CN110527628B - 一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110527628B
CN110527628B CN201910693692.5A CN201910693692A CN110527628B CN 110527628 B CN110527628 B CN 110527628B CN 201910693692 A CN201910693692 A CN 201910693692A CN 110527628 B CN110527628 B CN 110527628B
Authority
CN
China
Prior art keywords
acetamiprid
agent
concentration
protective agent
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910693692.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110527628A (zh
Inventor
黄星
卢家森
杨涵
祁鹏
何健
蒋建东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201910693692.5A priority Critical patent/CN110527628B/zh
Publication of CN110527628A publication Critical patent/CN110527628A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110527628B publication Critical patent/CN110527628B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Abstract

本发明公开了一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用，该保护剂由稳定剂、营养剂和防腐剂和水组成，所述的稳定剂成分为糊精，营养剂成分为柠檬酸钠和氯化钙，防腐剂成分为苯甲酸钠。本发明的保护剂可以有效解决微生物菌剂活菌数低、保藏期短、易染菌等问题；可有效保持菌剂的性能、提高有效菌存活率、延长菌剂的保藏寿命，并且使得微生物菌剂可以在常温下进行保藏，且其不易染菌，保藏方法成本低廉、使用方便，有效的减少了运输和保藏的成本，进一步保障了农药降解微生物菌剂在农药降解中的实际应用。

Description

一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物降解领域，涉及一种农药降解的微生物菌剂的保护，具体涉及一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
由于农药的肆意使用，以及缺乏合理的科学监督和使用管理，农药的残留导致了环境的退化，严重破坏了生态系统的平衡，造成了生态系统的结构破坏和功能损失。农药污染是一种面源污染，物理化学修复方法存在一定的缺陷。微生物因为具本身固有的特点，使得其在农药降解中占有重要的地位。应用微生物的方法修复农药残留的污染被公认为是一种廉价、安全、有效且无二次污染的方法。目前国内外针对各种农药污染物筛选分离了大量降解性微生物，并且开发了各种微生物降解制剂及配套产品应用于生物原位修复，然而，生物菌剂的保存一直是个难题,也直接影响到生物菌剂的应用潜力，目前市场上的液体菌剂普遍存在活菌数低、保藏期短、易染菌等问题。而采用干燥等方式保藏，虽然可以延长保藏周期，但是其保藏的成本太高、设备技术复杂。因此研究适宜延长菌剂保藏时间的保护剂，使得菌剂在常温下的保藏期能够延长就显得尤为重要。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种啶虫脒降解菌的保护剂，该保护剂可以有效解决微生物菌剂活菌数低、保藏期短、易染菌等问题；可有效保持菌剂的性能、提高有效菌存活率、延长菌剂的保藏寿命，并且使得微生物菌剂可以在常温下进行保藏，且其不易染菌。
本发明还提供一种啶虫脒降解菌的保护剂的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种啶虫脒降解菌的保护剂，由稳定剂、营养剂和防腐剂和水组成，所述的稳定剂成分为糊精，营养剂成分为柠檬酸钠和氯化钙，防腐剂成分为苯甲酸钠。
