CN104789548A - 一种海洋水产养殖用载体固定化抑菌型水质净化剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海洋水产养殖用载体固定化抑菌型水质净化剂及其制备方法。该载体固定化抑菌型水质净化剂是将枯草芽孢杆菌YB-01CGMCC-No.9756和侧孢短芽孢杆菌YB-02CGMCC-No.9757的混合发酵菌液吸附固化到复合载体上制备得到的。本发明中的菌株为分离自海水源中的芽孢杆菌，有很好的净水效果和抑菌作用，硅藻土和玉米芯粉为活菌载体，对环境耐受性强，漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性好，对养殖水体三维立体的净化效果显著。本发明产品快速降解海洋养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质和高效吸附底泥中的重金属离子，避免水质恶化、酸化和臭底；抑制海水养殖中的主要病原菌生长，有效预防病害的发生。

Description

一种海洋水产养殖用载体固定化抑菌型水质净化剂及其制备方法

技术领域

本发明属于水产养殖及海洋微生物技术领域，具体涉及一种菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参、大菱鲆和红鳍东方鲀等海产品养殖用载体固定化水质净化剂及其制备方法和应用。

背景技术

海水是海水养殖动物赖以生存的基本环境条件，俗话说：“三分养鱼，七分养水”。水质的好坏直接影响到它们的生长状况和养殖者的经济效益。随着生活水平的提高，人们对水产品的需求量日益增加，在捕捞量不能满足市场需求的情况下，高密度的集约化水产养殖方式得到了迅猛发展。然而，这种养殖模式中水体的污染程度远远超过了水体自身的净化能力，残存饵料及排泄物在水体中沉积，造成水体自身污染乃至水质恶化，表现为水体严重富营养化，水体中悬浮物增多，化学需氧量、氨氮、亚硝态氮、硫化氢的含量增加，有害重金属含量累积，溶解氧下降，水体酸化和臭底。尤其对底息型动物(如海参、大菱鲆和红鳍东方鲀等)尤为严重，轻者影响其生长、发育和繁殖；重者导致疫病频发和直接死亡。

现有海水集约化养殖过程中的净水方式一般是采用清池倒池，循环过滤，投放化学净水剂和微生态制剂等。但普遍存在费时费力和高能耗高成本的缺点；虽然对于突发的水体恶化，化学净水剂能快速反应转化有害物质，但会对水体环境造成二次污染；微生态制剂为环境友好型净水方案，但存在菌群活化时间长、存活繁殖适应性差和数量递减等问题。

目前用于水环境的微生态制剂的益生菌种主要有光合细菌、芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、硝化细菌等。这些微生物菌种单一，净化效果有限；基本为淡水菌株，不适用于海水养殖应用；不产芽孢菌剂存活期短，对环境耐受能力差；有的菌种生长缓慢，使用中“活化”时间长，导致活菌制剂的加工、保存、运输和使用等问题，阻碍了微生态制剂的研发、生产和应用。

芽孢杆菌是能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌一类细菌，对外界有害因子抵抗力强，广泛存在于土壤、水体、空气以及动物肠道等中，具有繁殖快、 代谢快、生命力强(无湿状态可耐低温-60℃、芽孢耐高温280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧和耐低氧等)等优点。农业部第2045号公告《饲料添加剂品种目录(2013)》中，允许使用的36种微生物中有5种芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌)。但这些芽孢杆菌多为淡水菌株，不适用于海水养殖，对于专用于海水养殖的、具有高效海水养殖水体净化作用的芽孢杆菌以及其微生物制剂的研究很少见。

硅藻土是一种生物成因的硅质沉积岩，主要由古代硅藻遗体组成，具有不同的形状(圆盘状、针状、筒状、羽状等)，其化学成份主要是SiO₂，由于具有空隙率高、比表面大、比重小、耐磨、耐酸、吸附性强、热导性低、隔热阻燃、保温隔音等优良特性，被广泛地应用于饮食、建材、化工、能源、水处理等行业中。硅藻土的表面及孔内表面分布有大量的硅羟基，使颗粒表现出一定的表面负电性，使得其在水处理过程中，不但能去除颗粒态和胶体态的污染物质，还能有效地降低水体浊度和去除水体富营养化的主要污染物磷与氨氮，以及Hg²⁺、Pb²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等重金属离子等有害物质。

