CN111349627A - 微生物菌剂载体以及微生物固体菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及为微生物技术领域，具体地涉及微生物菌剂载体以及微生物固体菌剂及其制备方法。该微生物菌剂载体含有硅藻土和营养材料，所述硅藻土和营养材料的重量比为1:0.5‑5；其中，所述营养材料含有玉米粉。本发明提供的方法采用含有硅藻土和营养材料的微生物菌剂载体，能够充分吸收水分，从而吸附菌液，同时含有维持微生物活性所需的多种营养成分，更有利于微生物菌剂的保存，在常温下可保存18个月以上。此外，采用本发明的微生物菌剂载体制备微生物固体菌剂，还能够为后续的干燥方式提供多种选择，干燥温度只要在70℃以下即可，避免了传统冷冻干燥的设备投入和能耗。

Description

微生物菌剂载体以及微生物固体菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及为微生物技术领域，具体地涉及一种微生物菌剂载体，使用该微生物菌剂载体制备微生物固体菌剂的方法以及由该方法制备的微生物固体菌剂。

背景技术

枯草芽孢杆菌是在自然界广泛存在的一种好氧的产芽孢杆菌。它具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，在畜牧业饲料行业应用广泛。枯草芽孢干菌是饲用微生态制剂的常用菌种之一，芽孢杆菌在成熟期以孢子状态存在，具有天然耐酸和耐胆盐等优点。枯草芽孢杆菌通过定植到目标动物肠道中，经生物夺氧作用，颉颃致病微生物，并产生多种消化酶及营养物质，产生有益代谢产物。所以枯草芽孢杆菌不仅可以改善原料风味，更重要的是它可调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，最终预防疾病的发生，达到促进目标动物生长和提高饲料转化率的目的，因而枯草芽孢杆菌被越来越多地研制成饲用微生态制剂。

现行枯草芽孢杆菌固体菌剂的生产，多为在发酵液中加入石粉作为菌剂载体，之后离心分离，再对分离得到的固形物进行冷冻干燥或喷雾干燥。然而上述工艺过程涉及多个高能耗单元，能源消耗及设备投入较高，且在吸附和保持微生物活性方面不够理想。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种微生物菌剂载体以及微生物固体菌剂及其制备方法，采用本发明的微生物菌剂载体制备微生物固体菌剂，能够减少设备投入，节约成本，且得到的微生物固体菌剂在常温下保存18个月活菌数不下降。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种微生物菌剂载体，该微生物菌剂载体含有硅藻土和营养材料，所述硅藻土和营养材料的重量比为1:0.1-10；

其中，所述营养材料含有玉米粉。

本发明第二方面提供一种微生物固体菌剂的制备方法，该方法包括：将微生物发酵液进行固液分离，得到微生物菌体，并将所述微生物菌体与微生物菌剂载体混合，之后对得到的混合进行干燥，得到所述微生物固体菌剂；

其中，所述微生物菌剂载体为如上所述的微生物菌剂载体。

本发明第三方面提供如上所述的方法制备的微生物固体菌剂。

本发明提供的方法采用含有硅藻土和含有玉米粉的营养材料的微生物菌剂载体，能够充分吸收水分，从而吸附菌液，同时含有维持微生物活性所需的多种营养成分，更有利于微生物菌剂的保存，在常温下可保存18个月以上。此外，采用本发明的微生物菌剂载体制备微生物固体菌剂，还能够为后续的干燥方式提供多种选择，干燥温度只要在70℃以下即可，避免了传统冷冻干燥的设备投入和能耗。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中，术语“玉米粉”是指玉米粒去皮或不去皮后研磨成的粉，其粒径通常为200-850μm。

本发明中，术语“谷糠”是指谷物的皮壳，如稻、稷、麦、豆、麻的皮壳。

本发明中，术语“大米粉”是指大米粒去皮或不去皮后研磨成的粉，其粒径通常为200-850μm。

第一方面，本发明提供一种微生物菌剂载体，该微生物菌剂载体含有硅藻土和营养材料，所述硅藻土和营养材料的重量比为1:0.1-10；

其中，所述营养材料含有玉米粉。

优选的，所述硅藻土和营养材料的重量比为1:0.5-5，更优选为1:1-1.5，例如，可以为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5。

