JP3217140B2 - 新規キラー酵母 - Google Patents
新規キラー酵母Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、不良野生酵母を生育阻
害または死滅させる能力を有する酵母（以下、キラー酵
母と略す）に関する。酵母は、食品およびワインなどの
アルコール飲料の製造に用いられており、本発明は、食
品およびアルコール飲料などの製造分野に利用できる。
また、医薬、農薬などの分野での利用の可能性も有す
る。
害または死滅させる能力を有する酵母（以下、キラー酵
母と略す）に関する。酵母は、食品およびワインなどの
アルコール飲料の製造に用いられており、本発明は、食
品およびアルコール飲料などの製造分野に利用できる。
また、医薬、農薬などの分野での利用の可能性も有す
る。
【０００２】
【従来の技術】酵母に対して抗菌活性を有する酵母とし
ては、キャンディダ・ヴィネア（特開昭62-19079) 、キ
ャンディダ・スピーシーズ (特開平1-117778) などが知
られている。
ては、キャンディダ・ヴィネア（特開昭62-19079) 、キ
ャンディダ・スピーシーズ (特開平1-117778) などが知
られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】一般に、アルコール飲
料、アルコールの製造には、酵母による発酵の工程が必
須である。この発酵工程において、たとえばワインで
は、サッカロマイセスに属する野生酵母である仮性産膜
性酵母、またはブドウ果汁中に存在し発酵開始前および
発酵初期において、異臭、 異味の原因となる物質を生成
するハンセヌラ（Hansenula）属、 クロエッケラ（Kloec
kera）属などの不良野生酵母による汚染が問題となる
〔ミクロビオロヒア（Microbiologia)，5, 79(1989) 、
ヴィニュ・エ・ヴァン (Vignes et Vins), 318, 25(198
3)〕。その問題を解決するためにキラー酵母またはキラ
ー形質を導入した優良酵母の利用が試みられている〔ジ
ャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジー
（J.Fermentation Technology),63, 421(1985)、アプラ
イド・アンド・エンバイランメンタル・マイクロバイオ
ロジー（Applied and Environmental Microbiology), 5
3, 2171(1987)、アメリカン・ジャーナル・オブ・エノ
ロジー・アンド・ヴィティカルチャー(AmericanJournal
of Enology and Viticulture), 31, 28(1980)〕。しか
し、従来実用化されているキラー酵母は、サッカロマイ
セス属および一部のキャンディダ（Candida) 属の酵母
に対してのみ抗菌活性を示すため、ワインをこれらの野
生酵母による汚染から守ることは可能であるが、ハンセ
ヌラ属、クロエッケラ属などの酵母によるワインの汚染
を防止することはできない。従って、より広い範囲の野
生酵母に対してキラー性を示すワイン酵母を育種するこ
とは、より良質のワインを醸造するための重要な課題と
なっている。
料、アルコールの製造には、酵母による発酵の工程が必
須である。この発酵工程において、たとえばワインで
は、サッカロマイセスに属する野生酵母である仮性産膜
性酵母、またはブドウ果汁中に存在し発酵開始前および
発酵初期において、異臭、 異味の原因となる物質を生成
するハンセヌラ（Hansenula）属、 クロエッケラ（Kloec
kera）属などの不良野生酵母による汚染が問題となる
〔ミクロビオロヒア（Microbiologia)，5, 79(1989) 、
ヴィニュ・エ・ヴァン (Vignes et Vins), 318, 25(198
3)〕。その問題を解決するためにキラー酵母またはキラ
ー形質を導入した優良酵母の利用が試みられている〔ジ
ャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジー
（J.Fermentation Technology),63, 421(1985)、アプラ
イド・アンド・エンバイランメンタル・マイクロバイオ
ロジー（Applied and Environmental Microbiology), 5
3, 2171(1987)、アメリカン・ジャーナル・オブ・エノ
ロジー・アンド・ヴィティカルチャー(AmericanJournal
of Enology and Viticulture), 31, 28(1980)〕。しか
し、従来実用化されているキラー酵母は、サッカロマイ
セス属および一部のキャンディダ（Candida) 属の酵母
に対してのみ抗菌活性を示すため、ワインをこれらの野
