CN100363493C - 一种Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因，其特征在于它是编码Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因。制备该基因时，首先使用PCR法筛选Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因组DNA文库并测序，初步确定嘧啶核苷磷酸化酶的基因序列；进一步在大肠杆菌中重组表达该基因、纯化重组酶并测定活性，结果表明所发明的嘧啶核苷磷酸化酶基因能编码生产重组嘧啶核苷磷酸化酶，且重组酶不仅具有磷酸化活性还具有较高转移酶活性，具有工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因和用Exiguobacterium sp.MY02菌株制备嘧啶核苷磷酸化酶基因的方法。
背景技术
近三十年来，在代谢中起着重要作用的核苷类活性物质(包括自然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物和聚合物)是当今人类治疗病毒、肿瘤、爱滋病等不可缺少的临床药物，目前已开发的核苷类抗病毒化合物已有数千种。5’-脱氧-5-氟尿苷(5’-deoxy-5-fluorouridine，5’-dFUrd)是一种良好的抗肿瘤新药，我国于1995年正式用于临床，临床效果好，市场需求量大，目前主要采用化学合成法大量生产。但是，在化学生产过程中：(1)首先需要将碱基和核糖残基的部分基团进行保护；(2)产物为多种核苷异构体和其它副产品的混合物，需要进一步分离，因此耗时费力、收率很低(约10％)；(3)对环境污染严重。所以，针对已有生产技术的缺陷，寻求新型方法满足大量合成5’-dFUrd的需要成为新的研究热点。
5-氟尿苷是合成抗癌药物5’-dFUrd的重要中间体，具有一定的抗癌活性。5-氟尿苷中的核糖在5’位上脱氧后即可得到5’-dFUrd，是一个过程比较简单的化学合成步骤。因此，如果能够建立高效、低污染的5-氟尿苷合成新技术，则建立5’-dFUrd合成新工艺的瓶颈技术问题迎刃而解。研究表明，某些嘧啶核苷磷酸化酶(pyrimidine nucleotide phosphorylase，PyNPase)可以表现为较高的转移酶活性，如：能够以5-氟尿嘧啶、尿苷等为底物，通过一步反应法催化合成5-氟尿苷。该技术反应条件温和，易于控制，且对环境污染小。因此，这种具有较高转移酶活性的嘧啶核苷磷酸化酶PyNPase，是建立5-氟尿苷、乃至5’-dFUrd合成新工艺的理想工具，它的开发具有重要的应用价值和经济价值。
但是，已报道的各类嘧啶核苷磷酸化酶的转移酶活性不高，无法满足工业化生产的需求。因此，寻找并发现新的具有较高转移酶活性的嘧啶核苷磷酸化酶及其基因资源成为解决相关问题的当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因及其制备方法。
本发明的内容是：一种嘧啶核苷磷酸化酶基因，其特征在于它是Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因，核苷酸序列为：
1 atgcgtatgg tagatttgat tgcaacaaaa cgagacggtg gcgaactcgc aacagctgat 60
61 attcaagcaa tggtagaagg attcacgaat ggtgagattc cagattacca aatgtcagcg 120
121 atgtcgatgg cgattttcta tcaaggaatg tcagatcgtg aaatcgctga tttgacgatg 180
181 gcgatggtca actcgggcga cgtgatcgac ctttcacgta tccacggtaa aaaagtcgat 240
241 aaacgctcga caggcggtgt tggtgacaag atcagtctga tcgtcgcacc gctcgttgcg 300
301 tcaatcggca ttccggttgc gaagatgagc ggtcgtggac tcggtcatac aggtggaacc 360
361 atcgacaaac tcgaagcgtt ccctggtttt gacgtcgagc tttctgaaga agcgttcgtc 420
421 tcacaagtca acgacatcaa gatggcgatc atcggtcaaa cgggtaacct gacgcctgca 480
481 gacaaaaaac tctacgcatt acgtgacgtc acggcgacgg tcaactcgat cccattgatc 540
541 gcaagttcaa tcatgtcgaa aaaaatcgca gcaggagcag acagcatcgt actcgacgtc 600
601 aagacaggtt ctggtgcctt catgaaatcg tttgaagatg caaaagcact cgcgacagag 660
661 atggtttcaa tcggtaagag tgtcaaccgt aagacggttg ctatcattac agacatggat 720
721 cagccgctcg gctttgaaat cggaaacgca aacgaagtca aggaagcgat cgaagtcctt 780
781 caagggaaag atgtccgtga cttgaaagtc atcgccttga cgattgcatc acacatggcg 840
841 gtcctcggtg atttctaccc gacattcgac gaagcatatg cggatctcga aacacgtctc 900
901 ggtaacggag cagcacttga cgtcttcaag aagttcatcg cagcgcaagg tggcgacgcg 960
961 tcactcgttg acgatatgac aaaagcactt gaaacgaaat acgaaaaaac attcgtcgct 1020
1021 tcaaaagcag gttatgtctc tgaaatcatc gctgacgaag tcggtgttgc agcaatgatc 1080
1081 ctcggtgcag gacgcgtgac gaaagcagat gagatcgatc acgcagcaag cgttacgctg 1140
1141 cacaagaaag tcggcgatcg tgtcgaagtc ggtgatgtca tcgcaacact tcgttcaaac 1200
1201 aaagatacac tcgatcaagc aatcgaaaaa atggatcacg cgtaccacat cagtgaaacg 1260
1261 aaaccggaag cacgtccgct cgtccacgct gtcattcaat aa 1302
Exiguobacterium sp.MY02菌株的“嘧啶核苷磷酸化酶基因”总长1302bp，根据原核生物的基因特征进行判断，前3个字符“atg”是该基因的起始密码子，根据三联体密码规则依次计算，最后3个字符“taa”是该基因的终止密码子。
本发明的另一内容是：一种嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法，其特征在于采取以下步骤：
