CN105255846A - 一种工程化有机磷水解酶、核酸和突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种工程化有机磷水解酶、核酸和突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的工程化有机磷水解酶，是如SEQ？ID？No.1所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸残基中的一位或者多位经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的活性提高的有机磷水解酶突变体。与现有技术相比，本发明中的有机磷水解酶突变体对马拉硫磷的催化活性提高了36.7倍，同时该突变体保持了母本优良的热稳定性，50℃半衰期达65h。本发明中的有机磷水解酶突变体能够高效降解马拉硫磷等常见有机磷农药，热稳定性佳，在降解有机磷农药领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种有机磷水解酶、突变体及其编码基因，以及该有机磷水解酶及其突变体在有机磷农药降解中的应用。
背景技术
我国是农药生产和使用大国。全国约有2000多家农药生产企业，生产农药种类超过200种。有机磷农药具有价格低廉、高效、广谱等特点，是广泛生产、应用的杀虫剂，占据世界杀虫剂市场38％的份额。2010年国内农药总产量为226.22万吨，其中有机磷农药产品占到总量的80％。在我国，农药年使用量高达80-100万吨，居世界首位。尽管有机磷农药有效防治了农作物病虫害，显著提高了农作物的产量，但长期和大量的使用给食品安全以及生态环境带来了许多负面的影响。2012年，对9个品牌18种国内常见的中档茶叶调查发现所有样品均有多种农药残留。农田喷洒的农药除了少量被农作物吸收，大量农药聚集在土壤中，并通过降雨、排水等途径进入大气和湖泊，造成土壤、大气污染和水体生态的严重破坏。对硫磷、甲基对硫磷、内吸磷、马拉硫磷、乐果、毒死蜱等有机磷农药是我国生活饮用水的农药检测项目。据统计，我国被农药污染的土壤已达1300-1600万公顷，经济损失超过十亿元，农药的污染已经十分严重，降解高毒有机磷农药的工作刻不容缓。其中，以微生物或酶制剂为代表的生物降解和修复技术由于其高效率、低成本和环境友好等特点，显示出广阔的前景。
根据农业部禁用高毒农药的1586号公告，我国自2011年10月31日起，全面停止包括甲基对硫磷、苯线磷、地虫硫磷、甲基硫环磷、硫线磷、蝇毒磷、治螟磷、特丁硫磷等在内的高毒有机磷农药的生产，并在2013年10月31日起停止其销售和使用。因此，毒性相对较小的马拉硫磷、乐果、杀螟硫磷等农药的生产量与使用量日益增长，成为广泛使用的有机磷类农药。其中马拉硫磷也是目前美国使用量最大的有机磷农药，适用于防治烟草、茶、蔬菜、棉花和谷物等作物上的害虫，也可作为室内杀虫剂防治仓库害虫，使用范围广泛。尽管毒性相对较低，但接触后仍可造成严重的中毒反应，例如呼吸困难、肺水肿，肌痉挛以及中枢神经系统紊乱，表现为头痛、乏力、抽搐、昏迷或脑水肿。目前发现的微生物来源的有机磷水解酶包括两大类：磷酸三酯酶(PTE)，属于酰胺水解酶超家族；甲基对硫磷水解酶(MPH)和有机磷水解酶C2(OPHC2)，属于β-内酰胺酶超家族。然而，上述有机磷水解酶对常用农药马拉硫磷的降解活性很低。例如，属于内酰胺酶超家族的有机磷水解酶PoOPH，经过突变改造后，其双突变体PoOPHM2对禁用农药甲基对硫磷的活力高达56.8U/mg，但其对目前常用农药马拉硫磷的活力却不足1U/mg。因此，利用理性的进化分析和蛋白质工程手段，开发具有高活性、高稳定性的有机磷水解酶突变体，用于降解目前常用的有机磷农药，进而降低农作物及土壤的农药残留问题，具有较大的实际应用价值。
发明内容
为了克服上述已知有机磷水解酶对常用有机磷农药马拉硫磷性能欠佳的问题，本发明对已知有机磷水解酶进行基因突变改造以提高有机磷水解酶的活性，同时保留良好的热稳定性，进而提供一种工程化有机磷水解酶、其编码基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体及其制备方法，以及突变体蛋白在降解有机磷农药中的应用技术。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明采取的技术方案之一是：
一种工程化有机磷水解酶，所述的工程化有机磷水解酶是如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的有机磷水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸残基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成且对马拉硫磷水解活性提高的工程化有机磷水解酶。