生酵母による汚染から守ることは可能であるが、ハンセ
ヌラ属、クロエッケラ属などの酵母によるワインの汚染
を防止することはできない。従って、より広い範囲の野
生酵母に対してキラー性を示すワイン酵母を育種するこ
とは、より良質のワインを醸造するための重要な課題と
なっている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、クロエッケ
ラ属の酵母および／またはK2タイプのキラー活性を有す
るサッカロマイセス・セレビシエなどの不良野生酵母に
対して生育阻害あるいは死滅させる活性 (以下、キラー
活性と略す) を有する酵母の検索を行った結果、クロエ
ッケラ、ハンセニアスポラ（Hanseniaspora）、ハンセ
ヌラ、サッカロマイセスなどに対してキラー活性を有
し、かつこのキラー活性が２本鎖RNA プラスミドによっ
て遺伝的に支配されている新規キラー酵母株をブドウ果
皮から、さらには、クロエッケラおよび／またはハンセ
ニアスポラに対してキラー活性を有する新規キラー酵母
株をブドウ果皮から分離、取得して本発明を完成するに
至った。
ラ属の酵母および／またはK2タイプのキラー活性を有す
るサッカロマイセス・セレビシエなどの不良野生酵母に
対して生育阻害あるいは死滅させる活性 (以下、キラー
活性と略す) を有する酵母の検索を行った結果、クロエ
ッケラ、ハンセニアスポラ（Hanseniaspora）、ハンセ
ヌラ、サッカロマイセスなどに対してキラー活性を有
し、かつこのキラー活性が２本鎖RNA プラスミドによっ
て遺伝的に支配されている新規キラー酵母株をブドウ果
皮から、さらには、クロエッケラおよび／またはハンセ
ニアスポラに対してキラー活性を有する新規キラー酵母
株をブドウ果皮から分離、取得して本発明を完成するに
至った。
【０００５】以下に本発明を詳細に説明する。本発明
は、不良野生酵母を生育阻害または死滅させる能力を有
するキャンディダ・ステラータおよびハンセニアスポラ
・オシデンタリスに関する。本発明の酵母菌株としては
具体的にはそれぞれ、キャンディダ・ステラータSW-259
（以下、SW-259と略す) 、ハンセニアスポラ・オシデン
タリスSW-283（以下、SW-283と略す) 、ハンセニアスポ
ラ・オシデンタリスSW-298（以下、SW-298と略す) があ
げられ、次のような菌学的性質を示す。
は、不良野生酵母を生育阻害または死滅させる能力を有
するキャンディダ・ステラータおよびハンセニアスポラ
・オシデンタリスに関する。本発明の酵母菌株としては
具体的にはそれぞれ、キャンディダ・ステラータSW-259
（以下、SW-259と略す) 、ハンセニアスポラ・オシデン
タリスSW-283（以下、SW-283と略す) 、ハンセニアスポ
ラ・オシデンタリスSW-298（以下、SW-298と略す) があ
げられ、次のような菌学的性質を示す。
【０００６】Ｉ. キャンディダ・ステラータSW-259 本菌株は、山形県においてブドウ果皮より分離されたも
ので、その菌学的性質は次の通りである。YM寒天培地上
において、25℃で培養したとき、半レンズ状にやや隆起
し、周縁は滑らかで、表面は平滑、性状はやや粘稠な、
クリーム色を呈する集落を形成する。栄養細胞は、卵形
あるいは長円形で、 平均の大きさは4.0〜8.9μｍ×2.4
〜6.4μｍであり、多極出芽により増殖する。また、射
出胞子を形成しない、細胞が短命ではない、子のう胞
子, 冬胞子, 担子胞子を形成しない、カロテノイド色素
を生成しない、分裂子, 芽状胞子を形成しない、偽菌子
を形成する、DBBテストが陰性である、イノシトール、
硝酸塩、エリスリトール、マルトース、D-マンニトー
ル、ガラクトースを資化できない、シュークロースを発
酵するなどの性質を有している。
ので、その菌学的性質は次の通りである。YM寒天培地上
において、25℃で培養したとき、半レンズ状にやや隆起
し、周縁は滑らかで、表面は平滑、性状はやや粘稠な、
クリーム色を呈する集落を形成する。栄養細胞は、卵形
あるいは長円形で、 平均の大きさは4.0〜8.9μｍ×2.4
〜6.4μｍであり、多極出芽により増殖する。また、射
出胞子を形成しない、細胞が短命ではない、子のう胞
子, 冬胞子, 担子胞子を形成しない、カロテノイド色素
を生成しない、分裂子, 芽状胞子を形成しない、偽菌子
を形成する、DBBテストが陰性である、イノシトール、
硝酸塩、エリスリトール、マルトース、D-マンニトー
ル、ガラクトースを資化できない、シュークロースを発
酵するなどの性質を有している。
【０００７】本菌株を、ザ・イースツ・ア・タキソノミ
ック・スタディー第３版(The Yeasts,a taxonomic stud
y,third revised and enlarged edition,Elsevier Scie