根据本发明，所述微生物菌体载体还可以含有本领域常规的在微生物固体菌剂制备过程中使用的载体，例如，石粉。

根据本发明，所述营养材料除了含有玉米粉之外，还可以含有本领域常规的用于维持微生物活性的物质，根据本发明一种优选的实施方式，所述营养材料还含有阳离子盐、谷糠和大米粉中的至少一种。

其中，所述阳离子盐可以为本领域常规的用于微生物培养过程中加入的盐，例如，可以为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和锰盐中的至少一种。其中，所述钠盐可以为氯化钠和/或硫酸钠；所述钾盐可以为氯化钾和/或硫酸钾；所述钙盐可以为碳酸钙；所述镁盐可以为硫酸镁；所述锰盐可以为硫酸锰。

优选的，所述营养材料还含有阳离子盐，所述阳离子盐的含量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，基于100重量份的玉米粉，所述阳离子盐的含量为0.1-5重量份，例如，可以为0.1重量份、0.5重量份、1重量份、1.5重量份、2重量份、2.5重量份、3重量份、3.5重量份、4重量份、4.5重量份、5重量份。

优选的，所述营养材料还含有谷糠，所述谷糠的含量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，基于100重量份的玉米粉，所述谷糠的含量为1-20重量份，例如，1重量份、3重量份、5重量份、10重量份、13重量份、15重量份、20重量份。

优选的，所述营养材料还含有大米粉，所述大米粉的含量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，基于100重量份的玉米粉，所述大米粉的含量为1-50重量份，例如，1重量份、3重量份、5重量份、10重量份、13重量份、15重量份、20重量份、23重量份、25重量份、30重量份、33重量份、35重量份、40重量份、43重量份、45重量份、50重量份。

根据本发明一种优选的实施方式，所述微生物菌剂载体含有硅藻土和营养材料，所述营养材料含有玉米粉、钠盐和钙盐，其中，所述硅藻土和营养材料的重量比为1:0.5-5，优选为1:1-1.5。在该优选的营养材料含有玉米粉、钠盐和钙盐的情况下，最终由此微生物菌剂载体制备的微生物固体菌剂在常温下的保存时间能够进一步延长。

第二方面，本发明提供一种微生物固体菌剂的制备方法，该方法包括：将微生物发酵液进行固液分离，得到微生物菌体，并将所述微生物菌体与微生物菌剂载体混合，之后对得到的混合进行干燥，得到所述微生物固体菌剂；

其中，所述微生物菌剂载体为如上所述的微生物菌剂载体。

根据本发明，所述微生物菌剂载体的用量可以参考本领域常规的制备微生物固体菌剂时微生物菌剂载体的用量，优选的情况下，所述微生物菌体和所述微生物菌剂载体的重量比为1:1-4，例如，可以为1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4。

根据本发明，对微生物发酵液进行固液分离的方法可以在较宽的范围内进行选择，例如，可以参照常规的离心分离的方法，也可以采用膜过滤的方法。而本发明的发明人在研究的过程中发现，通过采用向微生物发酵液中加入絮凝剂的方法不但能够节省设备的投入，还能够进一步延长所制备的微生物固体菌剂在常温下的保存时间，因此，优选的，将微生物发酵液进行固液分离的方法包括：向微生物发酵液中加入絮凝剂并进行沉降，得到所述微生物菌体。

其中，本发明对于所述絮凝剂的种类并没有特别的限定，可以为常规使用的各种有机絮凝剂和/或无机絮凝剂，只要对维持微生物的生命活动没有影响即可。根据本发明一种优选的实施方式，所述絮凝剂为聚丙烯酸钠、羧甲基壳聚糖、蒙脱石、硅藻土、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸钠中的至少一种。

其中，所述絮凝剂的用量也可以在较宽的范围内进行选择，优选的情况下，基于1000mL的微生物发酵液，所述絮凝剂的加入量为5-20g，例如，可以为5g、6g、7g、8g、9g、10g、11g、12g、13g、14g、15g、16g、17g、18g、19g、20g、21g、22g、23g、24g、25g。