所述工程化有机磷水解酶的制备可以是从表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以是人工合成获得。由SEQIDNo.1所示氨基酸序列所构成的有机磷水解酶是申请人自己保藏的有机磷水解酶突变体，命名为PoOPHM2，并且在申请号为201410167955.6的中国专利中有公开。该蛋白质对甲基对硫磷具有很高的有机磷水解酶活性，比活力为56.8U/mg，T50值为76.8℃，具有很好的热稳定性，但其对常用农药马拉硫磷的水解活力仅为0.95U/mg。
为了提高PoOPHM2蛋白对马拉硫磷的水解活性，我们通过对PoOPHM2进行序列和构效分析，利用多种蛋白质工程改造技术，组合有益突变，从中筛选对马拉硫磷水解活性提高、同时保持酶的高热稳定性的工程化有机磷水解酶。
其中所述工程化有机磷水解酶较佳的情况是：对SEQIDNo.1所示氨基酸序列的第1、14、55、57、68、83、87、88、114、137、177、187、188、203、248、262、267、318位氨基酸残基中的一个或者多个位点进行氨基酸替换后的形成的新氨基酸序列对应的水解酶。
所述工程化有机磷水解酶更佳的情况是：对SEQIDNo.1所示氨基酸序列的有机磷水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位和第262位氨基酸残基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换形成的新氨基酸序列对应的水解酶。
所述工程化有机磷水解酶最佳的情况是：同时对SEQIDNo.1所示氨基酸序列的有机磷水解酶的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位和第262位氨基酸残基经过氨基酸替换的新氨基酸序列对应的水解酶。
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的各位氨基酸残基的替换具体如下：
所述氨基酸序列的第1位的甲硫氨酸突变为精氨酸(M1R)；
所述氨基酸序列的第14位的甲硫氨酸突变为亮氨酸(M14L)；
所述氨基酸序列中的第55位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V55I)、亮氨酸(V55L)或丝氨酸(V55S)，其中更佳的是突变为异亮氨酸(V55I)；
所述氨基酸序列中的第57位的亮氨酸突变为甘氨酸(L57G)或异亮氨酸(L57I)，其中更佳的是突变为甘氨酸(L57G)；
所述氨基酸序列的第68位的赖氨酸突变为谷氨酸(K68E)；
所述氨基酸序列的第83位的赖氨酸突变为甘氨酸(K83G)；
所述氨基酸序列的第87位的苏氨酸突变为丙氨酸(T87A)；
所述氨基酸序列的第88位的丙氨酸突变为脯氨酸(A88P)；
所述氨基酸序列的第114位的苏氨酸突变为丙氨酸(T114A)；
所述氨基酸序列的第137位的亮氨酸突变为异亮氨酸(L137I)；
所述氨基酸序列的第177位的苏氨酸突变为丙氨酸(T177A)；
所述氨基酸序列的第187位的甘氨酸突变为异亮氨酸(G187I)；
所述氨基酸序列的第188位的甲硫氨酸突变为苯丙氨酸(M188F)；
所述氨基酸序列的第203位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(N203D)；
所述氨基酸序列的第248位的异亮氨酸突变为苏氨酸(I248T)；
所述氨基酸序列的第262位的缬氨酸突变为丙氨酸(V262A)或甘氨酸(V262G)，其中更佳的是突变为丙氨酸(V262A)；
所述氨基酸序列的第267位的谷氨酰胺突变为精氨酸(Q274R)；
所述氨基酸序列的第318位的丝氨酸突变为甘氨酸(S318G)。
本发明采取的技术方案之二是：
一种分离的核酸，所述核酸是编码上述工程化有机磷水解酶的核酸分子。
本发明所述的核酸的制备方法较佳为：可以从含编码表达所述蛋白的氨基酸序列的表达质粒或重组转化体中分离获得，也可以通过全基因序列人工合成获得。
如本领域技术人员所知：由于密码子的简并性，编码所述工程化有机磷水解酶的碱基序列不仅限于一种，还可以适当引入替换来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换来制得。
本发明采取的技术方案之三是：
一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达质粒。
其可通过本领域常规方法制备，即将编码本发明所述的工程化有机磷水解酶的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种质粒，优选质粒pET-28a(+)。
本发明采取的技术方案之四是：
一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化体。