ncePublication B.V.,N.J.W. Kreger-van Rij,1984 年)
に従って検索した結果、上記の菌学的性質からキャン
ディダ・ステラータと同定し、キャンディダ・ステラー
タSW-259と命名して、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に平成４年７月９日付でFERM BP-3919号とし
て寄託した。
ック・スタディー第３版(The Yeasts,a taxonomic stud
y,third revised and enlarged edition,Elsevier Scie
ncePublication B.V.,N.J.W. Kreger-van Rij,1984 年)
に従って検索した結果、上記の菌学的性質からキャン
ディダ・ステラータと同定し、キャンディダ・ステラー
タSW-259と命名して、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に平成４年７月９日付でFERM BP-3919号とし
て寄託した。
【０００８】II. ハンセニアスポラ・オシデンタリスSW
-283およびハンセニアスポラ・オシデンタリスSW-298 両菌株はともに山梨県においてブドウの果皮より分離さ
れたもので、その菌学的性質は共通して下記の通りであ
る。YM寒天培地上において、25℃で培養したとき、円錐
状にやや隆起し、周縁は滑らかで、表面は平滑、性状は
やや粘稠な、淡いクリーム白色を呈する集落を形成し、
カロテノイド色素は生成しない。栄養細胞は、両菌株と
もに卵〜レモン形で、それぞれの平均の大きさはSW-283
が4.0〜10.5μｍ×2.4〜5.6μｍ、SW-298が3.2〜8.1μ
ｍ×2.4〜5.7μｍであり、両株ともに両極出芽によって
増殖する。真菌糸ならびに偽菌糸は認められない。皮膜
の形成は認められず、子のう当り１〜２個の胞子を形成
する。胞子は、球形で褐色ではなく、表面が平滑で、光
学顕微鏡で観察可能な突起を有している。また、胞子
は、子のう内で接合しない。シュークロース、メリビオ
ースを資化できるが、可溶性デンプン、L-アラビノース
を資化できない。また、37℃で増殖できない。
-283およびハンセニアスポラ・オシデンタリスSW-298 両菌株はともに山梨県においてブドウの果皮より分離さ
れたもので、その菌学的性質は共通して下記の通りであ
る。YM寒天培地上において、25℃で培養したとき、円錐
状にやや隆起し、周縁は滑らかで、表面は平滑、性状は
やや粘稠な、淡いクリーム白色を呈する集落を形成し、
カロテノイド色素は生成しない。栄養細胞は、両菌株と
もに卵〜レモン形で、それぞれの平均の大きさはSW-283
が4.0〜10.5μｍ×2.4〜5.6μｍ、SW-298が3.2〜8.1μ
ｍ×2.4〜5.7μｍであり、両株ともに両極出芽によって
増殖する。真菌糸ならびに偽菌糸は認められない。皮膜
の形成は認められず、子のう当り１〜２個の胞子を形成
する。胞子は、球形で褐色ではなく、表面が平滑で、光
学顕微鏡で観察可能な突起を有している。また、胞子
は、子のう内で接合しない。シュークロース、メリビオ
ースを資化できるが、可溶性デンプン、L-アラビノース
を資化できない。また、37℃で増殖できない。
【０００９】これら菌株をザ・イースツ・ア・タキソノ
ミック・スタディー第３版によって検索した結果、上記
の性質から、ハンセニアスポラ・オシデンタリスと同定
し、ハンセニアスポラ・オシデンタリスSW-283およびSW
-298と命名して、微工研に平成４年７月９日付でFERM B
P-3917号およびFERM BP-3918号として寄託した。ここで
得られたSW-259、SW-283およびSW-298は、第４表に示す
ように、それぞれ、種々の酵母に対してキラー活性を示
す新規キラー酵母である。また、第５表に示したよう
に、キャンディダ・ステラータSW-259は従来知られてい
るタイプのキラー酵母が有する２本鎖RNAプラスミドと
は異なるサイズの２本鎖RNAプラスミドを保持してい
る。該菌株およびその保有する２本鎖RNAプラスミド
は、例えば、細胞融合、遺伝子操作などによる醸造用酵
母の育種の材料として用いることができる。
ミック・スタディー第３版によって検索した結果、上記
の性質から、ハンセニアスポラ・オシデンタリスと同定
し、ハンセニアスポラ・オシデンタリスSW-283およびSW
-298と命名して、微工研に平成４年７月９日付でFERM B
P-3917号およびFERM BP-3918号として寄託した。ここで
得られたSW-259、SW-283およびSW-298は、第４表に示す
ように、それぞれ、種々の酵母に対してキラー活性を示
す新規キラー酵母である。また、第５表に示したよう
に、キャンディダ・ステラータSW-259は従来知られてい
