CN112094825A

CN112094825A - 硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因

Info

Publication number: CN112094825A
Application number: CN201910528023.2A
Authority: CN
Inventors: 尹汉维
Original assignee: Keaise Medicine Wuhan Co ltd
Current assignee: Keaise Medicine Wuhan Co ltd
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，是通过密码子优化的方式得到硫氧还蛋白还原酶编码基因，如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，并将其在大肠杆菌和哺乳细胞中进行表达，得到重组蛋白。本发明的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白序列完整，经验证其可与现有的TrxR1抗体特异性结合，方法简单，应用广泛。

Description

硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因。

背景技术

硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase，TrxR)、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。

硫氧还蛋白还原酶是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，包含保守的Cys Val Asn Val GlyCys氧化还原位点，催化依赖硫氧还蛋白NADPH还原反应。硫氧还蛋白还原酶活性检测可评价人体异常增生活性水平，硫氧还蛋白还原酶可实时检测人体内的异常增生活跃程度，由于不可逆恶性增生是肿瘤的重要特征，在癌症的早期阶段该值就会明显升高，因此硫氧还蛋白还原酶是一种特异性、敏感性、广谱性都较高的肿瘤标志物。

因此，体外制备硫氧还蛋白还原酶对于相关疾病的诊断和治疗研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白(TXNRD1)及其编码基因。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明提供一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。在本发明的一个实施方案中，是对硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化后，通过基因合成的方式得到编码基因。

第三方面，本发明还提供重组载体，含有所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因。在本发明一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到表达载体，构成重组载体；例如，所述载体为pET28b；在本发明另一个实施方案中，将所述编码基因亚克隆到克隆载体，构成重组载体；例如，所述载体为pUC19。

第四方面，本发明提供所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因的表达方法，包括如下步骤：

(1)将硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化得到编码基因，利用基因合成的方式得到编码基因，例如，通过线上软件进行氨基酸序列密码子优化；

(2)构建重组载体；

将PCR扩增的DNA序列和质粒载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组载体；所述载体可以为克隆载体或者表达载体；

(3)将重组载体转化到感受态细胞，培养筛选，测序验证；

(4)构建表达菌株或表达细胞，表达蛋白；

(5)重组蛋白纯化，利用Ni树脂纯化方式纯化。

根据本发明的表达方法，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因由大肠杆菌表达或者由哺乳细胞表达，例如有大肠杆菌或者HEK293细胞表达。

在本发明一个实施方案中，所述表达方法包括将DNA片段和表达载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组表达载体，将其转化到表达菌株，筛选阳性转化子，将目标表达菌株体外诱导表达，例如表达菌株可选自大肠杆菌，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

在本发明另一个实施方案中，所述表达方法包括将DNA片段和克隆载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化感受态细胞，经过菌P验证确定目标菌株，大量提取质粒，再瞬间转染到表达细胞，进行细胞培养，表达蛋白，例如表达细胞可选自HEK293细胞，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

第五方面，本发明还提供上述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在硫氧还蛋白还原酶活性检测中的应用，例如作为参比蛋白或者标准品辅助用于通过酶动力学方法检测离体生物样本中硫氧还蛋白还原酶活性水平，所述生物样本可以是来自生物体的离体血液、唾液、尿液、脑脊液、组织液、体外细胞、组织匀浆等，所述生物体可以是人类或其他哺乳动物。

有益效果

本发明通过密码子优化和基因合成得到了两种可编码硫氧还蛋白还原酶编码基因，并将该编码基因分别在大肠杆菌和哺乳细胞中成功表达，获得了体外表达的硫氧还蛋白还原酶。本发明所合成的编码基因表达效率高，且表达得到的硫氧还蛋白还原酶序列完整，经验证其可与现有的TrxR1抗体特异性结合，方法简单，稳定性好，可广泛用于硫氧还蛋白还原酶有关的疾病诊断、治疗研究，突破了现有硫氧还蛋白还原酶产品序列不完整的困境，具有重大意义。

附图说明

图1:为实施例1重组蛋白的表达测试结果(左：SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝；右：Western Blot，ECL显色)，其中MW.分子量标记，

