JP4908420B2 - 膵機能不全を治療するための、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼを含有する組成物 - Google Patents

Description

（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６１９，７６４号（２００４年１０月１４日出願）の米国特許法第１１９（ｅ）条の下の優先権を主張し、この仮特許出願の開示は、本明細書中で参考として援用される。

（発明の技術分野）
本発明は、容態（膵機能不全が含まれる）の治療のための組成物に関する。本発明の組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、患者（膵機能不全患者など）が有利な結果を得る特定の比率で含む。本発明はまた、膵機能不全の治療のためのこのような組成物の使用方法に関する。

（発明の背景）
消化は、消化した食物が容易に吸収される栄養成分に分解される生理学的過程を構成する。消化後、食物は、胃腸管の種々の区分を通過し、主に消化酵素によって消化が行われる。この過程に不可欠な３つの消化酵素群には、リパーゼ（脂肪消化のため）、プロテアーゼ（タンパク質消化のため）、およびアミラーゼ（炭水化物消化のため）が含まれる。

食物消化および栄養吸収は、小腸で起こる。小腸で、容易に吸収するために、消化酵素によって摂取された食物が分解される。ほとんどの消化酵素は、膵臓から分泌され、膵管を通して小腸に到達する。

膵臓は、適切な消化、栄養摂取、および代謝に必要な外分泌作用および内分泌作用をもたらす。膵臓の外分泌作用には、小腸内で脂肪のグリセロールおよび脂肪酸への加水分解タンパク質のペプチドおよびアミノ酸への加水分解、炭水化物のデキストリン、ジサッカリド、およびモノサッカリド（グルコースなど）への加水分解を触媒する酵素として機能するタンパク質の分泌が含まれる。膵外分泌機能障害（以後、「膵機能不全」）は、膵機能の低下に起因し、多数の臨床的障害によって引き起こされ得る。例えば、膵機能不全は、嚢胞性線維症、慢性膵炎、急性膵炎、膵臓癌、およびシュバッハマン・ダイヤモンド症候群に関連する（非特許文献１）。

膵機能不全を罹患した患者では、膵臓は、正常な消化過程（脂肪、タンパク質、および炭水化物の消化が含まれる）を支持する十分な量の消化酵素を産生および／または分泌することができない。結果として、患者は、栄養素の吸収不良を引き起こす。膵機能不全の臨床症状には、腹部仙痛、腹部膨満、下痢、脂肪便、悪心、および体重減少が含まれる。

膵機能不全は、嚢胞性線維症患者の８９％で存在する（非特許文献２）。嚢胞性線維症は、主に胃腸管および呼吸器系に影響を与える常染色体劣性遺伝病である（非特許文献３）。嚢胞性線維症患者で産生される異常な量および粘度の粘液が、十分な量の膵酵素の分泌を妨害する。膵臓分泌物量の減少により、膵管内で濃縮され、酵素および重炭酸塩の十二指腸への放出が阻止される。結果として、膵機能不全を伴う嚢胞性線維症患者は、消化不良を起こし、脂肪およびタンパク質の著しい吸収不良を経験する。例えば、このような患者は、典型的に、食物脂肪の吸収が６０％未満である（非特許文献４）。未処置のままであった場合、嚢胞性線維症患者の消化不良および吸収不良によって栄養不良になり、体重を増加または維持することができず、成長が低下し、慢性化膿性肺疾患が悪化する（非特許文献５；非特許文献６）。

今日まで、膵機能不全の標準的な治療法は、主に、経口投与されるブタパンクレリパーゼ（リパーゼの混合物を含む）、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、およびアミラーゼに基づいている。ブタ膵酵素サプリメントは相当量のアミラーゼを含んでいるが、嚢胞性線維症患者が正常なアミラーゼレベルを有すると報告されている（非特許文献７）。したがって、アミラーゼはポリサッカリド消化を増加する機能を果たさないと考えられる（非特許文献８）。ブタ膵臓サプリメントのリパーゼ成分、プロテアーゼ成分、およびアミラーゼ成分は、典型的には、１：３．５：３．５の比率で存在する。

膵酵素サプリメントは、通常、食事と共に経口投与される。これらのサプリメントは胃の低ｐＨ環境を通過する時に、その酵素活性が急速に減少する。結果として、確実に膵機能不全を緩和するのに十分に活性な酵素を近位の腸に存在させるために大量の酵素濃縮物（時折、食事あたり１５個ものカプセルまたは錠剤）を必要としていた。

プロテアーゼおよびリパーゼは、胃の酸性環境下で不可逆的に不活性化するようになり得るので、腸溶テクノロジーをパンクレリパーゼ製品に適用し、マイクロビーズ中に酵素を封入するか、そうでなければ、保護腸溶コーティングを用いて酵素が処理されている。このような腸溶コーティングによって製品のプロフィールが改良される一方で、治療による利益を得るためには依然として大量のサプリメントが必要である（非特許文献９）。膵機能不全の治療に必要な錠剤またはカプセルの量を軽減する目的で、高力価（ｈｉｇｈ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）パンクレリパーゼ製品ライン（Ｕｌｔｒａｓｅ（登録商標））が導入された。しかし、１９９１年の米国嚢胞性線維症財団は、ＦＤＡと協力して、このような高力価製品を摂取した嚢胞性線維症の患児が線維性大腸症を罹患する多数の症例を報告した（非特許文献１０）。これらの患者では、結腸線維症によって狭窄を引き起こし、これにより、手術、いくつかの場合、結腸切除を必要とする。

膵酵素の１日量を軽減する手段として、ＦＤＡは、市場から高力価の製品（体重１ｋｇあたり、２，５００ＵＳＰ単位を超える製品と定義）を排除した（非特許文献１１）。さらに、米国嚢胞性線維症財団は、ＦＤＡと協力して、ブタ酵素抽出物の複雑な性質の詳細な試験を推奨している（前出）。コンセンサスパネルも、別の酸安定性リパーゼの調査を推奨している。

いずれにせよ、患者間で腸の酸性化にばらつきがあるので、このようなサプリメントの生物学的利用能のばらつきが大きく、所与の膵酵素サプリメントは腸溶コーティングされる。結果として、多数の患者は、酵素サプリメントの臨床有効性を改良するために、ｐＨ調整剤（ヒスタミン−２（Ｈ２）受容体遮断薬およびプロトンポンプインヒビター（ＰＰＩ）など）を摂取する（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。

潜在性および薬学的性質ならびに安定性の欠如に関するばらつきもまた、従来の膵酵素サプリメントに対するいくつかの患者の不十分な応答に寄与する重要な要因として同定されている（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献８；非特許文献１９）。これらには、酵素活性、長期間にわたる日光の曝露による活性の喪失に対する感受性、熱、または湿度におけるバッチ毎のばらつきおよび不完全に定義された副作用プロフィールが含まれる（Ｄ．Ｓ．Ｂｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１２７，ｓｕｐｒａ）。膵機能不全療法を困難にする他の要因には、胃液および／または管腔内プロテアーゼによる代替酵素の破壊、酵素サプリメントおよび食事からの栄養素の非同期胃内容排出、ならびに腸溶コーティング調製物からの酵素遊離の遅延が含まれる（非特許文献１２；非特許文献１９）。

従来の膵酵素サプリメントを特徴づける潜在性、安定性、および生物学的利用能の問題のために、ブタ由来酵素の代替物としての微生物由来の酵素の使用が提案されている。例えば、特許文献１は、１つまたは複数の酸安定性リパーゼおよび１つまたは複数の酸安定性アミラーゼ（共に真菌起源であることが好ましい）を含む組成物を記載している。米国特許出願番号２００４／００５７９４４号は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓプロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアミラーゼを含む組成物を記載している。米国特許出願番号２００１／００４６４９３号は、真菌または植物のプロテアーゼおよび真菌または細菌のアミラーゼと共に、架結晶細菌リパーゼを含む組成物を記載している。
米国特許第６，０５１，２２０号明細書 Ｅ．Ｐ．ＤｉＭａｇｎｏら著，Ｖ．Ｌｉａｎｇら編，Ｔｈｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９３年，第２版，ｐ．６６５−７０１ Ｄ．Ｂｏｒｏｗｉｔｚら，「Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｅｃａｌ Ｅｌａｓｔａｓｅ−１ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｍｉｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｓｔａｔｕｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，２００４年，第１４５巻，ｐ．３２２−３２６ Ｓ．Ｍ．Ｒｏｗｅら，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９５年，第３５２巻，ｐ．１９９２−２００１ Ｍ．Ｋｒａｉｓｉｎｇｅｒら，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９４年，第３４巻，ｐ．１５８−１６６ Ｋ．Ｇａｓｋｉｎら，「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ＣＦ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｒｍａｌ Ｆａｔ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１９８２年，第１００巻，ｐ．８５７−８６２ Ｊ．Ｍ．Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら，「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍａｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｄｒｕｇｓ，２０００年，第２巻，ｐ．２０５−２２２ Ｐ．Ｌ．Ｔｏｗｎｅｓら，「Ａｍｙｌａｓｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｓｅｒａ ａｎｄ Ｄｕｏｄｅｎａｌ Ａｓｐｉｒａｔｅｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７６年，第２８巻，ｐ．３７８−３８９ Ｅ．Ｌｅｂｅｎｔｈａｌら，「Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｎｅｅｄｓ，」 Ｐａｎｃｒｅａｓ，１９９４年，第９巻，ｐ．１−１２ Ｊ．Ｈ．Ｍｅｙｅｒ著，Ｐ．Ｇ．Ｌａｎｋｉｓｃｈ編，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９１年，ｐ．７１−８８ Ｓ．Ｃ．Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓら，「Ｈｉｇｈ−Ｄｏｓｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９７年，第３３６巻，ｐ．１２８３−１２８９ Ｄ．Ｓ．Ｂｏｒｏｗｉｔｚら，「Ｕｓｅ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｓｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｏｐａｔｈｙ」，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１９９５年，第１２７巻，ｐ．６８１−６８４ Ｐ．Ｇ．Ｌａｎｋｉｓｈ，「Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｏｃｒｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ」，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，１９９３年，第５４巻（補遺２），ｐ．２１−２９ Ｄ．Ｙ．Ｇｒａｈａｍ，「Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｎｔａｃｉｄｓ ｏｒ Ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ」，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，１９８２年，第２７巻，ｐ．４８５−４９０ Ｊ．Ｈ．Ｓａｕｎｄｅｒｓら，「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．，１９７７年，第１巻，ｐ．４１８−４１９ Ｈ．Ｇ．Ｈｅｉｊｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，「Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ（Ｐａｎｃｒｅａｓｅ）ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．，１９９１年，第１１４巻，ｐ．２００−２０１ Ｍ．Ｊ．Ｂｒｕｎｏら，「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ Ｏｍｐｒａｚｏｌｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９４年，第３９巻，ｐ．９８８−９９２ ＣＬ． Ｃｈａｓｅら，「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｉｃ−Ｃｏａｔｅｄ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」，Ｐａｎｃｒｅａｓ，２００５年，第３０巻，ｐ．１８０−１８３ Ｄ．Ｓ．Ｂｏｒｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１２７，ｓｕｐｒａ；Ｃ．Ｊ．Ｐｏｗｅｌｌら，「Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎｓ：ａ Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｓａｆｅｔｙ Ｉｓｓｕｅ」，Ｌａｎｃｅｔ，１９９９年，第３５３巻，ｐ．９１１−９１５ Ｐ．Ｒｅｇａｎら，「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｔａｃｉｄｓ，Ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｃｏａｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｏｒａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓｅｖｅｒｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９７７年，第２９７巻，ｐ．８５４−８５８

このような発展にもかかわらず、膵酵素サプリメントの有効性および患者の服薬遵守の両方をさらに改善するための投薬処方物（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の至適化が依然として必要である。最も低い用量で最も高い有効性を示し、十分に定義された安全性プロフィールによって特徴づけられる膵酵素サプリメントの目的は、膵機能不全を罹患した全ての患者（嚢胞性線維症患者が含まれる）に非常に重要であり続けている。

（発明の要旨）
本発明は、容態（膵機能不全が含まれる）の治療のための組成物および方法に関する。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、約１．０：１．０：０．１５ＵＳＰ単位の酵素活性比の架橋微生物リパーゼ結晶、微生物プロテアーゼ、および微生物アミラーゼによって特徴づけられる。有利には、これらの組成物は、安定な酵素成分、言い換えると、胃腸管への活性酵素のｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）送達の確保およびそれによる膵機能不全のための治療計画における用量の有効な低下によって特徴づけられる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを含む組成物が、ＵＳＰ単位で約１．０：１．０：０．１５の酵素活性比で、容態（膵機能不全が含まれる）の治療に有効であるという発見に関する。固有のリパーゼ：プロテアーゼ：アミラーゼ比により、従来のブタ由来膵酵素サプリメントでは不可能な低用量の治療計画でこれらの容態を治療可能である。さらに、このリパーゼ：プロテアーゼ：アミラーゼ比により、従来の酵素サプリメントにおいて結腸線維症を担うと考えられている高濃度のプロテアーゼが回避される（Ｄ．Ｓ．Ｂｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１２７，ｓｕｐｒａ）。