(1)为克隆得到未知的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因，将该菌株在含有NaCl 0.1-0.2mol/L和牛肉膏重量浓度为0.5-1.0％的Luria-Bertani(LB)培养基中培养，温度为18-37℃，以100-150r/min的速度震荡培养至指数生长后期；
(2)按照常规方法离心得到菌体，使用浓度为10mmol/L、pH值为8.0的Tris-EDTA缓冲液重悬菌体，洗涤2遍后，同样使用该缓冲液重悬菌体并置于4℃，时间6-8h；
(3)继续加入溶菌酶至终浓度为10-150mg/mL，并震荡混匀，37℃温育1-6h；
(4)继续按照常规SDS-酚法制备高分子量基因组DNA，经过紫外光谱检测纯度，其OD260/OD280比值应大于1.8；
(5)继续以高分子量基因组DNA为材料，使用限制性核酸内切酶Sau3A I在37℃进行30-120min的不完全酶切，酶切后的总DNA经含有溴化乙啶的重量百分比为0.8％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量为5-10kb的产物区域，使用刀片切出该产物区域的凝胶，回收其中的DNA片断；
(6)在无菌条件下以限制性核酸内切酶BamH I处理商品化的人工克隆载体pUC18的多克隆位点，将其完全酶切成线性，去磷酸化处理；
(7)将回收的DNA片断与线性载体混合，加入T4 DNA连接酶在16℃连接10-14h，形成重组质粒并转化感受态细菌细胞，得到Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因组DNA文库，所说的感受态细菌细胞优选大肠杆菌，所说的转化，优选电击转化法；
(8)使用氨苄青霉素浓度为100mg/mL的Luria-Bertani液体培养基分别培养上述基因组DNA文库中的单克隆，温度为37℃，以100-150r/min的速度震荡培养至指数生长后期，分别以每个单克隆的1μL菌液为模板，使用猜测性的简并引物进行常规PCR扩增，引物序列如下：
5’-GGYGTKCCAGTKGCSAAGATG-3’
5’-GAASGCRCCSGCGACCSGTCTT-3
进行常规的PCR扩增反应，PCR反应体系与用作模板的单克隆对应编号，其中PCR反应的条件为：
94℃预变性2min，随后以94℃ 30s、55-63℃ 30s、72℃ 30s进行35个循环，最后在72℃延伸10min；
(9)将上述不同PCR反应的产物分别进行含有溴化乙啶的重量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确定在电泳结果中产物大小约400bp的PCR反应体系，根据步骤(8)所述的对应编号确定用作该PCR反应体系模板的单克隆，认为该单克隆的重组质粒中含有嘧啶核苷磷酸化酶基因，测定外源基因的核苷酸序列；
(10)通过使用BLAST软件，对上述方法所得到的基因序列与生物数据库中的信息进行基因和蛋白质的同源性比较，初步判定其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因，所说的生物学数据库优选美国的数据库。
所述嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法中，步骤(10)中所说的初步判断其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因以后，继续采取以下步骤以确认该基因具有编码嘧啶核苷磷酸化酶的功能：
(1)根据该基因的两端序列设计一对引物，其中包括和下一步骤相同的限制性核酸内切酶识别位点，以原重组质粒为模板进行常规PCR扩增，引物的序列如下：
5‘GCACCATGGTAA TGCGTATGGTAGATTTG3’(画横线处为Nco I的酶切位点)
5‘CCGTCTAGAAATTGAATGACAGC GTGGAC’3’(画横线处为Xba I的酶切位点)
PCR的反应条件为：94℃预变性2min，随后以94℃ 30s、55-63℃ 30s、72℃ 90s进行35个循环，最后在72℃延伸10min；
(2)取出PCR反应产物，经含有溴化乙啶的重量百分比为0.6-1.5％琼脂糖凝胶电泳后，用刀片在紫外灯下切割PCR扩增所产生的大小约1.3kb的DNA带，进行DNA回收；
(3)将回收得到的DNA使用Nco I和Xba I在37℃完全酶切，65℃热浴10-15min结束反应，12,000×g离心2min；同样方法处理pBAD g III/A载体；
(4)将上述DNA与pBAD g III/A载体构建重组克隆质粒，其反应体系为：回收的DNA 15μL，pMD18-T载体0.5μL，T4 DNA连接酶1-2μL，总体积30μL；将反应体系在16℃反应2-16h，形成重组质粒；
(5)将重组质粒转化感受态大肠杆菌Top 10F’，所说的重组质粒选用10μL，所说的感受态大肠杆菌选用50-150μL；
(6)将步骤(5)得到的转化产物涂布在含有氨苄青霉素50-100μg/mL的LB固体培养基上培养15-24h，挑选单菌落，在含有相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12-24h，经过碱裂解法提取其中的重组质粒；
(7)使用限制性核酸内切酶Nco I在37℃酶切重组质粒1.0-4h，65℃热浴10-15min结束反应，经含有溴化乙啶的重量百分比为0.6-1.5％琼脂糖凝胶电泳，发现酶切产物仅有1条大小大于5kb的DNA带，说明嘧啶核苷磷酸化酶基因已经正确插入该重组质粒中阿拉伯糖诱导型启动子的下游；
(8)将含有上述重组质粒的大肠杆菌Top10F’培养在LB液体培养基中，在37℃环境下振荡培养至OD600为0.6，加入L-阿拉伯糖至终浓度处于0.5-2.0mmol/L之间，继续培养3h，4℃5000×g离心30min收集菌体，重悬于12mL结合缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.8/0.5M NaCl)；
(9)将上述菌液于冰浴环境下超声破碎15min，每作用10s暂停10s；
(10)在4℃环境下12000×g离心30min去除细胞碎片，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤出液上缓冲液预平衡后的Ni离子亲和层析柱，所说Ni离子亲和层析柱优选Invitrogen公司产品；
(11)用结合缓冲液和冲洗缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)冲洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用体积为5mL和pH值分别为4～6的缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液/0.5M NaCl)进行洗脱，SDS-PAGE检测洗脱液中的蛋白质分布，合并含分子量约46kD的单一蛋白质条带的洗脱液，认为该蛋白质是上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码的重组嘧啶核苷磷酸化酶。
(12)用标准Lowry法测定上述重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂的蛋白质浓度，分装后冻存于-80℃。