空白培养基阴性对照，C.培养基，N.细胞破碎上清，D.细胞破碎沉淀，+.带His标签的BSA的阳性对照。

图2为实施例1所表达的蛋白纯化后的测试结果，A为SDS-PAGE电泳验证纯化结果，B为样品最终QC，其中MW.分子量标记，IN.流入，FT.流出，W.洗涤，E.洗脱。

图3为实施例1表达的蛋白样品与TrxR1兔多抗孵育的Western blot验证结果。

图4为实施例1表达的蛋白样品与HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)孵育的Western blot验证结果。

图5为实施例2表达的蛋白样品纯化后的测试结果，用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳图谱(左：定性分析，右：缓冲液交换后的最终样品QC，每泳道2μg)；其中MW.分子量标记，In.流入，FT，流出，W.洗涤，E1-E11.洗脱。

图6为实施例2表达的蛋白样品与TrxR1兔多抗孵育的Western blot验证结果。

图7为实施例2表达的蛋白样品与HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)孵育的Western blot验证结果。

图8为实施例3中硫氧还蛋白还原酶活性-吸光度标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。

除特殊说明外，本发明实施例所用试剂均可市购获得。主要试剂和仪器来源如表1。

表1本发明实施例所涉及主要试剂和仪器

实施例1

1.1 HEK293细胞表达TXNRD1

(1)基因序列的获得和优化

从UniProt网站得到TXNRD1的氨基酸序列，选取1-649AAs为表达目的片段，其中648U变为C，C端添加6*His标签，采用密码子优化后进行基因合成，得到编码基因序列SEQID NO.2。

(2)克隆载体的构建

PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，将载体pUC19和扩增的DNA片段用限制性内切酶EcoRI/NotI进行双酶切，DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体TXNRD1-pUC19。

PCR体系如表2和表3所示。

表2.PCR反应体系

表3.PCR反应程序

变性	95℃,10s
		退火	55℃,5s
延伸	72℃,15s
		循环	30次
保存	16℃，保持

(3)构建克隆菌株，并转化筛选

将克隆载体TXNRD1-pUC19转化至感受态细胞DH5а，培养筛选得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株。

(4)细胞转染和蛋白表达验证

从目标菌株中提取质粒，30～40℃，pH7.5条件下转染到HEK293细胞，细胞培养，第6天收集1.5ml培养基和细胞。半纯化后，通过SDS-PAGE和WB验证培养基、细胞破碎上清(Native)和细胞破碎沉淀(Denative)，结果如图1所示。图1显示，目标蛋白在培养基、细胞破碎上清和细胞破碎沉淀中均有表达。

1.2纯化实验

合并剩余的TXNRD1培养基，并通过镍离子亲和树脂(His-tag)进行纯化：

-用pH 7.5的PBS缓冲液进行平衡

-用包括0mM，30mM，50mM咪唑，pH 7.5的PBS缓冲液顺序洗涤

-用包括200mM和400mM咪唑，pH 7.5的PBS缓冲液顺序洗脱

-用SDS-PAGE电泳验证洗涤洗脱各组分；

-最终样品QC：通过SDS-PAGE对其定性和定量

通过SDS-PAGE验证纯化结果，结果如图2的A所示。合并组分W3至E9并进行贮存缓冲液的交换和浓缩，最终的QC如图2的B所示。图2说明经过镍离子亲和树脂纯化，得到纯度达85％以上的硫氧还蛋白还原酶蛋白。

1.3蛋白Western blot验证

(1)设置两个样品孔，上样量分别为400ng和200ng。过夜孵育TrxR1兔多抗，二抗室温孵育一小时，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图3；结果显示70kDa位置处有目的条带，且上样量不同，条带灰度不同。

(2)上样量与(1)相同，过夜孵育HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图4；结果显示70kDa之间有目的条带，且上样量不同，条带灰度深浅不同；Santa Cruz HRP标记TrxR1抗体可以与所得到的TXNRD1蛋白结合。通过哺乳细胞表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.1蛋白接近人体内天然形成的硫氧还蛋白还原酶构型，可以较大程度保持生物活性。