其中，所述糊精在保护剂中的添加浓度为10～20g/L。
其中，所述柠檬酸钠在保护剂中的添加浓度为10～30g/L，氯化钙在保护剂中的添加浓度为10～30g/L。
其中，所述苯甲酸钠在保护剂中的添加浓度为30g/L。
本发明最优的保护剂组成为：柠檬酸钠在保护剂中的添加浓度为20g/L，氯化钙在保护剂中的添加浓度为30g/L，糊精在保护剂中的添加浓度为20g/L，苯甲酸钠在保护剂中的添加浓度为30g/L。在菌液发酵液中柠檬酸钠添加浓度为2g/L，氯化钙添加浓度为3g/L，糊精添加浓度为2g/L，苯甲酸钠添加浓度为3g/L。
本发明所述的啶虫脒降解菌的保护剂的制备方法，将糊精、柠檬酸钠、氯化钙、苯甲酸钠和水按比例混合制成。
本发明所述的啶虫脒降解菌的保护剂在保护啶虫脒降解菌剂中的应用。
其中，所述啶虫脒降解菌剂为液体菌体。
作为优选，所述啶虫脒降解菌的保护剂添加到啶虫脒降解菌剂中使得在菌剂中糊精浓度为1～2g/L、柠檬酸钠浓度为1～3g/L，氯化钙浓度为1～3g/L、苯甲酸钠浓度为3g/L。
作为优选，所述保护啶虫脒降解菌剂为有效保持菌剂的性能、提高有效菌存活率、延长菌剂的保藏寿命。
作为优选，所述保护啶虫脒降解菌剂为保护啶虫脒降解菌剂在土壤残留啶虫脒农药降解中的应用。
本发明中无机盐培养基(MM)：NH4NO3 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH 7.0。
LB培养基：酵母浸出物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，H2O 1L，pH 7.0，固体培养基加入1.5％-2.0％的琼脂。
D-2发酵培养基：葡萄糖9g/L，硫酸铵0.9g/L，酵母膏0.3g/L，氯化钠0.1g/L，碳酸钙1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L，pH 7.0-7.2。
本发明中啶虫脒(纯度99.8％)原药由江苏绿叶制药厂提供。啶虫脒降解菌株Pigmentiphaga sp.D-2，(Biodegradation of acetamiprid by Pigmentiphaga sp.D-2and the degradation pathway；International Biodeterioration&Biodegradation 85(2013)95-102)。
本发明的液体菌剂在存放过程中容易受到污染而使得杂菌数上升而目标菌株数量的减少。防腐剂作为菌剂中的一种添加物质，其能够有效的减少杂菌的污染。本发明首先通过添加苯甲酸钠、丙酸钙、山梨酸钾三种具有抑菌防霉作用的防腐剂，对菌株D-2的杂菌率进行计算，筛选出抑菌效果好且活菌数相对较高的防腐剂，然后通过添加不同浓度的防腐剂检测其活菌数以及杂菌数，确定了液体发酵液中防腐剂的添加浓度。通过研究发现降解菌均以苯甲酸钠作为抑菌剂效果最好。能够维持在一个较高的活菌数且不产生杂菌污染。
液体菌剂在保存过程中稳定性较差、活菌数下降快。添加保护剂是提高微生物产品有效活菌数，延长其保存期的重要手段。添加保护剂有助于微生物的分散以及生存。本发明表明，通过正交试验筛选的菌剂保护剂能够有效提高细菌存活率。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的农药啶虫脒降解菌菌剂保护剂，稳定剂成分为糊精，其可以维持微生物菌剂内部环境稳定，进一步提高菌株的存活率。营养剂成分为柠檬酸钠和氯化钙，其可以降低微生物菌剂降解性能受环境变化的影响。防腐剂成分为苯甲酸钠，防止微生物菌剂受到杂菌的污染，菌剂的保护剂按照一定浓度有效成分加入到菌剂当中，并置于室温保藏。
本发明的保护剂可以使农药啶虫脒降解微生物菌剂在常温下保藏，最重要的是有效提高了菌剂常温保存条件下的降解效果，且保藏方法成本低廉、使用方便，有效的减少了运输和保藏的成本，进一步保障了农药啶虫脒降解微生物菌剂在农药降解中的实际应用。
本发明的保护剂采用苯甲酸钠作为防腐剂，其成本低廉，且能有效防腐杂菌的污染。本发明的保护剂采用柠檬酸钠和氯化钙作为营养剂，可有效保持菌剂的性能、延长菌剂的保藏寿命，可以满足微生物菌剂应用于农药残留降解的需求，有实用价值。
本发明啶虫脒降解菌的保护剂能够有效提高细菌存活率，添加保护剂保存30天的啶虫脒降解菌D-2的发酵液中活菌数能够提高38.70％；添加保护剂保存30天的菌株D-2的液体菌剂(发酵液)在3d内最多能够降解85.32％的浓度为50mg/L的啶虫脒；添加有保护剂的保存45天的菌株D-2的液体菌剂(发酵液)，在10d内能够使得浓度为5mg/kg干土的啶虫脒降解达92.75％。
