ES2614157T3 - Composiciones que contienen lipasa, proteasa y amilasa para el tratamiento de la insuficiencia pancreática - Google Patents

Abstract

Composición que comprende lipasa, proteasa y amilasa, en la que la proporción de lipasa, proteasa y amilasa en dicha composición es aproximadamente de 1:1:0,15 unidades USP, en la que la lipasa es lipasa de Burkholderia cepacia cristalizada reticulada, la proteasa es proteasa de Aspergillus melleus cristalizada y la amilasa es amilasa de Aspergillus oryzae amorfa.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Composiciones que contienen lipasa, proteasa y amilasa para el tratamiento de la insuficiencia pancreatica Campo tecnico de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones para el tratamiento de enfermedades, incluyendo la insuficiencia pancreatica. Las composiciones de la presente invencion comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion especial que proporciona resultados beneficiosos en pacientes tales como los afectados por insuficiencia pancreatica. Esta invencion se refiere tambien a tales composiciones para su uso en el tratamiento de la insuficiencia pancreatica.

Antecedentes de la invencion

La digestion constituye el proceso fisiologico por el que el alimento ingerido se descompone en componentes nutritivos de facil absorcion. Despues de la ingestion, el alimento pasa a traves de varios segmentos del tracto gastrointestinal y la digestion se lleva a cabo principalmente por enzimas digestivas. Los tres grupos de enzimas digestivas esenciales para este proceso incluyen lipasas (para la digestion de las grasas), proteasas (para la digestion de las protemas) y amilasas (para la digestion de los hidratos de carbono).

La digestion de los alimentos y la absorcion de los nutrientes tienen lugar en el intestino delgado. En este, el alimento ingerido es descompuesto por las enzimas digestivas para su facil absorcion. El pancreas secreta la mayor parte de las enzimas digestivas, que llegan al intestino delgado a traves del conducto pancreatico.

El pancreas efectua varias acciones exocrinas y endocrinas requeridas para una digestion, nutricion y metabolismo correctos. Las actividades pancreaticas exocrinas incluyen la secrecion de protemas que funcionan como enzimas en el intestino delgado, para catalizar la hidrolisis de las grasas a glicerol y acidos grasos, de las protemas a peptidos y aminoacidos y de los hidratos de carbono a dextrinas, disacaridos y monosacaridos, como glucosa. La insuficiencia pancreatica exocrina (en adelante, "insuficiencia pancreatica") es el resultado de una reduccion de la funcion pancreatica y puede estar causada por una serie de trastornos clmicos. Por ejemplo, la insuficiencia pancreatica esta asociada con la fibrosis qrnstica, la pancreatitis cronica, la pancreatitis aguda, el cancer de pancreas y el smdrome de Shwachmann-Diamond [E. P. DiMagno y col., en The Pancreas: Biology, Pathobiology and Disease, 2.a ed., V. Liang y col., eds., pags. 665-701 (1993)].

En los pacientes afectados con insuficiencia pancreatica, el pancreas no produce ni/o secreta cantidades de enzimas digestivas suficientes para llevar a cabo los procesos digestivos normales, incluyendo la digestion de las grasas, las protemas y los hidratos de carbono. Como resultado, estos pacientes sufren malabsorcion de nutrientes. Las manifestaciones clmicas de la insuficiencia pancreatica incluyen espasmos abdominales, meteorismo, diarrea, esteatorrea, nauseas y perdida de peso.

La insuficiencia pancreatica se presenta en el 89% de los pacientes que sufren fibrosis qrnstica [D. Borowitz y col., "Use of Fecal Elastase-1 to Identify Misclassification of Functional Pancreatic Status in Patients with Cystic Fibrosis" J. Pediatr., 145, pags. 322-326 (2004)]. La fibrosis qrnstica es un trastorno genetico recesivo autosomico que afecta principalmente a los sistemas gastrointestinal y respiratorio [S. M. Rowe y col., "Mechanisms of Disease: Cystic Fibrosis", N. Engl. J. Med., 352, pags. 1992-2001 (1995)]. Las cantidades anormales y la viscosidad del moco producido en los pacientes de fibrosis qrnstica impiden la secrecion de cantidades suficientes de las enzimas pancreaticas. La disminucion del volumen de secreciones pancreaticas conduce al espesamiento dentro de los conductos pancreaticos, lo que impide la excrecion de las enzimas y el bicarbonato al duodeno. Como resultado, los pacientes de fibrosis qrnstica con insuficiencia pancreatica sufren una digestion deficiente y experimentan una malabsorcion significativa de grasa y protema. Por ejemplo, tfpicamente, estos pacientes absorben menos del 60% de la grasa de la dieta [M. Kraisinger y col., "Clinical Pharmacology of Pancreatic Enzymes in Patients with Cystic Fibrosis and in vitro Performance of Microencapsulated Formulations", J. Clin. Pharmacol., 34, pags. 158-166 (1994)]. Sin tratamiento, la mala digestion y la malabsorcion en pacientes de fibrosis qrnstica pueden conducir a malnutricion, incapacidad de ganar o mantener el peso y crecimiento reducido, asf como al empeoramiento de la enfermedad pulmonar supurativa cronica [K. Gaskin y col., "Improved Respiratory Prognosis in CF Patients with Normal Fat Absortion", J. Pediatr., 100, pags. 857-862 (1982); J. M. Littlewood y col., "Control of Malabsorption in Cystic Fibrosis", Paediatr. Drugs, 2, pags. 205-222 (2000)].

Hasta la fecha, el tratamiento estandar para la insuficiencia pancreatica se basa principalmente en la administracion por via oral de pancreolipasa porcina, que contiene una mezcla de lipasas, tripsina, quimotripsina, elastasa y amilasas. Aunque los suplementos de enzimas pancreaticas porcinas contienen cantidades sustanciales de amilasa, se ha descrito que los pacientes de fibrosis qrnstica tienen niveles normales de amilasa [P. L. Townes y col., "Amylase Polymorphism: Studies of Sera and Duodenal Aspirates in Normal Individuals and in Cystic Fibrosis", Am. J. Hum. Genet., 28, pags. 378-389 (1976)]. En consecuencia, se cree que la amilasa no desempena ninguna funcion en el aumento de la digestion de los polisacaridos [E. Lebenthal y col., "Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Needs", Pancreas, 9, pags. 1-12 (1994)]. Tfpicamente, los componentes de lipasa,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

proteasa y amilasa de los suplementos pancreaticos porcinos estan presentes en una proporcion de 1:3,5:3,5.

Los suplementos de enzimas pancreaticas se administran normalmente por via oral con las comidas. A medida que estos suplementos pasan a traves entorno de pH bajo del estomago, su actividad enzimatica disminuye rapidamente. Como resultado, se han requerido grandes cantidades de concentrado enzimatico (a veces hasta 15 capsulas o comprimidos por cada comida) para asegurar la presencia de suficiente enzima activa en el intestino proximal para aliviar la insuficiencia pancreatica.

Como la proteasa y la lipasa pueden quedar inactivadas irreversiblemente en el ambiente acido del estomago, se han aplicado tecnologfas de recubrimiento enterico a los productos de pancreolipasa con el fin de encerrar las enzimas en microesferas o tratarlas de otra manera con un recubrimiento enterico protector. Mientras que estos recubrimientos entericos mejoraron el perfil del producto, todavfa se requirieron grandes cantidades de suplementos para obtener un beneficio terapeutico [J. H. Meyer, en Pancreatic Enzymes in Health and Disease, P. G. Lankisch, ed., pags. 71-78 (1991)]. Con el objetivo de reducir las cantidades de comprimidos o capsulas necesarias para tratar la insuficiencia pancreatica se introdujo una lmea de productos de pancreolipasa de alta concentracion (Ultrase®). Sin embargo, en 1991, la Fundacion para la Fibrosis Qrnstica de los Estados Unidos, conjuntamente con la FDA, describieron multiples casos de colonopatfa fibrosante en ninos con fibrosis qrnstica que tomaban tales productos de alta concentracion [S. C. Fitzsimmons y col., "High-Dose Pancreatic-Enzyme Supplements and Fibrosing Colonopathy in Children with Cystic Fibrosis", N. Engl. J. Med., 336, pags. 1283-1289 (1997)]. En estos pacientes, la fibrosis del colon causo constricciones que, con frecuencia, requirieron cirugfa y, en algunos casos, una colectoirna.

Como un medio de reducir las dosis diarias de enzimas pancreaticas, la FDA retiro del mercado los productos de alta concentracion (definidos como de mas de 2,500 unidades de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) por kg de peso corporal) [D. S. Borowitz y col., "Use of Pancreatic Enzyme Supplements for Patients with Cystic Fibrosis in the Context of Fibrosing Colonopathy", J. Pediatr., 127, pags. 681-684 (1995)]. Ademas, la Fundacion para la Fibrosis Qrnstica de los Estados Unidos, conjuntamente con la FDA, recomendo un examen detallado de la naturaleza compleja de los extractos enzimaticos porcinos [id.]. El Panel de Consenso tambien recomendo la investigacion de lipasas alternativas estables frente a acidos.

Independientemente de que un suplemento dado de enzimas pancreaticas este o no recubierto entericamente, la biodisponibilidad de tales suplementos vana ampliamente, debido a diferencias en la acidificacion del intestino entre los pacientes. Como resultado, muchos pacientes toman farmacos que alteran el pH, como bloqueantes del receptor de la histamina-2 (H2) e inhibidores de la bomba de protones (IBP), para mejorar la eficacia clmica de los suplementos enzimaticos [P. G. Lankish, "Enzyme Treatment of Exocrine Pancreatic Insufficiency in Chronic Pancreatitis", Digestion, 54 (supl. 2), pags. 21-29 (1993); D. Y. Graham, "Pancreatic Enzyme Replacement: the Effect of Antacids or Cimetidine", Dig. Dis. Sci., 27, pags. 485-490 (1982); J. H. Saunders y col., "Inhibition of Gastric Secretion in Treatment of Pancreatic Insufficiency", Br. Med. J., 1, pags. 418-419 (1977); H. G. Heijerman y col., "Omeprazole Enhances the Efficacy of Pancreatin (Pancrease) in Cystic Fibrosis", Ann. Inter. Med., 114, pags. 200201 (1991); M. J. Bruno y col., "Comparative Effects of Adjuvant Cimetidine and Omeprazole during Pancreatic Enzyme Replacement Therapy", Dig. Dis. Sci., 39, pags. 988-992, (1994)].

La variabilidad en terminos de concentracion y propiedades farmaceuticas y la falta de estabilidad se han identificado tambien como factores importantes que contribuyen a la escasa respuesta de algunos pacientes a los suplementos de enzimas pancreaticas convencionales [C. L. Chase y col., "Enzyme Content and Acid Stability of Enteric-Coated Pancreatic Enzyme Products in vitro" Pancreas, 30, pags. 180-183 (2005); D. S. Borowitz y col., J. Pediatr., 127, supra; C. J. Powell y col., "Colonic Toxicity from Pancreatins: a Contemporary Safety Issue", Lancet, 353, pags. 911-915 (1999); E. Lebenthal y col., "Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Needs", Pancreas, 9, pags. 1-12 (1994); P. Regan y col., "Comparative Effects of Antacids, Cimetidine and Enteric Coating on the Therapeutic Response to Oral Enzymes in Severe Pancreatic Insufficiency", N. Eng. J. Med., 297, pags. 854-858 (1977)]. Estos incluyen la variacion de la actividad enzimatica entre lotes, la susceptibilidad a la perdida de actividad con el tiempo por exposicion a la luz solar, el calor o la humedad y un perfil de reacciones adversas escasamente definido [D. S. Borowitz y col., J. Pediatr., 127, supra], Otros factores que complican el tratamiento de la insuficiencia pancreatica incluyen la destruccion de las enzimas sustitutivas por el jugo gastrico y/o las proteasas intraluminales, el vaciado gastrico asmcrono del suplemento enzimatico y de los nutrientes de la comida y el retraso en la liberacion de las enzimas a partir de los preparados con recubrimiento enterico [P. G. Lankish, Digestion, 54, supra; P. Regan y col., N. Engl. J. Med., 297, supra].

Debido a los problemas de potencia, estabilidad y biodisponibilidad que caracterizan a los suplementos de enzimas pancreaticas convencionales, se ha propuesto el uso de enzimas de origen microbiano como alternativas a enzimas de origen porcino. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 6.051.220 describe composiciones que comprenden una o mas lipasas estables frente a acidos y una o mas amilasas estables frente a acidos, las dos preferentemente de origen fungico. La solicitud de patente de los Estados Unidos 2004/0057944 describe composiciones que comprenden lipasa de Rhizopus delemar, proteasa de Aspergillus melleus y amilasa de Aspergillus oryzae. La solicitud de patente de los Estados Unidos 2001/0046493 describe composiciones que comprenden lipasa bacteriana cristalina reticulada junto con una proteasa fungica o vegetal y una amilasa fungica o bacteriana.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

A pesar de estos desarrollos, sigue existiendo la necesidad de optimizar las formulaciones de dosificacion para mejorar aun mas tanto la eficacia de los suplementos de enzimas pancreaticas como el cumplimiento del paciente. El objetivo de un suplemento de enzimas pancreaticas que muestre la maxima eficacia a la minima dosis y se caracterice por un perfil de seguridad bien definido, sigue siendo de gran importancia para todos los pacientes que sufren insuficiencia pancreatica, incluyendo aquellos con fibrosis qrnstica.

Resumen de la invencion

La presente invencion se dirige a composiciones y su uso en el tratamiento de enfermedades, incluyendo la insuficiencia pancreatica. Segun una realizacion preferida, las composiciones de esta invencion se caracterizan por cristales de lipasa microbiana, proteasa microbiana y amilasa microbiana reticulados, en una proporcion de aproximadamente 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividad enzimatica como se reivindica en la reivindicacion 1. Ventajosamente, estas composiciones se caracterizan por componentes enzimaticos estables, que aseguran, a su vez, el suministro in vivo de la enzima activa al tracto gastrointestinal y, de este modo, permiten regfmenes de tratamiento efectivos a dosis bajas para la insuficiencia pancreatica.

Breve descripcion de los dibujos

La fig. 1 ilustra la variacion en el coeficiente de absorcion de grasa medio (“CFA”), en comparacion con el nivel inicial, en pacientes tratados con composiciones segun la presente invencion durante un estudio de fase II.

La fig. 2 ilustra la variacion en el coeficiente de absorcion de nitrogeno medio (“CNA”), en comparacion con el nivel inicial, en pacientes tratados con diversas composiciones segun la presente invencion durante un estudio de fase II.

La fig. 3 ilustra la correlacion entre el coeficiente de absorcion de grasa (“CFA”) y el coeficiente de absorcion de nitrogeno (“CNA”) iniciales en pacientes tratados con composiciones segun la presente invencion durante un estudio de fase II.

La fig. 4 ilustra la correlacion entre el coeficiente de absorcion de grasa (“CFA”) y el coeficiente de absorcion de nitrogeno (“CNA”) en el nivel de tratamiento en pacientes tratados con composiciones segun la presente invencion durante un estudio de fase II.