玉米芯粉是选用优质玉米芯加工而成，为米色或黄褐色，含碳水化合物54.5％、粗蛋白质2.2％、粗脂肪0.4％、粗纤维29.7％、矿物质1.2％，比重为0.3～0.35，吸附力50～70，一般为制作兽药的载体，是豆饼粉及其它载体的替代品。主要用于生产马杜霉素、胆碱类、维生素、预混剂和饲料添加剂等十几个兽药及饲料添加剂的载体。它具有比其它植物性载体成本低、保质期长、流动性好、吸水性强、适口性好等特点。以玉米芯粉为载体生产的兽药保质期达三年以上重稳定，各项指标及微生物指标均符合国内和国际标准。

发明内容

本发明的目的在于针对上述在海洋水产养殖用微生物制剂中存在的问题，提供一种适合用于海水养殖的菌群存活繁殖适应性强的载体固定化抑菌型水质净化剂，该净化剂尤其适合用于海参、大菱鲆和红鳍东方鲀等海产品养殖用水体的净化。本发明的载体固定化抑菌型水质净化剂主要由净水芽孢杆菌混合组成，由海水养殖环境的底泥中分离并筛选的降解氨氮的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YB-01(保藏号为CGMCC-No.9756，保藏日期为2014年10月11日)和降解亚硝酸氮的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)YB-02(保藏号为 CGMCC-No.9757，保藏日期为2014年10月11日)，以玉米粉、豆饼粉和玉米浆为主要发酵培养基，以硅藻土和玉米芯粉作为吸附和悬浮载体，加工成固体粉剂。所述的枯草芽孢杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌YB-02，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的：

一种载体固定化抑菌型水质净化剂，是将枯草芽孢杆菌YB-01(CGMCC-No.9756)和侧孢短芽孢杆菌YB-02(CGMCC-No.9757)的混合发酵菌液吸附固化到复合载体上制备得到的，其中所述复合载体由硅藻土粉和玉米芯粉按重量比2～4:1混合组成。

进一步地，所述的混合发酵菌液与复合载体的重量比为15～35:1，优选为20～30:1。

进一步地，所述的混合发酵菌液中菌体的镜检芽孢形成率为80～85％。

本发明从海洋环境的刺参池养殖池采集的底泥样品中分离得到具有高效氨氮降解能力的菌株枯草芽孢杆菌YB-01和具有高效的亚硝态氮降解能力的侧孢短芽孢杆菌YB-02。经检测，YB-01在24小时对氨氮降解效率达到99.35％，YB-02在24小时内对亚硝态氮降解达到99.87％，目前还没有具有如此高效的氨氮和亚硝态氮降解能力的海水用微生态菌。本发明按一定比例联合使用两种菌株，达到高效去除氨氮和去除亚硝态氮效果，同时对6种海水养殖中常见的致病菌有一定的抑菌效果，克服了目前海水池塘养殖水体快速恶化和疫病频发的问题。

上述技术方案中所述的载体固定化抑菌型水质净化剂，实际应用时含有枯草芽孢杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌YB-02的益生菌液在发酵培养基中发酵至其镜检芽孢形成率达到80～85％时，停止发酵，混合发酵菌液用于制备本发明的载体固定化抑菌型水质净化剂。

本发明的另一目的是提供一种本发明所述的载体固定化抑菌型水质净化剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)益生菌种子液制备：将斜面培养的枯草芽孢杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌YB-02，分别接种至种子液培养基中，在pH 7.2-7.5，26～28℃恒温摇床培养，得枯草芽孢杆菌YB-01益生菌种子液和侧孢短芽孢杆菌YB-02益生菌种子液，按体积比1:1～1.5混合，得混合益生菌种子液；

(2)益生菌液态发酵培养：将混合益生菌种子液按5～10％的体积比接种至发酵培养基中，在0.1MPa，温度28～30℃，溶氧≧30％的条件下，进行发酵，初始搅拌速度150rpm，2h后为200rpm，3h后为250rpm，4h后为300rpm，12h后得发酵菌液；