附图说明
图1为菌株D-2降解啶虫脒的曲线图；
图2为菌株D-2使用不同组合保护剂对啶虫脒的降解实验效果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
啶虫脒降解菌的保护剂：
称取糊精20g，柠檬酸钠20g，氯化钙30g，苯甲酸钠30g，混合均匀后，用无菌水定容至1000mL。
实施例2
啶虫脒降解菌的保护剂：
称取糊精20g，柠檬酸钠10g，氯化钙20g，苯甲酸钠30g，混合均匀后，用无菌水定容至1000mL。
实施例3
啶虫脒降解菌的保护剂：
称取糊精20g，柠檬酸钠30g，氯化钙10g，苯甲酸钠30g，混合均匀后，用无菌水定容至1000mL。
实施例4
啶虫脒降解菌的保护剂：
称取糊精10g，柠檬酸钠30g，氯化钙30g，苯甲酸钠30g，混合均匀后，用无菌水定容至1000mL。
实施例5
农药残留啶虫脒降解菌菌剂保藏效果
发酵液的制备
挑取菌株D-2单菌落于液体LB中，置于30℃摇床以160rpm培养至对数生长期。按照体积比1％的接种量接入装有1000mL发酵培养基的2L的三角瓶中，培养至对数生长后期。
将实施例1～4制得的保护剂加入到菌液(发酵液)中常温下保存(如实施例1保护剂加入到菌液发酵液中，发酵液中柠檬酸钠浓度为3g/L，氯化钙浓度为3g/L，糊精浓度为1g/L，苯甲酸钠浓度为3g/L)，于30d进行取样，采用稀释涂布平板法进行菌落计数。其结果如表1所示。
实施例6
无机盐培养基中啶虫脒降解效果
将实施例1～4制得的保护剂加入到菌液(发酵液)中常温下保存，于30d取出，以体积比3％的接种量接入啶虫脒浓度为50mg/kg的20ml液体无机盐培养基中，置于摇床中以30℃、150rpm培养3d后取样，使用HPLC测定啶虫脒的含量，并计算降解率，对比例不加入保护剂保存30天的相同发酵液，其结果如表2所示。
实施例7
土壤中的啶虫脒残留降解效果
将实施例1～4制得的保护剂加入到菌液(发酵液)中常温下保存，于45d取出，取10ml接入到啶虫脒终浓度为5mg/kg干土的100g土中，于第10d取样，使用HPLC测定啶虫脒的含量，并计算降解率，对比例不加入保护剂保存45天的相同发酵液，其结果如表3所示。
啶虫脒含量的测定
先在待测样品中加入等体积的二氯甲烷充分震荡萃取，去除上层废液，下层有机相加入适量无水硫酸钠后，取1.5mL于离心管中置于通风厨中吹干，待挥发完全后加入300μL甲醇(色谱纯)溶解，经有机相滤器(孔径为0.22μm)过滤后，用HPLC测定样品中啶虫脒的含量。
高效液相色谱条件：色谱柱，Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm)；流动相，60％甲醇+20％水；流速，1mL/min；检测波长，260nm和235nm；进样量，20μL。
农药含量的测定
土壤中残留啶虫脒的提取
取不同处理的待测土样各5g加入干净的50mL离心管中，再向其中加入10mL甲醇(分析纯)，在涡旋仪上振荡，使得土样被甲醇完全浸湿，然后放置于30℃，160rpm的摇床中振荡提取1h，使得啶虫脒能够完全溶于甲醇之中。取出后继续以6000rpm离心10min，将上清液转移到新的干净的离心管中，下层沉淀继续用涡旋仪进行振荡，然后重复上面的步骤。将上清液混合，放置于通风橱中风干，加入1mL甲醇溶解，用0.22μm有机相滤膜过滤，冷藏待测；用用HPLC测定样品中啶虫脒的含量，测定条件同上。
表1菌落计数结果(各成分以菌液中浓度计算g/L)
Figure BDA0002148664820000051
表2无机盐培养基中啶虫脒降解率(各成分以菌液中浓度计算g/L)
Figure BDA0002148664820000052
表3土壤中残留啶虫脒降解率(各成分以菌液中浓度计算g/L)
Figure BDA0002148664820000061
从表1-3可知，本发明将苯甲酸钠、糊精、柠檬酸钠、氯化钙组成菌剂的保护剂添加到啶虫脒降解菌的菌剂中与不添加保护剂的对比例相比，本发明的保护剂有效提高了菌剂常温保存条件下的有效活菌数和降解率。
实施例8
种子液的制备与菌体生长量的测定
挑取菌株D-2单菌落于液体LB试管中于160rpm、30℃培养至对数生长期，取出后以体积比1％的接种量接入盛有100mL发酵培养基的三角瓶中，于160rpm、30℃培养至对数生长期，然后置于离心机以6000rpm离心10min收集菌体，加入无菌水进行重悬，如此重复洗涤菌体三次，最后再使用无菌水进行重悬到OD600约为0.8左右作为种子液。