实施例2

2.1 E.coli表达TXNRD1

(1)基因序列的获得和优化

从UniProt网站得到TXNRD1的氨基酸序列，选取150-649AAs为表达目的片段，其中648U变为C，C端添加6*His标签，采用密码子优化后进行基因合成，得到编码基因序列SEQID NO.4。

(2)重组载体的构建

PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，将DNA片段亚克隆到pET28b载体，酶切位点为NcoI/Xho I，得到重组表达载体TXNRD1-pET28b。PCR反应体系和反应程序如下表4、表5所示。

表4.PCR反应体系

PCR反应体系总体积	50μL
		2X PrimeSTAR MAX	25μL
F引物(10μM)	2μL
		R引物(10μM)	2μL
模板	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	添加至总体积50μL
F引物	ggccccaaggggttatgctagt(SEQ ID NO.7)
		R引物	gatcccgcgaaattaatacg(SEQ ID NO.8)

表5.PCR反应程序

(3)转化筛选，构建表达菌株

将重组表达载体TXNRD1-pET28b转化至感受态细胞C41，培养筛选得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株。

(4)表达菌株的培养和表达

目标菌株用LB培养基培养，16-20℃下IPTG 1mM诱导表达16h。

2.2纯化实验

离心收集菌体，裂解菌体，收集上清，通过镍离子亲和树脂(His-tag)进行纯化：

-用PBS pH7.5进行平衡和结合

-咪唑(方法同实施例1)洗涤和洗脱

-最终样品QC：通过SDS-PAGE定性，通过Bradford方法定量

纯化后，将目标样品与贮存缓冲液进行缓冲液交换(除去咪唑)。

结果如图5所示，图5说明镍离子亲和树脂纯化，得到纯度大于90％的硫氧还蛋白还原酶蛋白。

2.3蛋白Western blot验证

(1)设置两个样品孔，上样量分别为400ng和200ng。过夜孵育TrxR1兔多抗，二抗室温孵育一小时，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图6；55～70kDa之间有目的条带，且上样量不同，条带灰度不同。

(2)上样量与(1)相同，过夜孵育HRP标记的TrxR1抗体(Santa Cruz)，进行WB实验，ECL发光，曝光结果如图7；55～70kDa之间有目的条带，且上样量不同，条带灰度不同，SantaCruz HRP标记TrxR1抗体可以与大肠杆菌表达的TXNRD1蛋白结合。

实施例3重组蛋白用酶动力学法测定硫氧还蛋白还原酶活性的应用

采用实施例2所制备的重组蛋白辅助测定人血样本中的硫氧还蛋白还原酶活性，方法：酶动力学法。

(1)标准曲线的绘制：

取实施例2所制备的重组蛋白用Tris缓冲液(含1mM的EDTA，300mM的NaCl，pH7.4)配制成0、6、12、18、24(U/mL)等不同活性的溶液，加入20μL NADPH，DTNB底物100μL，405nm下持续测定吸光度的变化，得到标准曲线如图8所示。

(2)样本中硫氧还蛋白还原酶活性的检测

取临床受试者血浆样本15μL，185μL酶促反应体系(NADPH 20μL、DTNB底物100μL)，用同步骤(1)的测定方法，获得吸光度，参考标准曲线获得对应的硫氧还蛋白还原酶活性(TrxR活性)。将相同的血浆样本采用Biovision K763-100(100assays)硫氧还蛋白还原酶检测分析试剂盒进行活性检测。样本1-50检测结果如表6所示。

采用本发明实施例2所制备的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白作为标准品制备标准曲线，通过酶动力学法检测样本TrxR活性所得检测结果与Biovision试剂盒检测结果对比，结果显示本发明制备的重组蛋白作为标准品的TrxR活性检测准确率可达90％以上。表明本发明制备的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白可用于辅助酶动力学方法检测硫氧还蛋白还原酶活性水平，对于人体内异常增生程度的临床诊断和临床的疗效监测具有重要的作用。