(3)载体固定化处理：向步骤(2)的发酵菌液中，加入复合载体，在搅拌下进行吸附固定化处理1～3h，优选为1h，离心，收集固定化载体菌体复合物，50～55℃干燥处理至半干后，自然晾干，粉碎，得终产品；

其中，步骤(1)所述的种子培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠30g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.2～7.5；步骤(2)所述的发酵培养基的组成为：玉米粉150g，豆饼粉250g，中温淀粉酶3.5g，中性蛋白酶2.5g，玉米浆40g，葡萄糖25g，硫酸镁10g，用陈海水定容至5L，pH7.2～7.5；步骤(3)所述的发酵菌液和复合载体的重量比为15～35:1，所述的复合载体为硅藻土粉和玉米芯粉按重量比2～4:1混合的混合物。

进一步地，在上述制备方法中，步骤(1)中所述的枯草芽孢杆菌YB-01益生菌种子液和侧孢短芽孢杆菌YB-02益生菌种子液中的菌体浓度均为2～3×10⁸cfu/ml。

进一步地，在上述制备方法中，步骤(2)中所述的发酵菌液中菌体的镜检芽孢形成率为80～85％。本发明将发酵菌液的菌体镜检芽孢形成率控制在80～85％，以达到最佳的活菌芽孢使用比，提高菌体存活繁殖能力，减少使用时的菌体活化时间。

进一步地，在上述制备方法中，所述的硅藻土的粒径为50～200目，玉米芯粉的粒径为60～150目。本发明使用特定粒径的硅藻土以及玉米芯粉，以达到最佳吸附菌体的目的和水体中的漂悬浮效果，所述硅藻土的粒径优选为100-150目，更优选为100-120目；所述玉米芯粉的粒径优选为60-100目，更优选为80-100目。

进一步地，在上述制备方法中，步骤(3)中所述的终产品的水份含量为3～5％，终产品中菌体终浓度≧5×10⁹cfu/g。在一般情况下，收集的菌体复合物，在50～55℃下干燥处理至半干后，自然晾干6～12小时即可。

本发明的再一目的是提供本发明所述的载体固定化抑菌型水质净化剂在海洋水产养殖中的应用。本发明的载体固定化抑菌型水质净化剂尤其适合应用于 海水环境中的海参养殖、大菱鲆养殖和红鳍东方鲀养殖。

本发明采用海水源(海水养殖环境的底泥)中分离得到的芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌和侧孢短芽杆菌)，区别现在淡水菌剂在海水养殖中的滥用和无效，其制剂适合应用于海水养殖水体的净化。菌株具有高效去除海水养殖水体中的氨氮和亚硝态氮的作用，对环境耐受性强、保质期长；并采用最佳的活菌芽孢比，减少使用的活化时间；同时，对海水养殖中的6种海水养殖致病菌具有一定的抑菌效果，减少抗生素的同时避免水体恶化引起的病疫和死亡。

本发明的净化剂采用具有特定粒径的硅藻土粉和玉米芯粉作为活菌载体，其中玉米芯粉中糖类物质提供芽孢杆菌快速活化，使菌群活化时间明显缩短，同时增加产品的漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性，有利于海水养殖水体三维立体的净化效果；本发明净化剂在使用时，载菌硅藻土粉吸水后比重变大沉于水底，菌体在底层水体和底泥中发挥作用(去除水体中的氨氮和亚硝态氮，吸附底泥中的重金属离子)，有利于缓解底层水体恶化和臭底问题；玉米芯载体入水后，能够水面漂浮和水中悬浮，活菌快速工作并迅速活化休眠的芽孢，高效去除水体中的氨氮、亚硝态氮和硫化氢等毒害物质。