好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、ＵＳＰ単位で約１．０：１．０：０．１５の酵素活性比の架橋微生物リパーゼ結晶、微生物プロテアーゼ、および微生物アミラーゼを含む。

（定義）
以下の用語は、他で示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。

用語「無定形」は、結晶（ｃｒｙｓｔａｌ）状態、クリスタリン（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）状態、またはセミクリスタリン（ｓｅｍｉｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）状態以外の任意の状態をいう。無定形物質には、無定形の固体および液体が含まれる。

用語「結晶」または「クリスタリン」は、三次元で周期的に繰り返されるパターン内に配された原子を含む固体状態の一形態をいう（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｔｈａｌｓ，２^ｎｄ ｅｄ．，（１９５２）参照）。酵素の結晶形態またはクリスタリン形態は、その無定形またはセミクリスタリン形態と異なる。結晶は、特徴的な性質（格子構造、特徴的な形状、および光学的性質（例えば、屈折率など）が含まれる）を示す。

用語「セミクリスタリン」は、クリスタリン領域および無定形領域の両方を有する固体状態をいう。

用語「被験体」、「患者」、または「個体」は、任意の哺乳動物（そういうものとして分類される任意の動物（したがって、ヒトおよび他の霊長類が含まれるが含まれる）が含まれる）をいう。

用語「消化不良」は、栄養素のその吸収可能な成分（モノ−、ジ−、またはオリゴサッカリド、アミノ酸、オリゴペプチド、脂肪酸、およびモノグリセリド）への分解障害をいう。消化不良は、いくつかの容態（膵機能不全が含まれる）に起因し得る。

用語「吸収不良」は、小腸または大腸からの消化した栄養素（ビタミンおよび微量元素が含まれる）の吸収障害をいう。吸収不良は、腸の内層による粘膜取り込みの欠損または特定の消化異常に起因し得る。多数の栄養素、特定の主要栄養素（すなわち、脂肪、タンパク質、または炭水化物）、ならびに微量栄養素（カルシウム、マグネシウム、鉄、およびビタミンなど）に対して腸管吸収障害が起こり得る。吸収不良は、いくつかの容態（膵機能不全が含まれる）に起因し得る。タンパク質吸収不良を、「窒素化合物過剰排泄」という。脂質吸収不良を、「脂肪便」という。

用語「リパーゼ」は、脂質のグリセロールおよび単純な脂肪酸への加水分解（すなわち、水の負荷による化合物の水酸基および水素原子のフラグメントへの分離）を触媒する酵素をいう。この酵素反応は、通常、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）が必要である。膵臓によって分泌されたリパーゼは、小腸の上部ループ（ｕｐｐｅｒ ｌｏｏｐ）中の脂肪（トリグリセリド）の消化に非常に重要である。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物および方法で有用なリパーゼは、非膵臓リパーゼである（すなわち、これらは、ヒトまたは動物の膵臓組織から精製されない）。本発明のより好ましい実施形態によれば、リパーゼは微生物リパーゼである。本発明のさらに好ましい実施形態では、リパーゼは、細菌リパーゼである。細菌リパーゼには、シュードモナスリパーゼおよび／またはバークホルデリアリパーゼが含まれる。

微生物リパーゼを、その天然の微生物供給源から単離することができるか、培養において細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物宿主細胞のいずれか１つから選択される適切な宿主細胞（好ましくは、細菌）によって組換えＤＮＡテクノロジーを介して産生された組換え微生物リパーゼであり得る。組換えリパーゼは、天然に存在するリパーゼ配列を含むか、これら由来の核酸によってコードされる。さらに、組換えリパーゼには、天然に存在する配列と相同または実質的に同一のアミノ酸配列ならびに天然に存在するリパーゼコード核酸と相同または実質的に同一の核酸によってコードされるリパーゼが含まれる。あるいは、本発明の組成物および方法で有用なリパーゼを、従来のペプチド合成技術によって合成することができる。

用語「プロテアーゼ」は、タンパク質中の内部アミドペプチド結合の分解を触媒する酵素であるプロテイナーゼ、タンパク質分解酵素、またはペプチダーゼをいう。詳細には、プロテアーゼは、一方のアミノ酸のカルボキシル基と他方のアミノ基との間のアミド結合の切断によるタンパク質のその成分アミノ酸への変換を触媒する。プロテアーゼは、一般に、その触媒型（例えば、アスパラギン酸ペプチダーゼ、システイン（チオール）ペプチダーゼ、金属ペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、トレオニンペプチダーゼ）、アルカリまたは半アルカリプロテアーゼ、中性ペプチダーゼ、および未知の触媒機構のペプチダーゼによって識別される（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋを参照のこと）。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物および方法で有用なプロテアーゼは、非膵臓プロテアーゼである（すなわち、これらは、ヒトまたは動物の膵臓組織から精製されない）。本発明のより好ましい実施形態によれば、プロテアーゼは、細菌プロテアーゼである。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、プロテアーゼは、真菌プロテアーゼである。本発明の１つのさらなる実施形態によれば、プロテアーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓプロテアーゼである。

微生物プロテアーゼを、その天然の微生物供給源から単離することができるか、培養において細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物宿主細胞のいずれか１つから選択される適切な宿主細胞（好ましくは、真菌）によって組換えＤＮＡテクノロジーを介して産生された組換え微生物プロテアーゼであり得る。組換えプロテアーゼは、天然に存在するプロテアーゼ配列を含むか、これら由来の核酸によってコードされる。さらに、組換えプロテアーゼには、天然に存在する配列と相同または実質的に同一のアミノ酸配列ならびに天然に存在するプロテアーゼコード核酸と相同または実質的に同一の核酸によってコードされるプロテアーゼが含まれる。あるいは、本発明の組成物および方法で有用なプロテアーゼを、従来のペプチド合成技術によって合成することができる。

用語「アミラーゼ」は、全ての哺乳動物というわけではないが、ヒトにおいて膵臓内で産生され、且つ唾液腺でも産生される酵素をいう。ヒト唾液腺アミラーゼは、プチアリンとして公知である。アミラーゼは、小腸内での２つのデンプン成分（アミロースおよびアミロペクチン）の単糖への変換の触媒による炭水化物（例えば、ポリサッカリド）の消化を担う主な消化酵素である。より詳細には、アミラーゼは、デンプン、グリコーゲン、およびデキストリンを加水分解して、グルコース、マルトース、および限界デキストリンを形成する。臨床的には、血中アミラーゼレベルは、しばしば、急性膵炎および時折慢性膵炎の容態で上昇する。用語「非膵臓アミラーゼ」は、ヒトまたは動物の膵臓組織から精製されないアミラーゼをいう。本発明のより好ましい実施形態によれば、アミラーゼは、微生物アミラーゼである。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、アミラーゼは、真菌アミラーゼである。本発明の１つのさらなる実施形態によれば、アミラーゼは、アスペルギルスアミラーゼであり、より好ましくは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアミラーゼである。

微生物アミラーゼを、その天然の微生物供給源から単離することができるか、培養において細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳動物宿主細胞のいずれか１つから選択される適切な宿主細胞（好ましくは、真菌）によって組換えＤＮＡテクノロジーを介して産生された組換え微生物アミラーゼであり得る。組換えアミラーゼは、天然に存在するアミラーゼ配列を含むか、これら由来の核酸によってコードされる。さらに、組換えアミラーゼには、天然に存在する配列と相同または実質的に同一のアミノ酸配列ならびに天然に存在するアミラーゼコード核酸と相同または実質的に同一の核酸によってコードされるアミラーゼが含まれる。あるいは、本発明の組成物および方法で有用なアミラーゼを、従来のペプチド合成技術によって合成することができる。

用語「治療有効用量」または「治療有効量」は、治療すべき容態の症状の発症を防止または遅延するか、症状を改善する組成物の量をいう。治療有効量は、治療すべき容態の治療、防止、重症度の軽減、発症の遅延、１つまたは複数の症状の発症の軽減に十分な量である。本発明の組成物を使用して治療することができる容態には、例えば、膵機能不全、吸収不良、および消化不良が含まれる。

用語「ＵＳＰ単位」は、薬剤または組成物中に存在する酵素活性の米国薬局方単位をいう。１ＵＳＰ単位のリパーゼ、プロテアーゼ、またはアミラーゼは、Ｐａｎｃｒｅｌｉｐａｓｅ，ＵＳＰ，Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，ＵＳＰ ２４，ｐｐ．１２５４− １２５５（２０００）で定義されている。リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼのアッセイは、上記引例に開示されており、本明細書中で参考として援用される。

（本発明の組成物の特徴）
有利には、本発明の組成物は、例えば、膵機能不全などの容態を罹患した患者における脂肪、タンパク質、およびデンプンの吸収を改善し、栄養摂取および成長を改善する。組成物は、酸−ペプシン環境下で高レベルの比活性を維持する。したがって、その酵素成分が上部胃腸管の酸性条件（胃の低ｐＨおよび胃腸管の高プロテアーゼレベルが含まれる）に耐えるので、酵素を活性形態で腸に送達することができる。結果として、組成物を、ブタ膵酵素サプリメントと比較して、投与あたりより少量且つより少ない投与回数で投与することができる。言い換えると、これにより、患者の服薬遵守が改善される。

さらに、本発明の組成物を、腸溶コーティングまたは酸抑制剤の添加を必要とせずに被験体に投与することができる。したがって、本発明の組成物の種々の実施形態で使用される微生物由来酵素成分は、ブタ膵酵素よりも胃酸に対する安定性が高い。

（リパーゼ成分）
本発明の組成物のリパーゼ成分は、好ましくは、微生物リパーゼである。より好ましくは、リパーゼは、真菌または植物起源よりもむしろ細菌起源である。

リパーゼは、好ましくは、酸性ｐＨ環境下で安定であり、そして／またはタンパク質分解に耐性を示すリパーゼである。リパーゼを、酸性ｐＨでのその安定性および／またはタンパク質分解に対するその耐性を増強させる形態で使用することもできる。そのためには、リパーゼは、架橋結晶の形態であることが好ましい。上記リパーゼのいずれかを使用して、本発明の組成物の架橋リパーゼ結晶成分を形成することができる。

（リパーゼの結晶化）
本発明の組成物で有用なリパーゼ結晶を、バッチ結晶化などの従来の方法を使用して成長させることができる。例えば、米国特許第６，５４１，６０６号を参照のこと。あるいは、リパーゼ結晶を、水溶液または有機溶媒を含む水溶液からのタンパク質沈殿の調節によって成長させることができる。例えば、米国特許第５，６１８，７１０号および米国特許出願番号２００３／００１７１４４号を参照のこと。当業者に認識されているように、結晶化中に調節されるべき条件には、例えば、溶媒の蒸発速度、適切な共溶質および緩衝液の存在、ｐＨ、ならびに温度が含まれる。

リパーゼ結晶を、結晶化すべきリパーゼ酵素と沈殿剤（塩または有機物質（ｏｒｇａｎｉｃ ａｇｅｎｔ）など）を含む適切な溶媒または水性溶媒との組み合わせによって生成することができる。溶媒を、リパーゼと組み合わせ、任意選択的に、結晶化の誘導に適切であり、且つタンパク質の安定性および活性の維持に許容可能であると実験的に決定された温度での震盪に供する。溶媒は、任意選択的に、共溶質（２価の陽イオンなど）、補因子またはカオトロープ、ならびにｐＨを調節するための緩衝種（ｂｕｆｆｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）を含むことができる。結晶化を容易にするための共溶質の必要性および濃度を実験的に決定することができる。産業規模での過程のために、結晶化させるための沈殿を、バッチ過程でのタンパク質、沈殿剤、共溶質、および、任意選択的に、緩衝液の単純な組み合わせによって調節することができる。あるいは、実験室レベルでの結晶化法（透析または蒸気拡散など）も使用することができる。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１４，ｐｐ．１１２−１２０（１９８５）およびＧｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，９０，ｐｐ．５１−５９（１９８８）は、結晶化に適切な条件の包括的リストを含む。時折、結晶化溶媒と架橋剤とが不適合である場合、架橋前に緩衝液または溶媒を変更することが必要であり得る。