表6样本中硫氧还蛋白还原酶活性检测结果

以上实验表明，本发明通过大肠杆菌和哺乳细胞HEK293分别成功表达了两种TXNRD1，且均可与TrxR1抗体特异性结合，说明本发明表达的两种硫氧还蛋白还原酶序列完整。而且实施例3说明，所制备的重组蛋白可用于酶动力学法检测样本中的TrxR活性，具有广泛的应用前景。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 凯熙医药（武汉）股份有限公司

<120> 硫氧还蛋白还原酶重组蛋白及其编码基因

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 656

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

<400> 2

Met Gly Cys Ala Glu Gly Lys Ala Val Ala Ala Ala Ala Pro Thr Glu

1 5 10 15

Leu Gln Thr Lys Gly Lys Asn Gly Asp Gly Arg Arg Arg Ser Ala Lys

20 25 30

Asp His His Pro Gly Lys Thr Leu Pro Glu Asn Pro Ala Gly Phe Thr

35 40 45

Ser Thr Ala Thr Ala Asp Ser Arg Ala Leu Leu Gln Ala Tyr Ile Asp

50 55 60

Gly His Ser Val Val Ile Phe Ser Arg Ser Thr Cys Thr Arg Cys Thr

65 70 75 80

Glu Val Lys Lys Leu Phe Lys Ser Leu Cys Val Pro Tyr Phe Val Leu

85 90 95

Glu Leu Asp Gln Thr Glu Asp Gly Arg Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ser

100 105 110

Glu Leu Ala Ala Glu Thr Asp Leu Pro Val Val Phe Val Lys Gln Arg

115 120 125

Lys Ile Gly Gly His Gly Pro Thr Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Gly Arg

130 135 140

Leu Gln Lys Leu Leu Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser

145 150 155 160

Tyr Asp Tyr Asp Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala

165 170 175

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp

180 185 190

Phe Val Thr Pro Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr

195 200 205

Cys Val Asn Val Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala

210 215 220

Leu Leu Gly Gln Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val

225 230 235 240

Glu Glu Thr Val Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln

245 250 255

Asn His Ile Gly Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu

260 265 270

Lys Lys Val Val Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His

275 280 285

Arg Ile Lys Ala Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala

290 295 300

Glu Arg Phe Leu Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile

305 310 315 320

Pro Gly Asp Lys Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu

325 330 335

Pro Tyr Cys Pro Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala

340 345 350

Leu Glu Cys Ala Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val

355 360 365

Met Val Arg Ser Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn

370 375 380

Lys Ile Gly Glu His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln

385 390 395 400

Phe Val Pro Ile Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg

405 410 415

Leu Arg Val Val Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly

420 425 430

Glu Tyr Asn Thr Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg

435 440 445

Lys Ile Gly Leu Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly

450 455 460

Lys Ile Pro Val Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr

465 470 475 480

Ala Ile Gly Asp Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala

485 490 495

Ile Gln Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr

500 505 510

Val Lys Cys Asp Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu

515 520 525

Glu Tyr Gly Ala Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe

530 535 540

Gly Glu Glu Asn Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu

545 550 555 560

Trp Thr Ile Pro Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile

565 570 575

Cys Asn Thr Lys Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly

580 585 590

Pro Asn Ala Gly Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys

595 600 605

Gly Leu Thr Lys Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val

610 615 620

Cys Ala Glu Val Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala

625 630 635 640

Ser Ile Leu Gln Ala Gly Cys Cys Gly Ser His His His His His His

645 650 655

<210> 2

<211> 1994

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaattcgccg ccaccatggg ctgcgcagag ggcaaggcag tggctgccgc cgccccaaca 60