本发明的有益效果：本发明的净化剂采用天然非金属矿物硅藻土和玉米芯粉为活菌载体，对环境耐受性强，漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性好，对海参、大菱鲆和红鳍东方鲀等的养殖水体三维立体的净化效果显著。玉米芯粉中糖类物质使菌群活化时间明显缩短，益生菌快速生长，尤其在海参的育苗期和养成期定期泼洒该载体固定化水质净化剂，可以快速降解养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质和高效吸附底泥中的重金属离子，避免水质恶化、酸化和臭底，同时YB-01和YB-02芽孢杆菌可非特异性抑制海水养殖中的病原菌生长(灿烂弧菌、黄海希瓦氏菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌)，有效预防海参病害的发生，提高海参养殖的质量和产量，对于急性水体污染有高效快捷安全的净水效果。

附图说明

图1为本发明载体固定化抑菌型水质净化剂SEM照片，其中图1A表示硅藻土上吸附固定的活菌和芽孢，图1B表示玉米芯粉上吸附固定的活菌和芽孢。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

种子培养基(营养肉汤液体培养基)：购于北京索莱宝科技有限公司。

发酵培养基：玉米粉150g，豆饼粉250g，中温淀粉酶3.5g，中性蛋白酶2.5g，玉米浆40g，葡萄糖25g，硫酸镁10g，陈海水定容至5L，pH 7.2～7.5。制备方法为：按照规定质量，称取玉米粉和豆饼粉，加入3L陈海水均匀搅拌后，转至发酵罐中，同时加入中性蛋白酶和中温淀粉酶，依次在50℃、65℃条件下水解40～60min；将已加入硫酸镁和葡萄糖的适量陈海水转入发酵罐中，最后将玉米浆转入发酵罐中，陈海水定容至5L，调pH 7.2～7.5，121℃灭菌30min。

玉米粉：购于大连星驰经贸有限公司。

豆饼粉：购于山东万得福实业集团有限公司。

葡萄糖：山东西王糖业有限公司。

玉米浆：山东郓城康源生物科技有限公司。

中温淀粉酶和中性蛋白酶：山东隆科特酶制剂有限公司。

硅藻土粉：食品级，100～150目，购于青山源硅藻土有限公司。

玉米芯粉：饲料级，60～100目，购于山东高唐华特威科技有限公司。

本发明实施例中涉及的微生态制剂包括：由海参养殖环境中分离筛选的芽孢杆菌包括：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YB-01CGMCC-No.9756和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)YB-02CGMCC-No.9757。2株菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，邮编100101)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下面通过实例进一步详细描述本发明。

实施例1菌株YB-01和YB-02的筛选、分离与鉴定

1.培养基的配制：

氨氮降解菌富集筛选培养基：(NH4)₂SO₄2g，NaH₂PO₄0.25g，MnSO₄·4H₂O0.01g，K₂HPO₄0.75g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，CaCO₃3g，陈海水1L，pH 7.5-8.0。

氨氮降解菌分离纯化固体培养基：(NH4)₂SO₄0.5g，NaH₂PO₄0.25g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，K₂HPO₄0.75g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，CaCO₃2g，陈海水1 L，琼脂粉12g，pH 7.5-8.0。

亚硝酸盐氮降解菌富集筛选液体培养基：NaNO₂1g，Na₂CO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，FeSO₄·7H₂O 0.4g，陈海水1L，pH 7.2-7.5。

亚硝酸盐氮降解菌分离纯化固体培养基：NaNO₂0.5g，Na₂CO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，FeSO₄·7H₂O 0.4g，陈海水1L，琼脂粉12g，pH 7.2～7.5。

2216E液体培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，FePO₄0.1g，陈海水1L，pH 7.2；固体培养基为液体培养基中加入15g l^-1琼脂粉。

营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠30g，蒸馏水1000ml，pH值7.2；固体培养基为液体培养基中加入15g l^-1琼脂粉。

以上培养基使用前，121℃灭菌20min，室温保存。 

2.菌种的筛选 

取刺参海水养殖池中采集的底泥样品的内层样品2g，加入50ml的PBS缓冲溶液，振荡5min，使样品均匀浑浊，1000rpm离心5min，收集底泥样品上清液，备用。