其可通过将上述重组表达质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的基因可被有效表达即可。较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。其中所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法，电转法等，较佳地为热激法。
本发明采取的技术方案之五是：
一种重组工程化有机磷水解酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组工程化有机磷水解酶。
其中所述的制备方法可采用本领域常规的培养方法。对于重组大肠杆菌转化体，较佳地为：将上述重组表达转化体接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，30～40℃，150～200rpm培养，培养液的光密度OD600达到0.5～1.0(较佳地为0.8)，加入0.05～1.0mM(较佳地为0.2mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～37℃(优选16℃)，诱导8～24小时即可得到高效表达的重组工程化有机磷水解酶。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：针对目前有机磷水解酶难以高效水解常用农药马拉硫磷的问题，以有机磷水解酶突变体PoOPHM2作为蛋白质工程改造的起点，通过多种蛋白质工程改造技术，组合有益突变位点，获得马拉硫磷水解活力显著提高的工程化有机磷水解酶，其最优突变体PoOPHM9(V55I/L57G/K83G/T114A/L137I/M188F/V262A)对马拉硫磷的活力达34.9U/mg，该突变体同时拥有极佳的热稳定性，T50值为67.6℃，50℃半衰期长达64.8h。进化得到的工程化有机磷水解酶同时具有高的有机磷水解活性和热稳定性，应用潜力巨大，具有很好的实际应用价值。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步阐明本发明的应用方法和有益效果。这些实施例仅用于例证的目的，并不因此限制本发明的保护范围。
下列实施例中的菌种、试剂和材料来源：
有机磷水解酶突变体基因PoOPHM2(见申请号为201410167955.6的中国专利)，与表达载体pET-28a(+)连接组成重组表达质粒pET28a-PoOPHM2自行保藏。
表达质粒pET-28a(+)购自上海Novagen公司。
E.coliDH5α感受态细胞、E.coliBL21(DE3)感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
基因工程酶SacI、HindIII、DpnI、DNaseI、T4-ligase购自大连宝生物工程有限公司。
DNA聚合酶Taq酶购自大连宝生物工程有限公司，KOD-plus酶购自上海TOYOBO公司。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。
实施例1
有机磷水解酶的定点饱和突变改造
本实施例采用活性位点盒式突变(CASTing)手段改造有机磷水解酶，选取发明人保藏的质粒pET28a-PoOPHM2，进行CASTing突变，改造蛋白质活性口袋氨基酸。根据蛋白质结构信息，选择Val55，Leu57，Leu62，Thr87，Val89，Phe111，Leu115，Trp172，Met188，Ile250，Trp263，Phe265进行定点饱和突变。
设计定点饱和突变引物，如表1所示。
表1.定点饱和突变引物表
其中，N代表A、C、G、T四种碱基中的任意一种，M代表T、G两种碱基中的任意一种，K代表A、C两种碱基中的任意一种，D代表A、G、T三种碱基中的任意一种，H代表A、C、T三种碱基中的任意一种。
以含有PoOPHM2基因的重组表达质粒为模板，进行全质粒PCR定点突变。
所述全质粒PCR定点突变反应体系为：重组质粒模板25ng，10×Buffer2.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，一对点突变引物(10pmol/μl)各0.75μl，KOD-plus-酶0.5U，蒸馏水补足至25μl。PCR扩增程序为：(1)94℃2min；(2)98℃10sec；(3)55℃30sec；(4)68℃7min；步骤(2)～(4)进行12个循环。
扩增得到的PCR产物加入DpnI酶，37℃消化2h。消化后产物转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB固体培养基(含50μg/ml卡那霉素)上，即得相应位点的饱和突变库。