菌体生长量通过分光光度计来测定，以波长λ＝600nm处的吸光度表示菌株的生长量。
菌株D-2对啶虫脒的降解：
将菌株D-2的种子液以体积比3％的接种量加入到啶虫脒浓度为50mg/L的100mL无机盐培养基中，30℃，150rpm培养，每8h取样，通过液相色谱法测定样品中啶虫脒的浓度。
在啶虫脒的浓度为50mg·L-1的无机盐液体培养基中，以体积比为3％的接种量接入菌株D-2的种子液，于30℃，160rpm恒温摇床中振荡培养，每隔8h取样一次，测定啶虫脒的浓度，如图1降解曲线所示，菌株D-2能够在3d内降解50mg·L-1的啶虫脒。
实施例9
发酵液的制备
挑取菌株D-2单菌落于液体LB中，置于30℃摇床以160rpm培养至对数生长期。按照体积比1％的接种量接入装有1000mL发酵培养基的2L的三角瓶中，培养至对数生长后期。采用稀释涂布平板计数法对菌落个数进行计算。
菌剂抑菌剂的初筛
将菌株D-2进行发酵后，分别取300mL发酵液，加入到500mL三角瓶中，向其中添加丙酸钙、苯甲酸钠、山梨酸钾，添加量为发酵液中终浓度的5g/L，同时设置不添加试剂对照组，向其中加入等体积无菌水，每个处理设置三个平行。用封口膜封紧，置于常温条件下避光保存。放置3d后，取样，采用稀释涂布平板法对降解菌D-2以及杂菌进行计数，并计算杂菌率。
以5g/L的添加量分别向菌株D-2的发酵液中加入山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钙，常温下避光放置3d后进行稀释涂布平板计数，并计算杂菌率。由表4可知，通过向发酵液中添加5g/L有效使用浓度的不同抑菌剂贮存3d之后，各项处理中的总菌体数均小于未添加抑菌剂的对照组，杂菌数均低于对照组，未添加抑菌剂的对照组中杂菌率达到了3.30％，而添加不同抑菌剂的处理中，以苯甲酸钠处理效果最好，未出现杂菌污染，因此选择苯甲酸钠作为降解菌D-2发酵液的抑菌剂进行后续的抑菌剂复筛试验。
表4添加不同防腐剂对D-2发酵液杂菌率的影响
Figure BDA0002148664820000071
防腐剂的复筛
将菌株D-2进行发酵后，分别取300mL发酵液，加入到500mL三角瓶中，分别添加不同浓度的苯甲酸钠作为防腐剂进行研究，添加量分别为发酵液的1、3、5、7、10g/L，同时设置不添加任何苯甲酸钠的对照组，对照组添加相同体积的无菌水，每个处理设置三个平行。装液后用封口膜封紧，置于常温条件下避光保存，放置3d后，取样，采用稀释涂布平板法对降解菌D-2以及杂菌进行计数，并计算杂菌率。
根据防腐剂的初筛结果，选择苯甲酸钠作为防腐剂进行后续的实验。分别向菌株D-2的发酵液中添加不同浓度的苯甲酸钠，使其终浓度分别为发酵液的1、3、5、7、10g/L，然后置于常温下避光保存3d后取样，进行稀释涂布计算菌落数，并计算杂菌率。由表5可以得知，当添加的苯甲酸钠有效浓度超过3g/L时，不会出现杂菌污染。而且当浓度为3g/L时，与其它没有受污染的处理相比，活菌数较高。因此对于菌株D-2而言，若选用苯甲酸钠作为防腐剂，可以选择3g/L浓度的苯甲酸钠来研究。
表5不同浓度的苯甲酸钠对D-2发酵液杂菌率的影响
Figure BDA0002148664820000081
实施例10
菌剂保护剂的筛选
单因子保护剂的筛选
分别挑取菌株D-2单菌落于液体LB中，放置于30℃摇床中160rpm培养至对数生长期，然后以体积比1％的接种量接入到盛有500mL液体发酵培养基的三角中继续培养至对数生长期。然后在无菌条件下装入已高温灭菌过的50mL的无菌螺口离心管中，先向其中加入苯甲酸钠使其浓度为3g/L，再分别向其中加入预先初筛过的的氯化钙、氯化镁、糊精、黄腐酸、糊精、乙酸钠、柠檬酸钠试剂作为保护助剂，使得试管中的助剂有效使用浓度分别为1g/L和2g/L，同时设置不加助剂的对照组，并向对照组加入相同体积的无菌水，每个处理设置三个平行。然后于30d取样，通过稀释涂布平板法计算有效活菌数。
降解菌助剂最佳物质浓度筛选
根据单因子助剂的实验结果，将筛选出来的三类保护剂分为无机盐助剂、有机物助剂、稳定剂三种因素，从每一种因素中取两种不同的物质作为两个水平，设计三因素两水平的L4(23)的正交实验来确定降解菌菌剂助剂的最佳物质组合。
降解菌助剂物质组合最佳使用浓度筛选
根据物质组合的正交实验结果，将筛选出来的三个助剂作为三种因素，从每一种因素中取三种不同的有效使用浓度作为三个水平，设计三因素三水平的L9(33)的正交实验来确定降解菌菌剂助剂的最佳浓度组合。
供试菌株保护剂的筛选：
添加无机盐类对降解菌菌剂的保藏效果的影响研究
