CN115025231B - 中药材的干法接种方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了中药材的干法接种方法，其包括：(1)将菌液与经灭菌的麦麸混合，干燥，得到接种载体；(2)将所述接种载体与中药材混合；(3)将所述接种载体与所述中药材分离，得到接种的中药材。本申请的方法采用麦麸作为干接种载体，能更加真实地还原中药材的微生物污染过程。
Description
技术领域
本申请属于中药生物技术领域，具体涉及中药材的干法接种方法。
背景技术
中药材在炮制过程中，可能由于炮制辅料中携带微生物而污染中药材，导致中药材染菌、变质等，严重影响中药材的质量。因此，模拟中药材的染菌情况，还原更加真实的污染过程，有助于研究和预防中药材的微生物污染。
目前湿法接种方法已成功应用于坚果、面包等的接种。但这种湿法接种方法存在一些问题，例如添加液体接种物会改变干燥基质的水分含量和水分活度，通常需要冗长的干燥步骤，并且接种后基质的水分吸附/解吸等温线可能会发生改变。因此，接种、干燥后产品的水分和水分活度可能与原始样品不同，对后续的研究产生影响。
因此，需要寻求和开发用于模拟中药材微生物污染情况的新的接种方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请的目的是提供中药材的干法接种方法。
本申请的一个或多个实施方式提供了中药材的干法接种方法，其包括：
(1)将菌液与经灭菌的麦麸混合，干燥，得到接种载体；
(2)将所述接种载体与中药材混合；
(3)将所述接种载体与所述中药材分离，得到接种的中药材。
在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中，所述菌液为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)的菌液。
在一个或多个实施方式中，将枯草芽孢杆菌或乙型副伤寒沙门氏菌接种到培养基中进行孵育，将所得培养物在斜面平板上培养，得到菌液。
在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中所述菌液的浓度为7～12logCFU/ml，例如，7logCFU/ml、8logCFU/ml、9logCFU/ml、9.5logCFU/ml、9.8logCFU/ml、10logCFU/ml、11logCFU/ml或12logCFU/ml。在一个或多个实施方式中，所述菌液与所述麦麸以10:35ml/g的比例混合。
在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中所述菌液的浓度为9～10logCFU/ml，例如9.8logCFU/ml。
在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中所述菌液与所述麦麸以(8～12):(30～40)ml/g的体积重量比混合；例如，体积重量比为8:30ml/g、9:32ml/g、10:35ml/g、11:38ml/g或12:40ml/g。在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中所述菌液与所述麦麸以10:35ml/g的体积重量比混合。
在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中通过将麦麸置于135℃～145℃灭菌1.5～2.5h从而得到所述灭菌的麦麸。在一个或多个实施方式中，例如，灭菌温度为135℃、136℃、137℃、138℃、139℃、140℃、141℃、142℃、143℃、144℃或145℃。在一个或多个实施方式中，灭菌温度为140℃。在一个或多个实施方式中，例如，灭菌时间为1.5h、1.8h、2h、2.2h或2.5h。在一个或多个实施方式中，灭菌时间为2h。
在一个或多个实施方式中，在步骤(1)中所述干燥为在33℃～42℃下干燥22～26h，例如，干燥温度为33℃、38℃、40℃或42℃，干燥时间为22h、24h或26h。在一个或多个实施方式中，干燥温度为42℃。在一个或多个实施方式中，干燥时间为24h。
在一个或多个实施方式中，在步骤(2)中，将所述经干燥的接种载体与所述中药材置于无菌袋中混合。
在一个或多个实施方式中，在步骤(2)中，所述接种载体与所述中药材的重量比为(1～2):20，例如，1:20、1.2:20、1.4:20、1.5:20、1.8:20、2:20。
在一个或多个实施方式中，在步骤(3)中，通过过筛将所述接种载体与所述中药材分离，得到接种的中药材。
在一个或多个实施方式中，所述中药材的在干燥前的水活度为0.45～0.60，例如0.45、0.5、0.55或0.6。