La fig. 5 ilustra la diferencia entre la correlacion entre el coeficiente de absorcion de grasa (“CFA”) y el coeficiente de absorcion de nitrogeno (“CNA”) en los niveles de tratamiento e inicial en pacientes tratados con composiciones segun la presente invencion durante un estudio de fase II.

La fig. 6 ilustra la variacion en el coeficiente de absorcion de grasa medio (“CFA”), en comparacion con el nivel inicial, en pacientes de fibrosis qrnstica tratados con diversas dosis segun la presente invencion durante un estudio de fase I.

La fig. 7 ilustra la variacion en el coeficiente de absorcion de nitrogeno medio (“CNA”), en comparacion con el nivel inicial, en pacientes tratados con diversas dosis segun la presente invencion durante un estudio de fase I.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere al descubrimiento de que composiciones que comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividad enzimatica son efectivas para el tratamiento de enfermedades, incluyendo la insuficiencia pancreatica. La proporcion unica entre lipasa, proteasa y amilasa permite el tratamiento de esas enfermedades en regfmenes terapeuticos de dosis bajas, que no son posibles con suplementos de enzimas pancreaticas convencionales de origen porcino. Ademas, esta proporcion entre lipasa, proteasa y amilasa evita una alta concentracion de proteasa, de la cual, en los suplementos enzimaticos convencionales, se ha pensado que es responsable de la colonopatfa fibrosante [D. S. Borowitz y col., J. Pediatr., 127, supra].

Las composiciones de esta invencion comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividad enzimatica, en las que la lipasa es lipasa de Burkholderia cepacia cristalizada reticulada, la proteasa es proteasa de Aspergillus melleus cristalizada y la amilasa es amilasa de Aspergillus oryzae amorfa.

A menos que se indique lo contrario, se entendera que los terminos siguientes tienen los significados siguientes:

El termino “amorfo” se refiere a cualquier estado distinto del estado de cristal, cristalino o semicristalino. La materia amorfa incluye solidos amorfos y lfquidos.

El termino “cristal” o “cristalino” se refiere a una forma de la materia en estado solido que comprende atomos dispuestos en un patron que se repite periodicamente en tres dimensiones [vease, por ejemplo, Barret, Structure of Methals, 2.a ed., (1952)]. Las formas de cristal o cristalina de una enzima son distintas de las formas amorfa o semicristalina de la misma. Los cristales muestran rasgos caractensticos, incluyendo una estructura de red, formas caractensticas y propiedades opticas, como por ejemplo, el mdice de refraccion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

El termino “semicristalino” se refiere a un estado solido de la materia que tiene tanto regiones cristalinas como amorfas.

El termino “sujeto”, “paciente” o “individuo” se refiere a cualquier mamfero, incluyendo cualquier animal clasificado como tal, incluyendo humanos y otros primates.

El termino “mala digestion” se refiere a la descomposicion deficiente de los nutrientes (tales como grasas, protemas e hidratos de carbono) en sus constituyentes absorbibles (mono-, di- u oligosacaridos, aminoacidos, oligopeptidos, acidos grasos y monogliceridos). La mala digestion puede ser el resultado de varias enfermedades, incluyendo la insuficiencia pancreatica.

El termino “malabsorcion” se refiere a la absorcion deficiente de los nutrientes digeridos, incluyendo vitaminas y oligoelementos, desde el intestino delgado o el intestino grueso. La malabsorcion puede deberse a una absorcion defectuosa a traves de la mucosa por parte del revestimiento intestinal o a anormalidades particulares de la digestion. La malabsorcion intestinal puede producirse para muchos nutrientes o para macronutrientes espedficos, concretamente grasas, protemas o hidratos de carbono, asf como para micronutrientes, como calcio, magnesio, hierro y vitaminas. La malabsorcion puede ser el resultado de varias enfermedades, incluyendo la insuficiencia pancreatica. La malabsorcion de las protemas se denomina “azotorrea”. La malabsorcion de los ftpidos se denomina “esteatorrea”.

El termino “lipasa” se refiere a una enzima que cataliza la hidrolisis (es decir, la separacion del grupo hidroxilo y el atomo de hidrogeno de los compuestos para dar fragmentos por la adicion de agua) de los ftpidos a glicerol y acidos grasos simples. Normalmente, esta reaccion enzimatica requiere iones de calcio (Ca2+). Las lipasas secretadas por el pancreas son de extrema importancia para la digestion de grasa (trigliceridos) en la parte superior del intestino delgado. Segun la invencion, la lipasa util en las composiciones y su uso de acuerdo con esta invencion es lipasa no pancreatica, lipasa de Burkholderia cepacia.

Generalmente las lipasas microbianas pueden aislarse de su fuente microbiana nativa o pueden ser lipasas microbianas recombinantes producidas por medio de la tecnologfa del ADN recombinante por una celula hospedadora adecuada, seleccionada entre una cualquiera de celulas hospedadoras de bacterias, levaduras, hongos, plantas, insectos o mamferos, en cultivo, preferentemente bacterias. Las lipasas recombinantes abarcan o estan codificadas por acidos nucleicos de una secuencia de lipasa de origen natural. Ademas, las lipasas recombinantes incluyen una secuencia de aminoacidos que es homologa o sustancialmente identica a una

secuencia de origen natural, asf como aquellas lipasas codificadas por un acido nucleico que es homologo o

sustancialmente identico a un acido nucleico codificante de lipasa de origen natural.

El termino “proteasa” se refiere a una proteinasa, enzima proteofttica o peptidasa, que es una enzima que cataliza la escision de los enlaces pepftdicos (amida) internos en una protema. Espedficamente, las proteasas catalizan la conversion de las protemas en sus componentes aminoacidos por rotura del enlace amida entre el grupo carboxilo de un aminoacido y el grupo amino de otro aminoacido. En general, las proteasas se identifican por su tipo catalftico, por ejemplo, peptidasas de acido aspartico, peptidasas de cistema (tiol), metalopeptidasas, peptidasas de serina, peptidasas de treonina, proteasas alcalinas o semialcalinas, peptidasas neutras y peptidasas de mecanismo catalftico desconocido (vease
http://merops.sanger.ac.uk). Segun la invencion, la proteasa util en las composiciones y su uso de acuerdo con esta invencion es proteasa no pancreatica, proteasa de Aspergillus melleus.

Generalmente las proteasas microbianas pueden aislarse de su fuente microbiana nativa o pueden ser proteasas microbianas recombinantes, producidas por medio de la tecnologfa del ADN recombinante por una celula hospedadora adecuada que se selecciona entre una cualquiera de celulas hospedadoras de bacterias, levaduras, hongos, plantas, insectos o mamferos, en cultivo, preferentemente hongos. Las proteasas recombinantes abarcan o estan codificadas por acidos nucleicos de una secuencia de proteasa de origen natural. Ademas, las proteasas

recombinantes incluyen una secuencia de aminoacidos que es homologa o sustancialmente identica a una

secuencia de origen natural, asf como aquellas proteasas codificadas por un acido nucleico que es homologo o sustancialmente identico a un acido nucleico codificante de proteasa de origen natural.

El termino “amilasa” se refiere a una enzima que se produce en el pancreas y tambien en las glandulas salivales en seres humanos, pero no en todos los mamfferos. La amilasa salival humana se conoce como ptialina. La amilasa es la enzima digestiva principal, responsable de la digestion de los hidratos de carbono, por ejemplo, polisacaridos, por catalisis de la conversion de los dos componentes del almidon (amilosa y amilopectina) en azucares simples en el intestino delgado. Mas espedficamente, la amilasa hidroliza el almidon, el glucogeno y la dextrina para formar glucosa, maltosa y las dextrinas ftmite. Cftnicamente, los niveles de amilasa en sangre se elevan con frecuencia en condiciones de pancreatitis aguda y a veces en condiciones de pancreatitis cronica. El termino “amilasas no pancreaticas” se refiere a amilasas que no se purifican a partir de tejido pancreatico humano ni animal. Segun la presente invencion, la amilasa, es amilasa de Aspergillus oryzae.

Las amilasas microbianas pueden aislarse de su fuente microbiana nativa o pueden ser amilasas microbianas recombinantes, producidas por medio de la tecnologfa del ADN recombinante por una celula hospedadora adecuada que se selecciona entre una cualquiera de celulas hospedadora de bacterias, levaduras, hongos, plantas, insectos o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mairftferos, en cultivo, preferentemente hongos. Las amilasas recombinantes abarcan o estan codificadas por acidos nucleicos de una secuencia de amilasa de origen natural. Ademas, las amilasas recombinantes incluyen una secuencia de aminoacidos que es homologa o sustancialmente identica a una secuencia de origen natural, asf como aquellas amilasas codificadas por un acido nucleico que es homologo o sustancialmente identico a un acido nucleico codificante de amilasa de origen natural.

Los terminos “dosis terapeuticamente efectiva” o “cantidad terapeuticamente efectiva” se refieren a aquella cantidad de una composicion que tiene como resultado la prevencion, el retraso del comienzo de los smtomas o la mejora de los smtomas de la enfermedad que ha de tratarse. Una cantidad terapeuticamente efectiva es aquella que es suficiente para tratar, prevenir, reducir la gravedad, retrasar el comienzo o reducir la ocurrencia de uno o mas smtomas de la enfermedad que ha de tratarse. Las enfermedades que pueden tratarse usando las composiciones de esta invencion incluyen, por ejemplo, la insuficiencia pancreatica, la malabsorcion y la mala digestion.

El termino “unidad USP” se refiere a la unidad de la Farmacopea de los Estados Unidos de la actividad enzimatica presente en un agente o composicion. Una unidad USP de lipasa, proteasa o amilasa se define en Pancrelipase, USP, U. S. Pharmacopeia National Formulary, USP 24, pags. 1254-l255 (2000).

Caracteristicas de las composiciones de esta invencion

Ventajosamente, las composiciones de la presente invencion mejoran la absorcion de la grasa, las protemas y el almidon en los pacientes que sufren enfermedades como, por ejemplo, la insuficiencia pancreatica, lo que lleva a una mejora de la nutricion y el crecimiento. Las composiciones retienen altos niveles de actividad espedfica en un entorno de acido y pepsina. Este es el caso porque sus componentes enzimaticos resisten el ambiente acido de la parte superior del tracto gastrointestinal, incluyendo el pH bajo del estomago y los niveles altos de proteasa del tracto gastrointestinal, lo que permite el suministro de las enzimas al intestino en forma activa. Como resultado, pueden administrarse en menores cantidades por dosis y mediante menos administraciones, en comparacion con los suplementos de enzimas pancreaticas porcinas. Esto, a su vez, permite una mejora en el cumplimiento del paciente.

Ademas, las composiciones de la presente invencion pueden administrarse a un sujeto sin necesidad de recubrimientos entericos o la adicion de agentes supresores de la acidez. Este es el caso porque los componentes enzimaticos de origen microbiano usados en diversas realizaciones de las composiciones de esta invencion son mas estables frente al acido del estomago que las enzimas pancreaticas porcinas.

El componente de lipasa

El componente de lipasa de las composiciones de la presente invencion es lipasa de Burkholderia cepacia.

Preferentemente, la lipasa es una lipasa estable en un entorno de pH acido y/o es resistente a la degradacion proteolftica. La lipasa se emplea tambien en una forma que mejore su estabilidad al pH acido y/o su resistencia a la degradacion proteolftica. Con este fin, la lipasa esta en forma de cristales reticulados.

Cristalizacion de la lipasa

Los cristales de lipasa utiles en las composiciones de la presente invencion pueden formarse usando procedimientos convencionales, como la cristalizacion por lotes. Vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 6.541.606. Alternativamente, los cristales de lipasa pueden formarse por precipitacion controlada de la protema a partir de una disolucion acuosa o de una disolucion acuosa que contiene disolventes organicos. Vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 5.618.710 y la solicitud de patente de los Estados Unidos 2003/0017144. Como apreciaran los expertos en la tecnica, las condiciones que han de controlarse durante la cristalizacion incluyen, por ejemplo, la velocidad de evaporacion del disolvente, la presencia de cosolutos y tampones apropiados, el pH y la temperatura.

Los cristales de lipasa pueden producirse por combinacion de la enzima lipasa que ha de cristalizarse con un disolvente apropiado o un disolvente acuoso que contiene los agentes precipitantes apropiados, como sales o agentes organicos. El disolvente se combina con la lipasa y se somete opcionalmente a agitacion a una temperatura que se ha determinado experimentalmente como apropiada para la induccion de la cristalizacion y aceptable para el mantenimiento de la estabilidad y la actividad de la protema. Opcionalmente, el disolvente puede contener cosolutos, como cationes divalentes, cofactores o agentes caotropicos, asf como especies tamponantes para controlar el pH. La necesidad de cosolutos y sus concentraciones pueden determinarse experimentalmente para facilitar la cristalizacion. Para un proceso a escala industrial, la precipitacion controlada que conduce a la cristalizacion puede llevarse a cabo de la mejor manera por la simple combinacion de protema, precipitante, cosolutos y, opcionalmente, tampones, en un proceso por lotes. Alternativamente, pueden usarse tambien procedimientos de cristalizacion de laboratorio, como dialisis o difusion de vapor. McPherson y col., Methods Enzymol., 114, pags. 112-120 (1985) y Gilliland, J. Crystal Growth, 90, pags. 51-59 (1988) incluyen una lista exhaustiva de condiciones adecuadas en la bibliograffa sobre cristalizacion. Ocasionalmente, la incompatibilidad entre el medio de cristalizacion y el reticulante puede hacer necesario el cambio del tampon o del disolvente antes de la reticulacion.

La lipasa cristaliza en una serie de condiciones, incluyendo un intervalo de pH de aproximadamente 4-9. Los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

precipitantes utiles para la preparacion del componente de lipasa de las composiciones de la presente invencion incluyen isopropanol, ferc-butanol, 2-metil-2,4-pentadiol (MPD), sulfato de amonio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio y otros conocidos por los expertos en la tecnica. Las sales utiles incluyen cationes divalentes o monovalentes y sus sales.

Los cristales de lipasa utiles en las composiciones de esta invencion pueden tener una dimension longitudinal maxima entre aproximadamente 0,01 pm y aproximadamente 500 pm, alternativamente entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 50 pm o entre aproximadamente 0,1 pm y aproximadamente 10 pm. Pueden tener una forma seleccionada del grupo compuesto por esferas, agujas, bastones, placas, como hexagonos y cuadrados, romboides, cubos, bipiramides y prismas.

Reticulacion de los cristales de lipasa

Una vez que los cristales de lipasa se han formado en un medio adecuado, es posible su reticulacion. La reticulacion resulta en la estabilizacion de la red cristalina mediante la introduccion de enlaces covalentes entre las moleculas de protema que constituyen el cristal. Esto hace posible la transferencia de la enzima a un entorno alternativo que, de lo contrario, para una enzima dada, podna ser incompatible con la existencia de la red cristalina o de la enzima intacta.

