CN104371925B - 一种固态菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固态菌剂的制备方法。该方法将菌种培养液进行浓缩，浓缩后加入抑制剂再与一定量的固体吸附载体混合均匀，将混合物进行干燥后加入脱氧剂即可制备固态菌剂。本发明方法可提高固态菌剂的保存时间以及存活力，同时能够降低保存和运输成本，由于添加了抑制剂和铁粉脱氧剂不仅可以降低染菌机率，防止菌种培养基残余有机物氧化，也能在一定程度上降低目标菌种的活性，对保存时间的延长起到促进作用。

Description

一种固态菌剂的制备方法
技术领域
本发明属于菌种保存技术领域，具体涉及一种固态菌剂的制备方法。
背景技术
微生物菌种广泛应用于农业、饲料以及工业废水的处理。制备的菌种培养液如果不经过特殊处理会面临保存时间短、活力低以及容易变异的问题。目前一般通过降低生物活性的方式解决该问题。常用的技术有冷冻保存、冷冻干燥保存、向菌液中加入保护剂以及制备固态菌剂等。冷冻技术的设备成本较高，且适用于少量保存。添加保护剂的方法存在保存时间短、菌液易变质的情况。因此，当微生物菌液较多时，制备固态菌剂无疑是最方便有效和节约成本的方式。制备固态菌剂利用多孔性材料作为载体来吸附进行细胞固定化，从而使微生物细胞活性降低甚至休眠，具有存放时间长、保存及运输成本低的优点。公开专利CN103449681A介绍了一种用于治理环境污水的微生物制剂的制备方法，公开专利CN102719383B介绍了解淀粉芽孢杆菌K-8及其菌剂的制备方法，上述专利按照传统方式制备固态菌剂必然面临菌剂污染杂菌的问题，会给菌剂的应用带来困难。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种固态菌剂的制备方法，该方法可以解决菌种保存时间较短、容易污染杂菌的问题。
为实现上述的发明目的，本发明固态菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将原始菌种培养液进行浓缩，浓缩倍数为2～4倍，浓缩后调节pH值为3.0～5.0，并按比例加入终浓度为2wt‰～4wt‰的抑制剂，得到浓缩菌种培养液；
(2)将固体吸附载体过40目筛后，在121℃高温下灭菌20-30min；
(3)按照固液比(g/mL)为1∶3～1∶1向浓缩菌种培养液投加适量固体吸附载体，混合均匀并进行30-40℃干燥使其含水率为6wt％～10wt％，制备固态菌剂。
(4)向固态菌剂内加入1wt‰～2wt‰的铁粉脱氧剂，混合均匀后密封保存。
所述的抑制剂为山梨酸钾或苯甲酸钠中的一种；所述的固体吸附载体为燕麦糠、米糠、玉米粉、玉米胚芽粕、豆粕、麦麸、蔗渣、滑石粉、硅藻土、沸石粉中的一种或几种的混合物。
根据本发明上述固态菌剂的制备方法，所述浓缩菌种培养液优选通过离心、沉降、膜过滤中的任何一种方法制备。
所述脱氧剂优选为还原性铁粉、活性炭和氯化钠按照质量比8∶2∶1比例混合的混合物。
山梨酸钾和苯甲酸钠作为抑制剂主要通过在合适的pH值条件下抑制微生物酶系统，从而达到抑制微生物的生长和起防腐作用。脱氧剂使包装环境内的氧含量降至 0.02％以下，不仅可以抑制好氧微生物的活性而且能有效防止有机物的氧化。因此，在制备固态菌剂时将抑制剂和脱氧剂加入可以在保存过程中起到抑制微生物活性，降低染菌机率，防止菌种培养基残余有机物氧化的目的。
本发明固态菌剂的制备方法与现有技术相比，其有益效果是：
1)本方法制备的固态菌剂可提高菌剂的保存时间以及存活力，同时能够降低保存和运输成本。制备菌剂过程中培养基并未完全去除，其中残存的有机物可充当保护剂的作用。另外，由于添加了抑制剂和脱氧剂不仅可以降低染菌机率，防止菌种培养基残余有机物氧化，也能在一定程度上降低目标菌种的活性，对保存时间的延长起到促进作用。
2)该方法制备的菌剂在室温条件下保存时间较长，保存2年后菌种存活率可以达到85％以上，且能够保持降解性能，培养过程中无杂菌污染，这也说明该固态菌剂可直接用于菌种活化或者菌种发酵的种子菌种。该制备方法不仅局限于专利所用菌种也可适用于其他微生物菌种。
具体实施方式
实施例1：制备固态菌剂
菌种培养液的制备：将除油菌剂BDB-a(购自南洋东华工程科技有限公司)加入 LB培养基中培养16h，培养结束后将菌液通过沉降的方式进行浓缩，浓缩倍数为4 倍。
固态菌剂的制备：
(1)将固态吸附载体于121℃灭菌30min后备用；
(2)调节浓缩菌种培养液的pH至5.0，加入2wt‰山梨酸钾，混合均匀；
(3)按照固液比(g/mL)为1∶3的比例向上述混合液中分别加入麦麸与滑石粉混合均匀，放于摇床震荡1h，转速设定为50rpm，使菌种充分吸附于载体上；
(4)将上述混合样品放于35℃烘箱内进行恒温干燥后含水率达到6wt％；
(5)取固态菌剂1g加入100ml生理盐水中震荡1h，转速设定为150rpm。震荡结束后取上清液采用平板稀释法计数达到8.7×109cfu/g，且未发现杂菌；
(6)向固态菌剂内加入1wt‰的铁粉脱氧剂，混合均匀后放于样品袋内密封放于室温保存。
实施例2：制备固态菌剂
菌种培养液的制备：将除油菌剂BDB-a(购自南洋东华工程科技有限公司)加入 LB培养基中培养16h，培养结束后将菌液通过离心的方式进行浓缩，浓缩倍数为3 倍。
固态菌剂的制备：
(1)将固态吸附载体于121℃灭菌30min后备用；
(2)调节浓缩菌种培养液的pH至4.0，加入3wt‰苯甲酸钠，混合均匀；
(3)按照固液比(g/mL)为1∶2的比例向上述混合液中加入燕麦糠和蔗渣混合均匀，放于摇床震荡1h，转速设定为50rpm，使菌种充分吸附于载体上；
(4)将上述混合样品放于35℃烘箱内进行恒温干燥后含水率达到8wt％；
(5)取固态菌剂1g加入100ml生理盐水中震荡1h，转速设定为150rpm。震荡结束后取上清液采用平板稀释法计数达到9.2×109cfu/g，且未发现杂菌；
(6)向固态菌剂内加入1.5wt‰的铁粉脱氧剂，混合均匀后放于样品袋内密封放于室温保存。
实施例3：制备固态菌剂
菌种培养液的制备：将除油菌剂BDB-a(购自南洋东华工程科技有限公司)加入 LB培养基中培养16h，培养结束后将菌液通过陶瓷膜过滤的方式进行浓缩，浓缩倍数为2倍。
固态菌剂的制备：
(1)将固态吸附载体于121℃灭菌30min后备用；
(2)调节浓缩菌种培养液的pH至3.0，加入4wt‰山梨酸钾，混合均匀；
(3)按照固液比(g/mL)为1∶1的比例向上述混合液中加入玉米粉混合均匀，放于摇床震荡1h，转速设定为50rpm，使菌种充分吸附于载体上；
(4)将上述混合样品放于35℃烘箱内进行恒温干燥后含水率达到10wt％；
(5)取固态菌剂1g加入100ml生理盐水中震荡1h，转速设定为150rpm。震荡结束后取上清液采用平板稀释法计数达到1.1×1010cfu/g，且未发现杂菌；
(6)向固态菌剂内加入2wt‰的铁粉脱氧剂，混合均匀后放于样品袋内密封放于室温保存。
实施例4：固态菌剂保存效果的考察
保存2年后，分别取实施例1、2、3所制备的固态菌剂1g加入100ml生理盐水中震荡1h，转速设定为150rpm。震荡结束后取上清液采用平板稀释法计数。实施例 2所得固态菌剂计数达到7.4×109cfu/g，实施例3所得固态菌剂计数达到7.9×1010 cfu/g，实施例4所得固态菌剂计数达到9.6×109cfu/g，菌种存活率可达到85％以上，且培养过程中均未发现杂菌。该固态菌剂可直接用于菌种活化或者菌种发酵的种子菌种。
将保存前的菌种培养液按照5×108cfu/ml的接种量加入油含量为23.1mg/L含油废水中，降解24h后油去除率可达到73.8％。保存2年后，将实施例1、2、3所制备的固态菌剂投加到LB培养基培养16h后，仍按照5×108cfu/ml的接种量加入油含量为22.7mg/L含油废水中，降解24h后考察降解效果。
表1 菌剂降解性能考察
由表1的结果来看，实施例1、2、3所制备固态菌剂均能达到较好的降解效果，油去除率仍可达到70％以上，说明该方法制备的固态菌剂在较长时间保存之后，其性能并未产生明显变化。