るタイプのキラー酵母が有する２本鎖RNAプラスミドと
は異なるサイズの２本鎖RNAプラスミドを保持してい
る。該菌株およびその保有する２本鎖RNAプラスミド
は、例えば、細胞融合、遺伝子操作などによる醸造用酵
母の育種の材料として用いることができる。
【００１０】本発明の酵母の培養は、通常の酵母の培養
方法に従って行うことができる。例えば炭素源として、
グルコース、フラクトース、シュークロース、グリセリ
ン、マルトース、ガラクトース、ソルビトールなどのう
ち各酵母菌株が資化可能なものを用いる。窒素源として
は、NH4Cl、(NH4)2SO4、カザミノ酸、酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、マルトエキス、バクトトリプトン、コ
ーンスティープリカー、ソイビーンミール、ファーマメ
ディアなどが、その他の栄養源としては、K2HPO4、KH2P
O4、NaCl、MgSO4、MnCl2、CoCl2、MgCl2、FeSO4、CuSO4
などのミネラル分、ビオチン、ビタミンB1、パントテン
酸、ビタミンB2、ビタミンB6、イノシトールなどのビタ
ミン類などが使用できる。また、ブドウなどの果実や果
皮より得た果汁、抽出物、またはこれらを希釈または濃
縮したものを培地として用いることもできる。培養はpH
2.0〜8.0、温度10〜35℃、（好適には、pH5.0〜6.5、温
度20〜30℃) で24〜90時間行われる。
方法に従って行うことができる。例えば炭素源として、
グルコース、フラクトース、シュークロース、グリセリ
ン、マルトース、ガラクトース、ソルビトールなどのう
ち各酵母菌株が資化可能なものを用いる。窒素源として
は、NH4Cl、(NH4)2SO4、カザミノ酸、酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、マルトエキス、バクトトリプトン、コ
ーンスティープリカー、ソイビーンミール、ファーマメ
ディアなどが、その他の栄養源としては、K2HPO4、KH2P
O4、NaCl、MgSO4、MnCl2、CoCl2、MgCl2、FeSO4、CuSO4
などのミネラル分、ビオチン、ビタミンB1、パントテン
酸、ビタミンB2、ビタミンB6、イノシトールなどのビタ
ミン類などが使用できる。また、ブドウなどの果実や果
皮より得た果汁、抽出物、またはこれらを希釈または濃
縮したものを培地として用いることもできる。培養はpH
2.0〜8.0、温度10〜35℃、（好適には、pH5.0〜6.5、温
度20〜30℃) で24〜90時間行われる。
【００１１】これら菌株においては、高温での培養によ
り、２本鎖RNAプラスミドの脱落が起こりやすいため、2
5℃以下での培養が望ましい。また、２本鎖RNAプラスミ
ドの脱落を防ぐため、保存に際しては、グリセリン中で
低温保存（最終グリセリン濃度10〜40％で−30〜−80℃
保存) することが望ましい。以下に本発明の実施例を示
す。
り、２本鎖RNAプラスミドの脱落が起こりやすいため、2
5℃以下での培養が望ましい。また、２本鎖RNAプラスミ
ドの脱落を防ぐため、保存に際しては、グリセリン中で
低温保存（最終グリセリン濃度10〜40％で−30〜−80℃
保存) することが望ましい。以下に本発明の実施例を示
す。
【００１２】
実施例１ 畑より摘みとった果粒２個分のブドウ果皮を、ストレプ
トマイシン100 単位／ml 、ペニシリン100 単位／ml、
クロラムフェニコール50μg/ml、エタノール１V/V％を
含有するYPD 液体培地（グルコース２％、ペプトン２
％、酵母エキス１％、pH6.0)３ml に加えてよく振り混
ぜた後、25℃で３日間培養した。YPD 寒天培地(YPD液体
培地に寒天２％を添加したもの) 上に、シャーレ１個当
り酵母細胞数100〜150細胞になるように培養液を希釈し
たものを塗布し、25℃でインキュベートした。５日後、
生じたコロニーを、105細胞／ml になるようにクロエッ
ケラ・アピキュラータ（Kloeckera apiculata) IAM4018
またはK2タイプのキラー酵母であるサッカロマイセス・
セレビシエ SW-43を接種したYPD-MB寒天培地(YPD液体培
地18mlに0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液2ml 、メチレンブ
ルー0.04％、寒天0.4ｇを加え、pH4.8に調整) 上にレプ
リカし、25℃で２日間培養した。
トマイシン100 単位／ml 、ペニシリン100 単位／ml、
クロラムフェニコール50μg/ml、エタノール１V/V％を
含有するYPD 液体培地（グルコース２％、ペプトン２
％、酵母エキス１％、pH6.0)３ml に加えてよく振り混
ぜた後、25℃で３日間培養した。YPD 寒天培地(YPD液体