(1)氨氮降解菌菌株YB-01的分离与纯化 

取10ml刺参养殖池底泥样品上清液，加入到装有200ml氨氮降解菌富集筛选培养基的锥形瓶中，在28℃，150rpm恒温摇床培养3天，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释取100μl涂布于氨氮降解菌分离纯化固体培养基上，置于28℃培养箱培养。在48h时，挑取不同形态单菌落在2216E固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到的单菌落进行16S rDNA测序，其序列如SEQ ID No:1，长度为1422bp。该单菌落命名为YB-01。

将YB-01的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，与登录号KM_013814.进行比对分析，基因同源性分别达到100％。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)对菌落形态特征和生理生化鉴定，确定YB-01为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC-No.9756。

(2)亚硝态氮降解菌菌株YB-02的分离与纯化 

取10ml刺参养殖池底泥样品上清液，加入到装有200ml亚硝酸盐氮降解菌富集筛选液体培养基的锥形瓶中，28℃，150rpm恒温摇床培养3d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μl涂布于亚硝酸盐氮降解菌分离纯化固体培 养基上，置于28℃培养箱培养。在72h之后，挑取不同形态单菌落在2216E固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到的单菌落进行16S rDNA测序，其序列如SEQ ID No:2，长度为1388bp。该单菌落命名为YB-02。

将YB-02的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，与登录号AY_372923.1进行比对分析，基因同源性分别达到99％。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)对菌落形态特征和生理生化鉴定，确定YB-02为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC-No.9757。

实施例2菌株YB-01和YB-02的生理生化特征

根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)的菌株生理生化检测方法对YB-01和YB-02进行检测，检测指标有糖发酵、醇发酵、淀粉水解、脂肪酶、甲基乙酞、过氧化氢酶、酪素水解、蛋白质水解、柠檬酸酸盐利用、酪氮酸水解、苯丙氨酸脱氨和产酸情况等。

表1.YB-01和YB-02菌株的生理生化特征

注：表1中<+>表示阳性，<－>表示阴性。

实施例3菌株YB-01和YB-02的性能检测

(1)氨氮和亚硝态氮去除率检测：采用国标的苯酚次氯酸盐比色法和盐酸 萘乙二胺重氮偶氮比色法(GB_17378.4-2007)分别检测氨氮和亚硝态氮浓度。模拟海水养殖条件下(主要是盐度32‰、pH 7.5和温度24～26，溶解氧≧5mg/L)，分别检测YB-01或YB-02对氨氮初浓度为5、10、25和50mg/L的模拟液的24小时氨氮去除率；以及两个菌株对亚硝态氮初浓度为0.5、2、5和10mg/L的模拟液的24小时亚硝态氮去除率，每个浓度梯度设3个重复。用于检测的YB-01或YB-02的准备方法为：YB-01或YB-02益生菌种子液按5％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1MPa，温度28～30℃，溶氧≥30％。初始搅拌速度150rpm，2h后为200rpm，3h后为250rpm，4h后为300rpm，发酵10小时，得发酵菌液，其浓度约为5×10¹⁰cfu/ml。取5ml发酵菌液离心后将沉淀了的菌体分别加入到100ml的4个浓度的氨氮初浓度的模拟液或亚硝态氮初浓度的模拟液中，进行24小时亚硝态氮去除率或亚硝态氮去除率的试验。

表2.YB-01和YB-0224h氨氮去除率测试

表3.YB-01和YB-0224h亚硝态氮去除率测试

(2)抑菌效果检测：采用滤纸片琼脂平板扩散法，取6mm无菌滤纸片浸入YB-01和YB-02浓度均为1.0×10⁸cfu/ml培养液中。将培养至对数生长期的病原弧菌稀释至1.0×10⁸cfu/ml，取100ml均匀涂布于NB琼脂平板，并置入含YB-01和YB-02的滤纸片进行拮抗测试。于28℃培养24h观察细菌生长情况，测量抑菌圈直径，每平皿设3个重复。

表4.芽孢杆菌YB-01和YB-02对主要致病菌的抑制效果

注：d≧8mm表示具有抑菌活性，d<8mm表示不具有抑菌活性。

实施例4载体固定化抑菌型水质净化剂

(1)益生菌种子液的制备

将在-70℃保藏的菌液冻存管琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌YB-01CGMCC-No.9756和侧孢短芽孢杆菌YB-02CGMCC-No.9757，分别加进加盐营养肉汤液体培养基中，pH 7.2～7.5，28～30℃恒温摇床培养12h，制备成YB-01益生菌种子液和YB-02益生菌种子液，两种益生菌种子液中菌体浓度均为3×10⁸cfu/ml。