リパーゼは多数の条件下（約４〜９のｐＨ範囲が含まれる）で結晶化する。本発明の組成物のリパーゼ成分の調製のために、有用な沈殿剤には、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、硫酸アンモニア、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および当業者に公知の他の沈殿剤が含まれる。有用な塩には、２価または１価の陽イオンおよびその塩が含まれる。

本発明の組成物で有用なリパーゼ結晶の最長寸法は、約０．０１μｍと約５００μｍとの間、あるいは、約０．１μｍと約５０μｍとの間、または約０．１μｍと約１０μｍとの間であり得る。これらは、球体、針状、棒状、平面（六角形および正方形）、菱形、立方体、両錐、および角柱からなる群から選択される形状であり得る。

（リパーゼ結晶の架橋）
一旦リパーゼ結晶が適切な溶媒中で成長すると、これらを架橋することができる。架橋により、結晶の成分タンパク質分子の間の共有結合の導入によって結晶格子が安定化する。これにより、酵素を、所与の酵素について結晶格子またはインタクトな酵素の存在と不適合であり得る別の環境に移すことが可能になる。

リパーゼ結晶の架橋の結果として、酵素安定性（例えば、ｐＨ、温度、機械的および／または化学的安定性）、リパーゼ活性のｐＨプロフィール、溶解性、結晶のサイズまたは体積の均一性、結晶からのリパーゼの放出速度、および／または基礎をなす結晶格子中の核酵素分子の間の間隙のサイズおよび形状を変更することができる。

有利には、得られた架橋結晶が、未修飾リパーゼと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、または９９．９％またはそれを超えるリパーゼ活性を示すリパーゼを含むような方法で架橋させる。安定性を、未修飾リパーゼと比較して、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ以上増加させることができる。例えば、保存条件下での安定性（ｐＨ安定性、温度安定性、プロテアーゼ（胃腸管プロテアーゼおよびＰｒｏｎａｓｅ^ＴＭが含まれる）に対する安定性、溶解安定性、またはｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）での生物学的安定性）を測定することができる。

一定の例では、リパーゼ結晶の架橋により、リパーゼの溶液への溶解が遅延し、酵素分子が微晶性粒子に有効に固定される。架橋リパーゼ結晶の周辺の環境（保存条件よりもむしろ使用条件など）における誘発物質（ｔｒｉｇｇｅｒ）への曝露の際に、リパーゼ結晶が溶解し、リパーゼポリペプチドを放出し、そして／またはリパーゼ活性が増加する。溶解速度を、１つまたは複数の以下の要因によって調節することができる：例えば、架橋度、架橋剤へのリパーゼ結晶の曝露時間の長さ、リパーゼ結晶への架橋剤の添加速度、架橋剤の性質、架橋剤の鎖の長さ、ｐＨ、温度、サルファヒドリル試薬（システインまたはグルタチオンなど）の存在、架橋リパーゼ結晶の表面積、架橋リパーゼ結晶のサイズ、または架橋リパーゼ結晶の形状。

１つの架橋剤または架橋剤の組み合わせ（多官能性架橋剤（二官能性試薬が含まれる）が含まれる）を同時（並行が含まれる）または連続的に使用してリパーゼ結晶を架橋することができる。種々の実施形態では、周囲の環境中の誘発因子への曝露の際または所与の期間にわたってリパーゼ結晶間の架橋は減少するか弱まり、それにより、リパーゼが溶解し、活性が放出される。あるいは、結合点で架橋を破壊し、タンパク質を溶解させ、活性を放出させることができる。例えば、米国特許第５，９７６，５２９号および同第６，１４０，４７５号を参照のこと。任意の従来の架橋技術にしたがって架橋させることができる。

架橋リパーゼ結晶中の架橋剤の最終濃度は、約０．００１ｍＭと約３００ｍＭとの間、好ましくは、約１．０ｍＭと約５０ｍＭとの間、最も好ましくは、約２．０ｍＭと約５．０ｍＭとの間の範囲であるべきである。

本発明の好ましい実施形態によれば、架橋剤は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（「ＢＳ^３」）である。他の有用な架橋剤には、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびグリオキサールが含まれる。さらなる多官能性架橋剤には、ハロトリアジン（例えば、塩化シアヌル）ハロピリミジン（例えば、２，４，６−トリクロロ／ブロモ−ピリミジン）；脂肪族または芳香族モノカルボン酸またはジカルボン酸の無水物またはハライド（例えば、無水マレイン酸、塩化（メタ）クリロイル、塩化クロロアセチル）；Ｎ−メチロイル化合物（例えば、Ｎ−メチロイル−クロロアセトアミド）；ジイソシアネートまたはジイソチオシアネート（例えば、フェニレン−１，４−ジ−イソシアネートおよびアジリジン）が含まれる。他の架橋剤には、エポキシド（例えば、ジエポキシド、トリエポキシド、およびテトラエポキシドなど）が含まれる。他の利用可能な架橋剤の代表的なリストについては、例えば、２００３−２００４ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと。架橋剤の他の例には、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート・ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）；ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）（ＤＳＰ）；ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）；ｌ，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）；スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）；グルタミン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）；酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ−ＤＳＴ）；塩酸ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロプリル）カルボジイミド（ＥＤＣ）；エチレングルコビス（スルホ−スクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）；Ｎ−（γ−マレイミド−ブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）；スルホ−スクシンイミジル−６−（α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ビス−（β−（４−アジド−サリチルアミド）エチル）ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）；およびＮＨＳ−ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ）が含まれる。

可逆的架橋剤も使用することができる。このような可逆的可溶剤は、個別の基として誘発因子が組み込まれた多官能性架橋剤である。反応性多官能基は、タンパク質中の反応性アミノ酸側鎖の相互結合に関与し、誘発因子は、周囲の環境中の１つまたは複数の条件（例えば、ｐＨ、還元剤の存在、温度、熱力学的水分活性）の変化によって破壊することができる結合からなる。

架橋剤は、ホモ官能性またはヘテロ官能性であり得る。反応性官能基（または部分）を、例えば、１つまたは複数の以下の官能基から選択することができる（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、アルキル基、アリール基、または水素基であり得る）。
Ｉ．反応性アシルドナー（例えば、カルボン酸エステル（ＲＣＯＯＲ’）、アミド（ＲＣＯＮＨＲ’）、アシルアジド（ＲＣＯＮ_３）、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、Ｎ−ヒドロキシイミドエステル（ＲＣＯ−Ｏ−ＮＲ’）、イミドエステル（Ｒ−Ｃ＝ＮＨ２^＋（ＯＲ’））、無水物（ＲＣＯ−Ｃ−ＣＯＲ’）、カルボン酸塩（ＲＯ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’）、ウレタン（ＲＮＨＣＯＮＨＲ’）、酸ハライド（ＲＣＯＨａｌ）（式中、Ｈａｌ＝ハロゲン）、アシルヒドラジド（ＲＣＯＮＮＲ’’Ｒ’’）、およびＯ−アシルイソ尿素（ＲＣＯ−Ｏ−Ｃ＝ＮＲ’（−ＮＲ’’Ｒ’’’））など）。
ＩＩ．反応性カルボニル基（例えば、アルデヒド（ＲＣＨＯ）およびケトン（ＲＣＯＲ’）、アセタールＲＣＯ（Ｈ_２）Ｒ’、およびケタール（ＲＲ’ＣＯ_２Ｒ’Ｒ”）（当業者に公知のタンパク質の固定および架橋の官能基を含む反応性カルボニル）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ２００３−２００４；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，（１９９１）など）。
ＩＩＩ．アルキルまたはアリールドナー（例えば、アルキルまたはアリールハライド（Ｒ−Ｈａｌ）、アジド（Ｒ−Ｎ_３）、硫酸エステル（ＲＳＯ_３Ｒ’）、リン酸エステル（ＲＰＯ（ＯＲ’_３））、アルキルオキソニウム塩（Ｒ_３Ｏ^＋）、スルホニウム（Ｒ_３Ｓ^＋）、硝酸エステル（ＲＯＮＯ_２）、マイケル受容体（ＲＣＲ’＝ＣＲ’’’ＣＯＲ’’、アリールフルオリド（ＡｒＦ）、イソニトリル（ＲＮ^＋≡Ｃ−）、ハロアミン（Ｒ_２Ｎ−Ｈａｌ）、アルケン、およびアルキンなど）。
ＩＶ．硫黄含有基（例えば、ジスルフィド（ＲＳＳＲ’）、スルフヒドリル（ＲＳＨ）、およびエポキシド（Ｒ_２ＣＯＣＲ’_２）など）。
Ｖ．塩（例えば、アルキルまたはアリールアンモニウム塩Ｒ_４Ｎ^＋、カルボン酸塩（ＲＣＯＯ−）、硫酸塩（ＲＯＳＯ_３−）、リン酸塩（ＲＯＰＯ_３）、およびアミンＲ_３Ｎなど）。

可逆的架橋剤は、例えば、誘発因子を含む。誘発因子には、アルキル、アリール、または架橋すべきタンパク質と反応することができる活性化基を有する他の鎖が含まれる。反応基は、種々の基（求核、遊離ラジカル、または求電子置換に感受性を示す基など）（特に、ハライド、アルデヒド、カーボネート、ウレタン、キサンタン、およびエポキシドが含まれる）であり得る。例えば、反応基は、酸、塩基、フルオリド、酵素、還元、酸化、チオール、金属、光分解、ラジカル、または熱に対して不安定であり得る。

架橋リパーゼ結晶を、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥によって粉末形態で得ることができる。凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）により、無定形懸濁液を形成することなく、且つ最小の変性リスクで、組成物から水を分離し、非冷却温度（室温）で長期間保存することができ、且つ水性溶媒、有機溶媒、または最適な混合した水−有機溶媒中で容易に再構成することができる結晶を生成することが可能である。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４，ｐｐ．９６９−９７５（１９９７）。凍結乾燥を、米国特許第５，６１８，７１０号に記載のように行うか、当該分野で公知の他の方法によって行うことができる。例えば、架橋リパーゼ結晶を最初に凍結し、結晶水が昇華する高真空下に置き、強固に結合した水分子のみを含むリパーゼ結晶が残存する。

（架橋リパーゼ結晶の特徴）
架橋リパーゼ結晶の酵素活性を、任意の従来の方法を使用して測定することができる。例えば、リパーゼ活性を、米国特許第５，６１８，７１０号の実施例６に記載のように、分光光度法で決定することができる。リパーゼ活性を、基質である酢酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解のモニタリングによって評価することができる。基質の分解を、初期基質濃度０．００５％および出発酵素濃度１．５×１０^−８Ｍを用いた４００ｎｍでの吸光度の増加によってモニタリングする。室温でリパーゼ酵素を、５ｍｌの反応体積の基質を含む０．２Ｍ トリス（ｐＨ７．０）に添加する。クリスタリンリパーゼを、吸光度の測定前の遠心分離によって反応混合物から除去する。

あるいは、米国特許第５，６１４，１８９号の実施例２〜４に記載のように、リパーゼ活性を、オリーブ油の加水分解によってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。

リパーゼ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで測定することもできる。例えば、少量（約３ｍｌ）のオリーブ油またはトウモロコシ油を、^９９Ｔｃ−（Ｖ）チオシアネートで標識し、クリスタリンリパーゼを、^１１１Ｉｎで標識することができる。標識した脂肪を、標識クリスタリンリパーゼを点在させた動物性食品と混合する。胃内に５％未満の活性が残存するまで、近位および遠位の胃および小腸のシンチグラフィ画像を得る。次いで、各同位体の胃内容排出曲線（ｅｍｐｔｙｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）（例えば、長期間にわたる胃内の保持率）および目的の各領域から近位、中位、および遠位の小腸に侵入する同位体の量を決定する。

好ましくは、本発明の組成物の架橋リパーゼ成分は、高い比活性を有する。高比活性リパーゼ活性は、典型的には、トリオレインに対する比活性が、５００、１，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、または９，０００単位／ｍｇタンパク質を超える活性である。

好ましくは、本発明の組成物架橋リパーゼ成分はまた、胃腸領域（すなわち、胃領域、十二指腸領域、および腸領域）で見出される過酷な環境下で長期間安定である。例えば、リパーゼは、好ましくは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨが、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、または１．５未満の環境）で少なくとも１時間安定である。本明細書中で使用される、「安定な」は、リパーゼ結晶は、所与の条件および時間のためのリパーゼの可溶性形態よりも高活性であることを意味する。したがって、安定なリパーゼ結晶は、対応するリパーゼの可溶性形態よりも高い初期活性率を保持する。いくつかの実施形態では、リパーゼ結晶は、所与の条件および時間への曝露後にその活性の少なくとも１０％を保持する。他の実施形態では、リパーゼは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはこれらを超えるその活性を保持する。

あるいはまたはさらに、本発明の組成物の架橋リパーゼ結晶成分は、熱耐性を示す。例えば、種々の実施形態では、３０℃、３７℃、または４０℃で少なくとも１時間安定である。

