자를 확인 하기 위한 colony PCR 결과이고, 5~8번 레인은 GZF3 유전자를 확인 하기 위한 colony PCR 결과이다. 각각 같은 프라이머를 사용하여 colony PCR한 결과로 야생형 균주에 비해 밴드 사이즈가 감소한 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 재조합 균주의 CAR1 및 GZF3 유전자가 성공적으로 결손됐다는 것을 확인하였다.
[실험예 1: 야생형 균주 및 재조합 균주의 발효산물 비교]
재조합 균주의 발효산물 비교를 위하여 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6의 야생형 균주, CAR1 유전자가 결손된 ΔCAR1 균주, GZF3 유전자가 결손된 ΔGZF3 균주, CAR1 유전자 및 GZF3 유전자 모두 결손된 ΔCAR1ΔGZF3 균주, 이렇게 총 4가지 균주를 동시에 같은 조건에서 발효하였다. 발효는 8% 포도당(glucose), 50 mg/L 요소(Urea), 50 mM 아르기닌(arginine)이 포함된 YP배지를 사용하였으며, 초기 접종 O.D600은 0.2로 맞춰 실시하였고, 30℃, 200 rpm으로 진행하였다. 발효액은 0 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 168 h에 수집하여 -80℃에서 보관하였다. 이후 수집한 발효액을 HPLC와 GC/MS 측정을 통하여 분석하였다. 측정은 3회 반복실험하였고 평균값을 표기하여 도 5, 표 5 및 표 6에 나타내었다. 도 5는 각 균주 발효액의 포도당(Glucose), 글리세롤(Glycerol), 에탄올(Ethanol), 아세테이트(Acetate) 농도 및 O.D600 값을 보여주는 그래프이다. 이 중 12 h에 수집된 발효액의 값을 하기 표 5에 나타내었다. 표 6은 0 h, 24 h 및 168 h에 수집된 발효액의 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 농도를 보여준다.
| 균주 이름 | O.D600 | 에탄올(g/L) | 에탄올 수율 (g 에탄올/g 포도당) |
에탄올 생산성 (g/L/h) |
| S. cerevisiae GRL6 | 39.9±1.0 | 34.19 ± 0.24 | 0.45 ± 0.001 | 2.85 ± 0.02 |
| ΔCAR1 | 41.3 ± 0.7 | 34.42 ± 0.07 | 0.44 ± 0.007 | 2.87 ± 0.005 |
| ΔGZF3 | 40.7 ± 0.6 | 34.47 ± 0.63 | 0.47 ± 0.02 | 2.87 ± 0.05 |
| ΔCAR1ΔGZF3 | 41.4 ± 0.3 | 34.34 ± 0.14 | 0.44 ± 0.02 | 2.86 ± 0.01 |
상기 표 5는 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6의 야생형 균주, CAR1 유전자가 결손된 ΔCAR1 균주, GZF3 유전자가 결손된 ΔGZF3 균주, CAR1 유전자 및 GZF3 유전자 모두 결손된 ΔCAR1ΔGZF3 균주의 12 h 발효 후 O.D600 값, 에탄올 농도, 에탄올 수율, 에탄올 생산성을 보여준다. 상기 항목에서 4가지 균주 모두 유의적인 차이가 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 야생형 균주에 CAR1 및 GZF3 유전자를 결손시키더라도 균주의 성장과 에탄올 생성에서 차이가 나지 않는 것을 확인하였다.