Claims (2)

1.一种除油菌剂BDB-a的固态菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将原始除油菌剂BDB-a菌种培养液进行浓缩，浓缩倍数为2~4倍，调节pH值为3.0~5.0，按比例加入终浓度为2 wt‰~4 wt‰的抑制剂，得到浓缩菌种培养液；
（2）将固体吸附载体过40目筛后，在121℃高温下灭菌20 min -30 min；
（3）按照固液比为1:3~1:1的比例向浓缩菌种培养液投加固体吸附载体，混合均匀并进行30℃-40℃恒温干燥至其含水率为6 wt %~10 wt %得到固态菌剂，其中固液比单位为g/mL；
（4）向所述固态菌剂内加入1 wt‰~2 wt‰的铁粉脱氧剂，混合均匀后密封保存；
所述的抑制剂为山梨酸钾或苯甲酸钠中的一种；
所述的固体吸附载体为米糠、玉米粉、玉米胚芽粕、麦麸、蔗渣、滑石粉、硅藻土、锯末、膨润土、沸石粉中的一种或几种的混合物；
2.如权利要求1所述的一种除油菌剂BDB-a的固态菌剂的制备方法，其特征在于：所述浓缩菌种培养液可通过离心、沉降、膜过滤中的任何一种方法制备。
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