(2)益生菌液态发酵培养

向已空消的发酵罐中加入5L发酵培养基，将步骤(1)制备的YB-01益生菌种子液和YB-02益生菌种子液按体积比1:1.5混合，制备混合种子液，混合种子液按5％的体积比接种至发酵培养基中，进行发酵，调整罐压为0.1MPa，温度28～30℃，溶氧≥30％。初始搅拌速度150rpm，2h后为200rpm，3h后为250rpm，4h后为300rpm，发酵6小时。发酵过程中加入适量消泡剂消泡。发酵结束后，发酵菌液镜检，芽孢形成率在80～85％。

(3)载体固定化处理

步骤(2)得到的发酵菌液中，加入发酵液重量2％的硅藻土粉和发酵液质量1％的玉米芯粉，机械搅拌固定化处理1h后，4000rpm，离心10min收集固定化载体菌体复合物，50℃干燥处理至半干后，自然晾干，粉碎后即为载体固 定化抑菌型水质净化剂(粉剂)，其SEM照片如图1其中图1A表示硅藻土上吸附固定的活菌和芽孢，图1B表示玉米芯粉上吸附固定的活菌和芽孢。图1中可见软性基质的玉米芯粉对菌体的吸附能力很强，这有利于给活菌和芽孢提供生长的附着空间和碳源营养物质，会提高入水后的活化能力，加速芽孢复苏。

实施例5载体固定化抑菌型水质净化剂对海参养殖池的净化效果

选取4处条件相同的海参养殖池，尺寸为8m x 6m，平均水深1.4m，静水网片养殖，参苗规格40～50头/500g，养殖密度为150头/m³。

1、2号圈为对照组(未使用载体固定化抑菌型水质净化剂)，3、4号圈为实验组(使用实施例4制备的载体固定化抑菌型水质净化剂)；实验组除了定期泼洒所述载体固定化抑菌型水质净化剂之外，海参饲料、饲喂方式和管理方法与对照组一样。

使用效果： 

实验周期为2014年8月到9月，约30天，期间第16天倒池一次。养殖环境的盐度为30～32‰，水温为18～24℃，pH为7.5～8.5，溶解氧不低于5mg/L。实验组每隔5天泼洒1次载体固定化抑菌型水质净化剂，泼洒量为5g/m³。

实验期间，第30天检测水质(pH、氨氮、亚硝酸氮、硫化氢和COD浓度)，如表5；观察幼参存活与摄食情况，以及测量海参体重，呼吸爆发活力和吞噬率以及海参体壁重金属Pb²⁺含量，如表6。

表5.本发明载体固定化抑菌型水质净化剂对幼参养殖池的水质指标的影响

注：同列中上标字母，相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)。

表6.本发明载体固定化抑菌型水质净化剂对幼参生长和免疫机能的影响

注：同列中上标字母，相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)。

结果表明：本发明的海水养殖用载体固定化抑菌型水质净化剂，对幼参养殖池内的水质有明显的净化效果，可以稳定水体pH，并大幅降低非离子氨、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质的含量，降低海参体内重金属离子Pb²⁺的浓度，提高刺参的免疫力，预防刺参病害的发生，提高养殖刺参的质量和产量。

实施例6载体固定化抑菌型水质净化剂对大菱鲆养殖池的净化效果

选取4处条件相同的大菱鲆养殖池，直径为8m，平均水深0.8m，大菱鲆鱼苗规格5尾/500g，养殖密度为100尾/m³。

1、2号圈为对照组(未使用载体固定化抑菌型水质净化剂)，3、4号圈为实验组(使用实施例4的载体固定化抑菌型水质净化剂)；实验组除了定期泼洒载体固定化抑菌型水质净化剂之外，大菱鲆颗粒饲料、饲喂方式和管理方法与对照组一样。