在96孔深孔培养板中，将所得的重组表达菌株单克隆分别接种于600μl含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600达到0.8，加入终浓度为0.4mM的IPTG，16℃诱导表达20h。6000×g离心10min收集菌体，加入B-PER溶菌酶缓冲液(ThermoScientific)，6000×g离心30min，取上清，即为突变体蛋白粗酶液。
取20μl酶液加入180μl含有终浓度0.5mM马拉硫磷和2mMEllman试剂的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中，30℃条件下反应，在412nm处检测吸光值的变化率。计算母本及其突变体对马拉硫磷的水解活性。一个酶活单位(U)定义为在反应条件下每分钟释放1μmol水解产物硫醇所需的酶量。
突变体筛选结果如表2所示。
表2CASTing突变库筛选结果
| 氨基酸差异(相对于SEQIDNo.1) | 相对活力(％) |
| 无 | 100 |
| M188F | 115 |
| V55S/L57I | 116 |
| L57G | 179 |
| V55L/L57G | 180 |
| V55I/L57G | 242 |
| L57G/M188F | 408 |
| V55I/L57G/M188F | 812 |
7个突变体表现出明显的活力提高，其中三突变体V55I/L57G/M188F对马拉硫磷的活力提高了8倍，命名为PoOPHM5，作为下一轮易错PCR突变库的母本。
实施例2
有机磷水解酶的定点饱和突变改造
本实施例采用易错PCR(epPCR)技术对CASTing获得的突变体PoOPHM5进行全序列随机突变，改造有机磷水解酶。
设计基因克隆引物如下：
PoOPH-F：5'-GAATTCGAGCTCATGCGTCTTTTCTCG-3'
PoOPH-R：5'-CCCAAGCTTGGCGGTCGCTACGGA-3'
其中，上游引物PoOPH-F的下划线部分为SacI酶切位点，下游引物PoOPH-R的下划线部分为HindIII酶切位点。
以含有PoOPHM5基因序列的pET28a-PoOPHM5质粒为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：模板25ng，上下游引物(10pmol/μl)各1μl，2×TaqMix12.5μl，150μMMnCl2，ddH2O补足至25μl。PCR扩增程序为：(1)95℃2min；(2)94℃30sec；(3)55℃30sec；(4)72℃1min；步骤(2)～(4)进行30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收唯一的目标条带，将所得的PoOPHM5随机突变基因DNA片段和pET-28a(+)空载质粒分别用限制性内切酶SacI和HindIII在37℃双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。在T4DNA连接酶的作用下，酶切纯化后的突变基因DNA片段和pET-28a(+)片段在4℃连接12h，得到重组表达质粒。
突变体重组转化体构建方法和活力筛选方法与构建CASTing突变库的方法相同。
易错PCR突变库筛选结果如表3所示。
表3易错PCR突变库筛选结果
| 氨基酸差异(相对于SEQIDNo.1) | 相对活力(％) |
| V55I/L57G/M188F | 100 |
| V55I/L57G/T87A/M188F | 121 |
| V55I/L57G/T177A/M188F | 133 |
| V55I/L57G/T114A/M188F | 144 |
| V55I/L57G/M188F/V262G | 158 |
| V55I/L57G/L137I/M188F | 160 |
| V55I/L57G/M188F/N203D/S318G | 163 |
| M1R/M14L/K68EV55I/L57G/M188F | 174 |
| V55I/L57G/T114A/M188F/Q274R | 178 |
| V55I/L57G/M188F/I248T | 193 |
| V55I/L57G/M188F/V262A | 208 |
10个突变体表现出比PoOPHM5更高的活性，其中V262A突变体的活力比PoOPHM5进一步提高了两倍，命名为PoOPHM6，作为下轮DNA重排突变库的母本。
实施例3
有机磷水解酶的DNA重组改造