所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法中，步骤(12)所说的确定重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂的蛋白质浓度以后，继续采取如下步骤以测定上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码重组嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性和转移酶活性：
(1)在干燥无菌容器中，在磷酸钾盐浓度为25-40mmol/L、β-巯基乙醇浓度为5mmol/L、EDTA浓度为1-10mmol/L、尿苷浓度为10-100mmol/L的混合液反应体系中，加入上述重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂至终浓度0.1-20μg/mL，于37-60℃环境反应下3-12h，加入1mol/L的HCl至终浓度0.1mol/L终止反应；相同操作条件下，不加上述重组酶制剂的反应体系为对照组。
(2)将反应液点于GF254硅胶板上，用二氯甲烷/四氢呋喃溶剂系统展开，在254nm紫外光下检测化合物的斑点，结果扫描成图像并进行分析，表明加入了重组嘧啶核苷磷酸化酶的上述反应体系中的底物尿苷发生了明显变化，并产生了新的化合物尿嘧啶，而对照组中的底物没有任何明显变化；认为这是重组嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性的作用结果。
(3)在干燥无菌容器中，当磷酸钾盐浓度为15-40mmol/L、尿苷/5-氟尿嘧啶比值为2.4-3.1时，加入上述重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂至终浓度0.1-10μg/mL，于50-65℃环境反应下3-12h；加入1mol/L的HCl至终浓度0.1mol/L终止反应；相同操作条件下，不加上述重组酶制剂的反应体系为对照组。
(4)将反应液点于GF254硅胶板上，用二氯甲烷/四氢呋喃溶剂系统展开，在254nm紫外光下检测化合物的斑点，结果扫描成图像后进行计算分析，表明加入了重组嘧啶核苷磷酸化酶的上述反应体系中的底物5-氟尿嘧啶和尿苷被部分转化生成了5-氟尿苷和尿嘧啶，而对照组没有任何明显变化，认为这是重组嘧啶核苷磷酸化酶的转移酶活性的作用结果。
所述的细菌Exiguobacterium sp.MY02菌株，其16S rRNA的基因序列已经被GenBank收录，收录号为DQ083948；该菌株已经于2005年10月8日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏，其地址为北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.1473。
所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法中的步骤(4)中，用常规SDS-酚法制备的Exiguobacterium sp.MY02菌株的高分子量基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，所制备的基因组DNA分子量是否大于等于21kb，如果大于等于21kb则进入下一步骤，否则应重新制备DNA，直至大于等于21kb。
所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法中，步骤(10)中所说的美国的数据库为GenBank。
本发明所说的基因和Exiguobacterium sp.255-15菌株嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因输入美国GenBank数据库进行核苷酸同源性比较，结果如下：
Query：1 atgcgtatggtagatttgattgcaacaaaacgagacggtggcgaactcgcaacagctgat 60
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Sbjct：1 atgcgtatggtagatttgattgcaacaaaacgagacggcggcgaattacagactgctgat 60
Query：61 attcaagcaatggtagaaggattcacgaatggtgagattccagattaccaaatgtcagcg 120
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Sbjct：61 attaaagcaatggttgaaggcttcacgaacggcgatattccagattatcagatgtcagca 120
Query：121 atgtcgatggcgattttctatcaaggaatgtcagatcgtgaaatcgctgatttgacgatg 180
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Sbjct：121 atgtcgatggcgattttctatcaaggcatgtcagaccgtgaaatcgcggatttaacgatg 180
Query：181 gcgatggtcaactcgggcgacgtgatcgacctttcacgtatccacggtaaaaaagtcgat 240
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Sbjct：181 gcgatggtcgagtcgggtgacgtcatcgacttgtcccgtatccacggtaaaaaagtcgac 240
Query：241 aaacgctcgacaggcggtgttggtgacaagatcagtctgatcgtcgcaccgctcgttgcg 300
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Sbjct：241 aaacactcaacaggcggcgtcggcgataaaatcagtctgatcgttgcaccactcgtcgcg 300
Query：301 tcaatcggcattccggttgcgaagatgagcggtcgtggactcggtcatacaggtggaacc 360
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Sbjct：301 tcaatcggaattcctgtcgcgaaaatgagcggacgcggtcttggtcacacaggcggaacg 360
Query：361 atcgacaaactcgaagcgttccctggttttgacgtcgagctttctgaagaagcgttcgtc 420
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Sbjct：361 atcgacaagctcgaagcgttccctggatttgatgtggaattgtcggaagaagcattcgtt 420
Query：421 tcacaagtcaacgacatcaagatggcgatcatcggtcaaacgggtaacctgacgcctgca 480