gagctgcaga ccaagggcaa gaacggcgac ggccggagaa ggtctgccaa ggatcaccac 120

cccggcaaga ccctgccaga gaatccagca ggcttcacct ctacagcaac cgcagacagc 180

agagccctgc tgcaggccta catcgatggc cacagcgtgg tcatcttcag cagaagcaca 240

tgcaccaggt gtacagaggt gaagaagctg ttcaagtccc tgtgcgtgcc ctattttgtg 300

ctggagctgg accagaccga ggatggaagg gccctggagg gcacactgtc cgagctggca 360

gcagagaccg acctgccagt ggtgttcgtg aagcagagaa agatcggagg acacggacct 420

accctgaagg cctaccagga gggcaggctg cagaagctgc tgaagatgaa cggccccgag 480

gacctgccta agagctacga ctatgatctg atcatcatcg gaggaggatc cggaggactg 540

gctgccgcca aggaggcagc acagtatggc aagaaagtga tggtgctgga ttttgtgaca 600

cccacccctc tgggaacaag atggggactg ggaggcacct gcgtgaacgt gggctgtatc 660

cccaagaagc tgatgcacca ggccgccctg ctgggacagg ccctgcagga ctcccgcaat 720

tacggctgga aggtggagga gaccgtgaag cacgactggg atcggatgat cgaggccgtg 780

cagaaccaca tcggctctct gaattggggc tatcgcgtgg ccctgcggga gaagaaggtg 840

gtgtacgaga acgcctatgg ccagttcatc ggccctcaca gaatcaaggc cacaaacaat 900

aagggcaagg agaagatcta cagcgccgag aggtttctga tcgcaaccgg agagcgccca 960

cggtacctgg gcatccccgg cgacaaggag tattgcatca gctccgacga tctgttctct 1020

ctgccttact gtccaggcaa gacactggtg gtgggagcaa gctatgtggc cctggagtgc 1080

gcaggcttcc tggcaggcat cggcctggat gtgaccgtga tggtgcgctc catcctgctg 1140

cggggctttg accaggatat ggccaataag atcggcgagc acatggagga gcacggcatc 1200

aagttcatcc ggcagtttgt gcctatcaag gtggagcaga tcgaggccgg cacaccaggc 1260

agactgaggg tggtggccca gtccaccaac tctgaggaga tcatcgaggg cgagtacaat 1320

acagtgatgc tggccatcgg cagagacgcc tgtacaagga agatcggcct ggagaccgtg 1380

ggcgtgaaga tcaacgagaa gaccggcaag atcccagtga cagatgagga gcagaccaat 1440

gtgccctaca tctatgccat cggcgacatc ctggaggata aggtggagct gaccccagtg 1500

gcaatccagg caggccgcct gctggcacag cggctgtacg caggatctac agtgaagtgc 1560

gactatgaga acgtgcctac cacagtgttc accccactgg agtacggagc atgtggactg 1620

agcgaggaga aggccgtgga gaagttcggc gaggagaata tcgaggtgta ccactcctat 1680

ttttggcccc tggagtggac aatcccttct cgcgacaaca ataagtgcta tgccaagatc 1740

atctgtaaca ccaaggataa tgagagggtg gtgggattcc acgtgctggg acctaatgca 1800

ggagaggtga cacagggatt tgccgccgcc ctgaagtgcg gactgacaaa gaagcagctg 1860

gattccacca tcggcatcca ccccgtgtgc gcagaggtgt ttaccacact gtctgtgacc 1920

aagaggagcg gagcatccat cctgcaggca ggatgctgtg gaagccacca ccaccaccac 1980

cactgagcgg ccgc 1994

<210> 3

<211> 509

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Met Asn Gly Pro Glu Asp Leu Pro Lys Ser Tyr Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Leu Ile Ile Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala Lys Glu

20 25 30

Ala Ala Gln Tyr Gly Lys Lys Val Met Val Leu Asp Phe Val Thr Pro

35 40 45

Thr Pro Leu Gly Thr Arg Trp Gly Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Cys Ile Pro Lys Lys Leu Met His Gln Ala Ala Leu Leu Gly Gln

65 70 75 80

Ala Leu Gln Asp Ser Arg Asn Tyr Gly Trp Lys Val Glu Glu Thr Val

85 90 95

Lys His Asp Trp Asp Arg Met Ile Glu Ala Val Gln Asn His Ile Gly

100 105 110

Ser Leu Asn Trp Gly Tyr Arg Val Ala Leu Arg Glu Lys Lys Val Val

115 120 125

Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Phe Ile Gly Pro His Arg Ile Lys Ala

130 135 140

Thr Asn Asn Lys Gly Lys Glu Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Arg Phe Leu

145 150 155 160

Ile Ala Thr Gly Glu Arg Pro Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Gly Asp Lys