（プロテアーゼ成分）
本発明の組成物のプロテアーゼ成分は、微生物プロテアーゼである。好ましくは、プロテアーゼは、細菌または植物起源よりもむしろ真菌起源である。より好ましくは、プロテアーゼは、アスペルギルスプロテアーゼである。最も好ましくは、プロテアーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓプロテアーゼである。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物のプロテアーゼ成分は、結晶化された非架橋形態である。プロテアーゼ結晶を、例えば、沈殿剤としてエタノールを使用した上記のリパーゼについて記載された結晶化技術にしたがって調製することができる。あるいは、本発明の組成物のプロテアーゼ成分は、非クリスタリン形態、架橋クリスタリン形態、またはコーティング形態、または組成物の他のタンパク質成分を消化しないようにカプセル化または配合した形態であり得る。

（アミラーゼ成分）
本発明の組成物のアミラーゼ成分は、微生物アミラーゼである。好ましくは、アミラーゼは、細菌または植物起源よりもむしろ真菌起源である。より好ましくは、アミラーゼは、アスペルギルスアミラーゼである。最も好ましくは、アミラーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアミラーゼである。好ましい実施形態によれば、本発明の組成物のアミラーゼ成分は、無定形形態である。あるいは、本発明の組成物のアミラーゼ成分は、結晶形態（架橋クリスタリン形態、非クリスタリン形態、もしくはコーティング形態、または経口投与後に活性を保持するように調合した形態であり得る）であり得る。

（架橋リパーゼ結晶、プロテアーゼ、およびアミラーゼを含む組成物）
本発明の組成物は、１つまたは複数の賦形剤と共に、架橋微生物リパーゼ結晶、微生物プロテアーゼ、および微生物アミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１．０：１．０：０．１５の酵素活性比で含む組成物である。好ましくは、リパーゼは細菌リパーゼであり、プロテアーゼおよびアミラーゼは真菌起源である。最も好ましくは、組成物は、ＢＳ−３架橋剤と架橋した細菌リパーゼ結晶、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓプロテアーゼ結晶、および可溶性Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１．０：１．０：０．１５の酵素活性比で含む。

本発明の組成物のリパーゼ成分の架橋により、過酷なｐＨでの安定性およびタンパク質分解下での防御が付与される一方で、プロテアーゼおよびアミラーゼ成分は有効に溶解するための最大溶解性を保持する。より詳細には、リパーゼ成分の結晶化および架橋は、より低い投薬量で酵素活性を増強する組成物が得られるのを補助する。プロテアーゼの結晶形態はまた、酵素の安定性、純度、および潜在性を増強するのを補助する。

本発明の別の実施形態では、リパーゼは任意の安定化形態であり、組成物のプロテアーゼおよびアミラーゼ成分のいずれかまたは両方は結晶、無定形、またはセミクリスタリン形態であり得る。あるいは、前記いずれかまたは両方は、凍結乾燥形態であり得る。その形態と無関係に、前記いずれかまたは両方は、架橋することができる。

本発明の組成物は、有利に、組成物で処置した患者の脂肪吸収係数および窒素吸収係数が相関して増加する。さらに、本発明の組成物は、患者のデンプン消化および炭水化物吸収を増加させるレベルのアミラーゼを含む。本発明によって、デンプン消化および炭水化物吸収に対するこのような効果を、ブタ膵臓サプリメントよりもリパーゼおよびプロテアーゼと比較してはるかに少量のアミラーゼを使用して得ることができることが発見された。この発見は、アミラーゼが特に嚢胞性線維症患者における膵機能不全の治療に必要ないという当該分野の信念に反する。

本発明の組成物で有用な賦形剤は、充填剤または充填剤の組み合わせ（薬学的組成物中で使用される賦形剤など）として作用する。本発明の好ましい実施形態では、賦形剤は、微結晶性セルロース、マルトリン（Ｍａｌｔｒｉｎ）、クロスポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、およびタルクを含む。さらに好ましい賦形剤群には、以下または以下の混合物が含まれる：スクロース、トレハロース、ラクトース、ソルビトール、ラクチトール、マンニトール、イノシトール、ナトリウム塩およびカリウム塩（酢酸、リン酸、クエン酸、およびホウ酸など）、グリシン、アルギニン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、メトキシポリエチレングリコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリリジン、およびポリアルギニン。

他の好ましい賦形剤は、任意の以下または以下の組み合わせであり得る：１）アミノ酸（グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリンなど）、２）炭水化物（例えば、モノサッカリド（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、リボースなど）；３）ジサッカリド（ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロースなど）；４）ポリサッカリド（マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲンなど）；５）アルジトール（マンニトール、キシリトール、ラクチトール、ソルビトールなど）；６）グルクロン酸、ガラクツロン酸；７）シクロデキストリン（メチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；８）無機分子（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、ホウ酸、炭酸アンモニウム、およびリン酸アンモニウムなど）；９）有機分子（酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩など）；１０）乳化剤または可溶化剤／安定化剤（アカシア、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、レシチン、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロクサマー、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、および他のソルビタン誘導体、ポリオキシル誘導体、ワックス、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン誘導体など）；ならびに１１）増粘剤（寒天、アルギン酸およびその塩、グアーガム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、セルロースおよびその炭酸プロピレン誘導体、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、チロキサポールなど）のいずれか。このような化合物の塩も使用することができる。

賦形剤のさらなる例は、米国薬学会および英国薬学会が共同で刊行したＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓに記載されている。組成物に関して、本発明によれば、賦形剤は不活性成分であり、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼは有効成分である。本発明の組成物中の有効成分と不活性成分との比は、ｗ／ｗに基づいて、約１：９〜約９：１、好ましくは約１：６〜６：１であり得る。

本発明の別の実施形態では、リパーゼ成分、プロテアーゼ成分、またはアミラーゼ成分のいずれか１つは、高分子キャリアと会合して組成物中に存在し得る。これにより、経口摂取後に有効量且つ低投薬量の酵素を腸（すなわち、遠位腸（ｄｉｓｔａｌ ｂｏｗｅｌ））に送達する、酸耐性制御放出組成物が得られる。

有用な高分子キャリアには、例えば、タンパク質送達（制御放出生体送達が含まれる）のためのタンパク質結晶のカプセル化に使用されるポリマーが含まれる。このようなポリマーには、生体適合性ポリマーおよび生分解性ポリマーまたはこれらの混合物が含まれる。好ましくは、高分子キャリアは、生分解性ポリマーである。溶解速度、すなわち、酵素の送達を、特定のカプセル化技術、ポリマー組成物、ポリマー架橋、ポリマーの厚さ、ポリマーの安定性、酵素結晶の幾何学的性質および酵素の架橋度（いくらかある場合）によって決定する。１つの実施形態によれば、本発明の組成物を、高分子キャリアのマトリックス内にカプセル化し、それにより、リパーゼ成分、プロテアーゼ成分、およびアミラーゼ成分が胃腸管の過酷な環境からさらに保護される。

（組成物の投薬経路、形態、投与計画、および治療方法）
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、任意の被験体（嚢胞性線維症を罹患した被験体が含まれる）における膵機能不全の治療方法で有用である。別の実施形態によれば、本発明の組成物は、被験体の吸収不良の治療方法で有用である。本発明のさらなる実施形態は、被験体における脂肪吸収係数の増加または窒素吸収係数の増加のための本発明の組成物の使用を含む。本発明の別の実施形態は、任意選択的に同量の、被験体における脂肪吸収係数および窒素吸収係数の両方の増加のための組成物の使用を含む。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、被験体における炭水化物吸収の増加方法で有用である。

本発明の組成物を使用した治療方法は、被験体に治療有効量のこのような組成物を投与する工程を含む。本発明の方法のいずれかを使用して、膵機能不全を罹患した任意の被験体（嚢胞性線維症患者が含まれる）を治療することができる。同様に、これらの方法のいずれかを使用して、任意の嚢胞性線維症患者を治療することができる。

本発明の治療方法は、被験体に治療有効量の本発明の組成物を投与する工程であって、被験体におけるベースライン脂肪吸収係数が４０％以下である場合、該治療有効量によって、被験体の脂肪吸収係数がベースラインより約３０％と約３５％との間の量で増加する、投与する工程を含む方法を含む。好ましくは、このような被験体における脂肪吸収係数の増加は、ベースラインより約３０％の増加である。別の実施形態では、治療方法は、被験体に治療有効量の本発明の組成物を投与する工程であって、被験体におけるベースライン脂肪吸収係数が４０％超であるが８５％未満である場合、該治療有効量によって、被験体の脂肪吸収係数がベースラインより約１０％と約２５％との間の量で増加する、投与する工程を含む方法を含む。好ましくは、被験体の脂肪吸収係数の増加は、ベースラインより約１５％の増加である。

さらに、本発明の治療方法は、被験体に治療有効量の本発明の組成物を投与する工程であって、被験体におけるベースライン窒素吸収係数が４０％以下である場合、該治療有効量によって、被験体の窒素吸収係数がベースラインより約３０％と約３５％との間の量で増加する、投与する工程を含む方法を含む。好ましくは、このような被験体における窒素吸収係数の増加は、ベースラインより約３０％の増加である。別の実施形態では、治療方法は、被験体に治療有効量の本発明の組成物を投与する工程であって、被験体におけるベースライン窒素吸収係数が４０％超であるが８５％未満である場合、該治療有効量によって、被験体の窒素吸収係数がベースラインより約１０％と約２５％との間の量で増加する、投与する工程を含む方法を含む。好ましくは、被験体の窒素吸収係数の増加は、ベースラインより約１５％の増加である。

別の実施形態では、本発明の治療方法は、被験体に治療有効量の本発明の組成物を投与する工程であって、該治療有効量によって、被験体の炭水化物吸収がベースラインより約１０％以上の程度で増加する、投与する工程を含む方法を含む。別の実施形態では、このような方法は、治療有効量の本発明の組成物が被験体の炭水化物吸収がベースラインより約２０％以上の程度で増加する量である方法を含む。本明細書中で測定されるように、１０％の炭水化物吸収の増加は、１日あたり９０カロリーの増加である。３６５日後、１年あたり全部でさらに３２，８５０カロリーが吸収されるであろう。１ポンド増加させるために約３，５００カロリーが必要であるので、被験体の炭水化物吸収の１０％増加に基づいて、１年あたり９ポンド余り増加するであろう。

本発明の組成物を、任意の従来の送達経路（上部胃腸管（例えば、口腔（例えば、カプセル、錠剤、懸濁液、または食品と共に送達）、胃、上部腸管（例えば、チューブまたは注入による）、経口経路）が含まれる）のために処方することができる。好ましくは、組成物を、経口送達のために処方する。したがって、組成物は、任意の投薬形態（固体、液体、懸濁液、または分散液の形態が含まれる）（例えば、カプセル、錠剤、カプレット、サシェ、または糖衣錠など）であり得る。乳児および幼児または錠剤またはカプセルを摂取できない任意の成人のために、組成物を、液体、懸濁液、またはサシェ形態で投与し、他の適合可能な食品または製品と共に投与することができる。

本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物を、１つまたは複数のカプセル、懸濁液、またはサシェで食事または軽食時に被験体に投与する。好ましくは、本発明の組成物を、食事または軽食あたり１つまたは２つのカプセル、懸濁液、またはサシェで被験体に投与する。組成物を、食事または軽食の半分を消費した後に投与することができる。本発明にしたがって膵機能不全を治療するための治療有効量の組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１：１：０．１５の酵素活性比で含み、投与あたり、約５，０００ＵＳＰ単位と約１００，０００ＵＳＰ単位との間の活性リパーゼレベル、約５，０００ＵＳＰ単位と約１００，０００ＵＳＰ単位との間の活性プロテアーゼレベル、および約７５０ＵＳＰ単位と約１５，０００ＵＳＰ単位との間の活性アミラーゼレベルで含む。より好ましくは、このような組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１：１：０．１５の酵素活性比で含み、投与あたり、約２５，０００ＵＳＰ単位と約１００，０００ＵＳＰ単位との間の活性リパーゼレベル、約２５，０００ＵＳＰ単位と約１００，０００ＵＳＰ単位との間の活性プロテアーゼレベル、および約３，７５０ＵＳＰ単位と約１５，０００ＵＳＰ単位との間の活性アミラーゼレベルで含む。最も好ましくは、このような組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１：１：０．１５の酵素活性比で含み、投与あたり、約２５，０００ＵＳＰ単位の活性リパーゼレベル、約２５，０００ＵＳＰ単位の活性プロテアーゼレベル、および約３，７５０ＵＳＰ単位の活性アミラーゼレベルで含む。