培地に寒天２％を添加したもの) 上に、シャーレ１個当
り酵母細胞数100〜150細胞になるように培養液を希釈し
たものを塗布し、25℃でインキュベートした。５日後、
生じたコロニーを、105細胞／ml になるようにクロエッ
ケラ・アピキュラータ（Kloeckera apiculata) IAM4018
またはK2タイプのキラー酵母であるサッカロマイセス・
セレビシエ SW-43を接種したYPD-MB寒天培地(YPD液体培
地18mlに0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液2ml 、メチレンブ
ルー0.04％、寒天0.4ｇを加え、pH4.8に調整) 上にレプ
リカし、25℃で２日間培養した。
【００１３】上記の被検菌株のうちいずれか１株に対し
てキラー活性を示すコロニー３株（コロニーの周辺に、
生育阻止円あるいは、死菌体に取り込まれたメチレンブ
ルーによる青色の円が観察されるもの) を分離した。そ
れぞれSW-259、SW-283およびSW-298と命名し、以下の方
法で、キラー活性の性質の試験を行った。なお、既知の
K1タイプキラー酵母であるサッカロマイセス・セレビシ
エKL-88（以下、KL-88と略す) 、K2タイプキラー酵母で
あるサッカロマイセス・セレビシエNCYC738（以下、NCY
C738 と略す) およびK3タイプキラー酵母であるサッカ
ロマイセス・セレビシエNCYC761（以下、NCYC761 と略
す) についても同時に試験を行い、比較の対照とした。
てキラー活性を示すコロニー３株（コロニーの周辺に、
生育阻止円あるいは、死菌体に取り込まれたメチレンブ
ルーによる青色の円が観察されるもの) を分離した。そ
れぞれSW-259、SW-283およびSW-298と命名し、以下の方
法で、キラー活性の性質の試験を行った。なお、既知の
K1タイプキラー酵母であるサッカロマイセス・セレビシ
エKL-88（以下、KL-88と略す) 、K2タイプキラー酵母で
あるサッカロマイセス・セレビシエNCYC738（以下、NCY
C738 と略す) およびK3タイプキラー酵母であるサッカ
ロマイセス・セレビシエNCYC761（以下、NCYC761 と略
す) についても同時に試験を行い、比較の対照とした。
【００１４】試験例Ｉ. キラー活性の至適pH（ウエルテ
スト法) 前述の方法で分離されたキラー酵母菌株を、YPD-CP液体
培地(YPD液体培地90mlに0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液10
mlを加えた培地）に接種し、25℃で４日間静置培養後、
培養液をセルロースアセテート製メンブレンフィルター
でろ過した。得られた培養ろ液のキラー活性を、pHを3.
4から6.5に段階的に調整したキラー検定用培地〔YPD-MB
寒天培地に、105細胞／ml になるようにクロエッケラ・
アピキュラータ IAM4018（SW-259、SW-283、SW-298の検
定用）あるいはサッカロマイセス・セレビシエ・エパネ
ー(Epernay)(KL-88、NCYC738、NCYC761の検定用) を接
種し、直径9mmの穴をあけたもの〕により測定した。キ
ラー活性の測定は、各検体 200μlをキラー検定用培地
の穴に注入し、25℃で２日間培養後、穴の周辺に形成さ
れた生育阻止円あるいは死菌体に取り込まれたメチレン
ブルーによる青色の円の直径を測定して求めた。
スト法) 前述の方法で分離されたキラー酵母菌株を、YPD-CP液体
培地(YPD液体培地90mlに0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液10
mlを加えた培地）に接種し、25℃で４日間静置培養後、
培養液をセルロースアセテート製メンブレンフィルター
でろ過した。得られた培養ろ液のキラー活性を、pHを3.
4から6.5に段階的に調整したキラー検定用培地〔YPD-MB
寒天培地に、105細胞／ml になるようにクロエッケラ・
アピキュラータ IAM4018（SW-259、SW-283、SW-298の検
定用）あるいはサッカロマイセス・セレビシエ・エパネ
ー(Epernay)(KL-88、NCYC738、NCYC761の検定用) を接
種し、直径9mmの穴をあけたもの〕により測定した。キ
ラー活性の測定は、各検体 200μlをキラー検定用培地
の穴に注入し、25℃で２日間培養後、穴の周辺に形成さ
れた生育阻止円あるいは死菌体に取り込まれたメチレン
ブルーによる青色の円の直径を測定して求めた。
【００１５】各菌株の至適pHの範囲を第１表に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】試験例II. キラー活性のpH安定性（ウエル
テスト法) 試験例Ｉで得られた培養ろ液のpHを3.0、3.5、4.0、4.