在一个或多个实施方式中，所述中药材为果实、根茎、全草或皮类中药材。
在一个或多个实施方式中，所述中药材选自枳壳、枳实、山药、苍术、白术、穿心莲和合欢皮。
在一个或多个实施方式中，所述中药材为枳壳、穿心莲或合欢皮。
本申请的一个或多个实施方式提供了麦麸在制备用于中药材干法接种的接种载体中的用途。
在一个或多个实施方式中，所述中药材选自枳壳、枳实、山药、苍术、白术、穿心莲和合欢皮。
在一个或多个实施方式中，所述中药材为枳壳、穿心莲或合欢皮。
在一个或多个实施方式中，麦麸(即麦皮)为小麦加工面粉副产品，麦黄色，片状或粉状。
在一个或多个实施方式中，枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。
在一个或多个实施方式中，枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。
在一个或多个实施方式中，山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎。
在一个或多个实施方式中，苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎。
在一个或多个实施方式中，白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎。
在一个或多个实施方式中，穿心莲为爵床科植物穿心莲(圆锥须药草)Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分。
在一个或多个实施方式中，合欢皮为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz的干燥树皮。
本申请的干法接种方法采用麦麸为载体进行干接种，与现有技术中采用石英砂作为接种载体相比，麦麸的优点至少包括以下中的一种：
1.麦麸更接近于真实污染情况。麦麸是中药炮制的固体辅料，在炮制过程中，由于加热不均匀，可能导致麦麸中携带的微生物污染中药材。因此麦麸是中药材的污染源之一，采用麦麸作为干接种载体，能更加真实的还原污染过程。
2.麦麸有一定的吸水性。将接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)后的麦麸置麦迪康(Medicom)无菌自封袋中，于38℃～46℃条件下干燥24h，aw＜0.4；而石英砂在同条件下干燥24小时的aw在0.5～0.6之间，要达到与麦麸干燥24h后相似的低水活度需要干燥约48h。因此，麦麸干燥时间更短，更适宜为针对低水活度的枳壳等中药材的接种载体。
3.麦麸由于密度小，因此用量较石英砂少。达到同样的接种浓度，麦麸的用量仅为石英砂用量的一半左右。
附图说明
图1表示冷藏环境下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)在麦麸中的稳定性考察。
具体实施方式
实施例1
1实验仪器和材料
1.1仪器
Aqualab 4T水分活度仪(美国Decagon公司)；Sartorious T601-L电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；Heal Force-900C生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；PYX-DHS细菌培养箱(上海跃进医疗器械厂)；YXQ-LS-50SⅡ型高压蒸汽灭菌器(上海博讯实业医疗器械有限公司)。
1.2枳壳样品
购自怡源中药材批发零售公司，包装日期：2021年12月18日。
使用前，在常温条件下储存小于6个月。
1.3实验试剂与培养基
胰酪大豆胨液体培养基(批号：210809-7)，购于江苏益玛生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：201225)，购于北京陆桥技术有限责任公司。
1.4试验菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为从枳壳样品中分离纯化并通过菌种鉴定的菌株。乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)菌种编号：CMCC(B)50094，购于中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心。
2方法及结果
2.1菌液的制备