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Sbjct：421 tctcaagtcaacgacatcaagatggccatcatcggtcagacaggcaacctgacacctgcc 480
Query：481 gacaaaaaactctacgcattacgtgacgtcacggcgacggtcaactcgatcccattgatc 540
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Sbjct：481 gacaaaaaactctacgcattacgtgatgtgacagcaacggtcaactcgattccgttgatt 540
Query：541 gcaagttcaatcatgtcgnnnnnnntcgcagcaggagcagacagcatcgtactcgacgtc 600
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Sbjct：541 gcaagctcaatcatgtcgaaaaaaatcgcagccggtgctgacagtatcgtcctcgacgtg 600
Query：601 aagacaggttctggtgccttcatgaaatcgtttgaagatgcaaaagcactcgcgacagag 660
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Sbjct：601 aaaacaggttcaggcgcgttcatgaaatcatttgaagacgcgaaagcactcgcgacagaa 660
Query：661 atggtttcaatcggtaagagtgtcaaccgtaagacggttgctatcattacagacatggat 720
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Sbjct：661 atggtgtcgatcggtaaaagtgtgaaccggaagacgattgccgtcattacggacatggat 720
Query：721 cagccgctcggctttgaaatcggaaacgcaaacgaagtcaaggaagcgatcgaagtcctt 780
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Sbjct：721 cagccgctcggaaatgaaatcggaaatgcgaacgaagtcaaggaagcgattgaagtcctg 780
Query：781 caagggaaagatgtccgtgacttgaaagtcatcgccttgacgattgcatcacacatggcg 840
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Sbjct：781 caaggaaaagatgtccgtgacttgaaagtcatcgccttgacgattgcgtcacacatggca 840
Query：841 gtcctcggtgatttctacccgacattcgacgaagcatatgcggatctcgaaacacgtctc 900
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Sbjct：841 gtcctcggggagttctacccgacgtttgacgaagcgtacgcggatctcgagacacgtctc 900
Query：901 ggtaacggagcagcacttgacgtcttcaagaagttcatcgcagcgcaaggtggcgacgcg 960
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Sbjct：901 gcgaacggagcagcacttgacgtattcaagaaattcatcgcggcacaaggcggcgatgcg 960
Query：961 tcactcgttgacgatatgacaaaagcacttgaaacgaaatacgaaaaaacattcgtcgct 1020
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Sbjct：961 tcactcgtcgacgatatgacaaaagcactcgaaacgaaattcgaaaaagatttcgtcgca 1020
Query：1021 tcaaaagcaggttatgtctctgaaatcatcgctgacgaagtcggtgttgcagcaatgatc 1080
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Sbjct：1021 tcgaaagcaggatacgtttcggaaatcatcgcggatgaagtcggtgtcgcagccatgatc 1080
Query：1081 ctcggtgcaggacgcgtgacgaaagcagatgagatcgatcacgcagcaagcgttacgctg 1140
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Sbjct：1081 ctcggtgccggtcgtgcaacgaagaccgatgtcatcgatcacgcagcaagtgttaccctg 1140
Query：1141 cacaagaaagtcggcgatcgtgtcgaagtcggtgatgtcatcgcaacacttcgttcaaac 1200
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Sbjct：1141 ttcaaaaaagtcggcgataaagtcgaagtcggtgatgtcatcgcgacactccgttcgaac 1200
Query：1201 aaagatacactcgatcaagcaatcgaaaaaatggatcacgcgtaccacatcagtgaaacg 1260
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Sbjct：1201 aaagaaacactcgatcaagccatcgagaaaatggatcacgcgtatcacatcagcgagaca 1260
Query：1261 aaaccggaagcacgtccgctcgtccacgctgtcattcaataa 1302
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Sbjct：1261 aaaccggaagcacgtccgcttgtccacgctgtcattcaataa 1302
其中，Query为克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因；Sbjct为Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因。
上述比较显示，这两条基因的一致性达到86％(1128/1302)，表明所克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因不同于Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因。
本基因已经被美国GenBank数据库收录，收录号为：AY736134.