Como resultado de la reticulacion de los cristales de lipasa, pueden alterarse la estabilidad enzimatica (por ejemplo, la estabilidad al pH, a la temperatura, mecanica y/o qmmica), el perfil de pH de la actividad lipasa, la solubilidad, la uniformidad del tamano o del volumen del cristal, la velocidad de liberacion de la lipasa del cristal y/o el tamano y la forma de los poros entre moleculas de enzima individuales en la red cristalina subyacente.

Ventajosamente, la reticulacion se lleva a cabo de tal manera que los cristales reticulados resultantes comprenden una lipasa que muestra al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7% o 99,9% o mas de actividad lipasa, en comparacion con la lipasa sin modificar. La estabilidad puede aumentarse en al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% o mas, en comparacion con la lipasa sin modificar. La estabilidad puede medirse en condiciones de almacenamiento, por ejemplo, como estabilidad al pH, estabilidad a la temperatura, estabilidad frente a proteasas, incluyendo las proteasas gastrointestinales y Pronase™, estabilidad en disolucion o como estabilidad biologica in vivo.

En ciertos casos, la reticulacion de los cristales de lipasa ralentiza el paso de la lipasa a la disolucion, inmovilizando eficazmente las moleculas de enzima en partmulas microcristalinas. Con la exposicion a un activador en el entorno que rodea a los cristales de lipasa reticulados, tal como condiciones de uso mas bien que de almacenamiento, los cristales de lipasa se disuelven, liberando el polipeptido de lipasa y/o aumentando la actividad lipasa. La velocidad de disolucion puede ser controlada por uno o mas de los factores siguientes: el grado de reticulacion, la duracion del tiempo de exposicion de los cristales de lipasa al agente reticulante, la velocidad de adicion del agente reticulante a los cristales de lipasa, la naturaleza del reticulante, la longitud de cadena del reticulante, el pH, la temperatura, la presencia de reactivos sulfhidrilos, como cistema o glutation, el area superficial de los cristales de lipasa reticulados, el tamano de los cristales de lipasa reticulados o la forma de los cristales de lipasa reticulados, por ejemplo.

Los cristales de lipasa pueden reticularse por medio de un agente reticulante o una combinacion de estos, incluyendo agentes reticulantes multifuncionales, incluyendo reactivos bifuncionales, simultaneamente (en paralelo) o secuencialmente. En diversas realizaciones, las reticulaciones entre los cristales de lipasa se reducen o se debilitan con la exposicion a un activador en el entorno circundante o en un penodo de tiempo dado, lo que conduce a la disolucion de la lipasa o a la liberacion de actividad. Alternativamente, las reticulaciones pueden romperse en el punto de union, conduciendo a la disolucion de la protema o a la liberacion de actividad. Veanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5.976.529 y 6.140.475. La reticulacion puede llevarse a cabo segun cualquier tecnica de reticulacion convencional.

La concentracion final de reticulante en los cristales de lipasa reticulados debena estar entre aproximadamente 0,001 mM y aproximadamente 300 mM, preferentemente entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 50 mM, lo mas preferentemente entre aproximadamente 2,0 mM y aproximadamente 5,0 mM.

Segun una realizacion preferida de esta invencion, el agente reticulante es suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (“BS3”). Otros reticulantes utiles incluyen glutaraldehfdo, succinaldehudo, octanodialdehfdo y glioxal. Agentes reticulantes multifuncionales adicionales incluyen halotriazinas, por ejemplo, cloruro cianurico; halopirimidinas, por ejemplo, 2,4,6-tricloro/bromopirimidina; anhfdridos o haluros de acidos mono- o dicarboxflicos alifaticos o aromaticos, por ejemplo, anhfdrido maleico, cloruro de (met)acriloilo, cloruro de cloroacetilo; compuestos de W-metilol, por ejemplo, W-metilolcloroacetamida; diisocianatos o diisotiocianatos, por ejemplo, fenilen-1,4-diisocianato y aziridinas. Otros reticulantes incluyen epoxidos, como por ejemplo, diepoxidos, triepoxidos y tetraepoxidos. Para una lista representativa de otros reticulantes disponibles vease, por ejemplo, la edicion de 2003-2004 del catalogo de la empresa Pierce Chemical. Otros ejemplos de reticulantes incluyen: 3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo • HCl (DTBP); ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP); bismaleimidohexano (BMH); 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB); suberimidato de dimetilo • 2HCl (DMS); glutarato de disuccinimidilo (DSG); tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST); clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); etilenglicolbis(succinato de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS); ester de N-(Y-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS); 4-azidobenzoato de N- hidroxisulfosuccinimidilo (sulfo-HSAB); 6-[a-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-LC- SMPT); disulfuro de bis-[p-(4-azidosalicilamido)etilo (BASED) y NHS-PEG-vinilsulfona (NHS-PEG-VS).

Tambien pueden usarse reticulantes reversibles. Tales reticulantes reversibles son reticulantes multifuncionales en los que se incorpora un activador como grupo separado. La funcionalidad reactiva esta implicada en enlazar cadenas laterales aminoaddicas reactivas en una protema y el activador consta de un enlace que puede romperse por alteracion de una o mas condiciones en el entorno circundante (por ejemplo, el pH, la presencia de un agente reductor, la temperatura o la actividad termodinamica del agua).

El reticulante puede ser homofuncional o heterofuncional. La funcionalidad (o fraccion) reactiva puede elegirse, por ejemplo, entre uno de los grupos funcionales siguientes (en los que R, R', R" y R'" pueden ser grupos alquilo, arilo o hidrogeno):

I. Donadores de acilo reactivos como, por ejemplo: esteres de carboxilato RCOOR', amidas RCONHR', acilazidas RCON3, carbodiimidas R-N=C=N-R', esteres de N-hidroximida RCO-O-NR', imidoesteres R-C=NH2+(OR'), anddridos RCO-C-COR', carbonatos RO-CO-O-R', uretanos RNHCONHR', haluros de acido RCOHal (donde Hal es un halogeno), acilhidrazidas RCONNR''R'' y O-acilisoureas RCO-O-C=NR'(-NR''R''').

II. Grupos carbonilo reactivos como, por ejemplo: aldehfdos RCHO y cetonas RCOR', acetales RCO(H2)R' y cetales RR'CO2R'R'' (grupos funcionales reactivos que contienen carbonilo conocidos por los expertos en la tecnica de inmovilizacion de protemas y reticulacion (Pierce Catalog and Handbook, empresa Pierce Chemical 2003-2004; S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, (1991))).

III. Donadores de alquilo o arilo como, por ejemplo: haluros de alquilo o arilo R-Hal, azidas R-N3, esteres de sulfato RSO3R', esteres de fosfato RPO(OR'3), sales de alquiloxonio R3O+, sulfonio R3S+, esteres de nitrato RONO2, aceptores de Michael RCR'=CR'''COR'', fluoruros de arilo ArF, isonitrilos RN+=C-, haloaminas R2N-Hal, alquenos y alquinos.

IV. Grupos que contienen azufre como, por ejemplo: disulfuros RSSR', sulfhidrilos RSH y epoxidos R2COCR'2.

V. Sales como, por ejemplo: sales de alquil- o arilamonio R4N+, carboxilatos RCOO-, sulfatos ROSO3", fosfatos ROPO3 y aminas R3N.

Los reticulantes reversibles, por ejemplo, comprenden un activador. Un activador incluye un alquilo, arilo u otra cadena con un grupo activador que puede reaccionar con la protema que se ha de reticular. Estos grupos reactivos pueden ser una diversidad de grupos, como aquellos susceptibles de desplazamiento nucleofilo, por radicales libres o electrofilo, incluyendo haluros, aldehfdos, carbonatos, uretanos, xantanos y epoxidos, entre otros. Por ejemplo, los grupos reactivos pueden ser labiles a acido, base, fluoruro, enzima, reduccion, oxidacion, tiol, metal, fotolisis, radical o calor.

El cristal de lipasa reticulado puede suministrarse en forma de polvo, por ejemplo, por liofilizacion o por pulverizacion en seco. La liofilizacion o criodesecacion permite la separacion del agua de la composicion, produciendo un cristal que puede almacenarse a temperatura sin refrigeracion (ambiente) durante penodos prolongados y que despues se reconstituye facilmente en disolventes acuosos, organicos o mixtos acuoso-organicos segun se elija, sin la formacion de suspensiones amorfas y con un riesgo mmimo de desnaturalizacion. Carpenter y col., Pharm. Res., 14, pags. 969-975 (1997). La liofilizacion puede llevarse a cabo como se describe en la patente de los Estados Unidos 5.618.710 o por cualquier otro procedimiento conocido en la tecnica. Por ejemplo, el cristal de lipasa reticulado se congela en primer lugar y despues se somete a alto vacfo, en el que el agua cristalina se sublima, dejando atras un cristal de lipasa que solamente contiene las moleculas de agua firmemente unidas.

Caracteristicas de los cristales de lipasa reticulados

La actividad enzimatica de los cristales de lipasa reticulados puede medirse mediante cualquier procedimiento convencional. Por ejemplo, la actividad lipasa puede determinarse espectrofotometricamente como se describe en el ejemplo 6 de la patente de los Estados Unidos 5.618.710. La actividad lipasa puede evaluarse mediante la monitorizacion de la hidrolisis del sustrato acetato de p-nitrofenilo. La escision del sustrato se monitoriza por el aumento de la absorbancia a 400 nm, con una concentracion inicial de sustrato del 0,005% y una concentracion inicial de enzima de 1,5 x 10-8 M. La enzima lipasa se anade a un volumen de reaccion de 5 ml que contiene el sustrato en Tris 0,2 M pH 7,0 a temperatura ambiente. La lipasa cristalina se retira de la mezcla de reaccion por centrifugacion antes de medir la absorbancia.

Alternativamente, la actividad lipasa puede medirse in vitro por hidrolisis de aceite de oliva, como se describe en los ejemplos 2-4 de la patente de los Estados Unidos 5.614.189.

La actividad lipasa puede medirse tambien in vivo. Por ejemplo, un pequeno volumen (aproximadamente 3 ml) de aceite de oliva o de aceite de mafz puede marcarse con 99Tc(V)-tiocianato y la lipasa cristalina puede marcarse con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

111In. La grasa marcada se mezcla con pienso animal sobre el que se ha rociado la lipasa cristalina marcada. Se obtienen imagenes escintigraficas del estomago y del intestino delgado proximales y distales, hasta que queda menos del 5% de actividad en el estomago. Entonces se determinan las curvas de vaciado para cada uno de los isotopos (por ejemplo, el porcentaje de retencion en el estomago a lo largo del tiempo) y las cantidades de los isotopos que entran en el intestino delgado proximal, medio y distal desde las respectivas regiones de interes.

Preferentemente, el componente de lipasa reticulado de las composiciones de la presente invencion tiene una alta actividad espedfica. Tfpicamente, una lipasa de alta actividad espedfica es aquella que muestra una actividad espedfica frente a triolema (aceite de oliva) superior a 500, 1.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 o mas unidades/mg de protema.

Preferentemente, el componente de lipasa reticulado de las composiciones de la presente invencion tambien es estable durante un penodo de tiempo prolongado en el duro entorno que se encuentra en las regiones gastrointestinales, es decir, en las regiones gastrica, duodenal e intestinal. Por ejemplo, la lipasa es preferentemente estable durante al menos una hora en pH acido, por ejemplo, un entorno en el que el pH es inferior a 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 o menos. Como se usa en este documento, “estable” significa que el cristal de lipasa es mas activo que la forma soluble de la lipasa para una condicion y tiempo dados. Asf, un cristal de lipasa estable retiene un porcentaje de su actividad inicial mayor que la correspondiente forma soluble de la lipasa. En algunas realizaciones, el cristal de lipasa retiene al menos el l0% de su actividad despues de su exposicion a las condiciones y el tiempo dados. En otras realizaciones, la lipasa retiene al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mas de su actividad.

Alternativamente, o adicionalmente, el componente de cristal de lipasa reticulado de las composiciones de esta invencion es resistente al calor. Por ejemplo, en diversas realizaciones es estable durante al menos una hora a 30°C, 37°C o 40°C.

El componente de proteasa

El componente de proteasa de las composiciones de la presente invencion es proteasa de Aspergillus melleus. Segun una realizacion preferida, el componente de proteasa de las composiciones de la presente invencion esta en forma cristalizada, sin reticular. Los cristales de proteasa pueden prepararse segun las tecnicas de cristalizacion descritas anteriormente para la lipasa, usando, por ejemplo, etanol como precipitante.

El componente de amilasa

El componente de amilasa de las composiciones de la presente invencion es Aspergillus oryzae, en forma amorfa, o recubierto, o encapsulado o formulado de otra manera de modo que retenga su actividad despues de su administracion por via oral.

Composiciones que comprenden cristales de lipasa reticulados, una proteasa y una amilasa

Las composiciones segun la presente invencion incluyen aquellas que comprenden cristales de lipasa microbiana reticulados, una proteasa microbiana y una amilasa microbiana en una proporcion de aproximadamente 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividad enzimatica como se reivindica en la reivindicacion 1, junto con uno o mas excipientes. Con la maxima preferencia, la composicion comprende cristales de lipasa de Burkholderia cepacia reticulados con el reticulante BS3, cristales de proteasa de Aspergillus melleus y amilasa de Aspergillus oryzae amorfa en una proporcion de aproximadamente 1,0:1,0:0,15 unidades USP de actividad enzimatica.

La reticulacion del componente de lipasa de las composiciones de esta invencion proporciona una estabilidad anadida a valores de pH extremos y proteccion frente a proteolisis, mientras que los componentes de proteasa y amilasa mantienen una solubilidad maxima para su disolucion eficaz. Mas particularmente, la cristalizacion y la reticulacion del componente de lipasa ayudan a proporcionar una composicion con una actividad enzimatica mejorada a dosis mas bajas. La forma de cristal de la proteasa tambien ayuda a proporcionar una mejora de la estabilidad enzimatica, la pureza y la potencia.

E, independientemente de su forma, una o las dos de proteasa y amilasa pueden estar reticuladas.

Ventajosamente, las composiciones de la presente invencion conducen a incrementos correlacionados del coeficiente de absorcion de grasa y del coeficiente de absorcion de nitrogeno en pacientes tratados con ellas. Ademas, las composiciones de esta invencion incluyen un nivel de amilasa que produce un aumento de la digestion de almidon y de la absorcion de hidratos de carbono en estos pacientes. Por la presente invencion, se ha descubierto que un efecto tal en la digestion de almidon y en la absorcion de hidratos de carbono puede conseguirse mediante cantidades mucho menores de amilasa, respecto a las de lipasa y proteasa, que las de los suplementos pancreaticos porcinos. Este descubrimiento se opone a la creencia de la tecnica de que la amilasa no es necesaria para el tratamiento de la insuficiencia pancreatica, en particular en pacientes de fibrosis qrnstica.