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种到胰酪大豆胨液体培养基TSB中，并在37±2℃下孵育24h。将培养物(1ml)铺在TSA斜面平板上，并在37±2℃下培养24小时。向每个平板中加入5ml 0.1％蛋白胨，冲洗斜面上的菌苔，并将菌悬液转移入无菌试管中。将菌悬液分别用0.1％蛋白胨稀释，涡旋混合30秒。将菌悬液连续稀释，并取1ml置于无菌平皿中，倾倒45℃TSA培养基，培养24小时，计数。
2.2干接种物的制备
将麦麸置于140℃灭菌2h。将制备好的菌溶液与麦麸以10ml/35g的比例混合在无菌袋中，用手轻揉接种的麦麸5分钟。将接种的混合物按照上述细菌计数法计数，并置麦迪康(Medicom)无菌自封袋中，置于42℃培养箱中干燥24h。接种枳壳之前，将干燥的接种载体进行细菌计数。
2.3枳壳的干接种
将干燥的接种麦麸(5g、10g)、100g枳壳共同置于无菌袋中，手动混合5min，然后置于《中国药典》2020版四部粒度中的1目无菌筛中摇动1分钟，将麦麸与枳壳分离。采用2.2中的计数法对接种后的枳壳细菌计数。
2.4接种菌在麦麸中的存活
将接种后的麦麸置于冷藏(4℃)环境，分别于第0、2、6、13、30、60天取样进行细菌计数，以评估麦麸中接种微生物的稳定性。
3结果与讨论
3.1菌液浓度
在菌液接种前进行细菌计数，菌液浓度达到9.8logCFU/ml。
3.2干燥接种的载体
本研究用10ml枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液接种35g麦麸，接种后立即进行细菌计数，结果为7.3logCFU/g，测得aw为0.8901。接种后置于麦迪康(Medicom)无菌自封袋或金属盒中，分别在42℃、33℃培养箱中干燥24小时后对接种载体细菌计数、水活度测定，结果见下表。
各干燥条件下，载体中的枯草芽孢杆菌浓度增加了0.2～0.7logCFU/g。aw的变化则有差异，从上表可以看出，置金属盒中的接种载体在42℃、33℃下干燥24、48小时后的水活度几乎没有改变，aw均大于0.8。置无菌袋中的接种载体在42℃、33℃温度下干燥24小时后的水活度为：0.2448、0.3670。枳壳等中药材的水活度在0.45～0.60，因此置于无菌自封袋中的接种载体在两种温度(42℃、33℃)下干燥后aw均小于枳壳等中药材水活度，该接种载体不会改变材料的性质，满足接种要求。
3.3枳壳的干接种
分别以5g、10g的干接种载体与100g枳壳混合，通过摇晃、揉搓5分钟混合，再通过无菌筛去除麦麸。接种前后，测试枳壳的水活度均为0.47。说明该过程不会影响枳壳的水分活度，也不会对样品的外观或性状产生影响。接种后进行细菌计数，结果分别为5.7、6.2logCFU/g。两者之间差异较小，且与湿法接种并干燥后的接种量相当。因此，使用5g接种麦麸接种100g枳壳。
本申请通过模拟枳壳干污染的接种方法，更加真实地还原了中药材枳壳的微生物污染情况，可有利于研究和预防中药材的微生物污染。
3.4接种菌在麦麸上的存活
制备麦麸接种物需要几天时间，如果能够制备可在数周至数月内储存和使用的数量，将大大节约时间，提高效率。因此，我们对冷藏环境下枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)在麦麸中的稳定性进行了考察。结果见图1。
储存期间，两种菌浓度都没有明显的变化。枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌浓度变化幅度分别在±0.2logCFU/g、±0.3logCFU/g范围内。说明两种菌在麦麸中的存活率高，在冷藏环境下，该干接种物在60天内可以使用。
实施例2：用10ml乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)液(菌液制备同枯草芽孢杆菌)与35g麦麸混匀后，置于麦迪康(Medicom)无菌自封袋中，于42℃干燥24小时，aw＜0.40。用6g麦麸接种载体、60g穿心莲(购于济和堂养生苑，包装日期：2021年10月24日)混合，通过摇晃、揉搓5分钟混合，再通过无菌筛去除麦麸。接种后进行细菌计数，由于药材本底含菌量高(本底检测不含沙门氏菌)，采用沙门氏显色培养基(品牌：chromagar，批号：P001606)计数，结果为5.1logCFU/g。
实施例3：用10ml乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)液(菌液制备同枯草芽孢杆菌)与35g麦麸混匀后，置于麦迪康(Medicom)无菌自封袋中，于42℃干燥24小时，aw＜0.40。用5g麦麸接种载体、60g合欢皮(购于张氏中药材批发零售店，包装日期：2021年10月26日)混合，通过摇晃、揉搓5分钟混合，再通过无菌筛去除麦麸。接种后进行细菌计数，由于药材本底含菌量高(本底检测不含沙门氏菌)，采用沙门氏显色培养基(品牌：chromagar，批号：P001606)计数，结果为4.8logCFU/g。