幼児のために、本発明の組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１：１：０．１５の酵素活性比で含み、投与あたり、約１２，５００ＵＳＰ単位と約２５，０００ＵＳＰ単位との間の活性リパーゼレベル、約１２，５００ＵＳＰ単位と約２５，０００ＵＳＰ単位との間の活性プロテアーゼレベル、および約１，８７５ＵＳＰ単位と約３，７５０ＵＳＰ単位との間の活性アミラーゼレベルで含む。乳児のために、このような組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、ＵＳＰ単位で約１：１：０．１５の酵素活性比で含み、投与あたり、約５００ＵＳＰ単位と約１，０００ＵＳＰ単位との間の活性リパーゼレベル、約５００ＵＳＰ単位と約１，０００ＵＳＰ単位との間の活性プロテアーゼレベル、および約７５ＵＳＰ単位と約１５０ＵＳＰ単位との間の活性アミラーゼレベルで含む。本明細書中で考察された全ての酵素活性単位の数値および範囲について、リパーゼ、プロテアーゼ、またはアミラーゼの１単位を、各酵素について上記のアッセイにしたがって定義する。上記量はまた、それぞれ、成人、幼児、もしくは乳児の吸収不良もしくは消化不良の治療または成人、幼児、もしくは乳児の脂肪吸収係数、窒素吸収係数、炭水化物吸収、もしくはデンプン消化のいずれかの増加のための有効量である。

本発明の組成物の最も有効な投与様式および投薬計画は、所望の効果、以前の治療法、存在する場合、被験体の健康状態または容態自体の状態、治療に対する応答、および医師の判断に依存する。

被験体の容態の改善の際に、必要に応じて、維持投薬計画を導入することができる。その後に、症状の効用（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として、投薬量、投与頻度、またはその両方を、改善された容態が保持されるレベルに減少することができる。しかし、被験体は、その容態または症状の任意の再発の際に、長期を基本とした間欠的治療が必要であり得る。

本発明をより深く理解し得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみを目的とし、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限すると解釈すべきではない。

以下の実施例は、本発明の組成物ならびに膵機能不全の治療についてのその安全性および有効性を評価する臨床研究に関する。これらの研究は、膵機能不全を罹患した嚢胞性線維症患者における第１相および第２相臨床試験を含んでいた。

第２相研究は、以下の変化によって測定される本発明の組成物の有効性を評価した：脂肪吸収係数（「ＣＦＡ」）、窒素吸収係数（「ＣＮＡ」）、経口炭水化物吸収、１日あたりの糞便重量、１日あたりの排便回数、および嚢胞性線維症質問書（「ＣＦＱ」）によって測定した胃腸管の症状に関する生活の質。本研究はまた、処置した被験体中のベースライン（酵素なし）から脂肪吸収の改善についての最も高い臨床的に重要な係数を示すこのような組成物の投薬量を評価した。

第２相研究で証明されるように、本発明の組成物により、膵機能不全を有する嚢胞性線維症被験体のベースラインから治療期間までの平均ＣＦＡおよびＣＮＡが統計的に有意に増加した。本発明の組成物は、最小の用量（カプセルあたり２５，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、２５，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および３，７５０ＵＳＰ単位のアミラーゼ（本研究の「中用量」または「Ａｒｍ２」））で有効であり、ほとんどの被験体でＣＦＡおよびＣＮＡの両方が有意に（１０％以上）増加することが見出された。ＣＦＡおよびＣＮＡは、処置においてリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼをカプセルあたり、ＵＳＰ単位で１００，０００：１００，０００：１５，０００の酵素活性比で含む場合（本研究の「高用量」または「Ａｒｍ３」）にも増加した。しかし、中用量投与計画と高用量の投与計画との間にＣＦＡまたはＣＮＡのいずれかに関する統計的有意性は存在しなかった。本発明の組成物および第２相研究で使用した組成物には、カプセルあたり５，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、５，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および７５０ＵＳＰ単位のアミラーゼの用量（本研究の「低用量」または「Ａｒｍ１」）で投与する組成物も含まれる。

有利には、ＣＦＡおよびＣＮＡのベースライン値ならびに処置した被験体の性別の調節後でさえも、ＣＦＡおよびＣＮＡに対する本発明の組成物のこの効果は、統計的に有意なままであった（中用量および高用量治療群についてそれぞれｐ＝０．０００３および＜０．０００１）。ＣＦＡおよびＣＮＡの両方を別の四分位（ｑｕａｒｔｉｌｅ）として試験した場合（図１および２）、４０％未満のベースライン値の被験体で最も大きな変化が認められ、４０％を超えるベースラインＣＦＡおよびＣＮＡを有する被験体で比例的により小さな変化が認められた。ＣＦＡに関して、４０％以下のベースラインＣＦＡを有する８人の被験体の中用量治療群における平均増加は、３５．３％であった。４０％以下のベースラインＣＦＡを有する１２人の被験体の高用量群における平均増加は、３０．４％であった。４０％以下のベースラインＣＦＡを有する２０人の被験体の中用量および高用量の治療群についての全体的な増加は、３２．３％であった。

本発明の組成物はまた、処置した被験体における１日あたりの排便回数および糞便の重量の変化に関して測定したところ、有意な治療効果が得られた。高用量を投与した被験体は、ベースラインから治療期間までに排便回数が有意に減少する一方で、中用量および高用量治療群の両方における糞便重量の減少が統計的に有意であった。実際、脂肪吸収の変化と糞便重量の変化との間に非常に有意な逆相関（Ｒ＝−０．７２８３；Ｐ＜０．０００１）が認められた。したがって、これらに関して、高用量（Ａｒｍ３）での研究は、中用量（Ａｒｍ２）と有意に異ならなかった。

全ての研究被験体では、酵素ありおよび酵素なしにおけるデンプン攻撃試験（Ｓｔａｒｃｈ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｔｅｓｔ）で全体的に統計的に有意な変化は認められなかったにもかかわらず、最大グルコース変化および曲線下面積（「ＡＵＣ」）の両方において高用量被験体で認められた効果は、示唆されるアミラーゼ活性に向かう傾向があった（ｐ＜０．０５７）。さらに、フィッシャーの正確確率検定を使用した即興的分析は、デンプン攻撃試験後に、酵素ありと酵素なしの処置期間の比較に基づいて、中用量群および高用量群のより多くの被験体が低用量治療群よりも最大グルコース変化が１０％以上増加することを示した（ｐ＝０．０１３８）。これらの結果は、アミラーゼが本発明の重要な成分として機能し、デンプン消化および炭水化物吸収が改良されることを証明する。

本発明の組成物で処置した被験体で深刻な有害事象は報告されず、第２相研究での全ての用量レベルを十分に許容した。本研究中に死亡した被験体はいなかった。

（実施例１−研究組成物の調製）
本明細書中で考察した第１相および第２相研究で使用した組成物は、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを含んでおり、それぞれ、調節された条件下で、単離、精製、および乾燥前に異なる微生物株から個別に製造した。小腸内で安定であり、且つ強い酵素活性が保持される組成物が得られるような方法で製造した。

リパーゼ：細菌からのリパーゼの産生および精製方法は、当業者に周知である。例えば、本発明のリパーゼ成分を、細菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ（以前は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａとして公知であった）からの発酵によって産生した。２５，０００リットルの発酵槽で行った。株を、凍結乾燥万能細胞バンクから入手し、スラントで成長させ、８リットルの種培養物に育成し、２，５００リットルの種発酵槽でさらに発酵させ、最後に、２５，０００リットルの発酵槽で産生した。発酵後、生きた生物を、熱処理によって死滅させ、遠心分離によって除去した。蒸発によってタンパク質を濃縮し、その後にエタノール沈殿し、バスケット遠心分離機中にてエタノールで洗浄した。

硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡＥセルロースを使用した吸着および溶離、ならびにその後の限外濾過におる精製、濃縮、および脱塩によって、より精製されたリパーゼを生成した。得られた材料を、アセトン処理およびＣＭ−セルロースによってさらに精製し、安定剤としてグリシンを添加した。得られた材料を、膜濾過によって濾過し、凍結乾燥させた。次いで、材料を、篩にかけ、比活性、純度、および病原体の非存在について分析した。

精製リパーゼを、ダイアフィルトレーションによってさらに処理してグリシン安定剤を除去した。次いで、これを、２５％ｔ−ブタノール中で沈殿および結晶化させ、その後に、好ましくは、架橋リパーゼ結晶中の架橋剤の最終濃度が約２．０ｍＭと約５．０ｍＭとの間の範囲内であるような上記の濃度範囲内のＢＳ^３で架橋した。架橋リパーゼ結晶を、５倍体積の１５％エタノール緩衝液で洗浄し、その後に５倍体積のエタノール緩衝液（１．５ｍＭ酢酸カルシウム（ｐＨ５．０）を含む）でさらに洗浄して、残存する架橋剤およびｔ−ブタノールの両方を低下させた。得られた材料を凍結乾燥し、輸送のためにＨＤＰＥボトルに積めてテープで密封し、シリカゲル乾燥剤と共に１つのＰＥバッグに梱包した。各バッチを、他の微生物に加えてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａでの微生物汚染について明確に分析し、臨床用途のために発売される前にＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａおよび病原体について陰性でなければならなかった。

プロテアーゼ：プロテアーゼの産生および精製方法は、当業者に公知である。例えば、プロテアーゼを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓの固体発酵によって産生した。種培養物を溶液中で成長させ、小麦ふすまに移した。一旦種が滅菌ふすまを被うと、発酵室での発酵のために固体をトレイにロードした。発酵の完了後、巨大抽出タンクによる水の潅流によって固体バイオマスから酵素を抽出した。

次いで、プロテアーゼを含む抽出物を、活性炭濾過装置に流して濾過し、懸濁粒子を除去した。次いで、溶液を濃縮し、活性炭で２回処理した。プロテアーゼをエタノールで沈殿させ、最終精製のために真空乾燥させた。

プロテアーゼを溶解し、イオン交換樹脂を通過させた。次いで、材料を濾過し、その後に結晶化タンクに移し、ここで、複数回エタノールを添加しながら結晶化させた。一旦結晶化が完了すると、結晶をバスケット遠心分離機で回収し、さらなるエタノールで洗浄した。結晶を、バスケット遠心分離機から回収し、強制換気によって乾燥させ、その後に真空乾燥させた。一旦乾燥させると、最終的な篩および包装のために粉末をバルクコンテナに移した。

アミラーゼ：アミラーゼの産生および精製方法は、当業者に公知である。例えば、アミラーゼを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの固体発酵によって産生した。種培養物を溶液中で成長させ、小麦ふすまに移した。一旦種が滅菌ふすまを被うと、発酵のために固体をトレイにロードした。発酵の完了後、抽出タンクによる水の潅流によって固体バイオマスから酵素を抽出した。濾過した抽出物を、濃縮し、ダイアフィルトレーションを行った。このダイアフィルトレーション後に、熱処理し、ｐＨを調整し、その後に別のダイアフィルトレーションおよび濃縮を行った。魚類ゼラチンを、噴霧乾燥前の安定剤として材料に添加し、これは、生成物の総重量の３０％までに相当する。一旦乾燥させると、材料を篩にかけ、デキストリンと混合し、包装した。長期保存のための安定剤としてデキストリンを使用し、これは、最終生成物の総重量の３０％にもなる。得られた活性薬学的成分中のタンパク質の純度は、２８０ｎｍで検出するＳＥＣ ＨＰＬＣによって９０％を超えた。この９０％は、賦形剤としてのゼラチンおよびデキストリンの存在を示さず、賦形剤が２８０ｎｍで有意に吸収されなかった。精製および処理後、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、カプセルとして互いに配合した。より詳細には、乾燥酵素を、（賦形剤と）乾式混合し、ゼラチンカプセルに充填した。この組成物を、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭと呼んだ。

（実施例２−第２相研究）
（処置用量）
第２相研究で使用した組成物は、有効成分である架橋Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａリパーゼ結晶、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓプロテアーゼ結晶、および可溶性Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアミラーゼの有効成分、ならびに以下の不活性成分を含んでいた：微結晶性セルロース、マルトリン、クロスポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、およびタルク。これらは、リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを、ＵＳＰ単位で１：１：０．１５の酵素活性比で含んでいた。

組成物を、２つの異なる力価（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）のカプセルの形態で送達させた。「ＴＣＴ２０」と呼ばれる高力価処方物を、２０，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、２０，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および３，０００ＵＳＰ単位のアミラーゼの力価でサイズ２の白色不透明硬ゼラチンカプセルに充填した。「ＴＣＴ５」と呼ばれる低力価処方物を、５，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、５，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および７５０ＵＳＰ単位のアミラーゼの力価でサイズ５の白色不透明硬ゼラチンカプセルに充填した。ｗ／ｗベースでの有効成分：不活性成分比は、ＴＣＴ２０については３：４であり、ＴＣＴ５については２：５であった。