Los excipientes utiles en las composiciones segun esta invencion actuan como una sustancia de relleno o una combinacion de sustancias de relleno, como las usadas en las composiciones farmaceuticas. En una realizacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

preferida de esta invencion, el excipiente comprende celulosa microcristalina, Maltrin, crospovidona, dioxido de silicio coloidal, estearato de magnesio y talco. Otro grupo preferido de excipientes incluye uno o una mezcla de: sacarosa, trehalosa, lactosa, sorbitol, lactitol, manitol, inositol, sales de sodio y potasio como acetato, fosfatos, citratos y borato, glicina, arginina, oxido de polietileno, alcohol polivimlico, polietilenglicol, hexilenglicol, metoxipolietilenglicol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, polilisina y poliarginina.

Otros excipientes preferidos pueden ser uno cualquiera o una mezcla de: 1) aminoacidos, como glicina, arginina, acido aspartico, acido glutamico, lisina, asparagina, glutamina, prolina; 2) hidratos de carbono, por ejemplo, monosacaridos como glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, xilosa, ribosa; 3) disacaridos como lactosa, trehalosa, maltosa, sacarosa; 4) polisacaridos como maltodextrinas, dextranos, almidon, glucogeno; 5) alditoles como manitol, xilitol, lactitol, sorbitol; 6) acido glucuronico, acido galacturonico; 7) ciclodextrinas como metilciclodextrina, hidroxipropil-p-ciclodextrina y similares; 8) moleculas inorganicas como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, fosfatos de sodio y potasio, acido borico, carbonato de amonio y fosfato de amonio; 9) moleculas organicas como acetatos, citrato, ascorbato, lactato; 10) agentes emulsionantes o

solubilizantes/estabilizantes como goma de acacia, dietanolamina, monoestearato de glicerina, lecitina,

monoetanolamina, acido oleico, alcohol oleflico, poloxamero, polisorbatos, laurilsulfato de sodio, acido estearico, monolaurato de sorbitano, monoestearato de sorbitano y otros derivados de sorbitano, derivados de polioxilo, cera, derivados de polioxietileno, derivados de sorbitano; y 11) reactivos de aumento de la viscosidad como agar, acido algmico y sus sales, goma guar, pectina, alcohol polivimlico, oxido de polietileno, celulosa y sus derivados, carbonato de propileno, polietilenglicol, hexilenglicol, tiloxapol. Tambien pueden usarse sales de estos compuestos.

Otros ejemplos adicionales de excipientes se describen en el manual Handbook of Pharmaceutical Excipients, publicado conjuntamente por la Asociacion Farmaceutica Americana y la Sociedad Farmaceutica de Gran Bretana. Con respecto a las composiciones, segun esta invencion, los excipientes son ingredientes inactivos y la lipasa, la proteasa y la amilasa son los principios activos. La proporcion entre los principios activos y los ingredientes inactivos (p/p) en las composiciones de esta invencion puede ser de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, preferentemente de aproximadamente 1:6 a aproximadamente 6:1.

En una realizacion alternativa de esta invencion, uno cualquiera de los componentes de lipasa, proteasa o amilasa puede estar presente en la composicion en asociacion con un vehfculo polimerico. Esto proporciona una composicion resistente a acidos de liberacion controlada que permite la administracion de la enzima en cantidades efectivas y a bajas dosis al intestino, es decir, al intestino distal, despues de la ingestion por via oral.

Los vetuculos polimericos utiles incluyen, por ejemplo, polfmeros usados para la encapsulacion de cristales de protema para la administracion de protemas, incluyendo la administracion biologica de liberacion controlada. Tales polfmeros incluyen polfmeros biocompatibles y biodegradables o mezclas de estos. Preferentemente, el vetuculo polimerico es un polfmero biodegradable. La velocidad de disolucion y, por lo tanto, de administracion de las enzimas estara determinada por la tecnica de encapsulacion particular, la composicion del polfmero, la reticulacion del polfmero, el espesor del polfmero, la estabilidad del polfmero, la geometna del cristal de la enzima y el grado de reticulacion de la enzima, dado el caso. Segun una realizacion, las composiciones de esta invencion estan encapsuladas dentro de una matriz del vehfculo polimerico, lo que proporciona una proteccion adicional para los componentes de lipasa, proteasa y amilasa frente al duro entorno del tracto gastrointestinal.

Vias de dosificacion de la composicion, formas, regimenes y procedimientos de tratamiento

Segun una realizacion preferida, las composiciones de esta invencion son utiles para el tratamiento de la insuficiencia pancreatica en cualquier sujeto, incluyendo aquellos que sufren fibrosis qrnstica. Segun una realizacion alternativa, las composiciones de esta invencion son utiles en metodos para el tratamiento de la malabsorcion en un sujeto. Otras realizaciones de esta invencion incluyen el uso de las composiciones de esta invencion para aumentar el coeficiente de absorcion de grasa o para aumentar el coeficiente de absorcion de nitrogeno en un sujeto. Otra realizacion de esta invencion incluye el uso de estas composiciones para aumentar tanto el coeficiente de absorcion de grasa como el coeficiente de absorcion de nitrogeno en un sujeto, opcionalmente en la misma cantidad. En otra realizacion, las composiciones de esta invencion son utiles para aumentar la absorcion de hidratos de carbono en un sujeto.

El uso de las composiciones segun esta invencion comprende la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion tal. Cualquiera de las composiciones de esta invencion puede usarse para tratar a cualquier sujeto que sufra insuficiencia pancreatica, incluyendo los pacientes de fibrosis qrnstica. De manera similar, cualquiera de estas composiciones puede usarse para tratar a cualquier paciente de fibrosis qrnstica.

El uso de las composiciones segun esta invencion incluye la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de esta invencion, en el que esa cantidad terapeuticamente efectiva aumenta el coeficiente de absorcion de grasa en ese sujeto en una cantidad entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 35% sobre el nivel inicial, cuando el coeficiente de absorcion de grasa inicial en dicho sujeto es inferior o igual al 40%. Preferentemente, el aumento del coeficiente de absorcion de grasa en un sujeto tal es de aproximadamente el 30% sobre el nivel inicial. En una realizacion alternativa, el uso comprende la administracion a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de esta invencion, en el que esa cantidad terapeuticamente efectiva aumenta el coeficiente de absorcion de grasa en ese sujeto en una cantidad entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 25% sobre el nivel inicial, cuando el coeficiente de absorcion de grasa inicial en ese sujeto es superior al 40% pero inferior al 85%. Preferentemente, el aumento del coeficiente de absorcion de grasa en un sujeto tal es de aproximadamente el 15% sobre el nivel inicial.

Adicionalmente, el uso de las composiciones segun esta invencion incluye aquellos que comprenden la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de esta invencion, en el que esa cantidad terapeuticamente efectiva aumenta el coeficiente de absorcion de nitrogeno en ese sujeto en una cantidad entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 35% sobre el nivel inicial, cuando el coeficiente de absorcion de nitrogeno inicial en dicho sujeto es inferior o igual al 40%. Preferentemente, el aumento del coeficiente de absorcion de nitrogeno en un sujeto tal es de aproximadamente el 30% sobre el nivel inicial. En una realizacion alternativa, los usos comprenden la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de esta invencion, en los que esa cantidad terapeuticamente efectiva aumenta el coeficiente de absorcion de nitrogeno en ese sujeto en una cantidad entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 25% sobre el nivel inicial, cuando el coeficiente de absorcion de nitrogeno inicial en ese sujeto es superior al 40% pero inferior al 85%. Preferentemente, el aumento del coeficiente de absorcion de nitrogeno en un sujeto tal es de aproximadamente el 15% sobre el nivel inicial.

En otra realizacion, el uso de composiciones segun esta invencion comprende la administracion a un sujeto de una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de esta invencion, en el que esa cantidad terapeuticamente efectiva aumenta la absorcion de hidratos de carbono en ese sujeto en un grado superior o igual a aproximadamente el 10% sobre el nivel inicial. En otra realizacion, tales usos incluyen aquellos en los que la cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion de esta invencion es aquella que aumenta la absorcion de hidratos de carbono en ese sujeto en un grado superior o igual a aproximadamente el 20% sobre el nivel inicial. Como se mide en este documento, un aumento del 10% en la absorcion de hidratos de carbono supone 90 calonas (~377 J) mas por dfa. Despues de 365 dfas se habran absorbido un total de 32.850 calonas (~138 kJ) adicionales por ano. Dado que se necesitan aproximadamente 3.500 calonas (~15 kJ) para ganar 450 g, un aumento del 10% en la absorcion de hidratos de carbono en un sujeto podna suponer, por lo tanto, la ganancia de algo mas de 4 kg por ano.

Las composiciones segun la presente invencion pueden formularse para cualquier via de administracion convencional, incluyendo la administracion por via del tracto gastrointestinal superior, por ejemplo, la boca (por ejemplo en capsulas, comprimidos, suspensiones, o con el alimento) o el estomago o la parte superior del intestino (por ejemplo, mediante tubo o infusion), via oral. Preferentemente, las composiciones se formulan para su administracion por via oral. Por consiguiente, la composicion puede estar en cualquier forma de dosificacion, incluyendo aquellas de un solido, un lfquido, una suspension o una dispersion como, por ejemplo, una capsula, un comprimido, un comprimido oblongo, un sobre o una gragea. Para ninos y bebes o para cualquier adulto incapaz de tomar comprimidos o capsulas, las composiciones se administran en forma lfquida, en suspension o en sobres y pueden administrarse con otros alimentos o productos compatibles.

En una realizacion de esta invencion, las composiciones segun esta invencion se administran a un sujeto en el momento de una comida o tentempie en una o mas capsulas, suspensiones o sobres. Preferentemente, las composiciones de esta invencion se administran al sujeto en una o dos capsulas, suspensiones o sobres por comida o tentempie. Las composiciones pueden administrarse despues de haber consumido la mitad de la comida o el tentempie. Una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion para el tratamiento de la insuficiencia pancreatica segun la presente invencion comprende lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1:1:0,15 unidades USP de actividad enzimatica y, por dosis, comprende: un nivel de lipasa activa de entre aproximadamente 5.000 unidades USP y aproximadamente 100.000 unidades USP, un nivel de proteasa activa de entre aproximadamente 5.000 unidades USP y aproximadamente 100.000 unidades USP y un nivel de amilasa activa de entre aproximadamente 750 unidades USP y aproximadamente 15.000 unidades USP. Mas preferentemente, tales composiciones comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1:1:0,15 unidades USP de actividad enzimatica y, por dosis, comprenden: un nivel de lipasa activa de entre aproximadamente 25.000 unidades USP y aproximadamente 100.000 unidades USP, un nivel de proteasa activa de entre aproximadamente 25.000 unidades USP y aproximadamente 100.000 unidades USP y un nivel de amilasa activa de entre aproximadamente 3.750 unidades uSp y aproximadamente 15.000 unidades USP. Lo mas preferentemente, tales composiciones comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1:1:0,15 unidades USP de actividad enzimatica y, por dosis, comprenden: un nivel de lipasa activa de aproximadamente 25.000 unidades USP, un nivel de proteasa activa de aproximadamente 25.000 unidades USP y un nivel de amilasa activa de aproximadamente 3.750 unidades USP.

Para ninos, las composiciones segun esta invencion comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1:1:0,15 unidades USP de actividad enzimatica y, por dosis, comprenden: un nivel de lipasa activa de entre aproximadamente 12.500 unidades USP y aproximadamente 25.000 unidades USP, un nivel de proteasa activa de entre aproximadamente 12.500 unidades USP y aproximadamente 25.000 unidades USP y un nivel de amilasa activa de entre aproximadamente 1.875 unidades USP y aproximadamente 3.750 unidades USP. Para bebes, estas composiciones comprenden lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de aproximadamente 1:1:0,15 unidades USP de actividad enzimatica y, por dosis, comprenden: un nivel de lipasa activa de entre

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

aproximadamente 500 unidades USP y aproximadamente 1.000 unidades USP, un nivel de proteasa activa de entre aproximadamente 500 unidades USP y aproximadamente 1.000 unidades USP y un nivel de amilasa activa de entre aproximadamente 75 unidades USP y aproximadamente 150 unidades USP. Para todos los valores e intervalos de unidades de actividad enzimatica discutidos en este documento, una unidad de lipasa, proteasa o amilasa se define segun los ensayos expuestos anteriormente para la enzima respectiva. Las cantidades descritas anteriormente son tambien, respectivamente, cantidades terapeuticamente efectivas para el tratamiento de la malabsorcion o la mala digestion en adultos, ninos o bebes; o para el aumento de cualquiera de entre el coeficiente de absorcion de grasa, el coeficiente de absorcion de nitrogeno, la absorcion de hidratos de carbono o la digestion de almidon en adultos, ninos o bebes.

El modo mas efectivo de administracion y la pauta posologica de las composiciones segun esta invencion dependera del efecto deseado, el tratamiento previo, dado el caso, el estado de salud del sujeto o el estado de la enfermedad misma, la respuesta al tratamiento y el juicio del medico que aplica el tratamiento.

Ante una mejona del estado del sujeto, puede adoptarse un regimen de mantenimiento, segun se necesite. Posteriormente pueden reducirse la dosis o la frecuencia de administracion o ambas, en funcion de los smtomas, hasta un nivel en el que se mantenga el estado de mejona. Sin embargo, los sujetos pueden requerir un tratamiento intermitente a largo plazo si se produce una reaparicion de las enfermedades o de los smtomas de estas.

Con el fin de que esta invencion pueda entenderse mejor se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos solamente tienen un proposito ilustrativo y no han de interpretarse como limitantes del alcance de la invencion en ningun modo.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se refieren a composiciones segun la presente invencion, asf como a estudios clmicos que evaluan su seguridad y eficacia para el tratamiento de la insuficiencia pancreatica. Estos estudios incluyeron ensayos clmicos de fase I y de fase II en pacientes de fibrosis qrnstica con insuficiencia pancreatica.

El estudio de fase II evaluo la eficacia de las composiciones segun esta invencion, medida por los cambios en: el coeficiente de absorcion de grasa (“CFA”), el coeficiente de absorcion de nitrogeno (“CNA”), la absorcion de hidratos de carbono por via oral, el peso de las deposiciones diarias, el numero de deposiciones al dfa y la calidad de vida, en terminos de smtomas gastrointestinales, medidos mediante el Cuestionario de Fibrosis Qrnstica (“CFQ”). El estudio evaluo tambien la dosificacion de estas composiciones que proporciona el maximo grado de mejora clmicamente significativa del coeficiente de absorcion de grasa sobre el nivel inicial (sin enzimas) en los sujetos tratados.

