CN103509837B - 一种酶法复合化学法制备卡培他滨中间体2’，3’-二-o-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适合实际的工业化大生产和具有较高的收率、质量和良好的稳定性的卡培他滨中间体2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的制备方法。该卡培他滨中间体的制备方法包括：创新性地使用酶催化剂嘧啶核苷磷酸化酶（EC2.4.2.2）将底物5-氟-胞嘧啶（5-fluorocytosine）与5-脱氧核糖-1-磷酸（5-deoxyribose-1-phosphate）转化成5’-脱氧-5-氟-胞苷，5’-脱氧-5-氟-胞苷再经乙酰化反应得到2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷，？该方法收率高，质量好，符合环保要求，工艺简单易于操作。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域。具体涉及卡培他滨中间体2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的制备方法。
背景技术
卡培他滨（capecitabine）的化学名是5’-脱氧-5-氟-N4-戊氧羰基胞苷，即5’-deoxy-5-fluoro-N4-(pentyloxycarbony)cytidine。
2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷是制备抗肿瘤药物卡培他滨的重要中间体原料。其结构式如下：
目前文献及专利报道的卡培他滨中间体2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的合成路线主要有以下三种，先列举如下：
参考文献：Bioorganic＆MedicinalChemistry8(2000):1697-1706
参考文献：EP0602454
参考文献：中国医药工业杂志，2008,39（5）,328-329
以上三种方法是目前较常采用的，方法一、二、采用的催化剂为三甲基氯硅烷及HMDS和四氯化锡，其制备收率较低，只有50%左右，且质量低，难以直接结晶纯化得到符合要求的目标产物，需要通过硅胶层析纯化后方可结晶纯化得到98%以上的目标产物，收率大大降低，使得卡培他滨的生产成本难以降低。方法三的5’-脱氧-5-氟胞苷制备方法较繁琐复杂，不适合目前国内的实际生产条件，而且生产成本高。而且以上三种方法都不符合环保要求，因此需要找寻一种能提高收率和质量，降低成本、符合环保要求的中间体2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的新制备方法。
发明内容
本发明提供一种酶法复合化学法制备卡培他滨中间体2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的方法，该卡培他滨中间体的制备方法包括：创新性地使用酶催化剂嘧啶核苷磷酸化酶（EC2.4.2.2）将底物5-氟-胞嘧啶（5-fluorocytosine）与5-脱氧核糖-1-磷酸（5-deoxyribose-1-phosphate）转化成5’-脱氧-5-氟-胞苷，5’-脱氧-5-氟-胞苷再经乙酰化反应得到2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷，该方法副产物少，反应条件温和，易于控制，符合环保要求，产品得率与纯度高。
本发明的技术方案如下：
一种2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的制备方法，其特征在于：以5-氟胞嘧啶和5-脱氧核糖-1-磷酸为原料，以嘧啶核苷磷酸化酶（EC2.4.2.2）为催化剂，酶化得到5’-脱氧-5-氟-胞苷，5’-脱氧-5-氟-胞苷无水溶剂中制备得到目标产物2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷。
所述的2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷的制备方法，其特征在于如下进行步骤：将5-脱氧核糖-1-磷酸与5-氟-胞嘧啶加入到Tris-HCl缓冲液(pH5-10)中，加入10-90单位/ml的嘧啶核苷磷酸化酶，0.5-2倍的CaCl2或CaSO4，于10℃-60℃反应12小时。反应结束后过滤掉白色沉淀，将滤液减压浓缩干，残留物溶于甲醇，无水硫酸钠干燥脱水，过滤，滤液再滴加异丙醚，析出固体，过滤干燥即得5’-脱氧-5-氟-胞苷。再将5’-脱氧-5-氟-胞苷溶于无水吡啶中，低温下加入醋酐，反应完全后，减压蒸去溶剂，经萃取洗涤，萃取液干燥并浓缩干，然后在异丙醇中结晶即得到2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释。
实施例1
在10mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,25单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，28℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.8mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率96%，HPLC99.4%）。mp192～193℃（文献：192～194℃）。HNMR(DMSO-d6)δ：1.276（d，3H，H-11），3.644（m，1H，H-3），3.809（m，1H，H-4），3.992（m，1H，H-2），4.980（d，1H，H-10），5.277（d，1H，H-9），5.677（s，1H，H-1）7.559（s，J=7.0Hz，1H，H-8），7.753（m，2H，H-12）。