根据克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因，按照通常的三联体密码规律推测出它所编码的酶蛋白质序列，再与Exiguobacteriumsp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因进行同源性比较，结果如下：
Query：1 MRMVDLIATKRDGGELATADIQAMVEGFTNGEIPDYQMSAMSMAIFYQGMSDREIADLTM 60
MRMVDLIATKRDGGEL TADI+AMVEGFTNG+IPDYQMSAMSMAIFYQGMSDREIADLTM
Sbjct：1 MRMVDLIATKRDGGELQTADIKAMVEGFTNGDIPDYQMSAMSMAIFYQGMSDREIADLTM 60
Query：61 AMVNSGDVIDLSRIHGKKVDKRSTGGVGDKISLIVAPLVASIGIPVAKMSGRGLGHTGGT 120
AMV SGDVIDLSRIHGKKVDK STGGVGDKISLIVAPLVASIGIPVAKMSGRGLGHTGGT
Sbjct：61 AMVESGDVIDLSRIHGKKVDKHSTGGVGDKISLIVAPLVASIGIPVAKMSGRGLGHTGGT 120
Query：121 IDKLEAFPGFDVELSEEAFVSQVNDIKMAIIGQTGNLTPADKKLYALRDVTATVNSIPLI 180
IDKLEAFPGFDVELSEEAFVSQVNDIKMAIIGQTGNLTPADKKLYALRDVTATVNSIPLI
Sbjct：121 IDKLEAFPGFDVELSEEAFVSQVNDIKMAIIGQTGNLTPADKKLYALRDVTATVNSIPLI 180
Query：181 ASSIMSKKIAAGADSIVLDVKTGSGAFMKSFEDAKALATEMVSIGKSVNRKTVAIITDMD 240
ASSIMSKKIAAGADSIVLDVKTGSGAFMKSFEDAKALATEMVSIGKSVNRKT+A+ITDMD
Sbjct：181 ASSIMSKKIAAGADSIVLDVKTGSGAFMKSFEDAKALATEMVSIGKSVNRKTIAVITDMD 240
Query：241 QPLGFEIGNANEVKEAIEVLQGKDVRDLKVIALTIASHMAVLGDFYPTFDEAYADLETRL 300
QPLG EIGNANEVKEAIEVLQGKDVRDLKVIALTIASHMAVLG+FYPTFDEAYADLETRL
Sbjct：241 QPLGNEIGNANEVKEAIEVLQGKDVRDLKVIALTIASHMAVLGEFYPTFDEAYADLETRL 300
Query：301 GNGAALDVFKKFIAAQGGDASLVDDMTKALETKYEKTFVASKAGYVSEIIADEVGVAAMI 360
NGAALDVFKKFIAAQGGDASLVDDMTKALETK+EK FVASKAGYVSEIIADEVGVAAMI
Sbjct：301 ANGAALDVFKKFIAAQGGDASLVDDMTKALETKFEKDFVASKAGYVSEIIADEVGVAAMI 360
Query：361 LGAGRVTKADEIDHAASVTLHKKVGDRVEVGDVIATLRSNKDTLDQAIEKMDHAYHISET 420
LGAGR TK D IDHAASVTL KKVGD+VEVGDVIATLRSNK+TLDQAIEKMDHAYHISET
Sbjct：361 LGAGRATKTDVIDHAASVTLFKKVGDKVEVGDVIATLRSNKETLDQAIEKMDHAYHISET 420
Query：421 KPEARPLVHAVIQ 433
KPEARPLVHAVIQ
Sbjct：421 KPEARPLVHAVIQ 433
其中，Query为克隆的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因推测的氨基酸序列；Sbjct为Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因推测的氨基酸序列；相同的氨基酸以字母表示。
上述比较显示两条氨基酸序列的相似性为95％(415/433)，表明Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码的氨基酸序列不同于Sbjct为Exiguobacterium sp.255-15菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码的氨基酸序列。
将上述结构基因与表达载体连接形成重组载体，转化受体细胞，诱导表达后，纯化重组嘧啶核苷磷酸化酶，发现该基因表达的重组蛋白在聚丙烯酰胺变性凝胶电泳中分子量大约为46kD，与理论推测值相符。
嘧啶核苷磷酸化酶是嘧啶核苷补救代谢途径中的关键酶。在正磷酸存在下，这类酶能可逆地催化嘧啶核苷磷酸化为游离的碱基和核糖-1-磷酸，这些降解产物被有机体用作碳源、能源及核酸合成中的嘧啶碱基的来源。少数微生物所含有嘧啶核苷磷酸化酶可以表现为转移酶活性，如：能够以5-氟尿嘧啶、尿苷及磷酸盐缓冲液等为底物，通过一步反应法催化合成具有较强抗癌活性的化合物5-氟尿苷。因此，具有转移酶活性的嘧啶核苷磷酸化酶具有较高的潜在应用价值。
本发明所提供的嘧啶核苷磷酸化酶基因，所编码的嘧啶核苷磷酸化酶的转移酶活性高，具有工业化应用的价值，可以弥补已有的同类基因所编码嘧啶核苷磷酸化酶的转移酶活性不高的不足。
附图说明
附图1为权利要求3所述步骤(2)中所说的1.3kb的嘧啶核苷磷酸化酶基因的DNA带；
附图2为权利要求3所述步骤(11)中所说的Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码的约36kD大小的单一条带的重组嘧啶核苷磷酸化酶；
附图3为权利要求4所述步骤(2)中所说的结果扫描成的图像，其中“1”泳道是尿嘧啶的标准品的层析结果，“2”泳道是所说对照组的层析结果，“3”泳道是所说加入了重组嘧啶核苷磷酸化酶的反应体系的层析结果；
附图4为权利要求4所述步骤(4)中所说的结果扫描成的图像，其中“1”泳道是5-氟尿嘧啶标准品的层析结果，“2”泳道是尿嘧啶标准品的层析结果，“3”泳道是5-氟尿苷标准品的层析结果，“4”泳道是尿苷标准品的层析结果，“5”泳道是所说对照组的层析结果，“6”泳道是所说加入了重组嘧啶核苷磷酸化酶的反应体系的层析结果。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：嘧啶核苷磷酸化酶基因的克隆和测序