Como se demuestra en el estudio de fase II, las composiciones segun la presente invencion proporcionaron un aumento estadfsticamente significativo del CFA y del cNa medios desde el penodo inicial al penodo de tratamiento en pacientes de fibrosis qrnstica con insuficiencia pancreatica. Se encontro que las composiciones segun esta invencion fueron eficaces a una dosis minima de 25.000 unidades USP de lipasa, 25.000 unidades USP de proteasa y 3.750 unidades USP de amilasa por capsula (“la dosis media” o el “grupo 2” del estudio), y condujeron a un aumento significativo (> 10%) tanto del CFA como del CNA en la mayona de los sujetos. El CFA y el CNA tambien aumentaron cuando la dosis de tratamiento contuvo lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de 100.000:100.000:15.000 unidades USP de actividad enzimatica por capsula (“la dosis superior” del “grupo 3” del estudio). Sin embargo, no se observo una diferencia estadfstica entre las pautas de dosis media y dosis superior ni con respecto a CFA ni a CNA. Las composiciones segun esta invencion y usadas en el estudio de fase II incluyen tambien aquellas administradas a una dosis de 5.000 unidades USP de lipasa, 5.000 unidades USP de proteasa y 750 unidades USP de amilasa por capsula (la “dosis baja” o el “grupo 1” del estudio).

Ventajosamente, incluso despues de considerar los valores iniciales del CFA y el CNA y el genero de los sujetos tratados, este efecto de las composiciones segun esta invencion sobre el CFA y el CNA siguio siendo estadfsticamente significativo (p = 0,0003 y < 0,0001, respectivamente, para los grupos de tratamiento de dosis media y dosis superior). Cuando el CFA y el CNA se examinaron como cuartiles separados (figuras 1 y 2), los mayores cambios se observaron en aquellos sujetos con valores iniciales < 40% y cambios proporcionalmente menores se observaron en los sujetos con CFA y el CNA iniciales > 40%. Con respecto al CFA, el aumento medio en el grupo de tratamiento de dosis media de los ocho sujetos con un CFA inicial < 40% fue del 35,3%. El aumento medio en el grupo de dosis superior de 12 sujetos con un CFA inicial < 40% fue del 30,4%. El aumento global del CFA en 20 sujetos con un CFA inicial < 40% para los grupos de tratamiento de dosis media y de dosis superior fue del 32,3%.

Las composiciones segun esta invencion produjeron tambien un efecto significativo del tratamiento, medido en terminos del cambio en el numero y peso de las deposiciones diarias en los sujetos tratados. Los sujetos que recibieron la dosis superior mostraron una disminucion significativa del numero de deposiciones desde el penodo inicial al penodo de tratamiento, mientras que la disminucion del peso de las deposiciones fue estadfsticamente significativa para los grupos de tratamiento de dosis media y de dosis superior. De hecho, hubo una correlacion inversa altamente significativa (R = -0,7283; p < 0,0001) entre el cambio en la absorcion de grasa y el cambio en el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

peso de las deposiciones. A este respecto, por lo tanto, la dosis superior (grupo 3) del estudio no difirio significativamente de la dosis media (grupo 2).

En todos los sujetos del estudio, aunque no se notaron cambios globales estadfsticamente significativos en la prueba de exposicion a almidon con y sin enzimas, el efecto observado en los sujetos tratados con la dosis superior, tanto en el cambio maximo del nivel de glucosa como en el area bajo la curva (“AUC”) tendieron (p < 0,057) en una direccion que sugirio una actividad amilasa. Ademas, un analisis ad hoc mediante la prueba exacta de Fisher mostro que, basandose en una comparacion de los penodos de tratamiento sin y con enzimas (p = 0,0138), mas sujetos experimentaron un aumento > 10% en el cambio maximo del nivel de glucosa despues de la prueba de exposicion a almidon en el grupo de dosis media y en el grupo de dosis superior que en el grupo de tratamiento de dosis inferior. Estos resultados demuestran que la amilasa funciona como un componente importante de las composiciones de esta invencion, que conduce a la mejora de la digestion del almidon y de la absorcion de los hidratos de carbono.

No se describieron sucesos adversos graves en sujetos tratados con las composiciones segun esta invencion, que se toleraron bien a todos los niveles de dosificacion en el estudio de fase II. No se produjo el fallecimiento de ningun sujeto en el curso de este estudio.

Ejemplo 1 - Preparacion de las composiciones del estudio

Las composiciones usadas en los estudios de fase I y de fase II discutidos en este documento comprendieron lipasa, proteasa y amilasa, cada una de las cuales se preparo separadamente en condiciones controladas a partir de cepas microbianas diferentes antes de su aislamiento, purificacion y secado. La preparacion se llevo a cabo de modo que se proporcionaran composiciones que fueran estables y mantuvieran una actividad enzimatica potente dentro del intestino delgado.

Lipasa: los procedimientos para la produccion y la purificacion de lipasa a partir de bacterias son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, el componente de lipasa de las composiciones se produjo a traves de la fermentacion de la bacteria Burkholderia cepacia (conocida anteriormente como Pseudomonas cepacia). La fermentacion tuvo lugar en un fermentador de 25.000 litros. La cepa se obtuvo de un banco de celulas patron congeladas y liofilizadas, se hizo crecer en superficie inclinada, se incubo en ocho litros de cultivo de siembra, despues se dejo fermentar en un fermentador de siembra de 2.500 litros y, por ultimo, se realizo la produccion en el fermentador de 25.000 litros. Despues de la fermentacion, los organismos viables se destruyeron mediante tratamiento termico y se eliminaron por centrifugacion. La protema se concentro por evaporacion, seguida de precipitacion con etanol y lavado con etanol en una centnfuga de cesta.

Una lipasa mas purificada se genero por precipitacion con sulfato de amonio, adsorcion y elucion con DEAE-celulosa y posterior refinado, concentracion y desalinizacion por ultrafiltracion. El material resultante se purifico adicionalmente por tratamiento con acetona y CM-celulosa y despues se le anadio glicina como agente estabilizante. El material resultante se filtro por membrana y despues se liofilizo. Entonces, el material se tamizo y se analizo su actividad espedfica, su pureza y la ausencia de patogenos.

La lipasa purificada se proceso posteriormente por diafiltracion con el fin de eliminar el estabilizante de glicina. Despues se precipito y se cristalizo en ferc-butanol al 25%, a lo que siguio la reticulacion con BS3 con los intervalos de concentracion descritos anteriormente, preferentemente de modo que la concentracion final de reticulante en los cristales de lipasa reticulados estuviera en el intervalo entre aproximadamente 2,0 mM y aproximadamente 5,0 mM. Los cristales de lipasa reticulados se lavaron con cinco volumenes de tampon de etanol al 15%, a lo que siguio un lavado adicional con cinco volumenes de tampon de etanol al 15% (con acetato de calcio 1,5 mM, pH 5,0), con el fin de reducir la cantidad residual de reticulante y ferc-butanol. El material resultante se liofilizo y envaso para su envfo en botellas de HPDE cerradas con cinta, empaquetadas en una bolsa de PE con un desecante de gel de sflice. Cada lote se analizo espedficamente en cuanto a la contaminacion microbiologica con Burkholderia cepacia ademas de otros microorganismos y debio dar un resultado negativo para Burkholderia cepacia y microorganismos patogenos antes de autorizarse su uso clmico.

Proteasa: los procedimientos para la produccion y la purificacion de proteasa son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la proteasa se produjo por fermentacion solida de Aspergillus melleus. El cultivo de siembra se hizo crecer en disolucion y luego se transfirio al salvado de trigo. Una vez que el cultivo de siembra hubo recubierto el salvado esterilizado, los solidos se cargaron en bandejas para su fermentacion en salas de fermentacion. Despues de finalizar la fermentacion, la enzima se extrajo de la biomasa solida por perfusion de agua a traves de tanques de extraccion de gran tamano.

Despues, el extracto que contema la proteasa se hizo pasar a traves de lechos de carbon y se filtro para eliminar las partfculas en suspension. La disolucion se concentro luego y se trato con carbon una segunda vez. La proteasa se precipito con etanol y despues se seco al vado para su purificacion final.

La proteasa se disolvio y despues se paso a traves de una resina de intercambio ionico. El material se filtro a continuacion antes de transferirlo a los tanques de cristalizacion, donde se cristalizo con adiciones multiples de etanol. Una vez finalizada la cristalizacion, los cristales se recuperaron en una centnfuga de cesta y se lavaron con mas etanol. Los cristales se recuperaron de la centnfuga de cesta y se secaron con aire forzado, seguido de secado

5

10

15

20

25

30

35

40

45

al vado. Una vez seco, el polvo se transfirio a contenedores graneleros para su tamizado y envasado final.

Amilasa: los procedimientos para la produccion y la purificacion de amilasa son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la amilasa se produjo por fermentacion solida de Aspergillus oryzae. El cultivo de siembra se hizo crecer en disolucion y luego se transfirio al salvado de trigo. Una vez que el cultivo de siembra hubo recubierto el salvado esterilizado, los solidos se cargaron en bandejas para su fermentacion. Despues de haber finalizado la fermentacion, la enzima se extrajo de la biomasa solida por perfusion de agua a traves de tanques de extraccion. Luego, el extracto filtrado se concentro y se diafiltro. A esta diafiltracion le siguio un tratamiento termico y un ajuste del pH, seguidos de otra diafiltracion y concentracion. Despues, antes del secado por pulverizacion, se anadio gelatina de pescado al material como estabilizante, que representa hasta el 30% del peso total del producto. Una vez seco, el material se tamizo, se mezclo con dextrina y se envaso. La dextrina se utilizo como estabilizante para el almacenamiento a largo plazo y podna representar hasta el 30% del peso total del producto final. La protema en los principios farmaceuticamente activos resultantes fue de una pureza superior al 90% segun determinacion por SEC HPLC, con deteccion a 280 nm. Este 90% no tiene en cuenta la presencia de gelatina o dextrina como excipientes; ninguno de los excipientes tuvo una absorbancia significativa a 280 nm. Despues de haberse purificado y procesado, la lipasa, la proteasa y la amilasa se formularon conjuntamente como capsulas. Mas en particular, las enzimas secas se mezclaron en seco (con excipientes) y se introdujeron en capsulas de gelatina. Las composiciones se denominaron TheraCLEC™.

Ejemplo 2 - El estudio de fase II

Dosis de tratamiento

Las composiciones usadas en el estudio de fase II comprendieron principios activos de cristales de lipasa reticulados de Burkholderia cepacia, cristales de proteasa de Aspergillus melleus y amilasa soluble de Aspergillus oryzae y los siguientes ingredientes inactivos: celulosa microcristalina, Maltrin, crospovidona, dioxido de silicio coloidal, estearato de magnesio y talco. Dichas composiciones conteman lipasa, proteasa y amilasa en una proporcion de 1:1:0,15 unidades USP de actividad enzimatica.

Las composiciones se administraron en forma de capsulas de dos concentraciones diferentes. La formulacion de mayor concentracion, denominada “TCT20”, se introdujo en capsulas de gelatina dura, blancas y opacas del tamano 2, con una concentracion de 20.000 unidades USP de lipasa, 20.000 unidades USP de proteasa y 3.000 unidades USP de amilasa. La formulacion de menor concentracion, denominada “TCT5”, se introdujo en capsulas de gelatina dura, blancas y opacas del tamano 5, con una concentracion de 5.000 unidades USP de lipasa, 5.000 unidades USP de proteasa y 750 unidades USP de amilasa. La proporcion entre los ingredientes activos e inactivos (p/p) fue de 3:4 para TCT20 y de 2:5 para TCT5.

En el estudio de fase II se usaron capsulas de placebo de tamanos 2 y 5 para enmascarar la dosis de TheraCLEC™. Las capsulas de placebo conteman los mismos ingredientes inactivos que las capsulas de TheraCLEC™ y teman el mismo aspecto que las capsulas de TheraCLEC™, de modo que la identidad de las capsulas (activa frente a placebo) era desconocida. Se administro el numero y el tipo de capsulas de TheraCLEC™ y de placebo adecuados para conseguir el nivel de dosis enmascarado para el que el sujeto se habfa aleatorizado.

Durante el estudio de fase II, aproximadamente a la mitad de la comida o tentempie durante un penodo de tratamiento de 28 dfas, los sujetos tomaron un total de seis capsulas, que eran una combinacion de capsulas de TheraCLEC™ y de placebo, de las que una era una capsula del tamano 5 y cinco eran capsulas del tamano 2, como se describe a continuacion:

Tabla 1. Distribucion del tratamiento de estudio frente a placebo, por grupo de tratamiento

Numero de capsulas por comida/tentempie

Grupo de estudio

Capsulas del tamano 5 Capsulas del tamano 2

Grupo 1

1 TCT5 5 placebo

Grupo 2

1 TCT5 1 TCT20 4 placebo

Grupo 3

1 placebo 5 TCT20

Seleccion y ritmo de las dosis

La dosis maxima fijada del estudio de fase II de 100.000 unidades USP de lipasa por comida fue equivalente a 1.250 unidades USP de lipasa por kg para un sujeto de 80 kg y 2.500 unidades uSp de lipasa por kg para un sujeto de 40 kg.

Tabla 2. Dosis del farmaco de estudio TheraCLEC™

Unidades USP por comida o tentempie

TheraCLEC1™

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Principio activo

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

Lipasa

5.000 25.000 100.000

Proteasa

5.000 25.000 100.000

Amilasa

750 3.750 15.000

Otros parametros del estudio de fase II

El estudio de fase II fue un ensayo aleatorizado, con doble ciego y busqueda de rango de dosis en paralelo. El estudio incluyo un total de 129 sujetos de genero masculino y femenino de aproximadamente 26 localidades de los EE.UU. y tres niveles de dosis de TheraCLEC™ (aproximadamente 42 sujetos por grupo). El estudio se separo en cuatro penodos diferentes de observacion y evaluacion: cribado, inicial, tratamiento y seguimiento.

La poblacion del estudio de fase II

Las composiciones preparadas como se describe anteriormente se ensayaron en tres poblaciones de sujetos. La poblacion con intencion de tratar modificada (“mITT”) incluyo todos los sujetos elegibles que se sometieron a mediciones en el penodo inicial (sin enzimas), recibieron al menos una dosis aleatorizada, y para los que se llevaron a cabo evaluaciones de la seguridad en el penodo de tratamiento y una recogida de deposiciones entre marcadores. Se ensayaron otras poblaciones de sujetos y los resultados fueron coherentes con los de la poblacion mITT.

Penodo de cribado (dia S1 - penodo inicial)

En el dfa uno de la consulta de cribado (dfa S1), se entrevisto a los sujetos para determinar su elegibilidad para participar en el estudio. Los sujetos se sometieron tambien a un examen ffsico completo.

Se pidio a los sujetos que ingirieran una dieta rica en grasa durante todo el penodo del estudio. Se les permitio tomar la medicacion requerida para el tratamiento y manejo de su fibrosis qmstica subyacente y otras enfermedades afines. Los sujetos no debfan recibir productos de suplementacion enzimatica o complementos dieteticos que podnan haberse interpretado como suplementacion enzimatica durante los penodos hospitalarios inicial (dfas B1 a B3) y de tratamiento (dfas T1 a T28) del estudio.