实施例2
在5mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,25单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，28℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.6mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率92%,HPLC99.2%）。
实施例3
在100mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,25单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，28℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.7mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率94%,HPLC99.5%）。
实施例4
在10mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,10单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，28℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.5mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率90%,HPLC99.0%）。
实施例5
在10mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,50单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，28℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.8mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率96%,HPLC99.3%）。
实施例6
在10mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,25单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，10℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.5mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率90%,HPLC99.1%）。
实施例7
在10mL的10mMTris-HCl反应缓冲液(pH7.2)中加入5mM5’-脱氧核糖-1-磷酸与5mM5-氟-胞嘧啶,25单位/mL嘧啶核苷磷酸化酶，5mMCaCl2，60℃反应12小时。反应结束后可见反应器底部具有白色沉淀。过滤掉白色沉淀，滤液于55℃减压浓缩干，所得残留物溶于5ml甲醇中，加入2g无水硫酸钠干燥，过滤，滤液搅拌下滴加5ml异丙醚，2h后过滤，固体与40℃真空干燥4小时，即得4.6mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷（收率92%,HPLC99.1%）。
实施例8
将5mM的5’-脱氧-5-氟-胞苷溶于2,5ml的无水吡啶中，冷却至0℃左右，搅拌下将30ml醋酐滴入到反应液当中，0℃左右反应3h。减压除去溶剂后，将残余物在乙酸乙酯和冰水之间分配。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，过滤，滤液减压浓缩干，残余物在异丙醇中重结晶，得到3.5mM的2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷。（收率70%,HPLC99.1%）HNMR(DMSO-d6)δ：1.321（d，3H，H-11），2.040（d，6H，H-13＆14），4.008（m，1H，H-4），5.071（m，1H，H-3），5.411（m，1H，H-2），5.751（d，1H，H-1），7.695（s，1H，H-8），7.971（m，2H，H-12）。
比较例1
按参考文献：Bioorganic＆MedicinalChemistry8(2000):1697-1706中的方法实施