其中，所述沉降的时间可以在较宽的范围内进行选择，本领域技术人员可以根据实际过程中微生物的沉降情况进行选择，优选的，所述沉降的时间为12-36小时。

根据本发明，所述干燥的方式可以按照本领域常规的方式进行，例如，冷冻干燥，然而本发明的发明人在研究的过程中发现，采用本发明的微生物菌剂载体制备微生物固体菌剂的过程中，可以脱离冷冻干燥的限制，例如，在较高的温度下进行干燥，仍然能够保证固体菌剂保存过程中的活菌数，从而降低了设备投入和能耗。在优选使用絮凝剂进行固液分离的情况下，能够进一步脱离常规干燥条件的限制，且使得微生物在保存的过程中活菌数的下降得到进一步抑制。优选的。所述干燥温度不高于70℃，例如可以为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，干燥的时间使得干燥后物料的含水量为5-15重量％，例如，可以为5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％。

根据本发明，为了便于后续微生物固体菌剂的保存以及使用时的量取，优选的，本发明的方法还包括将干燥后的物料进行粉碎，所述粉碎的程度可以参照本领域常规的微生物固体菌剂的粒度，例如，粉碎后的微生物固体菌剂的粒度可以为200-600μm。

根据本发明，所述微生物可以为各种需要以固体制剂进行保存的微生物，优选的，所述微生物为芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌可以为本领域常用的各种枯草芽孢杆菌，可以通过商购获得。

根据本发明，所述微生物发酵液可以按照本领域常规的方法进行制备，例如，当所述微生物为枯草芽孢杆菌时，用于发酵所述枯草芽孢杆菌的培养基可以含有0.3-1.0重量％的酵母粉、0.3-0.8重量％的玉米浆、0.3-0.8重量％的糖蜜、1.5-2.5重量％的玉米粉、1-3重量％的豆粕和0.008-0.05重量％的硫酸锰，pH 7-7.5；优选的，所述培养基含有0.7-0.9重量％的酵母粉、0.45-0.55重量％的玉米浆、0.45-0.55重量％的糖蜜、1.9-2.1重量％的玉米粉、1.5-2.0重量％的豆粕和0.01-0.03重量％的硫酸锰，pH 7-7.4。

所述培养基一般含有水，含量可根据需要进行选择，例如，可以为92-96重量％。所述培养基含有上述成分或由以上成分和水组成。其中，酵母粉、玉米浆、糖蜜、玉米粉和豆粕均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。

其中，培养枯草芽孢杆菌的方法可以包括：采用上述培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养。

培养时，对枯草芽孢杆菌的接种量没有特别的要求，然而，在本发明的优选实施方式中，相对于每毫升的培养基，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1-2CFU。

本发明中，对液体培养的条件没有特别的要求，可以为常规的培养枯草芽孢杆菌的条件。优选情况下，液体培养的条件包括：温度为28-32℃，时间为12-20h，搅拌速率为110-130rpm。

本发明中，在采用本发明的培养基对枯草芽孢杆菌进行液体培养之前，还可以对枯草芽孢杆菌进行活化，活化可以按照常规的活化方式进行。例如，可以采用含蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖的培养基进行活化，活化可以采用一级活化的方式，也可以采用二级活化的方式。在此不再详述。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，培养基的pH均指初始pH值，也即灭菌前的pH值，其它成分亦然，均为配制时(灭菌前)的用量；使用的“CFU”为菌落形成单位，可以通过平板菌落计数法测得。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