Los sujetos se aleatorizaron para una de las tres dosis enmascaradas de TheraCLEC™

Periodo inicial (dias B1 a B3)

En un plazo de 10 a 14 dfas desde la consulta de cribado, se requirio de los sujetos aleatorizados que ingresaran en el centro hospitalario en estado de ayuno y antes de la primera comida del dfa (desayuno). El penodo inicial comenzo con la primera comida del dfa (desayuno) el dfa B1. Antes del desayuno, se determino el peso corporal. Despues, el sujeto comenzo un penodo de dieta controlada de 72 horas sin suplementacion de enzimas pancreaticas. Al principio de la primera comida el dfa B1 se tomo un marcador de deposiciones (500 mg de colorante azul FD&C n° 2). La ingestion de grasa y protema se registro en funcion del consumo real. La recogida de deposiciones para la evaluacion de la grasa y el nitrogeno fecales comenzo una vez expulsado el primer marcador (la deposicion que contema el primer marcador se descarto) y se finalizo cuando se empezo a observar el segundo marcador en la deposicion (la deposicion que contema el segundo marcador se recogio).

Cada dfa del penodo inicial se evaluaron los sujetos en cuanto a sucesos adversos y medicaciones concomitantes, se registraron las constantes vitales y se realizo un breve examen ffsico.

Periodo de tratamiento (dias T1 a T28)

La primera dosis del farmaco de estudio se administro a cada sujeto el dfa uno del penodo de tratamiento (T1), aproximadamente a la mitad de la primera comida despues de haber finalizado los procedimientos predosis y la prueba de exposicion a almidon el dfa T1 (almuerzo). Los sujetos se observaron entonces durante al menos 30 minutos despues de la administracion de la primera dosis. En caso de haber tolerado bien el farmaco, los sujetos tomaron luego la misma dosis del farmaco de estudio aproximadamente a la mitad de cada una de las tres comidas y dos tentempies desde el dfa T1 hasta el dfa T28 del penodo de tratamiento. En este estudio, la mitad de una comida se definio como el momento en el que los sujetos habfan consumido aproximadamente la mitad de la comida o el tentempie.

El dfa T29, los sujetos interrumpieron la toma del farmaco de estudio. Durante la consulta ambulatoria al final del tratamiento el dfa T29 se realizo un examen ffsico completo. Los sujetos se evaluaron tambien en cuanto a sucesos adversos.

Periodo de seguimiento (dia F7 + 2)

Durante el penodo de seguimiento, los sujetos se mantuvieron con una dieta rica en grasa y con las enzimas de la medicacion usual segun prescripcion de su medico. La consulta ambulatoria al final del penodo de seguimiento (dfa F7 + 2) se planifico para tener lugar 7 + 2 dfas despues de la consulta de finalizacion del penodo de tratamiento (dfa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T29). En esta consulta, los sujetos se sometieron a un breve examen f^sico y se evaluaron en cuanto a sucesos adversos y medicaciones concomitantes.

Analisis de grasa y nitrogeno en las deposiciones

Durante la consulta de cribado se recogieron deposiciones para una prueba de elastasa fecal puntual con el fin de evaluar la elegibilidad para el estudio. Las deposiciones de cada sujeto se analizaron en varios momentos durante el estudio para determinar la presencia de sangre oculta y leucocitos.

Durante el penodo inicial hospitalario y el penodo de tratamiento hospitalario se suministro un marcador indicador (500 mg de colorante azul fD&C n° 2) al principio de la primera comida de la dieta controlada (desayuno), que consistio en aproximadamente 100 g de grasa y un mmimo de aproximadamente 2 g de protema por kg de peso corporal por dfa. La ingestion real de grasa y protema debena registrarse en funcion de la comida consumida.

Despues de 72 horas con la dieta controlada, se suministro un segundo marcador indicador azul a los sujetos en ayunas con la comida de prueba para la prueba de exposicion a almidon. La recogida de deposiciones para la evaluacion de grasa y nitrogeno fecales comenzo despues de haber expulsado el primer marcador azul y se finalizo despues de haber expulsado el segundo marcador azul. Se determino el peso de las deposiciones recogidas y se analizo el contenido de grasa y nitrogeno. Seligson, D. (ed.), Standard Methods of Clnical Chemistry, volumen II, Fatty Acids in Stool, 1985, Academic Press, pags. 34-39; Veldee M. S., Nutritional Assessment, Therapy and Monitoring en Burtis, C. A., Ashwood, E.R. (eds.), Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3.a edicion, 1999, W. B. Sanders Co., pags. 1385-86.

El coeficiente de absorcion de grasa (% CFA) se calculo manualmente mediante dos puntos de datos:

1) el consumo de grasa en g/24 horas, suministrado por el dietista de investigacion central y

2) la excrecion de grasa en g/24 horas, suministrada por los servicios de laboratorio de la Clmica Mayo.

El CFA se calculo manualmente de la manera siguiente:

promedio de gramos de grasa consumida en 24 h- promedio de gramos de grasa excretada en 24 k

promedio de gramos de grasa consumida en 24 k *100

El coeficiente de absorcion de nitrogeno (% CNA) se calculo manualmente mediante dos puntos de datos:

1) el consumo de nitrogeno en g/24 horas, suministrado por el dietista de investigacion central y

2) la excrecion de nitrogeno en g/24 horas, suministrada por los servicios de laboratorio de la Clmica Mayo. El CNA se calculo manualmente de la manera siguiente:

frame d\o de gramos de nitrogeno consumida en 24 h- de gramos de nitrogeno excretado en 24 fc

premedio de gramos de n'.trdgeno consvmido enZ4h 5

Evaluacion de la eficacia - Coeficiente de absorcion de grasa

El coeficiente de absorcion de grasa en el penodo inicial, en el penodo de tratamiento y el cambio desde el penodo inicial al de tratamiento se resumio por grupo de tratamiento. El coeficiente de absorcion de grasa descrito fue la media de dos calculos del CFA independientes, usando dos resultados de grasa fecal a partir de una recogida de deposiciones. La diferencia en el coeficiente de absorcion de grasa medio durante el penodo de tratamiento entre los tres grupos de tratamiento se analizo mediante un analisis de la varianza de un factor. Con el fin de evaluar las tres comparaciones de parejas posibles, a la vez que se consideraba una tasa de error global de tipo I del 5%, se uso la prueba del rango estudentizado de Tukey. La variable dependiente incluyo las mediciones durante el tratamiento.

Tambien se realizo un analisis de regresion lineal que examinaba los efectos simultaneos del grupo de tratamiento y del CFA inicial medio. De nuevo, la variable dependiente incluyo las mediciones durante el penodo de tratamiento. Otros factores adicionales analizados en el modelo incluyeron las siguientes determinaciones en el penodo inicial: edad, genero, raza e mdice de masa corporal (IMC). Para estos factores adicionales se uso un proceso de eliminacion progresiva para eliminar los factores no significativos (p > 0,10) del modelo. En este analisis de regresion lineal tambien se realizaron comparaciones por parejas mediante la prueba del rango estudentizado de Tukey.

El coeficiente de absorcion de grasa (CFA) en el penodo inicial, en el penodo de tratamiento y el cambio desde el penodo inicial al de tratamiento para la poblacion mITT se resume a continuacion en la tabla 3 por grupo de tratamiento. En las tres poblaciones de tratamiento se observo un aumento significativo en el CFA medio desde el penodo inicial al penodo de tratamiento. El CFA durante el penodo de tratamiento fue significativamente mayor en los dos grupos de tratamiento 2 (la dosis media) y 3 (la dosis superior) que en el grupo de tratamiento 1 (la dosis baja). Ademas, los grupos de tratamiento 2 y 3 presentaron un mayor aumento medio del CFA entre el penodo sin

5

10

15

20

25

enzimas y con enzimas que el grupo de tratamiento 1. Mientras que el grupo de tratamiento 3 mostro una ventaja numerica consistente sobre el grupo de tratamiento 2, esta diferencia no fue estadfsticamente significativa.

Tabla 3. Coeficiente de absorcion de grasa medio - Analisis de la varianza

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Total valor de p*

(N=39) (N=41) (N=37) (N=117)

Penodo inicial

N

39 41 36 116

Media

55,0 55,6 52,2 54,4

(DE)

(17,54) (20,29) (19,14) (18,94)

Tratamiento **

N

39 41 37 117

Media

56,2 67,0 69,7 64,3 0,0032

(DE)

(18,16) (18,08) (17,86) (18,81)

Cambio desde el

penodo inicial al de tratamiento

N

39 41 36 116

Media

1,2 11,4 17,3 9,8 0,0005

(DE)

(14,77) (19,10) (18,37) (18,59)

Porcentaje de cambio (%) desde el penodo inicial al de tratamiento

N

39 41 36 116

Media

5,6 42,7 45,9 31,2 0,0153

J2E)______________

(32,15) (95,46) (53,51) (68,69)

* Valor de p global del analisis de la varianza.

** Resultados en el penodo de tratamiento (mediante la prueba del rango estudentizado de Tukey para comparaciones por parejas):

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 2, valor de p de mITT = 0,0229.

Grupo de tratamiento 2 frente a grupo de tratamiento 3, valor de p de mITT = 0,7874.

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 3, valor de p de mITT = 0,0041.

Si el CFA inicial se divide en quintiles del 0 al 100%, resulta claro que todos los grupos de tratamiento mostraron un

aumento mayor sobre el nivel inicial para un CFA del 0 al 40% que en caso de un CFA inicial superior al 40% (vease la figura 1). Ademas, cuanto mas bajo era el CFA inicial, mayor fue la respuesta al tratamiento.

Evaluacion de la eficacia - Coeficiente de absorcion de nitrogeno

El coeficiente de absorcion de nitrogeno (CNA) en los penodos inicial (B1 a B3) y de tratamiento para la poblacion mITT se resume a continuacion en la tabla 4 por grupo de tratamiento. El coeficiente de absorcion de nitrogeno descrito fue la media de dos calculos del CNA independientes, usando dos resultados de nitrogeno fecal a partir de una recogida de deposiciones. La diferencia en el CNA medio entre los tres grupos de tratamiento se analizo de la misma manera que el CFA.

De manera similar a las mediciones del CFA, las tres poblaciones de tratamiento mostraron un aumento significativo del CNA medio desde el penodo inicial al penodo de tratamiento. En las tres poblaciones de tratamiento, el CNA en el penodo de tratamiento fue significativamente mayor en los grupos de tratamiento 2 y 3 que en el grupo de tratamiento 1. Ademas, los grupos de tratamiento 2 y 3 presentaron un mayor aumento medio del CNA entre el penodo sin enzimas y con enzimas que el grupo de tratamiento 1. Mientras que el grupo de tratamiento 3 mostro una ventaja numerica consistente sobre el grupo de tratamiento 2, esta diferencia no fue estadfsticamente significativa.

Tabla 4. Coeficiente de absorcion de nitrogeno medio - Analisis de la varianza

Grupo 1 (N=39) Grupo 2 (N=41) Grupo 3 (N=37) Total (N=117) valor de p*

Penodo inicial

5

10

15

20

25

30

N

39 41 36 116

Media

60,6 58,8 56,8 58,8

(DE)

(16,38) (17,88) (16,36) (16,84)

Tratamiento **

N

39 41 37 117

Media

61,6 71,3 74,6 69,1 0,0009

(DE)

(15,46) (16,38) (13,51) (16,05)

Cambio desde el

periodo inicial al de tratamiento

N

39 41 36 116

Media

1,1 12,5 17,5 10,2 0,0002

(DE)

(14,89) (18,37) (18,00) (18,33)

Porcentaje de cambio (%) desde el periodo inicial al de tratamiento

N

39 41 36 116

Media

9,0 37,6 40,6 29,0 0,0883

J2E)_________________

(48,83) (96,72) (45,04) (69,74)

* Valor de p global del analisis de la varianza.

** Resultados en el periodo de tratamiento (mediante la prueba del rango estudentizado de Tukey para comparaciones por parejas):

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 2, valor de p de mITT = 0,0145.

Grupo de tratamiento 2 frente a grupo de tratamiento 3, valor de p de mITT = 0,6130.

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 3, valor de p de mITT = 0,0009.

Si el CNA inicial se divide en quintiles del 0 al 100%, resulta claro en la figura 2 que todos los grupos de tratamiento mostraron un aumento mayor sobre el nivel inicial cuando el CNA inicial era del 40% o inferior que cuando el CNA inicial era superior al 40%. Los grupos de tratamiento 2 y 3 fueron aparentemente mas efectivos que el grupo de tratamiento 1. Ademas, cuanto mas bajo era el CNA inicial, mayor fue la respuesta al tratamiento.

Mejoras en el CFA y el CNA y correlacion entre estos

El estudio reflejo un aumento significativo del CFA y el CNA medios desde el penodo inicial al periodo de tratamiento en los grupos de tratamiento de dosis media y superior en las tres poblaciones de tratamiento. Ademas, el grupo de tratamiento 3 (el grupo de tratamiento de dosis superior) mostro el mayor aumento medio del CFA y el CNA en este periodo, aunque la diferencia entre las dosis media y alta no fue estadfsticamente significativa. Incluso despues de considerar los valores iniciales del CFA y el CNA y el genero, este efecto del tratamiento en el CFA y el CNA siguio siendo estadfsticamente significativo (p = 0,0003 y < 0,0001, respectivamente).

La correlacion entre los aumentos del CFA y el CNA tambien fue estadfsticamente significativa. Las figuras 3 y 4 ilustran la correlacion entre el CFA y el CNA en los pacientes mITT tratados con todas las composiciones dosificadas segun la presente invencion en el nivel inicial y en el nivel de tratamiento, respectivamente. La figura 5 ilustra la diferencia entre la correlacion entre el CFA y el CNA en los niveles inicial y de tratamiento en esos pacientes.

Evaluacion de la eficacia - Analisis del cambio desde el periodo inicial - Muestreo de deposiciones

Los cambios en la media del numero de deposiciones y del peso de las deposiciones entre los periodos inicial y de tratamiento frente al valor final del penodo de tratamiento relevante se representan separadamente para cada grupo de tratamiento del estudio en las tablas 5 y 6, respectivamente.

En los tres grupos de tratamiento hubo una disminucion del numero de deposiciones desde el penodo inicial al penodo de tratamiento (p = 0,0968, p = 0,0975 y p = 0,1807, respectivamente). En particular, el grupo de tratamiento 3 mostro la mayor disminucion media (-2,6 en la poblacion mITT) en el numero de deposiciones desde el penodo inicial al penodo de tratamiento (p = 0,0003). Sin embargo, una comparacion del cambio en el numero de deposiciones entre grupos no revelo ninguna diferencia estadfsticamente significativa entre los grupos de tratamiento.

Tambien se observo una disminucion significativa del peso de las deposiciones desde el penodo inicial al penodo de tratamiento en los grupos de tratamiento de dosis media y superior de las tres poblaciones de tratamiento (p = 0,0001). Mientras que el grupo de tratamiento 3 de las tres poblaciones mostro la mayor disminucion del peso de las

deposiciones desde el penodo inicial al penodo de tratamiento (p < 0,0001), las comparaciones por parejas mediante la prueba del rango estudentizado de Tukey no revelo diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos de tratamiento de dosis media y superior.