第２相研究でＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの用量を分からなくするためにサイズ２およびサイズ５プラセボカプセルを使用した。プラセボカプセルは、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭカプセルと同一の不活性成分を含み、カプセルの身元（活性対プラセボ）が分からないように、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭカプセルと同一の外観であった。適切な数および型のＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭカプセルおよびプラセボカプセルを、投与レベルを分からなくするために、無作為に選択した被験体に投与した。

第２相研究中、２８日の処置期間中の各食事または軽食のほぼ中間で、被験体は、全部で６カプセルを摂取し、これらは、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭとプラセボカプセルとの組み合わせであり、下記のように、１つがサイズ５カプセルであり、５つがサイズ２カプセルであった。

（表１−治療群（ａｒｍ）による研究処置対プラセボの分布）

（投与の選択およびタイミング）
第２相研究の最も高い固定用量（１００，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ／食事）は、８０ｋｇの被験体のための１ｋｇあたり１，２５０リパーゼＵＳＰ単位および４０ｋｇの被験体のための１ｋｇあたり２，５００リパーゼＵＳＰ単位と等しかった。

（表２−研究薬−ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの用量）

（第２相研究のさらなるパラメーター）
第２相研究は、無作為化した二重盲検の並行用量分類試験であった。本研究には、米国の約２６箇所から全部で１２９人のＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの３つの投与レベルの男性および女性の被験体が参加した（治療群あたり約４２人）。研究を、以下の４つの異なる観察および評価期間に分けた：スクリーニング、ベースライン、処置、および追跡。

（第２相研究集団）
上記のように調製した組成物を、３つの被験体集団で試験した。修正治療意図（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉｎｔｅｎｔ−Ｔｏ−Ｔｒｅａｔ）（「ｍＩＴＴ」）集団は、ベースライン期間（酵素なし）測定を受け、少なくとも１つの無作為化投与を受け、安全性についての処置期間評価を受け、マーカー毎に糞便を回収した全ての適格な被験体を含んでいた。他の被験体集団を試験し、結果は、ｍＩＴＴ集団の結果と一致した。

（スクリーニング期間（日数Ｓ１〜ベースライン））
スクリーニング外来（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｖｉｓｉｔ）の第１日目（日数Ｓ１）に、本研究の参加に適格であるかを決定するために被験体を面接した。被験体は、完全な身体検査も受けた。

被験体に、研究期間を通して高脂肪食を摂取するよう依頼した。被験体は、被験体が罹患している嚢胞性線維症および関連疾患の治療および管理のために必要な薬物を摂取することが許容された。被験体に、研究の入院患者ベースライン期間（日数Ｂ１〜Ｂ３）および処置期間（日数Ｔ１〜Ｔ２８）に酵素補充と解釈され得る酵素補充剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）または補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ ａｉｄ）を投与しなかった。

被験体を、３つのＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭ投与のうちの１つに無作為に選択した。

（ベースライン期間（日数Ｂ１〜Ｂ３））
スクリーニング開始から１０〜１４日以内に、無作為化被験体は、絶食状態且つその日の最初の食事前（朝食前）に入院施設に入院することが必要であった。ベースライン期間を、第Ｂ１日目の１日の最初の食事（朝食）から開始した。朝食前に、体重を測定した。次いで、被験体は、膵酵素を補充することなく７２時間の栄養制限食を開始した。糞便マーカー（ｓｔｏｏｌ ｍａｒｋｅｒ）（５００ｍｇ ＦＤ＆Ｃ Ｄｙｅ Ｂｌｕｅ番号２）を、第Ｂ１日目の最初の食事の開始時に摂取した。実際の消費に基づいて、脂肪およびタンパク質の取り込みを記録した。便中脂肪および窒素評価のための糞便回収を、第１のマーカーの通過後に開始し（第１のマーカーを含む糞便を破棄する）、糞便中に第２のマーカーが最初に認められた時（第２のマーカーを含む糞便を回収した時）に終了した。

ベースライン期間中の各日に、被験体を、有害事象および併用薬について評価し、生命徴候を記録し、簡単な身体検査を行った。

（処置期間（日数Ｔ１〜Ｔ２８））
処置期間の第１日目（Ｔ１）に、投与前手順の完了後およびＴ１日目のデンプン攻撃試験後の第１の食事（昼食）のほぼ中間で、研究薬物の第１の投与を各被験体に行った。次いで、第１の投与から少なくとも３０分後に被験体を観察した。十分な薬物耐性を示す場合、治療期間のＴ１〜２８における３回の食事および２回の軽食のほぼ中間に被験体に同用量の研究薬物を摂取させた。本研究では、食事の中間を、被験体が食事または軽食のほぼ半分を消費した時点と定義した。

第Ｔ２９日目に、被験体に対する薬物研究を中断した。第Ｔ２９日目／ＥＴ外来診療中に、完全な身体検査を行った。被験体を、有害事象についても評価した。

（追跡期間（Ｆ７±２日目））
追跡期間中、被験体を、医師が処方した高脂肪食および通常ケアの酵素（ｕｓｕａｌ ｃａｒｅ ｅｎｚｙｍｅ）で維持した。処置期間（Ｔ２９日目）の外来の完了から７±２日後に、追跡期間の外来が終了するように計画した（Ｆ７±２日目）。この外来時に、被験体に簡単な身体検査を受けさせ、有害事象および併用薬について評価した。

（脂肪および窒素についての糞便分析）
スクリーニング外来中にスポット糞便エラスターゼ試験のための糞便を回収して、本研究の適性について評価した。各被験体は、潜血および白血球の存在についての試験中の種々の期間で試験する糞便を有していた。

入院患者のベースライン期間および入院患者の処置期間中に、および入院患者の治療期間中に、脂肪（約１００ｇ／ｋｇ体重／日）および最低限のタンパク質（約２ｇ／ｋｇ体重／日）からなる栄養制限食の第１の食事（朝食）の開始時に、指標マーカー（５００ｍｇのＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ番号２）を投与した。実際の脂肪およびタンパク質の取り込みを、食事の消費量に基づいて記録しなければならなかった。

栄養制限食から７２時間後、デンプン攻撃試験のための試験食を用いる絶食被験体に第２の青色指標マーカーを投与した。便中脂肪および窒素評価のための糞便回収を、第１のマーカーの通過後に開始し、第２の青色マーカーの通過時に完了した。回収した糞便を、糞便重量ならびに脂肪および窒素含有量の分析のために測定した。Ｓｅｌｉｇｓｏｎ，Ｄ（ｅｄ）， Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ，Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｓｔｏｏｌ，１９８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ ３４−３９；Ｖｅｌｄｅｅ ＭＳ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ， Ｔｈｅｒａｐｙ， ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ Ｂｕｒｔｉｓ ＣＡ， Ａｓｈｗｏｏｄ ＥＲ（ｅｄｓ）． Ｔｉｅｔｚ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，１９９９， Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏ，ｐｐ １３８５−８６。

脂肪吸収係数（％ＣＦＡ）を、以下の２つのデータポイントを使用したサイトによって手作業で計算した。
（１）ｃｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｉｃｉａｎによって提供された２４時間あたりの脂肪消費量（ｇ）、および
（２）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって提供された２４時間あたりの脂肪排泄量（ｇ）。

ＣＦＡを、以下のように手作業で計算した：
（２４時間あたりの平均脂肪消費量（ｇ）−２４時間あたりの平均脂肪排泄量（ｇ））／（２４時間あたりの平均脂肪消費量（ｇ））×１００。

窒素吸収係数（％ＣＮＡ）を、以下の２つのデータポイントを使用して手作業で計算した。
（１）ｃｅｎｔａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔｉｃｉａｎによって提供された２４時間あたりの窒素消費量（ｇ）、および
（２）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって提供された２４時間あたりの窒素排泄量（ｇ）。

ＣＮＡを、以下のように手作業で計算した：
（２４時間あたりの平均窒素消費量（ｇ）−２４時間あたりの平均窒素排泄量（ｇ））／（２４時間あたりの平均窒素消費量（ｇ））×１００。

（有効性の評価−脂肪吸収係数）
処置群によるベースライン、処置時での脂肪吸収係数、およびベースラインから処置までの変化をまとめた。報告した脂肪吸収係数は、１つの糞便回収物由来の２つの便中脂肪の結果を使用した２つの独立したＣＦＡ計算値の平均であった。処置期間中の平均脂肪吸収係数の３つの処置群間の相違を、一元配置分散分析を使用して分析した。全部で５％のＩ型エラー率に調節しながら３つの可能な２つ１組の比較を評価するために、テューキーのスチューデント化された範囲の検定を使用した。従属変数は、処置中の測定値を含んでいた。

処置群および平均ベースラインＣＦＡの同時効果を試験する線形回帰分析も行った。この場合も、従属変数は、処置中の測定値を含んでいた。モデルで試験されたさらなる要因には、以下のベースライン測定が含まれた：年齢、性別、人種、およびＢＭＩ。これらのさらなる要因について、減少過程を使用して、有意でない要因（ｐ＞０．１０）をモデルから排除した。この線形回帰分析においてテューキーのスチューデント化された範囲の試験を使用して、２つ１組の比較も行った。

処置群によるｍＩＴＴ集団についてのベースライン、治療での脂肪吸収係数（ＣＦＡ）およびベースラインから処置までの変化を、以下の表３にまとめている。３つ全ての処置集団にわたって、ベースラインから処置期間までの平均ＣＦＡに有意な増加が認められた。脱落者を除く治療（ｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によるＣＦＡは、治療群１（低用量）よりも治療群２（中用量）および治療群３（高用量）で有意に高かった。さらに、治療群２および３は、酵素なしから酵素ありまでの平均増加が治療群１よりも高かった。治療群３が治療群２を超える一貫した多数の利点を示したが、この相違は統計的に有意ではなかった。

（表３−平均脂肪吸収係数−分散分析）

＊分散分析由来の全ｐ値
＊＊脱落者を除く治療の結果（２つ１組の比較のためのテューキーのスチューデント化された範囲の試験を使用）：
治療群１対治療群２、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．０２２９。
治療群２対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．７８７４。
治療群１対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．００４１。

ベースラインＣＦＡを０〜１００％の五分位数に分けた場合、全治療群は、ベースラインＣＦＡが４０％を超えた場合よりも、０〜４０％のＣＦＡのベースラインで著しく増加したことが明らかである（図１を参照のこと）。さらに、ベースラインＣＦＡが低いほど、治療に対する応答は高くなる。

（有効性の評価−窒素吸収係数）
ｍＩＴＴ集団についてのベースライン（Ｂ１〜Ｂ３）および処置時の窒素吸収係数を、処置群により以下の表４にまとめた。報告した窒素吸収係数は、１つの糞便回収物由来の２つの便中窒素の結果を使用した２つの独立したＣＮＡ計算値の平均であった。平均ＣＮＡの３つの処置群間の相違を、平均ＣＦＡと同一の様式で分析した。

ＣＦＡの測定と同様に、３つ全ての処置集団にわたって、ベースラインから処置期間までの平均ＣＮＡに有意な増加は認められた。３つ全ての処置集団では、脱落者を除く治療によるＣＮＡは、治療群１よりも治療群２および治療群３の両方で有意に高かった。さらに、治療群２および３は、酵素なしから酵素ありまでの平均増加が治療群１よりも高かった。治療群３が治療群２を超える一貫した多数の利点を示したが、この相違は統計的に有意ではなかった。

（表４−平均窒素吸収係数−分散分析）

＊分散分析由来の全ｐ値
＊＊脱落者を除く治療の結果（２つ１組の比較のためのテューキーのスチューデント化された範囲の試験を使用）：
治療群１対治療群２、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．０１４５。
治療群２対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．６１３０。
治療群１対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．０００９。

ベースラインＣＮＡを０〜１００％の五分位数に分けた場合、全治療群は、ベースラインＣＮＡが４０％を超えた場合よりも、ベースラインＣＮＡが４０％以下の場合のベースラインで増加したことが図２において明らかである。治療群２および３は、治療群１よりも依然として有効なようであった。さらに、ベースラインＣＮＡが低いほど、治療に対する応答は高くなる。

（ＣＦＡおよびＣＮＡの改善およびその間の相関）
本研究は、３つの全処置集団の間での中用量および高用量処置群におけるベースラインから処置期間までの平均ＣＦＡおよびＣＮＡの有意な増加を反映した。さらに、治療群３（高用量処置群）は、この期間でのＣＦＡおよびＣＮＡの最も高い平均増加を示したが、中用量と高用量との間の相違は統計的に有意ではなかった。ＣＦＡおよびＣＮＡのベースライン値および性別の調節後でさえも、ＣＦＡおよびＣＮＡのこの処置効果は統計的に有意なままであった（それぞれ、ｐ＝０．０００３および＜０．０００１）。