枯草芽孢杆菌获自安徽农业大学生命科学学院，编号为951NA4；

硅藻土购自上海滤飞化工科技有限公司，货号D301；

玉米粉为东北烘干玉米，自行粉碎制得；

谷糠为除尘稻壳粉，购自飞腾农副产品有限公司；

大米粉当地产脱壳水稻经粉碎获得。

石粉为饲料级石粉，购自华邦新材料厂，钙含量大于38重量％。

制备例

本制备例用于说明枯草芽孢杆菌发酵液的制备

按照表1的培养基和条件，使用250ml的烧瓶对枯草芽孢杆菌进行一级摇瓶和二级摇瓶(活化)，然后，使用有效容积为400L的扩培罐对枯草芽孢杆菌扩培。

表1

实施例1

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

(1)微生物菌剂载体的制备

将1重量份的硅藻土和1.2重量份的营养材料混合，得到微生物菌剂载体，其中，所述营养材料为玉米粉、氯化钠和碳酸钙，相对于100重量份的玉米粉，氯化钠的含量为2重量份，碳酸钙的含量为3重量份。

(2)微生物菌体的制备

取一定体积的制备例扩培后的发酵液，常温下，并向其中加入聚丙烯酸钠和羧甲基壳聚糖，沉降24小时，之后排去上清，获得微生物菌体，其中，相对于1000mL的发酵液，聚丙烯酸钠的加入量为5g，羧甲基壳聚糖的加入量为8g。

(3)微生物固体菌剂的制备

向步骤(2)得到的微生物菌体中加入步骤(1)制备的微生物菌剂载体，其中，所述微生物菌体和所述微生物菌剂载体的重量比为1:2.5，得到混合物，然后将所得混合物在50℃的条件下干燥至含水量为10重量％，并将干燥产物粉碎至粒径为200-450μm，得到所述微生物固体菌剂A1。

实施例2

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

(1)微生物菌剂载体的制备

将1重量份的硅藻土和1重量份的营养材料混合，得到微生物菌剂载体，其中，所述营养材料为玉米粉、硫酸钠和碳酸钙，相对于100重量份的玉米粉，硫酸钠的含量为1重量份，碳酸钙的含量为2重量份。

(2)微生物菌体的制备

取一定体积的制备例扩培后的发酵液，并向其中加入蒙脱石、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸钠，沉降12小时，之后排去上清，获得微生物菌体，其中，相对于1000mL的发酵液，蒙脱石的加入量为2g，聚丙烯酰胺的加入量为2g，聚丙烯酸钠的加入量为1g。

(3)微生物固体菌剂的制备

向步骤(2)得到的微生物菌体中加入步骤(1)制备的微生物菌剂载体，其中，所述微生物菌体和所述微生物菌剂载体的重量比为1:4，得到混合物，然后将所得混合物在70℃的条件下干燥至含水量为6重量％，并将干燥产物粉碎至粒径为200-450μm，得到所述微生物固体菌剂A2。

实施例3

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

(1)微生物菌剂载体的制备

将1重量份的硅藻土和1.5重量份的营养材料混合，得到微生物菌剂载体，其中，所述营养材料为玉米粉、氯化钠和碳酸钙，相对于100重量份的玉米粉，氯化钠的含量为0.5重量份，碳酸钙的含量为0.5重量份。

(2)微生物菌体的制备

取一定体积的制备例扩培后的发酵液，并向其中加入硅藻土，沉降36小时，之后排去上清，获得微生物菌体，其中，相对于1000mL的发酵液，硅藻土的加入量为20g。

(3)微生物固体菌剂的制备

向步骤(2)得到的微生物菌体中加入步骤(1)制备的微生物菌剂载体，其中，所述微生物菌体和所述微生物菌剂载体的重量比为1:1，得到混合物，然后将所得混合物在30℃的条件下干燥至含水量为15重量％，并将干燥产物粉碎至粒径为200-450μm，得到所述微生物固体菌剂A3。

实施例4

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂A4的制备，不同的是，步骤(1)中，不添加阳离子盐，而是添加谷糠和大米粉，相对于100重量份的玉米粉，谷糠的含量为10重量份，大米粉的含量为15重量份。

实施例5

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂A5的制备，不同的是，步骤(1)中，将氯化钠替换为等量的氯化钾，将碳酸钙替换为等量的硫酸镁。

实施例6

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂A6的制备，不同的是，步骤(2)中，不添加絮凝剂，而是通过常温离心的方式进行固液分离，离心的转速为8000rpm，时间为5min。