Tabla 5. Cambio en el numero de deposiciones desde el penodo inicial al penodo de tratamiento

Grupo 1 (N=39) Grupo 2 (N=41) Grupo 3 (N=37) Total (N=117) valor de p*

Penodo inicial

N

39 41 37 117

Media

7,7 8,2 8,8 8,3

(DE)

(3,04) (3,49) (4,56) (3,73)

Tratamiento

N

39 41 37 117

Media

6,9 7,4 6,2 6,9

(DE)

(3,06) (4,37) (3,01) (3,56)

Cambio desde el

0,0968

penodo inicial al de tratamiento

N

39 41 37 117

Media

-0,8 -0,9 -2,6 -1,4

(DE)

(3,39) (4,52) (4,04) (4,07)

prueba t por parejas**

0,1393 0,2211 0,0003 0,0003

5 * Valor de p global del analisis de la varianza.

** Prueba t por parejas.

Nota: cambio respecto a los resultados del penodo inicial (mediante la prueba del rango estudentizado de Tukey para comparaciones por parejas):

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 2, mITT, valores de p = 0,5502.

10 Grupo de tratamiento 2 frente a grupo de tratamiento 3, mITT, valores de p = 0,4842.

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 3, mITT, valores de p = 0,2040.

Tabla 6. Cambio en el peso de las deposiciones (g) desde el penodo inicial al penodo de tratamiento

Grupo 1 (N=39) Grupo 2 (N=41) Grupo 3 (N=37) Total (N=117) valor de p*

Penodo inicial

N

38 41 36 115

Media (DE)

1234,0 (529,46) 1251,8 (474,14) 1396,8 (613,79) 1291,3 (539,16)

Tratamiento

N

38 41 37 116

Media (DE)

1174,1 (565,34) 937,3 (539,91) 869,2 (448,92) 993,2 (533,10)

Cambio desde el penodo inicial al de tratamiento

0,0001

N

38 41 36 115

Media (DE)

-59,9 (399,46) -314,5 (455,89) -514,2 (428,37) -292,9 (463,44)

prueba t por parejas**

0,3612 <0,0001 <0,0001 <0,0001

* Valor de p global del analisis de la varianza.

** Prueba t por parejas.

15 Nota: cambio respecto a los resultados del penodo inicial (mediante la prueba del rango estudentizado de Tukey para comparaciones por parejas):

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 2, mITT, valor de p = 0,8842.

Grupo de tratamiento 2 frente a grupo de tratamiento 3, mITT, valor de p = 0,2415.

Grupo de tratamiento 1 frente a grupo de tratamiento 3, mITT, valor de p = 0,1971.

Evaluacion de la eficacia - Digestion de almidon y absorcion de hidratos de carbono, medidas por la respuesta de

5 glucosa en sangre

En la prueba de exposicion a almidon, sujetos que habfan ayunado por la noche durante al menos 8 horas ingirieron una comida de prueba estandar que comprendfa 100 g de pan de harina blanca (50 g de hidratos de carbono) durante el penodo inicial hospitalario y durante el penodo de tratamiento hospitalario. Los sujetos debfan descansar durante 30 minutos antes de comenzar la prueba de exposicion a almidon y su actividad durante la evaluacion debfa 10 ser limitada. Los niveles de glucosa en sangre se midieron con un glucometro (Accucheck, Bayer). Inmediatamente antes de la comida de prueba se tomo una medida. Se administro TheraCLEC™ al haber ingerido aproximadamente la mitad del pan. Durante un penodo de 4 horas se tomaron medidas seriadas con el glucometro. Los valores calculados incluyen el maximo cambio en el nivel de glucosa desde el nivel de ayuno y el maximo cambio en el nivel de glucosa entre los penodos con y sin enzimas (T17-T1). La prueba de exposicion a almidon no se llevo a cabo con 15 los sujetos con diabetes mellitus en los que la medida de glucosa en ayunas habfa sido inferior a 75 mg/dl.

La respuesta de glucosa en sangre en la poblacion mITT se midio por las variables siguientes:

Variacion en el nivel de glucosa desde el tiempo 0: la variacion en el nivel de glucosa en cada uno de los puntos temporales desde el tiempo 0.

Maxima respuesta de glucosa: el maximo valor de glucosa despues del tiempo 0.

20 Variacion maxima en la respuesta de glucosa: definida como la respuesta maxima menos el valor de glucosa a tiempo 0.

Tiempo hasta alcanzar la maxima respuesta de glucosa (Tma>): definido como las horas desde el tiempo 0 hasta la variacion maxima en el nivel de glucosa.

Para cada una de estas variables se presenta una estadfstica descriptiva por grupo de tratamiento para lo siguiente: 25 1. Sin TheraCLEC™

2. Con TheraCLEC™

3. Con TheraCLEC™ menos sin TheraCLEC™

4. Relacion con TheraCLEC™: sin TheraCLEC™ (R)

Esta estadfstica descriptiva se presenta tanto para todos los sujetos como solamente para los sujetos sin diabetes. 30 Se considero que un sujeto tema diabetes relacionada con la fibrosis qrnstica si tema un historial medico de diabetes conocida, tomaba insulina o medicacion oral relacionada con la diabetes o si tema una medida del nivel de glucosa en ayunas > 126 mg/dl o un nivel de glucosa postprandial > 200 mg/dl.

En la tabla 7, se han eliminado del analisis los 25 sujetos con diabetes mellitus relacionada con la fibrosis qrnstica para reducir la variabilidad procedente tanto del alto nivel de glucosa inicial como de las disminuciones en el nivel de 35 glucosa despues de la prueba de exposicion a almidon como resultado de las inyecciones matinales de insulina. La dosis TCT5 parece tener significativamente (p = 0,0053) un numero menor de sujetos con aumentos en el cambio maximo en el nivel de glucosa entre los penodos con y sin enzimas > 10 mg/dl que la dosis TCT25. Ademas, los resultados de la tabla 7 sugieren que la dosis media de amilasa en el grupo de tratamiento 2 es igualmente eficaz que la dosis superior en el grupo de tratamiento 3.

40 Tabla 7. Prueba de exposicion a almidon en pacientes no diabeticos con fibrosis qrnstica -- cambio maximo en el nivel de glucosa con y sin tratamiento enzimatico *

Variacion maxima de glucosa entre con y sin enzimas

Grupo de tratamiento 1: TCT5 Grupo de tratamiento 2: TCT25 Grupo de tratamiento 3: TCT100

< 10 mg/dl

21 14 15

> 10 mg/dl

4 16 11

> 20 mg/dl

3 8 8

* Prueba de exactitud de Fisher (global); p = 0,0138 TCT5 frente a TCT25, p = 0,0053

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

TCT5 frente a TCT100, p = 0,0644 TCT25 frente a TCT100, p = 0,4357

En conjunto, este estudio demostro que los sujetos tratados con composiciones segun esta invencion lograron un aumento de la digestion de almidon y de la absorcion de hidratos de carbono, medido por la respuesta de glucosa en sangre, en que los sujetos en el grupo de tratamiento de dosis superior requirieron menos tiempo para dicho logro.

Ejemplo 3 - El estudio de fase I

Antes del estudio de fase II, las composiciones segun esta invencion se evaluaron tambien en cuanto a su seguridad y eficacia preliminar en un ensayo de fase I en pacientes de fibrosis qrnstica con insuficiencia pancreatica.

Se llevo a cabo un estudio de busqueda de dosis sin enmascaramiento para determinar la seguridad y la tolerabilidad a corto plazo, asf como la actividad clmica de TheraCLEC™ en 23 pacientes de fibrosis qrnstica con insuficiencia pancreatica. Los sujetos tomaron 100, 500, 1.000, 2.500 o 5.000 unidades de lipasa por kg y comida de TCT durante tres dfas. Se monitorizaron los parametros de seguridad clmicos y de laboratorio y los sucesos adversos.

No hubo sucesos adversos graves ni muertes en el estudio de fase I. La mayona de los sucesos adversos fueron leves, aunque las molestias gastrointestinales fueron frecuentes. TheraCLEC™ aumento el coeficiente de absorcion de grasa y el coeficiente de absorcion de nitrogeno en todos los grupos, excepto en aquellos que recibieron 100 unidades de lipasa por kg y comida. Para todos los sujetos a todos los demas niveles de dosificacion, el aumento del CFA medio fue del 20,6 + 23,5, el aumento del CNA medio fue del 19,7 + 12,2% y la disminucion del peso medio de las deposiciones fue del 425 + 422 g.

TheraCLEC™ se tolero bien en este estudio de exposicion a corto plazo en dosis de hasta 5.000 unidades de lipasa por kg y comida. Los datos de eficacia preliminar demostraron un efecto beneficioso en la absorcion de grasa y nitrogeno. Ventajosamente, estos efectos se observaron con una dosis de 500 unidades de lipasa por kg y comida y no parecio haber necesidad de incrementar la dosis por encima de este nivel para conseguir estos resultados. Estos datos apoyaron un ensayo aleatorizado mayor de fase II.

1. El diseno del estudio de fase I

Se llevo a cabo un estudio de busqueda de dosis sin enmascaramiento y multicentrico, con el objetivo principal de determinar la seguridad y tolerabilidad a corto plazo de cinco niveles de dosificacion de TheraCLEC™ en pacientes de insuficiencia pancreatica con fibrosis qrnstica. Los objetivos secundarios fueron determinar el efecto de TheraCLEC™ en la absorcion de grasa y nitrogeno por via oral, en los smtomas intestinales y en el numero y peso de las deposiciones. TheraCLEC™ tiene proporciones fijas de lipasa, amilasa y proteasa. Las cohortes de dosificacion se basaron en la dosis de lipasa por kg y comida, como se muestra en la tabla 8.

Tabla 8. Cohortes de dosificacion

Principio activo

Unidades USP/kg/comida

Cohorte 1

Cohorte 2 Cohorte 3 Cohorte 4 Cohorte 5

Lipasa

500 1.000 2.500 5.000 100

Proteasa

500 1.000 2.500 5.000 100

Amilasa

75 150 375 750 15

Suministrado como capsulas con las enzimas siguientes en proporciones fijas: 20.000 unidades USP de lipasa + 20.000 unidades USP de proteasa + 3.000 unidades USP de amilasa por capsula.

Para este estudio se reclutaron sujetos con fibrosis qrnstica asistidos por uno de los once centros acreditados por la Fundacion para la Fibrosis Qrnstica. Todos los individuos firmaron un formulario de consentimiento aprobado por el comite de revision institucional local y, en el caso de los pacientes pediatricos, tambien se conto con consentimiento. Se incluyeron sujetos que teman de > 13 a < 45 anos de edad, con un diagnostico de fibrosis qrnstica basado en los criterios estandar [B. J. Rosenstein y col., "The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement", J. Pediatr., 132, pags. 589-595 (1998)], sufnan insuficiencia pancreatica basada en un nivel de elastasa fecal, medido en un cribado ambulatorio mediante el ensayo ELISA monoclonal ScheBo (BioTech EE. UU.), < 100 mg/g, y teman un coeficiente de absorcion de grasa, medido en un cribado hospitalario, < 80%, teman un volumen espiratorio forzado en un segundo (VEF1) > 30% del predicho, teman un mdice de masa corporal mayor que el decimo percentil y eran clmicamente estables, sin evidencia de infecciones agudas del tracto respiratorio superior o inferior. Se excluyeron los sujetos en estado de embarazo o lactancia, los que habfan tenido un episodio de smdrome de obstruccion intestinal distal que requirio atencion medica en la sala de urgencias o en el hospital en los seis meses previos, habfan estado tomando medicamentos que alteran el pH gastrico (por ejemplo, antagonistas del receptor de histamina 2, inhibidores de la bomba de protones o antiacidos) en la semana previa y no senan capaces de interrumpir esta medicacion durante el estudio, teman un historial de colonopatfa fibrosante, aspergilosis broncopulmonar alergica o una enfermedad hepatica, definida por los criterios siguientes: un nivel doble del normal

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) o fosfatasa alcalina; un historial de sangrado de varices; evidencia de cirrosis o una enfermedad hepatica grave en una biopsia de Idgado; transplante de tugado; o los sujetos que hadan tomado acido ursodeoxicolico en el ano anterior. Tambien se excluyeron los sujetos incapaces de interrumpir la alimentacion por tubo enterico durante las partes hospitalarias del protocolo del estudio, aquellos con hipersensibilidad conocida a aditivos alimentarios o aquellos que hadan participado en el mes anterior en otro estudio de investigacion de un farmaco, producto biologico o dispositivo no aprobado actualmente.

Los sujetos que cumplieron los criterios en la consulta de cribado inicial ingresaron en un centro de investigacion clmica. El tratamiento enzimatico prescrito para estos sujetos se interrumpio, se les administro un colorante marcador indicador (azul FD&C n° 2, 500 mg) por via oral y se les sometio a una dieta especial consistente en 100 g de grasa y un mmimo de 2 g de protema por kg de peso corporal y por dfa, dividida en tres comidas y dos tentempies. La ingestion real de grasa y protema se registro en funcion de la cantidad de comida consumida. Despues de 72 horas con la dieta especial, la dieta se interrumpio y se administro un segundo marcador indicador. En este momento, los pacientes reanudaron su tratamiento enzimatico normal. La recogida de deposiciones para la evaluacion de grasa y nitrogeno fecales comenzo despues de la primera deposicion en la que se observo el colorante azul y se finalizo una vez que se hubo expulsado el segundo marcador, incluyendo esta deposicion en la recogida. Se calculo el CFA y en caso de ser < 80%, el sujeto se considero elegible para la fase de tratamiento del estudio.

Los sujetos volvieron a ingresar en un centro de investigacion clmica y se interrumpio el suplemento de enzimas pancreaticas de rutina. Se suministraron el colorante marcador y la dieta especial y los sujetos tomaron la medicacion del estudio con cada una de las tres comidas y dos tentempies durante las 72 horas siguientes, con las dosis por cohorte como se ha descrito anteriormente. Se instruyo a los sujetos para que tomaran la medicacion del estudio antes de cada comida. Despues de 72 horas, la dieta especial se interrumpio y se administro un segundo marcador indicador. En este momento, los pacientes reanudaron su tratamiento enzimatico normal. El procedimiento para la recogida de deposiciones fue el mismo que se ha descrito anteriormente. Dentro de los tres dfas despues del alta del centro de investigacion clmica se realizo una llamada telefonica de seguimiento y entre tres a siete dfas despues del alta tuvo lugar una consulta de seguimiento.

La monitorizacion de la seguridad incluyo la incidencia de sucesos adversos, determinada mediante la formulacion de preguntas abiertas a los sujetos del estudio durante las consultas ambulatorias y la asistencia hospitalaria y durante la llamada telefonica planificada, la frecuencia de pruebas de laboratorio anormales, incluyendo perfiles rutinarios hematologicos, de la qdmica del suero y de coagulacion, analisis de orina, excrecion de acido urico urinario y ensayos de deteccion de hemoglobina y leucocitos en las deposiciones. Tambien se monitorizo la frecuencia de smtomas gastrointestinales, medida mediante un Cuestionario de Fibrosis Qrnstica (CFQ) modificado, espedfico para el tracto gastrointestinal [A. Quittner y col., "CFQ Cystic Fibrosis Questionnaire, a Health Related Quality of Life Measure", version inglesa 1.0 (2000)].