利用DNA重排技术，将易错PCR突变库中得到的优势突变体进行随机组合，合并有益突变。将上述易错PCR突变库中得到的所有优势突变体基因混合后作为模板，进行基因克隆，克隆引物与易错PCR相同。PCR反应体系为：混合重组质粒模板25ng，10×Buffer2.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，一对克隆引物(10pmol/μl)各0.75μl，KOD-plus-酶0.5U，蒸馏水补足至25μl。PCR扩增程序为：(1)94℃2min；(2)98℃10sec；(3)55℃30sec；(4)68℃1min；步骤(2)～(4)进行25个循环。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收唯一的目标条带，将所得的混合突变体基因浓缩至200ng/μl，利用DNaseI进行随机切断，酶切体系如下：100mMTris·Cl,10mMMnCl2,20μgDNA和0.1UDNaseI，蒸馏水补足至200μl。37℃保温2min后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收50–250bp大小的基因片段，以此为模板PCR自组装，本步骤无外加引物。PCR反应体系为：基因短片段模板25ng，10×Buffer2.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，，KOD-plus-酶0.5U，蒸馏水补足至25μl。PCR扩增程序为：(1)94℃2min；(2)98℃10sec；(3)55℃30sec；(4)68℃1min；步骤(2)～(4)进行45个循环。扩增得到的PCR产物稀释200倍后作为巢式PCR的模板，克隆引物与易错PCR相同。PCR反应体系为：模板，10×Buffer2.5μl，dNTPs(2mM)2.5μl，，一对克隆引物(10pmol/μl)各0.75μl，KOD-plus-酶0.5U，蒸馏水补足至25μl。PCR扩增程序为：(1)94℃2min；(2)98℃10sec；(3)55℃30sec；(4)68℃1min；步骤(2)～(4)进行30个循环。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收唯一的目标条带，得到DNA重排突变基因库，进行克隆、表达和筛选，方法与易错PCR突变库相同。
DNA重排突变库筛选结果如表4所示。其中S22A7突变体对马拉硫磷的活力最高，为母本PoOPHM2的33.5倍，命名为PoOPHM8。
表4.DNA重排突变库筛选结果
实施例4
热稳定有机磷水解酶突变体的制备以及热稳定性测定
PoOPHM8的热稳定性相较于母本PoOPHM2发生了显著下降。利用FoldX软件进行理性设计，制备相应的PoOPHM8突变体，对得到的突变体进行活力和热稳定性筛选。热稳定性测定筛选方法如下：破碎上清在65℃保温15min，在30℃测定残余活力，对其进行比较。
筛选结果如表5所示。其中，K83G突变体的稳定性获得提高，同时保留了原有突变体的活力，命名为PoOPHM9。
表5.热稳定性理性设计突变体筛选结果
对所得到的突变体进行纯化，使用Ni亲和层析柱(GE公司HisTrapTMFF柱，5mL)纯化突变体蛋白，具体方法如下：
(1)用5倍床层体积的Tris-HCl缓冲液(20mM,pH8.0，含0.5MNaCl和20mM咪唑)平衡Ni层析柱；
(2)将实施例2中所得的粗酶液以1ml/min流速通过Ni层析柱；
(3)用5倍床层体积的20mMpH8.0Tris-HCl缓冲液(含0.5MNaCl和20mM咪唑)洗脱非特异结合的杂蛋白；
(4)用5倍床层体积的20mMpH8.0Tris-HCl缓冲液(含0.5MNaCl和0.5M咪唑)洗脱特异结合的目的蛋白。
测定所得到的突变体的动力学参数和热稳定性，结果如表6所示。其中PoOPHM9的活力获得显著提高，同时保持了优良的热稳定性。
表6.有机磷水解酶突变体活性和热稳定性表征
PoOPHM9的T50值为67.6℃，50℃时的半衰期高达64.8h。T50显著高于目前其他具有高有机磷水解活性的酶，包括MPH和PTE(T50值分别为48℃和62℃)。
实施例5
突变体PoOPHM9对于其他几种常用有机磷农药的水解活性
为评价PoOPHM9用于多种有机磷农药降解的效能，测定了PoOPHM9纯酶对甲基对硫磷、杀螟硫磷、二嗪磷和乐果的催化水解活性，见表7。
表7.PoOPHM9纯酶对于部分有机磷农药的水解活性
其中，对甲基对硫磷的反应条件为：取100μl酶液加入900μl含有0.5mM甲基对硫磷的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中，30℃条件下反应，在405nm处检测吸光值的变化率。
对于杀螟硫磷的反应条件为：890μlTris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中加入10μl杀螟硫磷母液(25mM)以及100μl酶液，30℃条件下反应，在358nm处检测吸光值的变化率。