在0℃，将碘化钠（3.6g）和三甲基氯硅烷（0.794ml）加入到无水乙腈（15ml）中，此溶液与分子筛4A（200mg）一起搅拌5分钟（在搅拌过程中无色氯化钠沉积出来）。加入1，2，3-三-O-乙酰基-5-脱氧核糖（2.0g）并在0℃将该混合物搅拌30分钟。然后在0℃加入5ml无水乙腈中的由5-氟胞嘧啶（1.12g）新制备的三甲基氯硅烷化的5-氟胞嘧啶溶液，并在室温连续搅拌3小时。过滤该混合物，真空浓缩滤液，并将残余物在二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液之间分配。用二氯甲烷/甲醇（10/1）萃取水层。用无水硫酸钠干燥合并的有机层并减压蒸发。残余物经硅胶柱色谱（二氯甲烷/甲醇=15/1作为洗脱剂）纯化，然后在异丙醇中重结晶，得到2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷（1.24g，50.2%），HPLC:99.2%。
比较例2
按参考文献：EP0602454中的方法实施
5-氟胞嘧啶（1.32g，10.0mmol）悬浮于无水甲苯（25ml）中，加入HMDS（2.40ml,11.0mmol），加热回流反应3h。60℃以下减压浓缩至干，剩余物中加入5-脱氧三乙酰核糖（2.4g,9.0mmol）和无水1,2-二氯乙烷（20ml），-5℃下滴加无水四氯化锡（1.2ml,9.5mmol）的无水1，2-二氯乙烷(5ml)溶液，滴毕于0℃反应2h。依次加入碳酸氢钠（2.6g,30.0mmol）和水（2.0ml），室温搅拌5h。过滤，滤饼用1，2－二氯乙烷洗涤，合并滤液和洗液，用5％碳酸氢钠溶液(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至干，残余物经硅胶柱色谱（二氯甲烷/甲醇=15/1作为洗脱剂）纯化，洗脱液浓缩至干，剩余类白色泡沫状固体用异丙醇重结晶，得白色晶体2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷（1.44g,48.7％），HPLC:99.3%。
比较例3
按参考文献：中国医药工业杂志，2008,39（5）,328-329中的方法实施
将2.6g的5-氟胞嘧啶加入到40ml1,2-二氯乙烷中，氮气保护下加入6ml苯甲酰氯，搅拌加热回流1h，缓慢滴加7ml三乙胺，滴完后回流5h，冷至10℃，过滤，向滤液中加入5.7g的5-脱氧三乙酰核糖，氮气保护下，冷却至10℃，滴加4ml四氯化钛，滴完后，缓慢升至室温，搅拌反应过夜。将反应液倒入100ml冰水中，加入50ml氯仿，萃取分层，有机层水洗，再无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩干，残留物经硅胶柱层析，得到白色固体。将所得固体溶于5ml的无水吡啶中，冷却至0℃左右，搅拌下将50ml醋酐滴入到反应液当中，0℃左右反应3h。减压除去溶剂后，将残余物在乙酸乙酯和冰水之间分配。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，过滤，滤液减压浓缩干，残余物在异丙醇中重结晶，2’，3’-二-O-乙酰基-5’-脱氧-5-氟胞苷。（1.45g，29.4%）HPLC:99.6%。
实验结果
实施例1-8比较了部分的不同参数投料下的实验效果，结果表明在所有的参数投料下，该反应都具有很好的收率，基本能达到60%以上。相较于比较例1-3方法，由于原料以及催化剂的不同，比较例1-3中的目标产物收率，普遍在50%左右甚至更低，因此催化剂嘧啶核苷磷酸化酶（EC2.4.2.2）在本方法的应用，极大地提高了目标产物收率，明显降低了抗肿瘤药物卡培他滨的成本，使其具有非常大的市场竞争力。
此外，根据实施例1-8和比较例1-3的实验过程发现，实施例1-4由于收率得到极大的提高，使得产品质量不用硅胶柱层析纯化，直接结晶即可达到98.5%以上,完全能满足后续生产的质量要求，更加符合环保要求，使得生产的工艺操作得到简化，更有利于工业化大生产的要求。
Claims (2)
1.一种酶法复合化学法制备卡培他滨中间体2’,3’-二-O-乙酰基-5-脱氧-5-氟胞苷的方法，其特征在于：该方法使用酶催化剂嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)在Tris-HCl反应缓冲液中催化底物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)和5-脱氧核糖-1-磷酸(5-deoxyribose-1-phosphate)生成5-脱氧-5-氟胞苷；嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)催化的反应如下：
5-氟胞嘧啶+5-脱氧核糖-1-磷酸5-脱氧-5-氟胞嘧啶+磷酸；
嘧啶核苷磷酸化酶所催化的反应是在Tris-HCl反应缓冲液中进行，反应缓冲液的pH值为7.2，催化反应温度范围为10-60℃，反应底物5-氟胞嘧啶和5-脱氧核糖-1-磷酸反应浓度为0.5mM/L，两者的使用比例为1:1；反应缓冲液中包含有CaCl2或CaSO4，CaCl2或CaSO4使用浓度为5-脱氧核糖-1-磷酸浓度的0.5-2倍，反应中嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)的加入量为10-50单位/ml；再经过乙酰化反应，反应产物经过减压除去溶剂，然后将残余物在乙酸乙酯与冰水之间分配，再经过过滤，将滤液减压浓缩，残余物在异丙醇中重结晶，获得2’,3’-二-O-乙酰基-5-脱氧-5-氟胞苷。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述的乙酰化反应试剂为无水吡啶和酸酐。
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