6、5.0、6.0に各々調整して、５℃で15時間放置した
後、pHを4.5に再調整し、試験例Ｉと同様にキラー検定
用培地を用いたウエルテスト法によりキラー活性を測定
した。その結果を第２表に示す。
テスト法) 試験例Ｉで得られた培養ろ液のpHを3.0、3.5、4.0、4.
6、5.0、6.0に各々調整して、５℃で15時間放置した
後、pHを4.5に再調整し、試験例Ｉと同様にキラー検定
用培地を用いたウエルテスト法によりキラー活性を測定
した。その結果を第２表に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】試験例III. 温度安定性（ウエルテスト
法) 試験例Ｉで得られた培養ろ液をpH4.2に調整した後、30
℃でインキュベートし、経時的にサンプリングして、試
験例Ｉと同様なキラー用検定用培地を用いたウエルテス
ト法によりキラー活性を試験した。その結果を第３表に
示す。
法) 試験例Ｉで得られた培養ろ液をpH4.2に調整した後、30
℃でインキュベートし、経時的にサンプリングして、試
験例Ｉと同様なキラー用検定用培地を用いたウエルテス
ト法によりキラー活性を試験した。その結果を第３表に
示す。
【００２０】
【表３】
【００２１】試験例IV. 抗菌スペクトル（ウエルテス
ト法) 試験例Ｉで得られた培養ろ液を用い、種々の被検菌株を
接種して作製したキラー検定用培地によるウエルテスト
法によって、各キラー酵母の被検菌株に対するキラー活
性の有無を試験した。その結果を第４表に示す。
ト法) 試験例Ｉで得られた培養ろ液を用い、種々の被検菌株を
接種して作製したキラー検定用培地によるウエルテスト
法によって、各キラー酵母の被検菌株に対するキラー活
性の有無を試験した。その結果を第４表に示す。
【００２２】
【表４】
【００２３】SW-259はサッカロマイセス・セレビシエの
他に、キャンディダ・アルビカンス（Candida albican
s）、ハンセヌラ・アノマーラ (Hansenula anomala)
、一部のクロエッケラ、ハンセニアスポラ属の酵母な
ど幅広い抗酵母スペクトルを有していた。SW-283は一部
のクロエッケラ、ハンセニアスポラ属の酵母に、SW-298
は一部のクロエッケラ属の酵母に対してキラー活性を有
していた。
他に、キャンディダ・アルビカンス（Candida albican
s）、ハンセヌラ・アノマーラ (Hansenula anomala)
、一部のクロエッケラ、ハンセニアスポラ属の酵母な
ど幅広い抗酵母スペクトルを有していた。SW-283は一部
のクロエッケラ、ハンセニアスポラ属の酵母に、SW-298
は一部のクロエッケラ属の酵母に対してキラー活性を有
していた。
【００２４】試験例Ｖ. キラ−性の遺伝学的背景 SW-259, SW-283, SW-298それぞれのキラー酵母株を37℃
で培養することによって、２本鎖RNAプラスミドを脱落
させ、２本鎖RNAプラスミドを失った株と失わない株に
ついてキラー活性を検定して、キラー性のプラスミドへ
の依存性を検討した。その結果、SW-259では、キラー活
性が２本鎖RNAプラスミドによって遺伝的に支配されて
いることならびに、SW-283、SW-298では、２本鎖RNAプ
ラスミドがキラー活性の発現に関与していないことが明
らかとなった。
で培養することによって、２本鎖RNAプラスミドを脱落
させ、２本鎖RNAプラスミドを失った株と失わない株に
ついてキラー活性を検定して、キラー性のプラスミドへ
の依存性を検討した。その結果、SW-259では、キラー活
性が２本鎖RNAプラスミドによって遺伝的に支配されて
いることならびに、SW-283、SW-298では、２本鎖RNAプ
ラスミドがキラー活性の発現に関与していないことが明
らかとなった。
【００２５】キャンディダ・ステラータSW-259株からの
RNAプラスミドの抽出を、フレッドとフィンク〔H.M.Fr
ied and G.R.Fink:プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.)，75, 4224(1978)〕の方法に準じて行った。
すなわち、100mlのYPD液体培地中で25℃、５日間静置培
養した細胞をpH7.0の50mM EDTAで洗浄後、2.5％の2-メ
ルカプトエタノールを含むpH9.3の50mM Tris-H2SO4によ
り25℃で10分間処理した。集菌後、SDSを１％含むTES緩
衝液〔0.1％NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM EDTA〕
で25℃、10分間処理した。
RNAプラスミドの抽出を、フレッドとフィンク〔H.M.Fr
ied and G.R.Fink:プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.)，75, 4224(1978)〕の方法に準じて行った。
すなわち、100mlのYPD液体培地中で25℃、５日間静置培
養した細胞をpH7.0の50mM EDTAで洗浄後、2.5％の2-メ
ルカプトエタノールを含むpH9.3の50mM Tris-H2SO4によ
り25℃で10分間処理した。集菌後、SDSを１％含むTES緩
衝液〔0.1％NaCl、10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM EDTA〕
で25℃、10分間処理した。