165 170 175

Glu Tyr Cys Ile Ser Ser Asp Asp Leu Phe Ser Leu Pro Tyr Cys Pro

180 185 190

Gly Lys Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Tyr Val Ala Leu Glu Cys Ala

195 200 205

Gly Phe Leu Ala Gly Ile Gly Leu Asp Val Thr Val Met Val Arg Ser

210 215 220

Ile Leu Leu Arg Gly Phe Asp Gln Asp Met Ala Asn Lys Ile Gly Glu

225 230 235 240

His Met Glu Glu His Gly Ile Lys Phe Ile Arg Gln Phe Val Pro Ile

245 250 255

Lys Val Glu Gln Ile Glu Ala Gly Thr Pro Gly Arg Leu Arg Val Val

260 265 270

Ala Gln Ser Thr Asn Ser Glu Glu Ile Ile Glu Gly Glu Tyr Asn Thr

275 280 285

Val Met Leu Ala Ile Gly Arg Asp Ala Cys Thr Arg Lys Ile Gly Leu

290 295 300

Glu Thr Val Gly Val Lys Ile Asn Glu Lys Thr Gly Lys Ile Pro Val

305 310 315 320

Thr Asp Glu Glu Gln Thr Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Ala Ile Gly Asp

325 330 335

Ile Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Gln Ala Gly

340 345 350

Arg Leu Leu Ala Gln Arg Leu Tyr Ala Gly Ser Thr Val Lys Cys Asp

355 360 365

Tyr Glu Asn Val Pro Thr Thr Val Phe Thr Pro Leu Glu Tyr Gly Ala

370 375 380

Cys Gly Leu Ser Glu Glu Lys Ala Val Glu Lys Phe Gly Glu Glu Asn

385 390 395 400

Ile Glu Val Tyr His Ser Tyr Phe Trp Pro Leu Glu Trp Thr Ile Pro

405 410 415

Ser Arg Asp Asn Asn Lys Cys Tyr Ala Lys Ile Ile Cys Asn Thr Lys

420 425 430

Asp Asn Glu Arg Val Val Gly Phe His Val Leu Gly Pro Asn Ala Gly

435 440 445

Glu Val Thr Gln Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Cys Gly Leu Thr Lys

450 455 460

Lys Gln Leu Asp Ser Thr Ile Gly Ile His Pro Val Cys Ala Glu Val

465 470 475 480

Phe Thr Thr Leu Ser Val Thr Lys Arg Ser Gly Ala Ser Ile Leu Gln

485 490 495

Ala Gly Cys Cys Gly Leu Glu His His His His His His

500 505

<210> 4

<211> 1535

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccatgggcaa aatgaacggt ccggaggacc tgccgaagag ctacgactat gatctgatca 60