每种无机盐均设置两个不同的浓度，以不加无机盐类助剂的发酵液作为对照，每种浓度均设置三个重复。
由表6知，对于菌株D-2的发酵液，添加的MgCl2、CaCl2在1g/L、2g/L两个有效使用浓度下能够显著提高菌株D-2在发酵液中的存活率，添加2g/L的CaCl2后存活率能够提高17.61％，而添加2g/L的MgCl2后存活率提高了13.74％
表6无机盐类的有效使用浓度及其对D-2的存活提高率影响
Figure BDA0002148664820000091
添加有机物类对降解菌菌剂的保藏效果的影响研究
每种有机物均设置两个不同的浓度，以不加有机物类助剂的发酵液作为对照，每种浓度均设置三个重复。其存活提高率见下表。
由表7可知，对于菌株D-2的发酵液，添加的乙酸钠、柠檬酸钠在1g/L、2g/L两个有效使用浓度下能够显著提高菌株D-2在发酵液中的存活率，添加0.20％的乙酸钠后存活率能够提高11.30％，而添加0.20％的柠檬酸钠后存活率提高了21.74％。
表7有机物类的有效使用浓度及其对D-2的存活提高率影响
Figure BDA0002148664820000092
添加稳定剂类对降解菌菌剂的保藏效果的影响研究
每种稳定剂类均设置两个不同的浓度，以不加稳定剂剂的发酵液作为对照，进行研筛选，每种浓度均设置三个重复。其存活提高率见下表。
由表8可知，对于菌株D-2的发酵液，添加的糊精、黄腐植酸在1g/L、2g/L两个有效使用浓度下能够显著提高菌株D-2在发酵液中的存活率，添加0.20％的糊精后存活率能够提高27.29％，而添加0.20％的黄腐植酸后存活率提高了24.57％
表8稳定剂的有效使用浓度及其对D-2的存活提高率影响
Figure BDA0002148664820000093
保护剂的正交筛选
复配保护剂的最佳物质组合的筛选
根据单因子试验的结果，设计三因素二水平的正交表L4(23)来确定最佳物质的组合，将对D-2存活率有提高作用的几种物质按照有机物(A)、稳定剂(B)、无机盐(C)分类设计成三种因素，每一种因素取两种物质作为两种水平。各因素与水平的设置，试验设计与结果见下表。
由正交试验表9可以得知，对菌株D-2存活提高率影响的主次顺序为：A>C>B，即稳定剂对菌株D-2存活率影响最大，无机盐的影响次之，有机物影响最小。其最佳组合为A1B1C1，即柠檬酸钠、糊精、CaCl2的效果相比较本研究所筛选的其它物质组合而言，对D-2的存活率影响最大。因此，选择柠檬酸钠、糊精、CaCl2作为D-2液剂复配助剂进行下一步研究。
表9降解菌D-2物质组合正交试验表
Figure BDA0002148664820000101
复配保护剂的最佳使用浓度的筛选
根据复配保护剂组合正交试验的结果，设计三因素三水平的正交表L9(33)来确定D-2助剂物质浓度的组合，将对筛选到的糊精(A)、柠檬酸钠(B)、CaCl2(C)设计成三种因素，每一种因素取三个浓度作为三种水平(其中试验中先向其中加入苯甲酸钠使其为3g/L的)。各因素与水平的设置，试验设计与结果见下表10。
表10降解菌D-2浓度组合正交试验表
Figure BDA0002148664820000102
Figure BDA0002148664820000111
由表可以得出，各因子之间的主次水平为：A>C>B，最优水平为A2B2C3，因此本试验所筛选研究的降解菌D-2复配保护剂的最佳使用浓度为：2g/L的柠檬酸钠+2g/L的糊精+3g/L CaCl2。
实施例11
保存后的菌剂对无机盐培养基中农药的降解实验
将菌株D-2的浓度正交实验的最优组合实验5、以及实验3、实验4、实验6组合进行验证。取上述组合保存30d后的菌液，以3％的接种比接种到啶虫脒浓度为50mg/L的20mL无机盐液体培养基中，3d后使用HPLC测定其中啶虫脒的浓度，并计算降解率。结果如图2所示，降解率最高的组合为正交组合5(即实施例3的配方)，其降解率达到了85.32％，而其余组合的降解率与CK(不加任何保护剂)相比也有提高，而CK(不加保护剂菌剂)在相同条件下降解率只能达到了56.08％。
保存后的菌剂对土壤中农药的降解实验
将菌株D-2的浓度正交实验的最优组合实验5、以及实验3、实验4、实验6组合进行验证。取上述组合保存45d后的菌液，取10ml接入到多啶虫脒浓度为5mg/kg干土的100g土中，10d后使用HPLC测定其中啶虫脒的浓度，并计算降解率。降解率最高的组合为正交组合5(即实施例3的配方)，其降解率达到了92.75％，而其余组合的降解率与CK(不加任何保护剂)相比也有明显提高，而CK(不加保护剂菌剂)在相同条件下降解率只能达到了41.21％。