实施例4：用10ml枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液接种35g麦麸，混合后置于麦迪康(Medicom)无菌自封袋中，于42℃干燥24小时，aw＜0.40。用5g麦麸接种载体、50g合欢皮(购于张氏中药材批发零售店，包装日期：2021年10月26日)混合，通过摇晃、揉搓5分钟混合，再通过无菌筛去除麦麸。接种后进行细菌计数(枯草芽孢杆菌与药材本底菌形态不一致，较易区分)，结果为6.0logCFU/g。
实施例5：用10ml枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液接种35g麦麸，混合后置于麦迪康(Medicom)无菌自封袋中，于42℃干燥24小时，aw＜0.40。用5g麦麸接种载体、50g穿心莲(购于济和堂养生苑，包装日期：2021年10月24日)混合，通过摇晃、揉搓5分钟混合，再通过无菌筛去除麦麸。接种后进行细菌计数(枯草芽孢杆菌与药材本底菌形态不一致，较易区分)，结果为6.1logCFU/g。
对比例1：用6ml枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种43g石英砂，混匀后立即进行细菌计数，结果为7.5logCFU/g。将接种混合物转移到无菌自封袋中，并在42℃、33℃下干燥24小时，进行菌落计数及aw测定。结果如下：
| 放置条件 | 无菌袋(42℃) | 无菌袋(33℃) |
| aw(24h) | 0.4954 | 0.6023 |
| 24h细菌计数(logCFU/g) | 6.7 | 6.8 |
相同干燥条件下，石英砂中的枯草芽孢杆菌浓度减少了0.7～0.8logCFU/g，干燥后aw分别为：0.4954、0.6023。由于枳壳等中药材水活度较低(0.45～0.60)，因此麦麸更适宜做接种载体。
对比例2：取6ml枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种43g石英砂，混匀后立即进行细菌计数，结果为7.5logCFU/g。将接种混合物转移到无菌自封袋中，并在42℃温度下干燥48小时后，使其水活度aw＜0.45。用10g上述接种载体石英砂、100g枳壳混合，通过摇晃、揉搓5分钟混合，再通过无菌筛去除石英砂。接种后进行细菌计数，结果为5.3logCFU/g。
可见，以石英砂作为接种载体，接种后要达到aw＜0.45，需要延长干燥时间到48h，并且要使枳壳达到相当的接种浓度，石英砂(10g)是麦麸(5g)用量的2倍。
Claims (10)
1.中药材的干法接种方法，其包括：
（1）将菌液与经灭菌的麦麸混合，干燥，得到接种载体；
（2）将所述接种载体与中药材混合；
（3）将所述接种载体与所述中药材分离，得到接种的中药材；
其中在步骤（1）中所述干燥为在38℃~46℃下干燥22~26h，所述菌液为枯草芽孢杆菌或乙型副伤寒沙门氏菌的菌液，所述菌液的浓度为7~12 logCFU/ml，所述菌液与所述麦麸以(8~12):(30~40) ml/g的体积重量比混合；在步骤（2）中，将经干燥的接种载体与所述中药材置于无菌袋中混合，所述接种载体与所述中药材的重量比为(1~2):20，所述中药材的水活度为0.45~0.60。
2.如权利要求1所述的干法接种方法，其中在步骤（1）中，将枯草芽孢杆菌或乙型副伤寒沙门氏菌接种到培养基中进行孵育，将所得培养物在斜面平板上培养，得到菌液。
3. 如权利要求1或2所述的干法接种方法，其中在步骤（1）中所述菌液的浓度为9~10logCFU/ml。
4. 根据权利要求1或2所述的干法接种方法，其中所述体积重量比为10:35 ml/g。
5.根据权利要求1所述的干法接种方法，其中在步骤（1）中通过将麦麸置于135℃~145℃灭菌1.5~2.5h从而得到所述灭菌的麦麸。
6.根据权利要求1所述的干法接种方法，其中在步骤（1）中所述干燥为在42℃下干燥24h。
7.如权利要求1所述的干法接种方法，其中在步骤（3）中，通过过筛将所述接种载体与所述中药材分离，得到接种的中药材。
8.如权利要求1所述的干法接种方法，其中所述中药材为果实、根茎、全草或皮类中药材。
9.如权利要求1所述的干法接种方法，其中所述中药材选自枳壳、枳实、山药、苍术、白术、穿心莲和合欢皮。
10.麦麸在制备用于如权利要求1-9中任一项所述的中药材的干法接种方法的接种载体中的用途。
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