| 에틸 카바메이트 농도(μg/L) | 상대적인 농도 값 | |||||
| 균주 이름 | 0 h | 24 h | 168 h | 0 h | 24 h | 168 h |
| S. cerevisiae GRL6 | 13.2 ± 1.2 | 41.2 ± 5.2 | 56.9 ± 1.8 | 100 | 100 | 100 |
| ΔCAR1 | 13.1 ± 1.5 | 28.0 ± 2.7 | 42.1 ± 0.9 | 99.3 | 67.9 | 73.9 |
| ΔGZF3 | 13.0 ± 0.8 | 34.2 ± 2.9 | 48.2 ± 3.8 | 98.3 | 83.1 | 84.7 |
| ΔCAR1ΔGZF3 | 12.9 ± 1.2 | 19.7 ± 5.1 | 37.6 ± 2.1 | 98.0 | 47.9 | 66.1 |
상기 표 6은 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae) GRL6의 야생형 균주, CAR1 유전자가 결손된 ΔCAR1 균주, GZF3 유전자가 결손된 ΔGZF3 균주, CAR1 유전자 및 GZF3 유전자 모두 결손된 ΔCAR1ΔGZF3 균주의 0 h, 24 h 및 168 h 발효액의 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 농도 및 비교량을 보여준다. 24 h부터 4가지 균주 모두 서로 유의적인 차이를 보였다. ΔCAR1 균주는 야생형 균주 대비 67.9% 수준을 보이며 감소했고 ΔGZF3 균주는 야생형 균주 대비 83.1% 수준으로 감소했으며, ΔCAR1ΔGZF3 균주는 야생형 균주 대비 47.9% 수준을 보이며 감소했다. 또한, 168 h에서도 상기 4가지 균주는 모두 서로 유의적인 차이를 보였다. ΔCAR1 균주는 야생형 균주 대비 73.9% 수준을 보이며 감소했고 ΔGZF3 균주는 야생형 균주 대비 84.7% 수준으로 감소했으며, ΔCAR1ΔGZF3 균주는 야생형 균주 대비 66.1% 수준을 보이며 감소했다. CAR1 유전자 및 GZF3 유전자 모두 결손된 ΔCAR1ΔGZF3가 가장 낮은 에틸 카바메이트 농도를 보여주는데, 이를 통해 본 발명 재조합 균주의 우수한 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 저감화 효과를 확인하였다.
[실험예 2: 야생형 균주 및 재조합 균주의 RNA 발현량 확인]
본 실험예에서는 야생형 균주, CAR1 유전자가 결손된 ΔCAR1 균주, GZF3 유전자가 결손된 ΔGZF3 균주, CAR1 유전자 및 GZF3 유전자 모두 결손된 ΔCAR1ΔGZF3 균주의 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성관련 유전자 RNA 발현량을 확인하고자 했다. RNA 발현량의 확인하기 위하여 상기 실험예 1에서 수집한 발효액 중 6 h의 효모를 취하여 qRT-PCR을 실시했으며, 항상 일정하게 발현된다고 알려진 ACT1 유전자를 기준으로 CAR1, DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자의 상대적인 발현량을 계산하였고 이에 따른 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6의 결과를 보면, CAR1 유전자의 발현량 경우 ΔCAR1, ΔCAR1ΔGZF3 균주에서는 발현이 되지 않았으며, ΔGZF3 균주에서는 야생형 균주와 유의적으로 차이가 없는 발현량을 보였다. DUR1 및 DUR2 유전자의 경우 ΔCAR1는 야생형 균주와 유의적으로 차이가 없었으며, ΔGZF3와 ΔCAR1ΔGZF3 균주는 야생형 균주와 비교하여 유의적으로 발현량이 증가하였다. DUR1 및 DUR2 유전자의 발현량은 야생형 균주 대비 ΔGZF3 균주는 2.12배 증가하였으며, ΔCAR1ΔGZF3 균주는 1.92배 증가하였다. DUR3 유전자의 경우 ΔCAR1균주는 야생형 균주와 유의적으로 차이가 없었으며, ΔGZF3과 ΔGZF3 균주는 야생형 균주와 비교하여 유의적으로 발현량이 증가하였다. DUR3 유전자의 발현량은 야생형 균주 대비 ΔGZF3 균주는 1.41배 증가하였으며, ΔCAR1ΔGZF3 균주는 1.31배 증가하였다. 이를 통해, 본 발명의 재조합 균주가 의도한 대로 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 생성량이 적어지도록 잘 재조합 된 것을 확인하였다.