对二嗪磷的反应条件为：890μlTris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0)中加入10μl二嗪磷母液(25mM)以及100μl酶液，30℃条件下反应，在228nm处检测吸光值的变化率。
对于乐果的反应条件为：890μlTris-HCl缓冲液(50mM,pH9.0，含终浓度2mM的Ellman’sreagent)中加入10μl乐果母液(100mM)以及100μl酶液，30℃条件下反应，在412nm处检测吸光值的变化率。
综上，突变体PoOPHM9对所测试的有机磷农药均能降解，对甲基对硫磷、杀螟硫磷、二嗪磷、乐果表现出了非常好的降解效果。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种工程化有机磷水解酶，其特征在于，如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸残基中的一个或者多个位点经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的活性提高的有机磷水解酶突变体。
2.根据权利要求1所述的一种工程化有机磷水解酶，其特征在于，为由如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的第55位、第57位、第83位、第114位、第137位、第188位或第262位氨基酸残基同时经过氨基酸替换后形成的新氨基酸序列组成的有机磷水解酶突变体。
3.根据权利要求1或2所述的一种工程化有机磷水解酶，其特征在于，
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第55位的缬氨酸替换为异亮氨酸、亮氨酸或丝氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第57位亮氨酸替换为甘氨酸或异亮氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第83位赖氨酸替换为甘氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第114位苏氨酸替换为丙氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第137位亮氨酸替换为异亮氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第188位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第262位缬氨酸替换为丙氨酸或甘氨酸。
4.根据权利要求3所述的一种工程化有机磷水解酶，其特征在于，
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第55位的缬氨酸替换为异亮氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第57位亮氨酸替换为甘氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第83位赖氨酸替换为甘氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第114位苏氨酸替换为丙氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第137位亮氨酸替换为异亮氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第188位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸；
如SEQIDNo.1所示氨基酸序列中的第262位缬氨酸替换为丙氨酸。
5.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述工程化有机磷水解酶的核酸分子。
6.一种包含如权利要求5所述核酸的重组表达质粒。
7.一种包含如权利要求6所述重组表达质粒的重组表达转化体。
8.一种重组工程化有机磷水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：培养如权利要求7所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组工程化有机磷水解酶。
9.如权利要求1所述的工程化有机磷水解酶在降解有机磷农药中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的有机磷农药包括甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、二嗪磷或乐果。
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