通过PCR技术对Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因组DNA文库进行筛选，克隆未知的嘧啶核苷磷酸化酶基因，具体操作为：在含NaCl重量百分浓度为1％的Luria-Bertani(LB)培养基中培养Exiguobacterium sp.MY02至对数末期，提取基因组DNA。使用Sau3A I对该基因组DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收5～8kb的片断，与用BamH I完全酶切并经去磷酸化处理的pUC18质粒片段连接。然后将连接产物按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，在LB固体培养基(含有氨苄青霉素、X-gal、IPTG)上培养。挑取白斑重组菌落，在LB液体培养基(含有氨苄青霉素)中培养后，对应每个白斑菌落进行编号，分别取1μL菌液用作模板进行PCR反应，使用特定引物对UpperA(5’ATGCGTATGGTAGATTTGAT 3’)和LowerA(5’TTATTGAATGACAGCGTGGA 3’)，条件为：94℃预变性2min，随后以94℃30s、60℃30s、72℃90s进行35个循环，最后在72℃延伸10min。PCR反应的产物经琼脂糖凝胶电泳，在1.3kb处显示有一特异条带。则根据上述编号确定含有嘧啶核苷磷酸化酶基因基因的阳性转化子。大量培养阳性转化子并使用标准碱裂解法提取重组质粒，Sanger双脱氧末端终止法测序。最终通过生物信息学分析，确定其中存在的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因的核苷酸序列，序列全长1302bp，编码一个含有433个氨基酸的蛋白质序列。
实施例2：大肠杆菌表达载体的构建
根据所得到的嘧啶核苷磷酸化酶基因序列设计上游引物(5‘GCACCATGGTAA TGCGTATGGTAGATTTG3’)和下游引物(5‘CCGTCTAGAAATTGAATGACAGCGTGGAC’)，通过PCR扩增得到嘧啶核苷磷酸化酶基因全序列。该PCR的条件为：94℃预变性2min，随后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 90s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示1.3kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，用Nco I和Xba I酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收1.3kb的DNA片断。
将大肠杆菌表达载体pBAD gIII/A同样用Nco I和Xba I酶切，琼脂糖电泳分离，回收4.1kb的DNA片段，将其与上述所得1.3kp的DNA片段连接后，按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌DH5α中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NcoI和XbaI酶切得到1.3kb和4.1kb两个片段，分别与嘧啶核苷磷酸化酶基因和表达载体pBADgIII/A大小相同，证明嘧啶核苷磷酸化酶基因pynp已经克隆到表达载体pBAD gIII/A中，将此重组质粒命名为pPNP-A。
实施例3：能高效表达嘧啶核苷磷酸化酶的大肠杆菌工程菌株的构建
将表达载体pPNP-A按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌Top10F’中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NcoI和Xba I酶切得到1.3kb和4.1kb两个片段，分别与嘧啶核苷磷酸化酶基因和表达载体pBAD gIII/A大小相同，证明获得了能高效表达嘧啶核苷磷酸化酶的大肠杆菌重组株pLyase-A/Top10F’。
实施例4：利用大肠杆菌重组株生产重组嘧啶核苷磷酸化酶
挑取大肠杆菌重组株pPNP-A/Top10F’单克隆接种在2mL含有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。按1∶50接种至100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养至OD600为0.6，加入L-阿拉伯糖至终浓度处于0.5-2.0mmol/L之间，继续培养3h，4℃5000×g离心30min收集菌体，重悬于12mL结合缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5mol/L NaCl)。将菌悬液于冰上超声破碎细胞15min，每作用10s暂停10s。4℃12000×g离心30min去除细胞碎片，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤出液上缓冲液预平衡后的PreBondTM column(Invitrogen商品)。用结合缓冲液和冲洗缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5mol/L NaCl)冲洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用5mL pH为6、4等值的缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液/0.5mol/L NaCl)进行洗脱，SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带的洗脱液。用标准Lowry法测定目的蛋白浓度，分装后冻存于-80℃。
实施例5利用重组嘧啶核苷磷酸化酶生产5-氟尿苷
在玻璃试管等容器中，当磷酸盐浓度为15-40mmol/L，尿苷/5-氟尿嘧啶比值介于2.4-3.1之间时，加入上述实施例4所得到的重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂至终浓度0.1-10μg/mL，于50-65℃环境反应下3-12h，通过高效液相仪检测并进行计算分析，转化反应生成物5-氟尿苷的最高产率为68％。
Claims (5)
1.一种嘧啶核苷磷酸化酶基因，其特征在于它是Exiguobacterium sp.MY02菌株嘧啶核苷磷酸化酶的结构基因，核苷酸序列为：
1 atgcgtatgg tagatttgat tgcaacaaaa cgagacggtg gcgaactcgc aacagctgat 60
61 attcaagcaa tggtagaagg attcacgaat ggtgagattc cagattacca aatgtcagcg 120
121 atgtcgatgg cgattttcta tcaaggaatg tcagatcgtg aaatcgctga tttgacgatg 180