使用效果： 

实验周期为2014年10月末到11月初，约15天，采用半流水养殖。养殖环境的盐度为30～32‰，水温为12～18℃，pH为7.0～8.0，溶解氧不低于5.5mg/L。实验组每隔5天泼洒1次载体固定化抑菌型水质净化剂，泼洒量为5g/m³。

实验期间，第15天检测水质(pH、氨氮、亚硝酸氮、硫化氢和COD浓度)，如表7；观察鱼苗存活与摄食情况，以及测量鱼苗体重和体长，肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活力和白细胞的吞噬率，如表8。

表7.本发明载体固定化抑菌型水质净化剂对大菱鲆幼苗养殖池的水质指标的影响

注：同列中上标字母，相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)。

表8.本发明载体固定化抑菌型水质净化剂对大菱鲆幼苗生长和免疫机能的影响

注：同列中上标字母，相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)。

结果表明：本发明的载体固定化抑菌型水质净化剂，对大菱鲆养殖池内的水质有明显的净化效果，能控制非离子氨、亚硝酸盐、硫化氢和COD的浓度，并提高幼鱼SOD活力和吞噬率等免疫力，预防病害的发生，提高养殖大菱鲆的质量和产量。

以上所述，仅是本专利的较佳的染色工艺和实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化和替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种海洋水产养殖用载体固定化抑菌型水质净化剂，是将枯草芽孢杆菌YB-01 CGMCC-No.9756和侧孢短芽孢杆菌YB-02 CGMCC-No.9757的混合发酵菌液吸附固化到复合载体上制备得到的，其中所述复合载体由硅藻土粉和玉米芯粉按重量比2～4:1混合组成。

2.根据利要求1所述的载体固定化抑菌型水质净化剂，其特征在于，所述的混合发酵菌液与复合载体的重量比为15～35:1。

3.根据权利要求1所述的载体固定化抑菌型水质净化剂，其特征在于，所述的混合发酵菌液中菌体的镜检芽孢形成率为80～85％。

4.如权利要求1所述的载体固定化抑菌型水质净化剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)益生菌种子液制备：将斜面培养的枯草芽孢杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌YB-02，分别接种至种子培养基中，在pH 7.2～7.5，26～28℃恒温摇床培养，得枯草芽孢杆菌YB-01益生菌种子液和侧孢短芽孢杆菌YB-02益生菌种子液，按体积比1:1～1.5混合，得混合益生菌种子液；

(2)益生菌液态发酵培养：将混合益生菌种子液按5～10％的体积比接种至发酵培养基中，在0.1MPa，温度28～30℃，溶氧≥30％的条件下，进行发酵，初始搅拌速度150rpm，2h后为200rpm，3h后为250rpm，4h后为300rpm，得发酵菌液；

(3)载体固定化处理：向步骤(2)的发酵菌液中，加入复合载体，在搅拌下进行吸附固定化处理1～3h，离心，收集固定化载体菌体复合物，50～55℃干燥处理至半干后，自然晾干，粉碎，得终产品；

其中，步骤(1)所述的种子培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠30g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.2～7.5；步骤(2)所述的发酵培养基的组成为：玉米粉150g，豆饼粉250g，中温淀粉酶3.5g，中性蛋白酶2.5g，玉米浆40g，葡萄糖25g，硫酸镁10g，用陈海水定容至5L，pH7.2～7.5；步骤(3)所述的发酵菌液和复合载体的重量比为15～35:1，所述的复合载体由硅藻土粉和玉米芯粉按照重量比2～4:1组成。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的枯草芽孢杆菌YB-01益生菌种子液和侧孢短芽孢杆菌YB-02益生菌种子液中的菌体浓度均为2～3×10⁸cfu/ml。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的发酵菌液中菌体的镜检芽孢形成率为80～85％。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的硅藻土粉的粒径为100～150目，玉米芯粉的粒径为60～100目。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的终产品的水份含量为3～5％，终产品中菌体终浓度≧5×10⁹cfu/g。

9.如权利要求1所述的载体固定化抑菌型水质净化剂在海洋水产养殖中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述海洋水产养殖为海参养殖、大菱鲆养殖和红鳍东方鲀养殖。