ＣＦＡ増加とＣＮＡ増加との間の相関も統計的に有意であった。図３および４は、それぞれベースラインレベルおよび処置レベルでの本発明の全用量の組成物を使用して処置したｍＩＴＴ患者におけるＣＦＡとＣＮＡとの間の相関を示す。図５は、これらの患者における処置レベルおよびベースラインレベルでんＣＦＡとＣＮＡとの間の相関の相違を示す。

（有効性の評価−ベースライン分析からの変化−糞便採取）
関連する処置期間の終点に対するベースラインから処置期間までの排便回数および糞便重量の平均変化を、それぞれ表５および表６に各研究処置群について個別に示す。

３つ全ての治療群では、ベースラインから処置期間までの排便回数が減少した（それぞれ、ｐ＝０．０９６８、ｐ＝０．０９７５、およびｐ＝０．１８０７）。治療群３は、特に、ベースラインから処置までの排便回数の平均減少（−．２．６ ｍＩＴＴ における）が最も高かった（ｐ＝０．０００３）。しかし、排便回数の変化における群間の比較により、治療群間の統計学的有意差は認められなかった。

３つ全ての処置集団の中用量処置群と高用量処置群におけるベースラインから処置までの糞便重量も有意に減少した（ｐ＝０．０００１）。３つ全ての集団の治療群３はベースラインから処置までの糞便重量の平均減少が最も高いが（ｐ＜０．０００１）、テューキーのスチューデント化された範囲の検定を使用した２つ１組の比較によって、中用量の治療群と高用量の治療群との間に統計的有意差は認められなかった。

（表５−ベースラインから処置までの排便回数の変化）

＊分散分析由来の全ｐ値
＊＊対応のあるｔ検定
注釈：ベースラインの結果からの変化（２つ１組の比較のためのテューキーのスチューデント化された範囲の試験を使用）：
治療群１対治療群２、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．５５０２。
治療群２対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．４８４２。
治療群１対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．２０４０。

（表６−ベースラインから処置までの糞便重量（ｇ）の変化）

＊分散分析由来の全ｐ値
＊＊対応のあるｔ検定
注釈：ベースラインの結果からの変化（２つ１組の比較のためのテューキーのスチューデント化された範囲の試験を使用）：
治療群１対治療群２、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．８８４２。
治療群２対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．２４１５。
治療群１対治療群３、ｍＩＴＴ ｐ値＝０．１９７１。

（有効性の評価−血中グルコース反応によって測定したデンプン消化および炭水化物吸収）
デンプン攻撃試験では、入院患者のベースライン期間および入院患者の処置期間中、一晩（少なくとも８時間）絶食した被験体に、１００ｇの白小麦粉パン（炭水化物５０ｇ）を含む標準試験食を摂取させた。デンプン攻撃試験の開始前に被験体を３０分間休憩させ、評価中に活動を制限した。血糖計（Ａｃｃｕｃｈｅｃｋ，Ｂａｙｅｒ）を使用して、血糖値を測定した。試験食の直前に測定した。パン食の間の約中間にＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭを投与した。４時間にわたり、血糖計による測定を連続的に行った。計算値は、絶食レベル由来の最大グルコース変化および酵素あり−酵素なしでのグルコース変化（Ｔ１７〜Ｔ１）を含む。空腹時グルコースの測定値が７５ｍｇ／ｄＬ未満である場合、真性糖尿病を有する被験体に対してデンプン攻撃試験を行わなかった。

ｍＩＴＴ集団における血中グルコース反応を、以下の変数によって測定した。
時間０からのグルコース変化：時間０からの各時点でのグルコースの変化。
最大グルコース反応：時間０後の最大グルコース値。
グルコース反応の最大変化：最大反応−時間０でのグルコース値と定義する。
ピークグルコース反応時間（Ｔ_ｍａｘ）：時間０から最大グルコース変化までの時間と定義する。

以下での処置群によるこれらの各変数についての記述統計学を示す。
１．ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭなし
２．ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭあり
３．ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭあり−ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭなし
４．ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭあり：ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭなし比（Ｒ）
これらの記述統計学を、全被験体および糖尿病のみを罹患していない被験体について示す。被験体は、公知の糖尿病の病歴を有するか、インスリンまたは糖尿病関連経口薬を服用している場合または空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄＬ以上であるか食後血糖値は２００ｍｇ／ｄＬ以上である場合に嚢胞性線維症関連糖尿病を罹患していると見なされる。

表７では、２５人の嚢胞性線維症関連真性糖尿病を有する被験体を分析から除外し、高ベースライングルコースおよび午前中のインスリン注射の結果としての「デンプン攻撃試験」後のグルコースの減少の両方由来のばらつきを減少させた。ＴＣＴ５は、ＴＣＴ２５よりも酵素あり−酵素なしでの最大グルコースの増加が１０ｍｇ／ｄＬ以上である被験体数が有意に（ｐ＝０．００５３）減少するようである。さらに、表７の結果により、治療群２における中用量範囲のアミラーゼは治療群３における最も高い用量と有効性が同等であることが示唆される。

（表７−嚢胞性線維症を有する非糖尿病患者におけるデンプン攻撃試験−−酵素あり−酵素なし処置での最大グルコース変化の観察）

概して、本研究は、血中グルコース反応によって測定したところ、本発明の組成物で処置した被験体は、デンプン消化および炭水化物吸収が増加し、高用量治療群の被験体ではこれらの増加により少ない時間しか必要としないことを証明した。

（実施例３−第１相研究）
第２相研究前に、本発明の組成物を、膵機能不全を罹患した嚢胞性線維症患者における第１相試験でのその安全性および予備的有効性についても評価した。

膵機能不全を罹患した２３人の嚢胞性線維症患者におけるＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの急性安全性、耐用性、および臨床活性を決定するために、非盲検の用量分類研究を行った。被験体に、１００、５００、１，０００、２，５００、または５，０００リパーゼ単位／ｋｇ／食事のＴＣＴを３日間投与した。臨床的および実験的安全性パラメーターおよび有害事象をモニタリングした。

第１相研究で重篤な有害事象または死亡は認められなかった。最も有害な事象は軽度であったが、胃腸管疾患は一般的であった。ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭにより、１００リパーゼ単位／ｋｇ／食事を投与した被験体以外の全ての群における脂肪吸収係数および窒素吸収係数が増加した。他の投与レベルでの全被験体について、平均ＣＦＡ増加＝２０．６±２３．５、平均ＣＮＡ増加＝１９．７±１２．２％、および平均糞便重量の減少＝４２５±４２２ｇ。

ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭは、５，０００リパーゼ単位／ｋｇ／食事までの用量で、この短期曝露研究で十分に許容された。予備的有効性データは、脂肪および窒素吸収に対する有益な効果を証明した。有利には、これらの効果は、５００リパーゼ単位／ｋｇ／食事の投薬量で認められ、これらの結果を達成するためのレベルを超える用量に増加させる必要はないようであった。これらのデータは、より大きく無作為化した第２相試験を支持した。

（１．第１相研究デザイン）
嚢胞性線維症を有する膵機能不全被験体における５つの用量レベルのＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの急性安定性および耐用性を決定することを主な目的として、非盲検の多施設用量分類研究を行った。第２の目的は、経口脂肪および窒素吸収、胃腸の症状、ならびに糞便の回数および重量に対するＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの効果を決定することであった。ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭは、リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼの比率が固定されていた。投与コホートは、表８に示すように、リパーゼ用量／ｋｇ／食事に基づいていた。

（表８−投与コホート）

比率が固定された以下の酵素を有するカプセルとして提供される：リパーゼ２０，０００ＵＳＰ単位＋プロテアーゼ２０，０００ＵＳＰ単位＋アミラーゼ３，０００ＵＳＰ単位／カプセル。

１１箇所のＣＦ財団承認施設のうちの１つに属する嚢胞性線維症を有する被験体を、本研究に採用した。全被験体は、現地の治験審査委員会によって承認されている同意書に署名し、小児科の患者の場合も同意を得た。被験体が、１３歳以上４５歳以下である場合、標準的基準に基づいて嚢胞性線維症と診断された場合（Ｂ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ａ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ”，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１３２，ｐｐ．５８９−５９５（１９９８））、ＳｃｈｅＢｏモノクローナルＥＬＩＳＡアッセイ（ＢｉｏＴｅｃｈ ＵＳＡ）を使用した外来患者で測定された１００ｍｇ／ｇｍ未満である糞便エラスターゼに基づいて膵機能不全である場合、入院患者スクリーニングで測定された８０％以下の脂肪吸収係数を有する場合、３０％以上の推定１秒率（ＦＥＶ_１）を有する場合、１０パーセンタイルを超える体系指数を有する場合、急性上気道または下気道感染の証拠がなく、臨床的に安定している場合、被験体が含まれた。被験体が、妊娠または授乳している場合、前６カ月以内に緊急治療室または病院で介入を必要とする遠位小腸閉塞症候群の発作（ｅｐｉｓｏｄｅ）を起こした場合、前の週に胃のｐＨを変化させる薬物（例えば、ヒスタミン−２受容体アンタゴニスト、プロトンポンプインヒビター、または制酸薬）を服用しており、研究中にこれらの薬物を中断することができない場合、線維性大腸症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、または以下の基準によって定義される肝疾患の病歴を有する場合（正常値の２倍のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、またはアルカリホスファターゼ、静脈瘤出血の病歴、肝生検による肝硬変または有意な肝臓疾患の証拠、肝臓移植、被験体が前年にウルソデオキシコール酸を投与されたこと）に被験体を排除した。研究プロトコールの入院患者部分で経腸チューブ栄養を中断することができない被験体、既知の食品添加物に対する過敏症を有する被験体、または前月現在で承認されていない薬物、生物製剤、もしくはデバイスについて任意の他の調査研究に関与した被験体も排除した。

最初のスクリーニング外来で被験体が基準を満たした場合、被験体を臨床研究センターに収容した。被験体の処方された酵素療法を中断し、指標染色マーカー（ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ番号２、５００ｍｇ）を経口投与し、被験体に、体重１ｋｇあたり１００ｇの脂肪および最少で２ｇのタンパク質からなる特別食を３回の食事および２回の軽食に分割して与えた。実際の脂肪およびタンパク質取り込みを、食物消費量に基づいて記録した。特別食から７２時間後、食事を中断し、第２の指標マーカーを与えた。この時点で、患者の通常の酵素療法を再開した。便中脂肪および窒素評価のための糞便回収を、青色マーカーが認められた第１の排便後に開始し、第２のマーカーが通過した時に完了した（それにより、回収物中に糞便が含まれる）。ＣＦＡを計算し、これが８０％以下である場合、被験体は、本研究の処置期に適格であった。

被験体を再度臨床研究センターに収容し、日常的な膵酵素補充を中断した。染色マーカーおよび特別食を与え、被験体に、その後の７２時間に３回の各食事および２回の各軽食と共に研究薬物を摂取させた。コホートあたりの用量は前に記載している。被験体に、各食事前に研究薬物を摂取するように指示した。７２時間後、特別食を中断し、第２の指標マーカーを投与した。この時点で、患者の通常の酵素療法を再開した。糞便回収手順は、上記と同一であった。退院から３日以内に臨床研究センターから追跡のための電話連絡を行い、退院から３〜７日後に追跡のための訪問を行った。

安全性モニタリングは、外来患者の外来、入院患者のケア、および定期的な電話連絡の際の研究被験体の無制限の質問によって判断された有害事象の発生率、異常な臨床試験の頻度（日常的な血液学的試験、血液生化学検査、および凝集プロフィール、尿検査、尿中尿酸排泄、ならびに便中ヘムおよび白血球アッセイが含まれる）を含んでいた。ＧＩ用に修正した嚢胞性線維症質問表（ＣＦＱ）によって測定された胃腸管症状の頻度もモニタリングした（Ａ．Ｑｕｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＣＦＱ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ，ａ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｍｅａｓｕｒｅ”，Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０．（２０００））。

ＣＦ財団の治療開発ネットワークのデータ安全モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）がこの試験を監督した。ＤＳＭＢが試験を通して増量のコホートの安全性データをモニタリングし、正式な安全性の評価を行った後に、被験体を５，０００リパーゼ単位／ｋｇ／食事コホートに参加させることができた。なぜなら、上記用量が現在の投与推奨量を超えるからである。ＤＳＭＢはまた、被験体の安全性に懸念がある場合はいつでも試験を停止させた。