181 gcgatggtca actcgggcga cgtgatcgac ctttcacgta tccacggtaa aaaagtcgat 240
241 aaacgctcga caggcggtgt tggtgacaag atcagtctga tcgtcgcacc gctcgttgcg 300
301 tcaatcggca ttccggttgc gaagatgagc ggtcgtggac tcggtcatac aggtggaacc 360
361 atcgacaaac tcgaagcgtt ccctggtttt gacgtcgagc tttctgaaga agcgttcgtc 420
421 tcacaagtca acgacatcaa gatggcgatc atcggtcaaa cgggtaacct gacgcctgca 480
481 gacaaaaaac tctacgcatt acgtgacgtc acggcgacgg tcaactcgat cccattgatc 540
541 gcaagttcaa tcatgtcgaa aaaaatcgca gcaggagcag acagcatcgt actcgacgtc 600
601 aagacaggtt ctggtgcctt catgaaatcg tttgaagatg caaaagcact cgcgacagag 660
661 atggtttcaa tcggtaagag tgtcaaccgt aagacggttg ctatcattac agacatggat 720
721 cagccgctcg gctttgaaat cggaaacgca aacgaagtca aggaagcgat cgaagtcctt 780
781 caagggaaag atgtccgtga cttgaaagtc atcgccttga cgattgcatc acacatggcg 840
841 gtcctcggtg atttctaccc gacattcgac gaagcatatg cggatctcga aacacgtctc 900
901 ggtaacggag cagcacttga cgtcttcaag aagttcatcg cagcgcaagg tggcgacgcg 960
961 tcactcgttg acgatatgac aaaagcactt gaaacgaaat acgaaaaaac attcgtcgct 1020
1021 tcaaaagcag gttatgtctc tgaaatcatc gctgacgaag tcggtgttgc agcaatgatc 1080
1081 ctcggtgcag gacgcgtgac gaaagcagat gagatcgatc acgcagcaag cgttacgctg 1140
1141 cacaagaaag tcggcgatcg tgtcgaagtc ggtgatgtca tcgcaacact tcgttcaaac 1200
1201 aaagatacac tcgatcaagc aatcgaaaaa atggatcacg cgtaccacat cagtgaaacg 1260
1261 aaaccggaag cacgtccgct cgtccacgct gtcattcaat aa 1302
Exiguobacterium sp.MY02菌株的“嘧啶核苷磷酸化酶基因”总长1302bp，根据原核生物的基因特征进行判断，前3个字符“atg”是该基因的起始密码子，根据三联体密码规则依次计算，最后3个字符“taa”是该基因的终止密码子；
Exiguobacterium sp.MY02菌株的保藏编号为：CGMCC No.1473。
2.权利要求1所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法，其特征在于采取以下步骤：
(1)为克隆得到未知的Exiguobacterium sp.MY02菌株的嘧啶核苷磷酸化酶基因，将该菌株在含有NaCl0.1-0.2mol/L和牛肉膏重量浓度为0.5-1.0％的Luria-Bertani(LB)培养基中培养，温度为18-37℃，以100-150r/min的速度震荡培养至指数生长后期；
(2)按照常规方法离心得到菌体，使用浓度为10mmol/L、pH值为8.0的Tris-EDTA缓冲液重悬菌体，洗涤2遍后，同样使用该缓冲液重悬菌体并置于4℃，时间6-8h；
(3)继续加入溶菌酶至终浓度为10-150mg/mL，并震荡混匀，37℃温育1-6h；
(4)继续按照常规SDS-酚法制备高分子量基因组DNA，经过紫外光谱检测纯度，其OD260/OD280比值应大于1.8；
(5)继续以高分子量基因组DNA为材料，使用限制性核酸内切酶Sau3A I在37℃进行30-120min的不完全酶切，酶切后的总DNA经含有溴化乙啶的重量百分比为0.8％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量为5-10kb的产物区域，使用刀片切出该产物区域的凝胶，回收其中的DNA片断；
(6)在无菌条件下以限制性核酸内切酶BamH I处理商品化的人工克隆载体pUC18的多克隆位点，将其完全酶切成线性，去磷酸化处理；
(7)将回收的DNA片断与线性载体混合，加入T4DNA连接酶在16℃连接10-14h，形成重组质粒并转化感受态细菌细胞，得到Exiguobacterium sp.MY02菌株的基因组DNA文库，所说的感受态细菌细胞是大肠杆菌，所说的转化，是电击转化法；
(8)使用氨苄青霉素浓度为100mg/mL的Luria-Bertani液体培养基分别培养上述基因组DNA文库中的单克隆，温度为37℃，以100-150r/min的速度震荡培养至指数生长后期，分别以每个单克隆的1μL菌液为模板，使用猜测性的简并引物进行常规PCR扩增，引物序列如下：
5’-GGYGTKCCAGTKGCSAAGATG-3’
5’-GAASGCRCCSGCGACCSGTCTT-3
进行常规的PCR扩增反应，PCR反应体系与用作模板的单克隆对应编号，其中PCR反应的条件为：
94℃预变性2min，随后以94℃ 30s、55-63℃ 30s、72℃ 30s进行35个循环，最后在72℃延伸10min；
(9)将上述不同PCR反应的产物分别进行含有溴化乙啶的重量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确定在电泳结果中产物大小约400bp的PCR反应体系，根据步骤(8)所述的对应编号确定用作该PCR反应体系模板的单克隆，该单克隆的重组质粒中含有嘧啶核苷磷酸化酶基因，测定外源基因的核苷酸序列；
(10)通过使用BLAST软件，对上述方法所得到的基因序列与生物数据库中的信息进行基因和蛋白质的同源性比较，初步判定其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因，所说的生物学数据库是美国的数据库GenBank。