【００２６】反応液中に含まれる不純物を等量のフェノ
ールで抽出除去した後、水層を採取し、２〜３倍量の冷
エタノ−ルを加えて核酸を沈澱させた。得られた沈澱物
を減圧乾燥後、TES緩衝液に溶解し、混在するDNAを除く
ためにDNase処理（DNaseＩ30μg/ml、37℃、30分間) し
た後、電気泳動のサンプルとした。サンプル調製は以下
のとおり行った。サンプル30μｌに0.01％ブロモフェノ
ールブルーおよび40％ショ糖よりなるBPB溶液10μｌを
加えよく混合した後、その10μｌをチャージした。
ールで抽出除去した後、水層を採取し、２〜３倍量の冷
エタノ−ルを加えて核酸を沈澱させた。得られた沈澱物
を減圧乾燥後、TES緩衝液に溶解し、混在するDNAを除く
ためにDNase処理（DNaseＩ30μg/ml、37℃、30分間) し
た後、電気泳動のサンプルとした。サンプル調製は以下
のとおり行った。サンプル30μｌに0.01％ブロモフェノ
ールブルーおよび40％ショ糖よりなるBPB溶液10μｌを
加えよく混合した後、その10μｌをチャージした。
【００２７】泳動は、サブマリン型電気泳動装置にて、
0.7μg／mlのエチジウムブロマイドを含む厚さ3mmの１
％アガロースゲルを用い、60Ｖ定電圧で15℃にて３時間
行った。泳動終了後、波長254nmのUVランプ照射下で観
察した。また、標準マーカーとして、λDNAのHindIIIに
よる切断片を同時に泳動して、その泳動距離に基づき、
RNAプラスミドのサイズを算出した。さらには、サッカ
ロマイセス・セレビシエに属するキラー酵母のうち、K
1、K2、K3の３タイプについて同時に泳動を行い、比較
の対照とした。
0.7μg／mlのエチジウムブロマイドを含む厚さ3mmの１
％アガロースゲルを用い、60Ｖ定電圧で15℃にて３時間
行った。泳動終了後、波長254nmのUVランプ照射下で観
察した。また、標準マーカーとして、λDNAのHindIIIに
よる切断片を同時に泳動して、その泳動距離に基づき、
RNAプラスミドのサイズを算出した。さらには、サッカ
ロマイセス・セレビシエに属するキラー酵母のうち、K
1、K2、K3の３タイプについて同時に泳動を行い、比較
の対照とした。
【００２８】SW-259では、２本のRNAプラスミドのバン
ドが検出された。これらRNAプラスミドのサイズを第５
表にまとめた。また、これらRNAプラスミドのバンド
は、すべて、１本鎖、２本鎖RNAともに切断するRNase A
で処理したサンプルでは消失し、１本鎖RNAのみを切断
するS1ヌクレアーゼで処理したサンプルでは消失しない
ことから、見出されたRNAプラスミドは、２本鎖RNAプラ
スミドであることも明らかとなった。
ドが検出された。これらRNAプラスミドのサイズを第５
表にまとめた。また、これらRNAプラスミドのバンド
は、すべて、１本鎖、２本鎖RNAともに切断するRNase A
で処理したサンプルでは消失し、１本鎖RNAのみを切断
するS1ヌクレアーゼで処理したサンプルでは消失しない
ことから、見出されたRNAプラスミドは、２本鎖RNAプラ
スミドであることも明らかとなった。
【００２９】
【表５】
【００３０】SW-259は、従来知られているものとはサイ
ズが異なる２本鎖RNAプラスミドを有し、そのキラー活
性が２本鎖RNAプラスミド上の遺伝子によってコードさ
れている。キャンディダ属のキラー酵母でそのキラー性
がプラスミドに依存しているものは従来知られていな
い、さらには、キャンディダ・ステラータで酵母に対し
て抗菌活性を有するものも知られていない。
ズが異なる２本鎖RNAプラスミドを有し、そのキラー活
性が２本鎖RNAプラスミド上の遺伝子によってコードさ
れている。キャンディダ属のキラー酵母でそのキラー性
がプラスミドに依存しているものは従来知られていな
い、さらには、キャンディダ・ステラータで酵母に対し
て抗菌活性を有するものも知られていない。
【００３１】一方、ハンセニアスポラ属またはその不完
全型のクロエッケラ属のキラー酵母としては、ハンセニ
アスポラ・ウヴァルムおよびクロエッケラ・アピキュラ
ータの例が知られているのみである。さらに、従来知ら
れているハンセニアスポラ、クロエッケラ属のキラー酵
母のうちキラー活性が２本鎖RNAプラスミドに遺伝的に
依存していないものも知られていない。
全型のクロエッケラ属のキラー酵母としては、ハンセニ
アスポラ・ウヴァルムおよびクロエッケラ・アピキュラ
ータの例が知られているのみである。さらに、従来知ら
れているハンセニアスポラ、クロエッケラ属のキラー酵
母のうちキラー活性が２本鎖RNAプラスミドに遺伝的に
依存していないものも知られていない。
【００３２】
【発明の効果】本発明のキラー酵母菌株を直接または育
種の材料として利用すれば、野生酵母による汚染を防ぐ
ことができ、アルコール飲料、アルコール、食品の製造
上大きな利点となる。また、本発明は、生産される抗菌
性物質の農薬、動物薬、医薬、食品添加物などへの利用
の可能性を提供する。
種の材料として利用すれば、野生酵母による汚染を防ぐ
ことができ、アルコール飲料、アルコール、食品の製造
上大きな利点となる。また、本発明は、生産される抗菌
性物質の農薬、動物薬、医薬、食品添加物などへの利用