（２．第１相組成物）
ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの３つの酵素成分（リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼ）を、個別に製造した。リパーゼを、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ（以前は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａとして公知であった）からの発酵によって誘導し、これを処理してリパーゼ結晶を形成させ、その後に架橋し、腸溶コーティングを行うことなく酸およびプロテアーゼに対して安定な酵素形成を得た（ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭリパーゼと呼ぶ）。各バッチを、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａとの微生物汚染について明確に培養し、臨床用途のために発売される前にＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａについて陰性でなければならなかった。プロテアーゼ成分は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓに由来し、アミラーゼ成分は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの発酵に由来した。同様に、これらの生成物に対して複数の精製工程を行い、その後、これらを、全カビおよび酵母について培養した。

３つの酵素成分を含むＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭを、粉末含有カプセルとして処方した。前臨床有効性研究により、膵機能不全イヌモデルにおいてリパーゼおよびプロテアーゼが、５００リパーゼ単位／ｋｇ／食事以上および１０００プロテアーゼ単位／ｋｇ／食事以上の用量で有効であることが証明された。ＵＳＰおよびＦＣＣ（食品添加物公定書（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘ））法（薬物試験のために使用したＵＳＰ法と等価）を使用して、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭ中のアスペルギルス由来のアミラーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を行った。真菌アミラーゼは、ブタ由来アミラーゼと異なるｐＨプロフィールを有する。真菌アミラーゼは、ｐＨ４．８でブタアミラーゼよりも２０倍活性である。したがって、標準的なパンクレリパーゼカプセル中のリパーゼに比例すると考えられる用量の１／２０のアミラーゼを、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭのために選択した。

（３．第１相研究のデータ分析）
脂肪吸収係数を、以下のように計算した。
（消費脂肪（ｇ）−排泄脂肪（ｇ））×１００／消費脂肪（ｇ）
窒素のｇ数を使用した同一の式を使用して、窒素吸収係数（ＣＮＡ）を計算した。

本発明者らは、人口統計学的特徴および予想される特徴（年齢、性別、人種、遺伝子型、肺機能、ならびにコホートおよび全体への投与によるスポット（ｓｐｏｔ）糞便エラスターゼが含まれる）をまとめることを計画した。この第１相研究のサンプルサイズは、２０人の被験体と見積もり、投与コホートあたり４人の被験体と見積もった。本研究は、正式な統計的試験にできなかった。本発明者らは、標準的な分類体系を使用して有害事象を分類することを計画した。研究期間、測定点、および投与コホートによる異常な実験値の頻度を表にした。

（４．第１相研究の結果）
１１の嚢胞性線維症センターで２３人の被験体（男性１４人）が参加した。被験体の平均年齢は、２３．５±（７．８）（ＳＤ）（範囲＝１５．２〜４４．５歳）であった（表９）。被験体を同時に採用したいくつかのセンターの結果として、コホート１、３、および５でさらに１人の被験体をそれぞれ参加させた。

（表９−研究の人口統計）

（５．安全性）
ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭは、全用量レベルで十分に許容された。重篤な有害事象または死亡は報告されておらず、研究を取りやめた患者は存在しなかった。酵素なし療法の予備処置期間中、最も一般的に影響を受けた身体の系は、胃腸管であり、１４人の被験体が全部で２３の前処置有害事象を報告した。最も一般的な前処置胃腸管有害事象は、腹部不快感（４被験体が５事象を報告した）、上腹部痛（４被験体が４事象を報告した）、および鼓腸（４被験体が４事象を報告した）であった。２番目に最も影響を受けた身体の系は、呼吸器系であり、５被験体が８つの処置前有害事象を報告した。最も一般的な前処置呼吸器有害事象は、咳（４被験体が４事象を報告した）であった。

２日目後に始まった処置緊急有害事象は、２３人中１８人（７８．３％）の被験体で起こった。処置緊急有害事象の発生率は、コホートの間で統計的有意差は認められなかった（ｐ＝０．６１９６）。１１人（４７．８％）の被験体に関連有害事象（調査員によって研究薬物におそらくまたは場合によっては関連すると分類される事象と定義する）が認められた。

６人の被験体は、研究中にアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の増加を経験した。４人被験体の酵素レベルが上昇し、この上昇は、研究薬物処置後に始まった。１人の被験体（コホート１）は、研究終了時の外来で高いＡＬＴレベルを示し、１人の被験体（コホート５）は、追跡外来における追跡評価でＡＳＴの上昇が認められた。

（６．有効性）
表１０ならびに図６および７にまとめるように、コホート１〜４の予備臨床活性データは、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭでの処置によって全ての膵酵素補充のない期間と比較した場合にＣＦＡおよびＣＮＡが増加したことを証明している。コホート１〜４の全被験体について、ＣＦＡの平均増加は２０．６±２３．５％であり、平均ＣＮＡは１９．７±１２．２％増加した。これらのコホートについて、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭでの処置後に糞便重量も減少し、平均減少は４２５±４２２ｇであった。ＣＦＡおよびＣＮＡは、、最も低いＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭ用量レベルで酵素なしレベルより最も少なく増加した（コホート５：１００ＵＳＰ単位リパーゼ／ｋｇ／食事、１００ＵＳＰ単位プロテアーゼ／ｋｇ／食事、および１５ＵＳＰ単位アミラーゼ／ｋｇ／食事）。

（表１０−ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭの臨床活性：スクリーニング期間から処置期間までの変化）

ＳＤ＝標準偏差
^１脂肪吸収係数＝１００＊（消費脂肪（ｇ）−得られた脂肪（ｇ））／（消費脂肪（ｇ））
^２窒素吸収係数＝１００＊（消費窒素（ｇ）−得られた窒素（ｇ））／（消費窒素（ｇ））。

（第１相研究の結果）
ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭは安全なようであり、この３日間の曝露研究において十分に許容された。処置緊急有害事象は、用量とは無関係であった。被験体が通常のケアを受けているか、酵素なしであるか、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭを投与されているかにかかわらず、本研究中の胃腸管の病訴が頻繁であったが、被験体が通常のケアを受けている場合、外来期間中に頻度が最も低かった。研究における入院患者に、定期的に被験体にＧＩ病訴について質問したが、非盲検で研究したので、先入観があった。便中の肝臓酵素の上昇およびヘムおよび白血球の両方の存在は、被験体にＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭを投与した場合と酵素なしまたは通常のケアを行った場合とで同程度に一般的であった。

ベースラインと比較してＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭによって脂肪および窒素の吸収が改善され、ＴｈｅｒａＣＬＥＣ^ＴＭのリパーゼおよびプロテアーゼ成分の有効性が証明された。５００リパーゼ単位／ｋｇ／食事を超える用量で用量−応答曲線は認められないようであった。用量の増加と共に糞便重量が減少する傾向があったが、範囲は広かった。本研究におけるＣＦＡ値は、既刊文献中の値よりも低いようである。選択の偏り、食事、完全な回収、および酵素のタイミングによって説明可能である。

糞便エラスターゼのスクリーニングによって判断したところ、本研究中の全被験体は重症膵機能不全を罹患しており、これは、酵素なしのＣＦＡによって裏付けられた。他の研究は、膵酵素が十分な（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）患者が含まれており、これにより、平均ＣＦＡが高くシフトするであろう（Ｒ．Ｃ．Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅｌｉｐａｓｅ ａｎｄ Ｐｌａｃｅｂｏ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｅａｔｏｒｒｈｅａ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｘｏｃｒｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ”，Ａｍ Ｊ．Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，ｐｐ．１９３２−１９３８（２０００）；Ｍ．Ｐ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ ａｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ Ｐａｎｃｒｅａｌｉｐａｓｅ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｆａｔ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ”，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｅｎｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．，３５，ｐｐ．７９−８３（２００２））。

本研究では、被験体に少なくとも１日あたり１００ｇの脂肪を与えた。患者の日常的食事に基づいて実施された文献に報告されたＣＦＡは、より低い脂肪摂取に基づいている可能性が高く、このことは、多数の外来患者が１日あたり１００ｇ未満の脂肪を摂取しているからである（Ｐ．Ｄｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｂｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ”，Ｊ．Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．，９１，ｓｕｐｐｌ．３４，ｐｐ．２−３（１９９８）；Ｄ．Ａ．Ｋａｗｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｉｎｔａｋｅ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ”，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１２９，ｐｐ．１１９−１２９（１９９６））。脂肪負荷が低いほど、嚢胞性線維症患者で認められる残存代償性（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）舌リパーゼによってより容易に処理することができる（Ｂ．Ｆｒｅｄｒｉｋｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｉｎｇｕａｌ Ｌｉｐａｓｅ：ａｎ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｌｉｐａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ？”，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，１４，ｐｐ．１３８７−１３９０（１９８０））。

青色食用色素を使用して、糞便回収物に印を付けた。ついでながら言うと、臨床研究センターの看護師は、カーマインレッドまたはチャコールのマーカーは糞便中の識別が困難であり得ると報告している。５００ｍｇの用量のＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ番号２の経口投与は、糞便中を通過した場合に容易に目視することができ、糞便回収の開始および終了の境界が明確に定められる。糞便回収の短縮により、総糞便回収物中の脂肪がより少なくなり、ＣＦＡが不当に高くなる。以前の研究は、回収の開始および終了の識別が困難であったので、ＣＦＡが不当に高くなった可能性がある。糞便の回収は不快であるので、できるだけ速く回収を終了しようとする傾向がある。

上記発明は本発明を明確にし、理解を深める目的で図面および実施例によっていくらか詳細に記載しているが、本発明の教示に照らして、本明細書中の開示（添付の特許請求の範囲が含まれる）の精神または範囲から逸脱することなく、一定の変更および修正を行うことができることが当業者に容易に理解される。

図１は、第２相試験で本発明の組成物を使用して処置した患者における、ベースラインと比較した平均脂肪吸収係数（「ＣＦＡ」）の変化を示す。 図２は、第２相試験で本発明の種々の組成物を使用して処置した患者における、ベースラインと比較した平均窒素吸収係数（「ＣＮＡ」）の変化を示す。 図３は、第２相試験で本発明の組成物を使用して処置した患者における、ベースラインでの脂肪吸収係数（「ＣＦＡ」）と窒素吸収係数（「ＣＮＡ」）との間の相関関係を示す。 図４は、第２相試験で本発明の組成物を使用して処置した患者における、治療レベルでの脂肪吸収係数（「ＣＦＡ」）と窒素吸収係数（「ＣＮＡ」）との間の相関関係を示す。 図５は、第２相試験で本発明の組成物を使用して処置した患者における、治療レベルおよびベースラインレベルでの脂肪吸収係数（「ＣＦＡ」）と窒素吸収係数（「ＣＮＡ」）との間の相関関係の相違を示す。 図６は、第１相試験で本発明にしたがって種々の用量で処置した嚢胞性線維症患者における、ベースラインと比較した平均脂肪吸収係数（「ＣＦＡ」）の変化を示す。 図７は、第１相試験で本発明にしたがって種々の用量で処置した患者における、ベースラインと比較した平均窒素吸収係数（「ＣＮＡ」）の変化を示す。

Claims (8)

1. リパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼを含む、嚢胞性線維症に起因する膵外分泌機能障害の治療のための組成物であって、前記組成物中のリパーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼのＵＳＰ単位での比が、１：１：０．１５である、組成物。
2. 前記リパーゼが、架橋シュードモナスリパーゼ結晶および架橋バークホルデリアリパーゼ結晶からなる群から選択され、前記結晶がビス（スルホスクシンイミジル）スベレートで架橋されている、請求項１に記載の組成物。
3. 前記リパーゼが、架橋シュードモナスリパーゼ結晶および架橋バークホルデリアリパーゼ結晶からなる群から選択される架橋リパーゼ結晶の形態であり、前記プロテアーゼが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓプロテアーゼ結晶の形態であり、前記アミラーゼが無定形Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアミラーゼの形態である、請求項２に記載の組成物。
4. 治療有効量の請求項３に記載の組成物を含む、嚢胞性線維症に起因する膵外分泌機能障害に罹患している患者における脂肪吸収係数および窒素吸収係数を増加させるための組成物。
5. 治療有効量の請求項３に記載の組成物を含む、嚢胞性線維症に起因する膵外分泌機能障害に罹患している患者の炭水化物吸収を増加させるための組成物。
6. 前記治療有効量の組成物は、前記哺乳動物に、２５，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、２５，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および３，７５０ＵＳＰ単位のアミラーゼを提供する、請求項４または請求項５に記載の組成物。
7. 前記治療有効量の組成物は、前記哺乳動物に、１００，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、１００，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および１５，０００ＵＳＰ単位のアミラーゼを提供する、請求項４または請求項５に記載の組成物。
8. 前記治療有効量の組成物は、前記哺乳動物に、２５，０００〜１００，０００ＵＳＰ単位のリパーゼ、２５，０００〜１００，０００ＵＳＰ単位のプロテアーゼ、および３，７５０〜１５，０００ＵＳＰ単位のアミラーゼを提供する、請求項４または請求項５に記載の組成物。

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