3.如权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法，其特征在于步骤(10)中所说的初步判断其中存在的嘧啶核苷磷酸化酶基因以后，继续采取以下步骤以确认该基因具有编码嘧啶核苷磷酸化酶的功能：
(1)根据该基因的两端序列设计一对引物，其中包括和下一步骤相同的限制性核酸内切酶识别位点，以原重组质粒为模板进行常规PCR扩增，引物的序列如下：
5‘GCACCATGGTAA TGCGTATGGTAGATTTG3’(画横线处为Nco I的酶切位点)
5‘CCGTCTAGAAATTGAATGACAGC GTGGAC’3’(画横线处为Xba I的酶切位点)
PCR的反应条件为：94℃预变性2min，随后以94℃ 30s、55-63℃ 30s、72℃ 90s进行35个循环，最后在72℃延伸10min；
(2)取出PCR反应产物，经含有溴化乙啶的重量百分比为0.6-1.5％琼脂糖凝胶电泳后，用刀片在紫外灯下切割PCR扩增所产生的大小约1.3kb的DNA带，进行DNA回收；
(3)将回收得到的DNA使用Nco I和Xba I在37℃完全酶切，65℃热浴10-15min结束反应，12,000×g离心2min；同样方法处理pBAD gIII/A载体；
(4)将上述DNA与pBAD g III/A载体构建重组克隆质粒，其反应体系为：回收的DNA 15μL，pMD18-T载体0.5μL，T4DNA连接酶1-2μL，总体积30μL；将反应体系在16℃反应2-16h，形成重组质粒；
(5)将重组质粒转化感受态大肠杆菌Top 10F’，所说的重组质粒选用10μL，所说的感受态大肠杆菌选用50-150μL；
(6)将步骤(5)得到的转化产物涂布在含有氨苄青霉素50-100μg/mL的LB固体培养基上培养15-24h，挑选单菌落，在含有相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中培养12-24h，经过碱裂解法提取其中的重组质粒；
(7)使用限制性核酸内切酶Nco I在37℃酶切重组质粒1.0-4h，65℃热浴10-15min结束反应，经含有溴化乙啶的重量百分比为0.6-1.5％琼脂糖凝胶电泳，发现酶切产物仅有1条大小大于5 kb的DNA带，嘧啶核苷磷酸化酶基因已经正确插入该重组质粒中阿拉伯糖诱导型启动子的下游；
(8)将含有上述重组质粒的大肠杆菌Top10F’培养在LB液体培养基中，在37℃环境下振荡培养至OD600为0.6，加入L-阿拉伯糖至终浓度处于0.5-2.0mmol/L之间，继续培养3h，4℃ 5000×g离心30min收集菌体，重悬于12mL结合缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)；
(9)将上述菌液于冰浴环境下超声破碎15min，每作用10s暂停10s；
(10)在4℃环境下12000×g离心30min去除细胞碎片，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤出液上缓冲液预平衡后的Ni离子亲和层析柱，所说Ni离子亲和层析柱是Invitrogen公司产品；
(11)用结合缓冲液和冲洗缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)冲洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用体积为5mL和pH值分别为4～6的缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液/0.5 M NaCl)进行洗脱，SDS-PAGE检测洗脱液中的蛋白质分布，合并含分子量约46kD的单一蛋白质条带的洗脱液，该蛋白质是上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码的重组嘧啶核苷磷酸化酶。
(12)用标准Lowry法测定上述重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂的蛋白质浓度，分装后冻存于-80℃。
4.如权利要求3所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法，其特征在于在步骤(12)所说的确定重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂的蛋白质浓度以后，继续采取如下步骤以测定上述嘧啶核苷磷酸化酶基因所编码重组嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性和转移酶活性：
(1)在干燥无菌容器中，在磷酸钾盐浓度为25-40mmol/L、β-巯基乙醇浓度为5mmol/L、EDTA浓度为1-10mmol/L、尿苷浓度为10-100mmol/L的混合液反应体系中，加入上述重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂至终浓度0.1-20μg/mL，于37-60℃环境反应下3-12h，加入1mol/L的HCl至终浓度0.1mol/L终止反应；相同操作条件下，不加上述重组酶制剂的反应体系为对照组。
(2)将反应液点于GF254硅胶板上，用二氯甲烷/四氢呋喃溶剂系统展开，在254nm紫外光下检测化合物的斑点，结果扫描成图像并进行分析，表明加入了重组嘧啶核苷磷酸化酶的上述反应体系中的底物尿苷发生了明显变化，并产生了新的化合物尿嘧啶，而对照组中的底物没有任何明显变化；这是重组嘧啶核苷磷酸化酶的磷酸化活性的作用结果。
(3)在干燥无菌容器中，当磷酸钾盐浓度为15-40mmol/L、尿苷/5-氟尿嘧啶比值为2.4-3.1时，加入上述重组嘧啶核苷磷酸化酶制剂至终浓度0.1-10μg/mL，于50-65℃环境反应下3-12h；加入1mol/L的HCl至终浓度0.1mol/L终止反应；相同操作条件下，不加上述重组酶制剂的反应体系为对照组。
(4)将反应液点于GF254硅胶板上，用二氯甲烷/四氢呋喃溶剂系统展开，在254nm紫外光下检测化合物的斑点，结果扫描成图像后进行计算分析，表明加入了重组嘧啶核苷磷酸化酶的上述反应体系中的底物5-氟尿嘧啶和尿苷被部分转化生成了5-氟尿苷和尿嘧啶，而对照组没有任何明显变化，这是重组嘧啶核苷磷酸化酶的转移酶活性的作用结果。
5.如权利要求2所述的嘧啶核苷磷酸化酶基因的制备方法，其特征在于步骤(4)中，用常规SDS-酚法制备的Exiguobacterium sp.MY02菌株的高分子量基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，所制备的基因组DNA分子量是否大于等于21kb，如果大于等于21kb则进入下一步骤，否则应重新制备DNA，直至大于等于21kb。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20080123 Termination date: 20091109 |