El Comite de Monitorizacion de Datos y Seguridad (DSMB) de la Red de Desarrollo de Tratamientos de la Fundacion para la Fibrosis Qrnstica se ocupo de la supervision de este ensayo. El DSMB monitorizo los datos de seguridad de las cohortes de dosificacion ascendente durante el ensayo, requiriendose una evaluacion formal de la seguridad antes de que los sujetos pudieran formar parte de la cohorte de 5.000 unidades de lipasa por kg y comida, dado que esta dosis excede las recomendaciones actuales. Al DSMB le correspondio tambien la responsabilidad de interrumpir el ensayo en cualquier momento en interes de la seguridad de los sujetos.

2. La composicion del estudio de fase I

Los tres componentes enzimaticos de TheraCLEC™, lipasa, proteasa y amilasa, se prepararon independientemente. La lipasa se obtuvo por fermentacion a partir de la bacteria Burkholderia cepacia (anteriormente conocida como Pseudomonas cepacia) y despues se proceso para formar cristales de lipasa que posteriormente se reticularon, creando una forma enzimatica estable frente al acido y las proteasas, sin recubrimiento enterico (denominada lipasa de TheraCLEC™). Todos los lotes se cultivaron espedficamente para detectar una contaminacion microbiologica con Burkholderia cepacia y debieron ser negativos en cuanto a la presencia de Burkholderia cepacia para la aprobacion del lote para su uso clmico. El componente de proteasa se obtuvo de Aspergillus melleus; el componente de amilasa se obtuvo de Aspergillus oryzae por fermentacion. De manera similar, estos productos se sometieron a multiples etapas de purificacion, despues de las cuales se cultivaron para detectar mohos y levaduras totales.

Los tres componentes enzimaticos que forman TheraCLEC™ se formularon como una capsula rellena de polvo. Los estudios preclmicos de eficacia demostraron que la lipasa y la proteasa eran eficaces a las dosis de > 500 unidades de lipasa por kg y comida y > 1.000 unidades de proteasa por kg y comida en el modelo canino de insuficiencia pancreatica. Se realizaron estudios in vitro de la amilasa derivada de Aspergillus en TheraCLEC™ mediante la metodologfa de la USP (Farmacopea de los EE. UU.) y el FCC (Codigo de Sustancias Qdmicas Alimenticias) (que es equivalente a la metodologfa de la USP para el ensayo de farmacos). La amilasa fungica tiene un perfil de pH diferente de la amilasa de origen porcino. La amilasa fungica es veinte veces mas activa a pH 4,8 que la amilasa porcina. Por lo tanto, para TheraCLEC™ se eligio una dosis de amilasa veinte veces menor que la que se encontrana, respecto a lipasa, en una capsula de pancreolipasa estandar.

5

10

15

20

25

30

35

3. Analisis de los datos en el estudio de fase I

El coeficiente de absorcion de grasa se calculo de la manera siguiente:

(gramas de grasa consumida — gramas de grasa excret

gramos de grasa consumida

X 100

imagen1

La misma ecuacion usando el numero de gramos de nitrogeno se uso para calcular el coeficiente de absorcion de nitrogeno (CNA).

Los investigadores planificamos resumir las caractensticas demograficas y de pronostico, incluyendo la edad, el genero, la raza, el genotipo, la funcion pulmonar y la elastasa fecal puntual por cohorte de dosificacion y globales. El tamano de la muestra para este estudio de fase I se estimo en 20 sujetos, cuatro sujetos por cohorte de dosificacion. El estudio no se diseno para la aplicacion de pruebas estadfsticas formales. Los investigadores planificamos agrupar los sucesos adversos mediante un sistema de clasificacion estandar. La frecuencia de valores de laboratorio anormales se tabulo por penodo del estudio, punto temporal y cohorte de dosificacion.

4. Resultados del estudio de fase I

Participaron 23 sujetos (14 M) de once centros de fibrosis qmstica. La edad media de los sujetos fue 23,5 + 7,8 (DE) (intervalo = 15,2 a 44,5 anos) (tabla 9). Un sujeto adicional se anadio a las cohortes 1, 3 y 5, como resultado de que varios centros reclutaron pacientes simultaneamente.

Tabla 9. Demografia del estudio

Numero de pacientes

Edad (n = 23)

Planificados

20 Parametro Anos

Participaron

23 Media 23,5

Interrupcion del farmaco de estudio 0

Desviacion estandar 7,8

Min-Max

15,2-44,5

Raza (n = 23)

Genero (n = 23)

Parametro

N (%) Parametro N (%)

Caucasicos

22 (95,7%) Hombres 14 (61%)

Negros

0 (0,0%) Mujeres 9 (39%)

Asiaticos

0 (0,0%)

Hispanos

0 (0,0%)

Otros

1 (4,3%)

5. Seguridad

TheraCLEC™ se tolero bien a todos los niveles de dosificacion. No se documentaron sucesos adversos graves ni muertes y no se retiraron pacientes durante el estudio. Durante el penodo pretratamiento sin tratamiento enzimatico, el sistema corporal afectado mas frecuentemente fue el tracto gastrointestinal, en que 14 sujetos de un total de 23 describieron sucesos adversos pretratamiento. Los sucesos adversos gastrointestinales pretratamiento mas frecuentes fueron molestias abdominales (cuatro sujetos describieron cinco sucesos), dolor abdominal superior (cuatro sujetos describieron cuatro sucesos) y flatulencia (cuatro sujetos describieron cuatro sucesos). El sistema corporal mas frecuentemente afectado en segundo lugar fue el sistema respiratorio, en que cinco sujetos describieron ocho sucesos adversos pretratamiento. El suceso adverso respiratorio pretratamiento mas frecuente fue la tos (cuatro sujetos describieron cuatro sucesos).

Los sucesos adversos de aparicion con el tratamiento que comenzaron despues del dfa 2 tuvieron lugar en 18 (78,3%) de los 23 sujetos. No se observaron diferencias estadfsticamente significativas entre las cohortes en la incidencia de los sucesos adversos de aparicion con el tratamiento (p = 0,6196). Hubo once sujetos (47,8%) con sucesos adversos relacionados (definidos como sucesos clasificados por el investigador como posible o probablemente relacionados con la medicacion del estudio).

Seis sujetos experimentaron aumentos de la alanina aminotrasnferasa (ALT) y/o de la aspartato aminotransferasa (AST) durante el estudio. Cuatro sujetos presentaron niveles altos de las enzimas que comenzaron despues del tratamiento con el farmaco del estudio. Un sujeto (cohorte 1) presento un alto nivel de ALT en la consulta de finalizacion del estudio y un sujeto (cohorte 5) presento un nivel alto de AST en la evaluacion de seguimiento en la consulta de seguimiento.

6. Eficacia

Como se resume en la tabla 10 y en las figuras 6 y 7, los datos preliminares de actividad clinica en las cohortes 1 a 4

5

10

15

20

25

30

35

demuestran que el tratamiento con TheraCLEC™ aumento el CFA y el CNA en comparacion con el penodo sin cualquier suplementacion de enzimas pancreaticas. Para todos los sujetos en las cohortes 1 a 4, el aumento medio del CFA fue del 20,6 + 23,5% y el CNA medio aumento en el 19,7 + 12,2%. El peso de las deposiciones tambien disminuyo despues del tratamiento con TheraCLEC™ en estas cohortes, con una disminucion media de 425 + 422 a. El CFA y el CNA aumentaron mmimamente sobre los niveles sin enzimas con la dosis inferior de TheraCLEC™ (cohorte 5: 100 unidades USP de lipasa por kg y comida, 100 unidades USP de proteasa por kg y comida y 15 unidades USP de amilasa por kg y comida).

Tabla 10. Actividad clrnica de TheraCLEC™: cambio desde el penodo de cribado al penodo de tratamiento

Cambio desde el penodo inicial

Cohorte 1 (N=5) Cohorte 2 (N=4) Cohorte 3 (N=5) Cohorte 4 (N=4) Cohorte 5 (N=5) Total (N=23)

CFA1 medio (DE)

22,7% (19,4) 17,7% (25,9) 18,9% (11,9) 17,2% (42,3) 1,2% (20,3) 15,4% (23,8)

CNA2 medio (DE)

20,3% (14,2) 14,4% (18,0) 15,8% (5,7) 20,6% (16,5)_____ 0,1% (4,1) 14,0% (13,7)

N° medio deposiciones (DE)

-1,2 (1,5) -0,8 (1,7) -2,6 (1,7) OO CD c\T cnT 0,2 (3,3) -1,4 (2,4)

Peso de deposiciones Peso medio (g) de deposiciones (DE)

-311,4 (371,7) OO LO co h-T O CD CO CO -613,2 (423,3) -836,0 (284,7) -116,8 (373,2) -425,5 (422,2)

DE = desviacion estandar

1Coeficiente de absorcion de grasa = 100 x (numero de gramos de grasa consumida - numero de gramos de grasa obtenida) / (numero de gramos de grasa consumida).

2Coeficiente de absorcion de nitrogeno = 100 x (numero de gramos de nitrogeno consumido - numero de gramos de nitrogeno obtenido) / (numero de gramos de nitrogeno consumido).

Resultados del estudio de fase I

Aparentemente, TheraCLEC™ fue seguro y bien tolerado en este estudio de exposicion de tres dfas. No se observo una relacion entre la dosis y los sucesos adversos de aparicion con el tratamiento. Durante este estudio fueron frecuentes las molestias gastrointestinales, tanto al tomar los sujetos la medicacion usual, como al no recibir enzimas o al tomar TheraCLEC™, aunque se presentaron con la menor frecuencia durante el penodo ambulatorio al tomar los sujetos la medicacion habitual. Durante las partes hospitalarias del estudio, se pregunto regularmente a los sujetos acerca de sus molestias gastrointestinales y, dado que el estudio se realizo sin enmascaramiento, se genero un sesgo. El aumento de las enzimas hepaticas y la presencia de hemoglobina y leucocitos en las deposiciones no fueron mas frecuentes al tomar los sujetos TheraCLEC™ que al no recibir enzimas o tomar la medicacion habitual.

Hubo una mejora de la absorcion de grasa y de nitrogeno al tomar TheraCLEC™ en comparacion con el penodo inicial, lo que demuestra la eficacia de los componentes de lipasa y proteasa de TheraCLEC™ No parecio haber una curva de respuesta a la dosis para las dosis superiores a 500 unidades de lipasa por kg y comida. Aunque se observo una tendencia hacia un menor peso fecal al aumentar las dosis, el intervalo era amplio. Los valores de CFA en este estudio parecen ser inferiores a los de la bibliograffa publicada. Algunas explicaciones posibles incluyen un sesgo de seleccion, la dieta, las recogidas totales y el momento de administracion de las enzimas.

Todos los sujetos en este estudio sufnan una insuficiencia pancreatica grave, segun se determino por cribado de la elastasa fecal y se corroboro por el CFA sin enzimas. Otros estudios han incluido pacientes sin insuficiencia pancreatica, los cuales desplazaran mas hacia arriba los CFA medios [R. C. Stern y col., “A Comparison of the Efficacy and Tolerance of Pancrelipase and Placebo in the Treatment of Steatorrhea in Cystic Fibrosis Patients with Clinical Exocrine Pancreatic Insufficiency”, Am. J. Gastroenterol., pags. 1932-1938 (2000); M. P. Francisco y col., “Ranitidine and Omeprazole as Adjuvant Therapy to Pancrelipase to Improve Fat Absorption in Patients with Cystic Fibrosis”, J. Pediatric. Gastroenterol. Nutr., 35, pags. 79-83 (2002)].

En este estudio, los sujetos ingirieron al menos 100 g de grasa al dfa. Los CFA descritos en la bibliograffa que se determinaron en funcion de la dieta rutinaria del paciente, probablemente se basaron en una ingestion de grasa inferior, dado que muchos pacientes ambulatorios ingieren menos de 100 g de grasa al dfa [P. Durie y col., “Uses and Abuses of Enzyme Therapy in Cystic Fibrosis”, J. Royal Soc. Med. 91, supl. 34, pags. 2-3 (1998); D. A. Kawchak

y col., “Longitudinal, Prospective Analysis of Dietary Intake in Children with Cystic Fibrosis”, J. Pediatr., 129, pags. 119-129 (1996)]. Una menor carga de grasa puede ser manejada mas facilmente por la lipasa lingual compensatoria residual observada en pacientes con fibrosis qmstica [B. Fredrikzon y col., “Lingual Lipase: an important Lipase in the Digestion of Dietary Lipids in Cystic Fibrosis?”, Pediatr. Res., 14, pags. 1387-1390 (1980)].

5 Para el marcaje de la recogida de deposiciones se uso un colorante alimentario azul. Como anecdota, las enfermeras de los centros de investigacion clmica han descrito que los marcadores rojo carmm o carbon pueden ser diffciles de identificar en las deposiciones. El azul FD&C n° 2, a una dosis de 500 mg por via oral es facilmente visible cuando se expulsa en las deposiciones y demarca claramente el comienzo y el final de la recogida de deposiciones. Una recogida de deposiciones abreviada resultara en menos grasa en la recogida de deposiciones 10 total, lo que conducira a un CFA erroneamente alto. Los estudios anteriores pueden haber obtenido valores del CFA erroneamente superiores por la dificultad en la identificacion del comienzo y el final de la recogida. Dado que la recogida de deposiciones es desagradable, existe una tendencia humana a finalizar la recogida lo mas pronto posible.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Composicion que comprende lipasa, proteasa y amilasa, en la que la proporcion de lipasa, proteasa y amilasa en dicha composicion es aproximadamente de 1:1:0,15 unidades USP, en la que la lipasa es lipasa de Burkholderia cepacia cristalizada reticulada, la proteasa es proteasa de Aspergillus melleus cristalizada y

   5 la amilasa es amilasa de Aspergillus oryzae amorfa.
2. 2. Composicion segun la reivindicacion 1, en la que los cristales de lipasa se reticulan con un reticulante multifuncional.
3. 3. Composicion segun la reivindicacion 2, en la que el reticulante multifuncional es suberato de bis(sulfosuccinimidilo).

   10 4. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas un excipiente

   farmaceuticamente aceptable.
4. 5. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion esta en una forma de dosificacion por via oral seleccionada del grupo que consiste en comprimidos, capsulas, suspensiones espesas, sobres, suspensiones y grageas.

   15 6. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de la

   malabsorcion en un mairnfero.
5. 7. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de la insuficiencia pancreatica en un mamnfero.
6. 8. Composicion segun la reivindicacion 6 o 7, en la que el mamffero sufre fibrosis qrnstica.

   20