の可能性を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645） (56)参考文献 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．53 （10）ｐ．2593−2597（1989) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．52 （11）ｐ．2791−2796（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/16 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】 不良野生酵母を生育阻害または死滅させ
る能力を有するキャンディダ・ステラータ（Candida st
ellata）SW-259(FERM BP-3919)。 - 【請求項２】 不良野生酵母がクロエッケラ属、ハンセ
ニアスポラ属、ハンセヌラ属、キャンディダ属またはサ
ッカロマイセス属に属する酵母である請求項１記載の酵
母。 - 【請求項３】 不良野生酵母を生育阻害または死滅させ
る能力を有するハンセニアスポラ・オシデンタリス（Ha
nseniaspora occidentalis）SW-283(FERM BP-3917)また
はハンセニアスポラ・オシデンタリス（Hanseniaspora
occidentalis）SW-298(FERM BP-3918)。 - 【請求項４】 不良野生酵母がハンセヌラ属またはクロ
エッケラ属に属する酵母である請求項３記載の酵母。 - 【請求項５】 キャンディダ・ステラータSW-259(FERM
BP-3919)が保有し、かつ不良野生酵母を生育阻害または
死滅させる活性を付与する遺伝子を含む２６８０塩基対
からなる２本鎖RNAプラスミド。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵
母を用いることを特徴とするアルコール飲料または食品
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21788592A JP3217140B2 (ja) | 1992-08-17 | 1992-08-17 | 新規キラー酵母 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21788592A JP3217140B2 (ja) | 1992-08-17 | 1992-08-17 | 新規キラー酵母 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0662836A JPH0662836A (ja) | 1994-03-08 |
| JP3217140B2 true JP3217140B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=16711295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21788592A Expired - Fee Related JP3217140B2 (ja) | 1992-08-17 | 1992-08-17 | 新規キラー酵母 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3217140B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6598092B2 (en) | 1996-08-27 | 2003-07-22 | Nippon Telegraph & Telephone Corporation | Trunk transmission network |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100717742B1 (ko) | 1999-07-21 | 2007-05-11 | 가부시키가이샤 야쿠루트 혼샤 | 콜레스테롤 저하제，2차 담즙산 생산 억제제 및 음식품 |
| JP4565137B2 (ja) * | 2000-08-11 | 2010-10-20 | 宝ホールディングス株式会社 | 新規酵母及びその取得方法 |
| CN114874924B (zh) * | 2022-01-18 | 2023-07-18 | 吉林大学 | 一株酵母菌菌株cc-pt4及其应用 |
-
1992
- 1992-08-17 JP JP21788592A patent/JP3217140B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２（１１）ｐ．２７９１−２７９６（１９８８） |
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３（１０）ｐ．２５９３−２５９７（１９８９） |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6598092B2 (en) | 1996-08-27 | 2003-07-22 | Nippon Telegraph & Telephone Corporation | Trunk transmission network |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0662836A (ja) | 1994-03-08 |
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