[실험예 3: 야생형 균주 및 재조합 균주를 이용한 막걸리 비교]
본 실험예에서는 실제 주류에서도 재조합 균주 및 야생형 균주의 에틸 카바메이트 생성량 차이가 있는지 확인하기 위해 막걸리를 쌀 100 g, 황국균 가루 10 g, 물 300 ml를 섞고 각 균주의 세포를 O.D600 = 50 만큼 회수하여 접종하는 방법으로 제조하였다. 야생형 균주, CAR1 유전자가 결손된 ΔCAR1 균주, GZF3 유전자가 결손된 ΔGZF3 균주, CAR1 유전자 및 GZF3 유전자 모두 결손된 ΔCAR1ΔGZF3 균주를 이용해 막걸리를 제조하였으며, 첫 24시간 동안 25℃에서 정치 배양했으며, 이후에 168시간까지 20℃에서 정치 배양하였다. 각 균주마다 0 h, 24 h, 168 h에 배양액을 수집하고, HPLC와 GC/MS 측정을 통하여 에틸 카바메이트 및 에탄올 생성량을 분석하였다. 에탄올 측정량을 도 7에 나타내었고, 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 측정량을 도 8에 나타내었다. 도 7의 결과를 보면, 에탄올 함량에 유의적인 차이가 없는 것을 확인할 수 있다. 도 8의 결과를 보면, 본 발명에 따른 재조합 균주가 우수하게 막걸리의 에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함량을 저감화 시킨 것을 확인할 수 있다.
이후 상기 168 h에 수집된 배양액의 막걸리를 색, 맛 향을 비교하였다. 맛과 향의 경우 시음 및 시향을 통하여 비교하였고, 맛과 향 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, 도 9를 보면, 막걸리의 색에서도 유의적인 차이를 나타내지 않은 것을 확인할 수 있다.
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<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITS4
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SDM-gRNA-CAR1-F
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<220>
<223> Hyg-insert-R
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<213> Artificial Sequence
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gttttgcaac tgattatgct actatgtatt tatatatgca tacattcgta tatctagtat 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Check-CAR1-F
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<212> DNA
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ggataacgta ccagtgg 17
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<212> DNA
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<223> Check-GZF3-F
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<220>
<223> DUR1, 2-R
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<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DUR3-F
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actgcctgtg ggtgttgttg 20
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> DUR3-R
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cgtctactgg atgcctcttg g 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR1-F
<400> 23
gctgtcccgt gtcattcc 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> CAR1-R
<400> 24
gaccttcacc gtttgtttct g 21
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<223> ACT1-F
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ttattgataa cggttctggt atg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACT1-R
<400> 26
ccttggtgtc ttggtctac 19
Claims (7)
- 아르기나아제(Arginase) 활성을 줄이고자 CAR1 유전자를 결손시키고,
DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현의 억제를 해소하고자 GZF3 유전자를 결손시킨 것을 특징으로 하는 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae).
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)는,
GZF3 유전자의 결손으로 말미암아, DUR1, DUR2 및 DUR3 유전자 발현이 증가된 것을 특징으로 하는 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae).
- 제2항에 있어서,
상기 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)는,
DUR1, DUR2 유전자 발현의 증가로 말미암아 균체 내에 축적된 요소가 분해되고, DUR3 유전자 발현의 증가로 말미암아 균체 외의 요소가 균체 내부로 유입되어 균체 외부에 존재하는 요소의 양이 줄어든 것을 특징으로 하는 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae).
- 제1항의 재조합 사카로미세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 발효 균주로 이용하는 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 발효주는,
쌀을 기질로 이용하고 정치배양하여 제조한 막걸리인 것을 특징으로 하는 발효주의 제조방법.
- 제4항의 방법에 의해 제조된 막걸리.
- 제6항에 있어서,
상기 막걸리는,
에틸 카바메이트(Ethyl carbamate) 함유량이 줄어든 것을 특징으로 하는 막걸리.
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| KR1020210125167A KR102653503B1 (ko) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 에틸카바메이트가 저감화된 막걸리 제조용 개량 효모 균주 및 이를 이용한 막걸리의 제조 방법 |
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Citations (3)
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| KR20150045687A (ko) | 2013-10-21 | 2015-04-29 | 롯데칠성음료주식회사 | 발효주의 에틸카바메이트 저감방법 |
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2021
- 2021-09-17 KR KR1020210125167A patent/KR102653503B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
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| Molecules, 2020, 25, 3580. * |
Also Published As
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