实施例7

本实施例用于说明本发明微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂A7的制备，不同的是，步骤(3)中，通过冷冻干燥的方法对所得混合物进行干燥，冷冻干燥的温度为-40℃。

对比例1

本对比例用于说明参比微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂D1的制备，不同的是，步骤(1)中，所述硅藻土和营养材料的重量比1:0.05。

对比例2

本对比例用于说明参比微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂D2的制备，不同的是，步骤(1)中，所述硅藻土和营养材料的重量比1:15。

对比例3

本对比例用于说明参比微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂D3的制备，不同的是，将玉米粉替换为大米粉。

对比例4

本对比例用于说明参比微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂D4的制备，不同的是，将玉米粉替换为石粉。

对比例5

本对比例用于说明参比微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂D5的制备，不同的是，不添加硅藻土，仅使用营养物质。

对比例6

本对比例用于说明参比微生物固体菌剂的制备方法

按照实施例1的方法进行微生物固体菌剂D6的制备，不同的是，不添加营养物质，仅使用硅藻土。

测试例

将实施例1-7制备的微生物固体菌剂在室温下进行保存，并在保存2个月、8个月和18个月时测定微生物固体菌剂中的活菌数。

活菌数的测定方法：

培养基配方与制备例中扩培罐的培养基相同，不同的是，在培养基中添加1重量％的琼脂制备固体平板培养基，并在规定的时间内取一定量的微生物固体菌剂使用生理盐水稀释至合适的倍数后涂布在平板上，于37℃下倒置培养12小时，对菌落数进行计数，并计算得到活菌数，结果见表2。

表2

由表2可以看出，本发明提供的方法采用含有硅藻土和营养材料的微生物菌剂载体，更有利于微生物菌剂的保存，在常温下可保存18个月以上。此外，采用本发明的微生物菌剂载体制备微生物固体菌剂，还能够为后续的干燥方式提供多种选择，干燥温度只要在70℃以下即可，避免了传统冷冻干燥的设备投入和能耗。此外，在优选的情况下，例如，使用优选的营养材料组合，使用优选的阳离子盐以及优选的固液分离方式能够进一步提高保存过程中的活菌数，从而延长保存时间。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微生物菌剂载体，其特征在于，该微生物菌剂载体含有硅藻土和营养材料，所述硅藻土和营养材料的重量比为1:0.1-10；

其中，所述营养材料含有玉米粉。

2.根据权利要求1所述的所述微生物菌剂载体，其中，所述营养材料还含有阳离子盐、谷糠和大米粉中的至少一种；

优选的，所述阳离子盐选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和锰盐中的至少一种；

优选的，基于100重量份的玉米粉，所述阳离子盐的含量为0.1-5重量份，所述谷糠的含量为1-20重量份，所述大米粉的含量为1-50重量份。

3.根据权利要求1或2所述的微生物菌剂载体，其中，所述营养材料含有阳离子盐和玉米粉，所述阳离子盐包括钠盐和钾盐。

4.一种微生物固体菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：将微生物发酵液进行固液分离，得到微生物菌体，并将所述微生物菌体与微生物菌剂载体混合，之后对得到的混合进行干燥，得到所述微生物固体菌剂；

其中，所述微生物菌剂载体为权利要求1-3中任意一项所述的微生物菌剂载体。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，将微生物发酵液进行固液分离的方法包括：向微生物发酵液中加入絮凝剂并进行沉降，得到所述微生物菌体；

优选的，基于1000mL的微生物发酵液，所述絮凝剂的加入量为5-20g；

优选的，所述絮凝剂为聚丙烯酸钠、羧甲基壳聚糖、蒙脱石、硅藻土、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸钠中的至少一种；

优选的，所述沉降的时间为12-36小时。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述微生物菌体和所述微生物菌剂载体的重量比为1:1-4。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述干燥的条件包括：温度不高于70℃，干燥的时间使得干燥后物料的含水量为5-15重量％。

8.根据权利要求4-7中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括：将干燥后的物料进行粉碎。

9.根据权利要求4-8中任意一项所述的方法，其中，所述微生物为芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌。

10.权利要求4-9中任意一项所述的方法制备的微生物固体菌剂。