液体菌剂在存放过程中容易受到污染而使得杂菌数上升而目标菌株数量的减少。防腐剂作为菌剂中的一种添加物质，其能够有效的减少杂菌的污染。本研究首先通过添加苯甲酸钠、丙酸钙、山梨酸钾三种具有抑菌防霉作用的防腐剂，对菌株D-2的杂菌率进行计算，筛选出抑菌效果好且活菌数相对较高的抑菌剂，然后通过添加不同浓度的防腐剂剂检测其活菌数以及杂菌数，确定了液体发酵液中防腐剂的添加浓度。通过研究发现降解菌均以苯甲酸钠作为抑菌剂效果最好。能够维持在一个较高的活菌数且不产生杂菌污染。
液体菌剂在保存过程中稳定性较差、活菌数下降快。添加保护剂是提高微生物产品有效活菌数，延长其保存期的重要手段。添加保护剂有助于微生物的分散以及生存。本研究表明，通过正交试验筛选的菌剂保护剂能够有效提高细菌存活率，其中D-2的发酵液中活菌数能够提高38.70％。添加有保护剂保存30天的菌株D-2的液体菌剂在3d内最多能够降解85.32％的浓度为50mg/L的啶虫脒；而添加有保护剂的保存45天的菌株djl-6的液体菌剂，在10d内能够使得浓度为5mg/kg干土的多菌灵降解达92.75％。

Claims (3)

1.一种啶虫脒降解菌的保护剂在保护啶虫脒降解菌或者啶虫脒降解菌剂中的应用，所述啶虫脒降解菌的保护剂，由稳定剂、营养剂和防腐剂和水组成，所述的稳定剂成分为糊精，营养剂成分为柠檬酸钠和氯化钙，防腐剂成分为苯甲酸钠；所述啶虫脒降解菌的保护剂添加到啶虫脒降解菌剂中使得在菌剂中糊精浓度为1~2g/L、柠檬酸钠浓度为1~3g/L，氯化钙浓度为1~3 g/L、苯甲酸钠浓度为3 g/ L；所述啶虫脒降解菌为Pigmentiphaga sp .D-2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述啶虫脒降解菌的保护剂的制备方法为将糊精、柠檬酸钠、氯化钙、苯甲酸钠和水按比例混合制成。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述啶虫脒降解菌剂为液体菌剂。
CN201910693692.5A 2019-07-30 2019-07-30 一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用 Active CN110527628B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910693692.5A CN110527628B (zh) 2019-07-30 2019-07-30 一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910693692.5A CN110527628B (zh) 2019-07-30 2019-07-30 一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110527628A CN110527628A (zh) 2019-12-03
CN110527628B true CN110527628B (zh) 2022-05-10

Family

ID=68661086

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910693692.5A Active CN110527628B (zh) 2019-07-30 2019-07-30 一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110527628B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010111650A2 (en) * 2009-03-26 2010-09-30 Pulmatrix, Inc. Calcium citrate and calcium lactate formulations for alteration of biophysical properties of mucosal lining
CN104365583A (zh) * 2014-11-07 2015-02-25 郜鸿生物科技（上海）有限公司 一种稀少精子冷冻保护剂及其应用
CN107242233A (zh) * 2017-07-10 2017-10-13 四川蓝博兴科技有限公司 复合皮革防霉除菌剂及其制备方法
CN107619788A (zh) * 2016-07-21 2018-01-23 济南航晨生物科技有限公司 一种农用芽孢杆菌菌液长效保护剂配方及其制备方法