ttatcggtgg cggtagcggc ggtctggcgg cggcgaaaga agcggcgcag tacggcaaga 120

aagtgatggt tctggatttc gttaccccga ccccgctggg tacccgttgg ggtctgggcg 180

gtacctgcgt gaacgttggt tgcatcccga agaaactgat gcatcaagcg gcgctgctgg 240

gtcaggcgct gcaagacagc cgtaactacg gttggaaagt tgaggaaacc gtgaagcacg 300

actgggatcg tatgatcgag gcggttcaga accacattgg cagcctgaac tggggttatc 360

gtgtggcgct gcgtgagaag aaagtggttt acgaaaacgc gtatggccaa ttcatcggtc 420

cgcaccgtat taaagcgacc aacaacaagg gcaaagagaa gatctatagc gcggaacgtt 480

ttctgattgc gaccggcgag cgtccgcgtt acctgggtat cccgggtgac aaagaatatt 540

gcattagcag cgacgacctg ttcagcctgc cgtactgccc gggcaagacc ctggtggttg 600

gtgcgagcta tgttgcgctg gagtgcgcgg gcttcctggc gggcatcggt ctggatgtga 660

ccgttatggt gcgtagcatt ctgctgcgtg gttttgacca ggatatggcg aacaagatcg 720

gcgaacacat ggaggaacac ggtattaaat tcatccgtca gtttgttccg atcaaggtgg 780

agcaaattga ggcgggtacc ccgggtcgtc tgcgtgtggt tgcgcaaagc accaacagcg 840

aggaaattat cgagggcgaa tacaacaccg ttatgctggc gattggtcgt gatgcgtgca 900

cccgtaaaat tggcctggag accgttggtg tgaagatcaa cgaaaaaacc ggcaagattc 960

cggttaccga tgaggaacag accaacgtgc cgtacattta tgcgatcggt gacattctgg 1020

aggataaagt tgaactgacc ccggtggcga ttcaagcggg ccgtctgctg gcgcaacgtc 1080

tgtacgcggg tagcaccgtg aagtgcgact atgagaacgt tccgaccacc gtgttcaccc 1140

cgctggaata cggcgcgtgc ggtctgagcg aggaaaaagc ggttgagaag ttcggcgagg 1200

aaaacatcga agtgtaccac agctattttt ggccgctgga gtggaccatt ccgagccgtg 1260

acaacaacaa atgctatgcg aagattatct gcaacaccaa agataacgag cgtgtggttg 1320

gtttccacgt tctgggtccg aacgcgggtg aagtgaccca aggttttgcg gcggcgctga 1380

agtgcggtct gaccaagaaa caactggata gcaccattgg catccacccg gtttgcgcgg 1440

aagtgtttac caccctgagc gttaccaaac gtagcggtgc gagcatcctg caggcgggct 1500

gctgcggtct cgagcaccac caccaccacc actga 1535

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcgc cgccaccatg ggctgcgcag agggc 55

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcctgcag gtcgactcta gaggatcctc agtggtggtg gtggtggtgg cttcca 56

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggccccaagg ggttatgcta gt 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatcccgcga aattaatacg 20

Claims

1.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，其特征在于，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在氨基酸序列C端添加6个His(HHHHHH)片段。

2.根据权利要求1所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

3.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因，是对硫氧还蛋白还原酶的氨基酸序列密码子优化后，通过基因合成的方式得到编码基因。

5.重组载体，含有权利要求3或4所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的编码基因；

优选地，是将所述编码基因亚克隆到载体得到；

优选地，所述载体选自表达载体或者克隆载体；例如，所述表达载体为pET28b；例如，所述克隆载体为pUC19。

6.一种硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因的表达方法，包括如下步骤：

(1)将硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列密码子优化得到编码基因，利用基因合成的方式得到编码基因的DNA片段；

(2)构建重组载体；

PCR扩增步骤(1)得到的DNA片段，和载体用限制性内切酶进行双酶切，用DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到重组载体；优选地，所述载体选自克隆载体或表达载体；

(3)将重组载体转化到感受态细胞，培养筛选，测序验证；

(4)构建表达菌株或表达细胞，表达蛋白；

优选地，所述表达方法还可以包括步骤(5)重组蛋白纯化，更优选利用Ni树脂纯化方式纯化。

7.根据权利要求6所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因的表达方法，其特征在于，所述编码基因如权利要求3或4所述；

优选地，所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因由大肠杆菌表达或者由哺乳细胞表达。

8.根据权利要求6或7所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因的表达方法，所述步骤(2)的载体为表达载体，得到重组表达载体，

所述步骤(3)为将重组表达载体转化至感受态细胞，培养筛选得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标表达菌株；

所述步骤(4)为将目标表达菌株进行培养，体外诱导表达，得到所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白。

9.根据权利要求6或7所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白编码基因的表达方法，所述步骤(2)的载体为克隆载体，得到重组克隆载体，

所述步骤(3)为将重组克隆载体转化至感受态细胞，培养筛选得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株；

所述步骤(4)是从目标菌株中提取质粒，瞬间转染到表达细胞，进行细胞培养，表达蛋白。

10.如权利要求1或2所述的硫氧还蛋白还原酶重组蛋白在硫氧还蛋白还原酶活性检测中的应用；优选所述硫氧还蛋白还原酶重组蛋白作为参比蛋白或者标准品辅助用于通过酶动力学方法检测离体生物样本中硫氧还蛋白还原酶活性水平。