CN108315287A (zh) * 2018-05-15 2018-07-24 中国科学院上海有机化学研究所湖州生物制造创新中心 光合细菌培养菌剂及其制备方法
CN109762800A (zh) * 2018-12-14 2019-05-17 南京农业大学 一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB及其编码蛋白质及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101748082B (zh) * 2008-12-11 2012-01-04 吉林省农业科学院 乳杆菌发酵剂及其制备方法与专用菌株
US9414615B2 (en) * 2010-01-18 2016-08-16 PepciCo, Inc. Gel-based compositions and methods of making same
WO2012022032A1 (zh) * 2010-08-17 2012-02-23 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种内源性的对虾抗病毒复合益生菌制剂
CN104855428A (zh) * 2015-04-21 2015-08-26 福建农林大学 杀蚊苏云金杆菌漂浮剂及其制备方法
US20170087199A1 (en) * 2016-02-10 2017-03-30 Senomyx, Inc. Compositions for delivering a cooling sensation
WO2018002955A1 (en) * 2016-06-30 2018-01-04 Tropical Biosciences Pvt. Ltd. A formulation of bio-inoculants for agriculture with enhanced shelf life
WO2018072709A1 (zh) * 2016-10-19 2018-04-26 宁波西敦医药包衣科技有限公司 医药微丸的干粉包衣组合物
CN106520575B (zh) * 2016-11-25 2019-11-15 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产过氧化氢酶的黑曲霉菌株及其应用
CN106967828A (zh) * 2017-05-17 2017-07-21 上海默礼生物医药科技有限公司 一种用于检测低拷贝结核分枝杆菌的核酸提取试剂、试剂盒及其方法
CN109971684A (zh) * 2019-04-10 2019-07-05 天津大成前瞻生物科技研发有限公司 一种乳酸菌发酵制剂及其活化方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010111650A2 (en) * 2009-03-26 2010-09-30 Pulmatrix, Inc. Calcium citrate and calcium lactate formulations for alteration of biophysical properties of mucosal lining
CN104365583A (zh) * 2014-11-07 2015-02-25 郜鸿生物科技（上海）有限公司 一种稀少精子冷冻保护剂及其应用
CN107619788A (zh) * 2016-07-21 2018-01-23 济南航晨生物科技有限公司 一种农用芽孢杆菌菌液长效保护剂配方及其制备方法
CN107242233A (zh) * 2017-07-10 2017-10-13 四川蓝博兴科技有限公司 复合皮革防霉除菌剂及其制备方法
CN108315287A (zh) * 2018-05-15 2018-07-24 中国科学院上海有机化学研究所湖州生物制造创新中心 光合细菌培养菌剂及其制备方法
CN109762800A (zh) * 2018-12-14 2019-05-17 南京农业大学 一种啶虫脒酰胺酶基因aceAB及其编码蛋白质及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biodegration of acetamiprid by pigmentiphaga sp.D-2 and the degradation pathway;Hongxing Yang等;《International biodeterioration and biodegradation》;20131130(第85期);ABSTRACT *
多功能农药降解基因工程菌剂保藏条件研究;蒋建东等;《农业环境科学学报》;20080720(第04期);第424-429页 *
多菌灵降解菌djl-6和啶虫脒降解菌D-2液体菌剂的研发;徐铭阳等;《江苏农业科学》;20200905(第17期);第276-281页 *
降解菌Pigmentiphaga sp.strain D-2对啶虫脒污染土壤的生物修复作用;王光利等;《环境工程学报》;20140205(第02期);第379-385页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110527628A (zh) 2019-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chiswell et al. Stability of cylindrospermopsin, the toxin from the cyanobacterium, Cylindrospermopsis raciborskii: Effect of pH, temperature, and sunlight on decomposition
US9828581B2 (en) Efficient bottom-improving bacillus and compound bottom-improving microbial agent prepared from the same and applications thereof
CN106434374B (zh) 棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用
CN108546658B (zh) 一株溶磷菌及其与dehp降解菌复配菌剂和应用
CN101993837B (zh) 高活性高耐受甲醛降解菌及其应用
CN104371925B (zh) 一种固态菌剂的制备方法
CN109554316B (zh) 一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法
CN110241049B (zh) 一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其对米氏凯伦藻赤潮的应用
CN111019866B (zh) 一种普洱茶树叶片内生芽孢杆菌及其应用
WO2022111287A1 (zh) 降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇的菌株及应用
CN105820982A (zh) 一种赤红球菌xs-2、其生物菌剂及制备方法和应用
US11639491B2 (en) Microorganism lyophilized composition
CN111117909B (zh) 一种耐多重重金属促植物生长的菌株及其应用
CN110484449B (zh) 一种多菌灵降解菌的保护剂及其制备方法和应用
CN110076193B (zh) 黎巴嫩假单胞菌株my及其在重金属污染盐渍土壤修复中的应用
CN110527628B (zh) 一种啶虫脒降解菌的保护剂及其制备方法和应用
CN105733966B (zh) 耐辐射丝状真菌m30及其在吸附镉生物处理中的应用
CN106479926A (zh) 戊唑醇农药降解菌和基于该菌的土壤生物修复菌剂及其应用
CN111226951A (zh) 一种水处理杀菌剂及其制备方法
CN114214235B (zh) 一种高效絮凝菌及其在污水处理中的应用
CN103911319B (zh) 菊酯类农药降解菌株及其菌剂和应用
CN102757907A (zh) 一株硫丹降解菌及其在土壤修复方面的应用
CN113528406B (zh) 一种短短芽孢杆菌adt及其应用
Srinivasan Studies on antifungal activity of siderophores produced by rhizobium spp isolated from groundnut (Arachis hypogaea)
CN106754465B (zh) 一种鲁氏不动杆菌及其在降解拟除虫菊酯类农药中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant