JP2004524838A - 微生物酵素の新規混合物 - Google Patents
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Abstract
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼおよび付加的にアスペルギルス−メレウスのプロテアーゼならびにアスペルギルス−オリゼのアミラーゼを含有する新規の微生物酵素の混合物を記載する。さらに、微生物酵素を含有するこの混合物の医薬調製物を記載する。新規の医薬調製物は特に、哺乳動物およびヒトにおける消化不良、特に膵機能不全に起因する消化不良の治療および/または予防のために好適である。
Description
【0001】
本発明は微生物リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼの特定の組合せを含む新規の酵素混合物に関する。本発明はさらにこれらの微生物酵素の混合物を含有する医薬調製物に関する。この新規の医薬調製物は特に、哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するため、特に慢性膵外分泌機能不全に起因する消化不良治療および/または予防するために好適である。
【0002】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良は多くの場合、消化酵素の不足、特に内因性リパーゼの不足に起因するが、しかしまたプロテアーゼおよび/またはアミラーゼの不足も原因となる。このような消化酵素の不足の原因はしばしば、大部分の、および最も重要な内因性消化酵素を産生する器官である膵臓の機能低下(=膵機能不全)にある。病的な膵機能不全が存在している場合、これは先天的であるか、もしくは後天的でありうる。後天的な慢性膵機能不全はたとえばアルコール中毒が原因である可能性もある。先天的な膵機能不全はたとえば膵線維症に起因する可能性もある。消化酵素の不足は結果として重症の栄養不良もしくは栄養不足につながり、これは高い二次疾患の傾向を伴いうる。
【0003】
内因性消化酵素の不足の治療法として同じような働きのある外因性消化酵素もしくは消化酵素混合物による補充が有利であることが証明された。この目的のために今日では、ブタパンクレアチン(=パンクレアチン)を含有する医薬調製物(=処方)が最も頻繁に使用される。ブタの膵臓腺から得られる消化酵素混合物はその中に含有されている酵素および随伴物質(Begleitstoffe)と、ヒトの膵臓分泌物中に含有されている含有物質との大きな類似性に基づいてほぼ理想的な方法でヒトにおける酵素補充療法のために使用することができる。パンクレアチンの成分のいくつか、たとえば膵臓リパーゼおよび膵臓アミラーゼは、pH5を下回る酸性のpH値に対して敏感であるので、経口投与を想定したパンクレアチン調製物は胃の中で酸により誘発される変性に対する保護のために胃液耐性の保護層で被覆しなくてはならない。このような保護層は酸に敏感なパンクレアチン成分を不可逆的な分解から保護し、かつ胃を通過した後で初めて、比較的高い、無害なpH値、たとえばpH5.5〜pH8が支配的である上部の小腸領域でその内容物を放出する。上部の小腸領域、たとえば十二指腸は同時に、通常酵素により分解した栄養成分の主要量が身体に吸収される場所である。
【0004】
パンクレアチンは天然産物であるので、品質的に均一で高価な形で提供するためには極めて高い技術コストが必要である。さらにパンクレアチンへの加工のために適切な原料の供給は変動がある。
【0005】
従ってすでに、身体固有(koerpereigenen)の消化酵素を補充するために、パンクレアチンと比較して改善された特性を有する、パンクレアチンと同様に好適な消化酵素混合物を提供する種々の試みがなされている。
【0006】
ヒトにおける消化酵素の補充のために適切であるためには、全ての補充酵素が一連の要求を満足しなくてはならない(たとえばB. G. Peschke, ”Active Components and Galenic Aspects of Enzyme Preparations”、Pancreatic Enzymes in Health and Disease、P. G. Lankisch編、Springer Verlag Berlin, Heidelberg、1991年、第55〜64頁を参照のこと;以下では「Peschke」として引用する)。これらの補充酵素は特にペプシンならびにその他の身体固有のプロテアーゼ、たとえば膵臓プロテアーゼに対して安定化されているべきである。身体固有の胆汁酸塩の存在下でも補充酵素はその活性を維持すべきである。
【0007】
通常は病気によって条件付けられて産生が低下した身体固有のリパーゼの補充は、ヒトにおける消化酵素のための補充療法の重要な構成要素である。しかし以前から、産生の低下したプロテアーゼとアミラーゼとを同時に補充することは該当する患者に付加的な有利な影響を与えることが公知である(たとえばPeschke、第55頁;WO96/38170号、第6頁)。従って哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するための医薬調製物は脂肪分解活性以外に、蛋白分解およびデンプン分解活性もまた十分に代用すべきである。この場合に重要なことは、医薬調製物中に含まれている種々の補充酵素(リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ)がこのために想定された作用部位(これは通常、上部小腸領域である)でその活性をそのつど十分な高さで発揮することができることである。生理学的条件下ではヒトの胃の中で栄養摂取の際もしくはその直後に特に多くの場合、空の胃内(約pH1〜2)よりも高いpH値、たとえばpH4〜5が存在し、かつ上部の小腸領域での生理学的なpH値は通常、5.5〜8であるので、ヒトの場合、この約4〜8のpH範囲で良好なpH安定性および良好なpH活性を有する消化酵素が消化酵素の補充のために好適であると考えられる。
【0008】
欧州特許出願EP−A0387945号からすでに、哺乳動物の膵臓抽出物以外にさらに微生物リパーゼを含有する調製物が公知である。しかしその中になお含有されている動物性パンクレアチンの割合に基づいてこのような調製物は、簡単に標準化すべき実験室法によって常に同じ品質および任意の量で製造することはできない。
【0009】
国際特許出願WO96/38170号には、特にアスペルギルス−ニガーからの酸安定性のアミラーゼおよび場合によりリゾープス−ジュバニクスからの酸安定性のリパーゼを含有しており、かつ消化助剤として使用することができる調製物が記載されている。しかし身体固有の蛋白分解活性の補充に関してこの文献中では具体的な提案はされていない。その代わりに単に、リパーゼおよびアミラーゼ以外のヒトの膵臓分泌物のその他の全ての成分をブタパンクレアチンにより交換する可能性が存在することが示唆されているのみである。このことはWO96/38170号中に記載されている調製物が、身体固有の消化酵素の完全な補充のためのものではないか、または適切ではないことを示唆している。
【0010】
さらにS. Schelerの論文:”Multiple unit−Zubereitung aus Aspergillus oryzae−Enzymen hoher Aktivitaet mit optimierter digestiver Potenz”、Erlangen−Nuerunberg大学(1995年)では、ほぼ製剤的な観点で、市販されている酵素であるリゾープス−オリゼのリパーゼ、アスペルギルス−オリゼのプロテアーゼおよびアスペルギルス−オリゼのアミラーゼの組合せが試験されている。しかしたとえばここで使用されているリパーゼは身体固有の膵臓プロテアーゼに対して十分な安定性を有していない。
【0011】
前記の課題から、哺乳動物およびヒトの、身体固有の消化酵素を完全に補充するために想定されている医薬調製物は、身体固有の条件に慎重に適合させた補充酵素もしくは補充酵素の混合物を含有していなくてはならないことが明らかになる。
【0012】
従って本発明の課題は、哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するために、身体固有の脂肪分解、蛋白質分解およびデンプン分解酵素活性を補充することができ、かつその中に含有されている補充酵素の高い比活性において比較的わずかな投与量が可能である、消化酵素の改善された混合物ならびにこのような混合物を含有する医薬調製物を提供することである。同時に消化酵素混合物中に含有されている補充酵素(リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ)は、単独でも、相互の混合物としても、ヒトにおける治療のために想定された消化酵素に対して課される全ての要求をできる限り良好に満足すべきである。たとえば補充酵素は、そのつどの生理学的な作用部位で通常支配的なpH範囲で、良好なpH安定性および良好なpH活性を有しているべきである。さらに補充酵素は身体固有の作用物質、たとえば胆汁塩または身体固有のプロテアーゼ、たとえばペプシンもしくは膵臓プロテアーゼと良好に相容性であるべきである。その他の課題は本発明による目的のために、プロセス経過および生成物量に関して簡単に標準化することができる製造法により常に一定の品質および任意の量で得ることができる補充酵素を選択することである。
【0013】
前記課題は
a)リゾープス−デレマの濃縮リパーゼ、
b)アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼおよび
c)アスペルギルス−オリゼのアミラーゼ
を含有する新規の微生物酵素の混合物を提供することにより解決される。本発明による微生物酵素の混合物は通例の助剤および/または担体材料と共に通常の医薬調製物中に含有されていてもよい。これらの医薬調製物は作用物質としてもっぱら特定の糸状菌の本発明による微生物酵素の混合物を含有しており、かつ哺乳動物およびヒトの身体固有の消化酵素の完全補充のために適切である。本発明による微生物酵素の混合物中に含有されている個々の酵素(リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ)に共通していることは、消化官の生理学的ないし病態生理学的pH範囲(約pH4〜8)および特に栄養摂取の際もしくはその直後に支配的な条件下で良好なpH安定性および良好なpH活性を有していることである。該医薬調製物はさらに、良好な効果および良好な相容性により優れている。
【0014】
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼは、少なくとも1800000FIP−U/g(=ベルギーの国際薬学連盟(Federation International Pharmaceutic)の規定により決定された、国際的に標準化された酵素活性単位)の比活性を有している。菌株リゾープス−デレマは菌株リゾープス−オリゼの亜種であると見なされている。菌株リゾープス−デレマの糸状菌のリパーゼは自体公知であり、かつたとえば相応する菌の培養ブロスから自体公知の方法により得ることができる。糸状菌を発酵させるため、およびこれらの糸状菌から形成された酵素産物を単離するための方法は、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから(たとえばH. Diekmann, H. Metz, ”Grundlage und Praxis der Biotechnologie”、Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991を参照のこと)、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き、単離したリパーゼからたとえば自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。有利にはリパーゼ(EC番号3.1.1.3)は、日本の天野エンザイム株式会社(Amano Pharmaceuticals)のリゾープス−デレマの”Lipase D Amano 2000 (R)(Lipase D2 (R)とも呼ばれる)を使用することができる。これらのリパーゼは、天然の膵臓リパーゼと同様に、脂肪酸グリセリドに対して1,3−位特異性を有する。比活性はバッチに依存して約1800000FIP−U/gから約2250000FIP−U/gの間である。”Lipase D Amano 2000 (R)”は、パンクレアチンからの膵臓プロテアーゼに対する高い安定性により優れている。たとえば実験室試験において”Lipase D Amano 2000 (R)”の脂肪分解活性はpH6〜8のpH範囲でパンクレアチンからの膵臓プロテアーゼを2時間作用させた後で、なお初期活性の55%である。”Lipase D Amano 2000 (R)”のpH安定性は、37℃、120分以上の時間でpH4〜8のpH範囲での実験室試験において初期活性の少なくとも70%である。
【0015】
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼにとって特徴的なパラメータとしてたとえばそのpHプロファイルが適切である。従って”Lipase D Amano 2000 (R)”のpHプロファイルは比活性としてpH値に依存して決定した。この場合、個々のpH値での比活性は微生物リパーゼの活性を決定するためのFIP法の変更により測定された。さらにpHプロファイルは胆汁酸塩の可変的な濃度の存在下でも決定された。
【0016】
a)オリーブ油エマルションの製造
アラビアゴム 44g、
オリーブ油 115gおよび
水 400ml
を電動ミキサー中で15分間均質化する。
【0017】
b)異なった濃度の胆汁−ディスパート (Dispert) 溶液の製造
胆汁不含: 水120ml、
胆汁 0.5ミリモル/l: 水120ml+ディスパート溶液(FIP標準)200mg、
胆汁 5ミリモル/l: 水120ml+ディスパート溶液2g、
胆汁10ミリモル/l: 水120ml+ディスパート溶液4g。
【0018】
c)基質エマルションの製造
オリーブ油エマルション(vide supra) 480ml
塩化カルシウム溶液(CaCl2×2H2O 28.3g/l水)160mlおよび
所望の濃度の胆汁ディスパート溶液(vide supra) 120ml
を混合した。
【0019】
d)酵素溶液の製造
”Lipase D Amano 2000 (R)”(2230000FIP−U/gの比活性を測定)50mgを1%濃度の塩化ナトリウム溶液100ml中に溶解した。このストック溶液(Stammloesung)から1mlを採取し、かつ純水を用いて200mlに希釈した。そのつど、希釈したストック溶液の1ml(5575FIP−Uに相応)を次の測定の際に使用する。
【0020】
特定の胆汁酸塩濃度がその中に存在する前記の基質エマルションからそのつど19mlの試料を37℃にサーモスタット処理する。次いで基質エマルションの種々の試料を0.1MのNaOHもしくは1MのHClの添加により3、4、5、6、7および8のpH値に調整する。こうして準備した基質エマルションの試料に、引き続きそのつど1mlの前記の酵素溶液を添加する(注釈:最適な滴定速度を決定するために、酵素溶液中に理想的に含有されているリパーゼの適量は基本的に自体公知の方法により希釈列により確認することができる)。添加を行った後、0.1MのNaOHを用いてpH−スタット−滴定を10分間実施する。その後、遊離した脂肪酸を完全に解離するために、30秒以内にpH9まで終点滴定を実施する。合計して必要とされる0.1MのNaOHの消費量をリパーゼの活性単位Uに換算する:この場合、リパーゼの活性単位Uは毎分1μモルの消費量に相応する。確認されたリパーゼの活性単位はそのつど使用される乾燥酵素のgで表される量に関連させることによりU/mgの単位に換算することができる。pHプロファイルを調整するためにU/mgの単位はそれぞれの異なったpH値およびそれぞれの試験した胆汁酸塩濃度に関して第1表にまとめてあり、かつ表の値を第1図ではグラフにプロットする。
【0021】
前記のpHプロファイルから”Lipase D Amano 2000 (R)”に関して、0.5ミリモル/lのFIP−標準胆汁塩濃度でのリパーゼ活性の最大値として至適pHはpH約7に決定することができる。
【0022】
アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼは少なくとも7500FIP−U/gの比活性を有する。その至適pHはpH6〜pH8である。菌株アスペルギルス−メレウスの糸状菌の中性プロテアーゼは自体公知であり、かつたとえば自体公知の方法により相応する菌類の培養ブロスから得ることができる。糸状菌の発酵法およびこれらの糸状菌から形成される酵素産物の単離法は、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから(たとえばH. Diekmann, H. Metz, ”Grundlagen und Praxis der Biotechnologie”、Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991を参照のこと)、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き、単離したプロテアーゼから所望の場合には自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。
【0023】
有利には中性プロテアーゼは、日本の天野エンザイム社のアスペルギルス−メレウスからの”Prozyme (R)”(場合により”アルカリ性蛋白分解酵素”とも呼ばれる。EC番号3.4.21.63)を使用することができる。この微生物プロテアーゼは多糖類の少なくとも3つの1,4−α−D−グルコース単位を有する1,4−α−D−グルコシド結合を加水分解し、比活性約7800FIP−U/gを有する。このプロテアーゼのpH安定性はph5〜8のpH範囲および37℃で実験室試験において120分以上で初期活性の少なくとも60%である。
【0024】
アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼに関する特徴的なパラメータとしてたとえばそのpHプロファイルが適切である。従ってプロテアーゼ”Prozyme 6 (R)”のpHプロファイルは比活性としてpH値に依存して測定された。
【0025】
このために、膵臓プロテアーゼの活性を測定するためのFIP法の規定に相応して種々の基質溶液を製造した。FIP規定の変更において基質溶液として4%濃度のヘモグロビン溶液をカゼインの代わりに使用する。さらにFIP規定の変更において種々の基質溶液中で相応する量の1MのNaOHもしくは1MのHClを添加することにより、そのつど2、3、4、5、6、7および8の種々のpH値を調整する。基質溶液に”Prozyme 6 (R)”の試料を添加する。
【0026】
引き続き異なったpH値の基質溶液中で”Prozyme 6 (R)”試料のプロテアーゼ活性を前記のFIPの規定に従って決定する。個々の試料中で検出される酵素活性をこの測定列中で検出される最大値(=100%)へと標準化する。”Prozyme 6 (R)”に関して検出されるpHプロファイルのための測定値は第2表に記載されており、かつ第2図でグラフにプロットされている。したがって”Prozyme 6 (R)”は生理学的なpH範囲で最適に作用する。
【0027】
前記のpHプロファイルから”Prozyme 6 (R)”に関してプロテアーゼ活性の最大値として至適pHはpH約8に決定することができる。
【0028】
本発明により使用されるアスペルギルス−オリゼのアミラーゼ(EC番号3.21.1.1)はα−アミラーゼであり、かつ少なくとも40000FIP−U/g(pH5.8で測定)の比活性を有する。至適pHはpH4〜6.5のpH範囲である。菌株アスペルギルス−オリゼの糸状菌のアミラーゼは自体公知であり、かつたとえば自体公知の方法により相応する菌の培養ブロスから得られる。糸状菌の発酵のため、およびこの糸状菌から形成される酵素生成物の単離の方法は、、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから(たとえばH. Diekmann, H. Metz, ”Grundlagen und Praxis der Biotechnologie”、Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991を参照のこと)、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き単離したアミラーゼから所望の場合には自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。有利にはアミラーゼは天野エンザイム社(日本)のアスペルギルス−メレウスの”Amylase A1 (R)”およびExtrakt−Chemie社(ドイツ)の”Amylase EC (R)”を使用することができる。”Amylase A1 (R)”が有利である。
【0029】
微生物アミラーゼである”Amylase A1 (R)”は約52000FIP−U/g(pH5.8で測定)の比活性を有する。”Amylase A1 (R)”のpH安定性はpH5〜8のpH範囲で37℃、120分以上での実験室試験で初期活性(Anfangsaktivitaet)の少なくとも85%である。さらなる実験室試験でパンクレアチンからの膵臓プロテアーゼ(pH6〜8のpH範囲で測定)、”Prozyme 6 (R)”(pH4〜8のpH範囲で測定)ならびにペプシンと比較して、”Amylase A1 (R)”の良好な安定性が確認された。
【0030】
アスペルギルス−オリゼのアミラーゼに関する特徴的なパラメータとしてたとえばそのpHプロファイルが適切である。従って”Amylase A1 (R)”のpHプロファイルを比活性としてpH値に依存して測定した。
【0031】
微生物アミラーゼの活性を測定するためのFIP法の規定に相応して種々の基質溶液を製造する。FIP規定の変更において種々の基質溶液中で相応する量の5MのNaOHもしくは5MのHClをFIP法により使用されるアセテート緩衝液に予め添加することにより、そのつど3.25;4;5;6;6.8および7.4の種々のpH値を調整する。基質溶液に”Amylase A1 (R)”の試料を添加する。
【0032】
引き続き異なったpH値の基質溶液中で”Amylase A1 (R)”試料のアミラーゼ活性を前記のFIPの規定に従って決定する。個々の試料中で検出される酵素活性をこの測定列中で検出される最大値(=100%)へと標準化する。”Amylase A1 (R)”に関して検出されるpHプロファイルのための測定は第3表に記載されており、かつ第3図でグラフにプロットされている。
【0033】
前記のpHプロファイルから”Amylase A1 (R)”に関してアミラーゼ活性の最大値としてpH約5までの至適pHを決定することができる。
【0034】
微生物アミラーゼである”Amylase EC (R)”は、約42500FIP−U/g(pH5.8で測定)の比活性を有する。さらになお少量のβ−アミラーゼが検出可能である。至適pH(前記の”Amylase A1 (R)”のために記載した方法により測定)はpH約5である。pH6〜8のpH範囲で37℃、120分以上で実験室試験での”Amylase EC (R)”のpH安定性は初期活性の少なくとも80%である。さらなる実験室試験で、パンクレアチンからの膵臓プロテアーゼ(pH6〜8のpH範囲で測定)、”Prozyme 6 (R)”(pH4〜8のpH範囲で測定)ならびにペプシンと比較して、”Amylase EC (R)”の良好な安定性が確認された。
【0035】
本発明による医薬調製物のために有利には固体の経口投与可能な投与形、たとえば粉末、ペレットまたはマイクロスフェアを選択することができる、これらを所望の場合にはカプセルまたはサッシェに充填するか、または圧縮成形して錠剤にすることができる。液状の医薬調製物、たとえば懸濁剤または液剤もまた場合により考えられる。この場合、個々の酵素リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼは一緒に、または空間的に相互に分離して存在していてもよい。個々の酵素が相互に空間的に分離されて存在していない場合には、乾燥した加工および/または貯蔵が有利である。医薬調製物はさらに通例の助剤および/または担体材料を含有していてもよい。助剤および/または担体材料としてたとえば微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、たとえばPEG4000または低級アルコール、特に直鎖状もしくは分枝鎖状のC1〜C4−アルコール、たとえば2−プロパノールならびに水が考えられる。
【0036】
本発明により使用される微生物補充酵素は広いpH範囲にわたる良好な安定性により優れており、かつ従ってそれ以上の処理(たとえばフィルム被覆)を行わなくても直接、経口投与すべき医薬調製物の製造のために使用することができる。この目的のために個々の補充酵素(リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ)は一緒に、または空間的に相互に分離してペレット化することができる。所望の場合には個々の補充酵素を自体公知の適切な胃液耐性の層によりフィルム被覆することもできる。全ての補充酵素を胃液耐性にフィルム被覆すべきではない場合、補充酵素のそれぞれの種類を相互に別々にペレット化し、かつ1種類の酵素のペレットをそのつど別々にフィルム被覆することが有利である。プロテアーゼおよび/またはリパーゼをそのつど単独でペレット化し、かつ胃液耐性にフィルム被覆することが特に有利でありうる。所望の場合には酵素混合物中に存在する酵素の3種類全てを一緒に胃液耐性にフィルム被覆するか、または1種類の酵素をフィルム被覆せず、2種類の酵素を胃液耐性にフィルム被覆することができる。
【0037】
本発明により使用される補充酵素の高い比活性は、比較的小さいにも関わらず、高い効果をもたらす投与形を可能にする。たとえば1つの実施態様では医薬調製物は、経口投与可能な、サイズ0のカプセルとして存在していてもよい。このような投与形中にリパーゼ約10000〜50000FIP−U、アミラーゼ8000FIP−Uおよびプロテアーゼ200FIP−Uが存在していてもよい。有利には補充酵素リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼは約50〜500FIP−U:40〜120FIP−U:1FIP−Uの比で存在する。
【0038】
本発明による医薬調製物の、哺乳動物およびヒトにおける消化不良の治療および/または予防のための適性を、以下に記載する、脂肪の消化を測定するためのインビトロ試験モデルにより証明することができる。
【0039】
1.ブタ用飼料試験栄養における脂肪の消化の検出
その他の栄養成分も含有するブタ用飼料の試験栄養中での脂肪の分解に対する、本発明により使用可能な微生物酵素の混合物の影響を調査する。この場合、塩化カルシウム溶液の添加は遊離する脂肪酸をカルシウムけん化物として沈澱させることに役立つ。
【0040】
A)ブタ用飼料の試験栄養の製造
以下に記載する成分:
”Altromin 9021 (R)”−完成栄養(Altromin GmbH社、ドイツ、脂肪含有率約2〜3%、実質的に挽き割り小麦からなる) 64.8g
”Sojamin (R)”タンパク質混合物(Lukas Meyer社、ドイツ) 3.85g
アラビアゴム(Merck KGaA社、ドイツ) 24.5g
大豆油(Roth社、ドイツ;主な脂肪成分;平均分子量=932g/モル)
26.7g
を純水265mlと混合し、かつ引き続き家庭用ミキサー中で15分間均質化した。得られるホモジネートに体積が450mlになるまで純水を満たした。
【0041】
B)胆汁−ディスパート溶液の製造
胆汁−ディスパート溶液1.35g(FIP−標準;リパーゼ活性化混合物)を純水50ml中に溶解した。
【0042】
C)酵素溶液の製造
1.リパーゼ溶液
天野エンザイム社(日本)の”Lipase D Amano 2000 (R)”(pH7での比活性は1888137FIP−U/gが測定された)63.1mgを純水10ml中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために250μlを使用した。
【0043】
2.プロテアーゼ溶液
天野エンザイム社(日本)の”Prozyme 6 (R)”(pH7.5での比活性は7812FIP−U/gが測定された)319mgを純水10ml中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために250μlを使用した。
【0044】
3.アミラーゼ溶液
Extrakt−Chemie社(ドイツ)の”Amylase EC (R)”(pH5.8での比活性は13466FIP−U/gが測定された)595mgを純水10ml中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために1000μlを使用した。
【0045】
D)測定溶液の準備
前記のブタ用飼料の試験栄養15.5mlに、前記の胆汁ディスパート溶液2mlならびに前記の3つの酵素溶液C)1.〜C)3.を順次添加し、かつ純水29mlで満たした。
【0046】
E)測定の実施
準備した測定溶液を37℃に温度調節し、かつ終点滴定により1MのNaOHを用いてpH7に調整した。3つの酵素溶液を添加した直後に、20分間のpHスタット滴定を開始し、かつ1MのNaOHの消費を10秒ごとに記録した。滴定の間、4Mの塩化カルシウム溶液1mlを50μlの段階で、最大の反応速度が達成されるように手動で計量供給した。
【0047】
F)結果
ブタ用飼料−試験栄養中に含有されている脂肪(=脂肪酸トリグリセリド)は、20分間の反応時間後に約67%まで加水分解されていた。これは生理学的な加水分解産物2−脂肪酸モノグリセリドに対して100%を越える分解に相応する(100%を越える値は、2−脂肪酸モノグリセリドの1−もしくは3−脂肪酸モノグリセリドへの、およびその後の脂肪分解による分解への自発貯蔵(spontane Umlagerung)に起因する)。
【0048】
本発明により使用可能な酵素を含有する消化酵素混合物の良好な脂肪の消化能はインビトロでもオリーブ油の試験栄養により証明することができる。
【0049】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良、特に膵機能不全に起因する消化不良の治療および/または予防のために本発明による医薬調製物の特に良好な適性は、インビトロの動物モデルに基づいて、たとえば膵機能不全のブタを用いて証明することもできる:
2.インビトロでの膵機能不全によるブタにおける本発明による酵素混合物の効果
9匹のエレガード(Ellegaard)系統のメスのゲッティンゲン成ミニブタ(体重33〜40kg)を用いて試験を実施し、その際、該ミニブタには回盲部シャント(Umleitungskanuele)を使用した。シャントは試験動物のキームスの回収のために使用した。これらの動物の6匹はさらに膵路を結紮した(=試験動物)。残りの3匹の動物は無損傷の膵路を維持しており、かつ試験結果のコントロールに使用した(=対照動物)。試験は合計して異なった3つの投与量の本発明による酵素混合物を用いて実施した。以下の酵素用量を投与した:
投与量に応じて全ての動物に22日間にわたって毎日2回、ミニブタ用の飼育飼料(Altromin (R)、Lukas Meyer社;実質的に二回挽き割りにした小麦)170g、タンパク質コンセントレート(Sojamin 90 (R)、Lukas Meyer社)10g、大豆油(Roth社)70gおよびCr2O3(非吸収性のマーカーとして、roth社)0.625gと、水1lとを混合して含有している脂肪分の多い試験飼料をそのつど250g与えた。試験動物のみの飼料に付加的に本発明による酵素混合物の個々の酵素を相応する量で食餌の少し前に混合した。さらに試験動物の5匹で、その試験飼料が酵素混合物を添加されていない試験列を実施した。この試験列で得られた結果を以下では「ゼロ値」として記載する。そのつど試験期間の20日〜22日目に試験動物から12時間にわたってシャントからキームスを採取し、かつ該キームスの粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの含有率を調査した。食餌試験およびその評価は自体公知の方法で実施した(P. C. Gregory、R. Tabeling、J. Kamphues、”Biology of the Pancreas in Growing Animals”;Developments in Animal and Veterinary Sciences 28(1999)、第381〜394頁、Elsevier、アムステルダム;S. G. PierzynowskiおよびR. Zabielski編)。
【0050】
前記のインビトロ試験において確認された、試験動物における粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの前盲腸の見かけの消化率を以下の表Aにそのつど本来与えられた脂肪、タンパク質もしくはデンプンの絶対量に対するパーセント値で記載する。「前盲腸の消化率」として記載される値は「前盲腸の見かけの消化率」に相応し、これは実際の前盲腸の消化率とは異なって、試験物質の内因性の成分、たとえば内因性タンパク質をなおわずかな量で含有している可能性がある。前盲腸の消化率は試験動物のキームスからマーカー法により以下に記載する式に基づいて決定することができる:
【0051】
【数1】
【0052】
表A:
試験動物の粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの前盲腸消化率のインビボ測定
【0053】
【表1】
【0054】
全ての値は標準偏差を有する平均値として記載されている。
【0055】
記載の試験結果から、本発明による酵素混合物の投与により膵機能不全のブタにおいて脂肪、タンパク質および炭水化物の消化率の著しい改善が達成され、かつこの改善は投与量に依存していることが明らかである。
【0056】
例I:
”Lipase D Amano 2000 (R)”400g、PEG 4000 400gおよび”Vivapur (R)”(=微結晶性セルロース)1200gから、少量の2−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径0.7〜1.4mmのペレットを製造した。
【0057】
”Amylase A1 (R)”7000g、PEG 4000 2000gおよび”Vivapur (R)”(=微結晶性セルロース)1000gから、少量の2−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径0.7〜1.7mmのペレットを製造した。
【0058】
”Prozyme 6 (R)”1750g、PEG 4000 500gおよび”Vivapur (R)”250gから、少量の2−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径0.7〜1.7mmのペレットを製造した。
【0059】
前記で製造したペレットからそのつどリパーゼペレット32mg、アミラーゼペレット325mgおよびプロテアーゼペレット40mgをサイズ0のゼラチンカプセルに充填した。1カプセルあたり、次の活性を有する投与形が得られた:
リパーゼ 約10000FIP−U、
プロテアーゼ 約200FIP−U、
アミラーゼ 約8000FIP−U。
【図面の簡単な説明】
【図1】
Lipase D Amano 2000 (R)のpHプロファイルの表およびグラフを示す。
【図2】
Prozyme 6 (R)のpHプロファイルの表およびグラフを示す。
【図3】
Amylase A1 (R)のpHプロファイルの表およびグラフを示す。
本発明は微生物リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼの特定の組合せを含む新規の酵素混合物に関する。本発明はさらにこれらの微生物酵素の混合物を含有する医薬調製物に関する。この新規の医薬調製物は特に、哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するため、特に慢性膵外分泌機能不全に起因する消化不良治療および/または予防するために好適である。
【0002】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良は多くの場合、消化酵素の不足、特に内因性リパーゼの不足に起因するが、しかしまたプロテアーゼおよび/またはアミラーゼの不足も原因となる。このような消化酵素の不足の原因はしばしば、大部分の、および最も重要な内因性消化酵素を産生する器官である膵臓の機能低下(=膵機能不全)にある。病的な膵機能不全が存在している場合、これは先天的であるか、もしくは後天的でありうる。後天的な慢性膵機能不全はたとえばアルコール中毒が原因である可能性もある。先天的な膵機能不全はたとえば膵線維症に起因する可能性もある。消化酵素の不足は結果として重症の栄養不良もしくは栄養不足につながり、これは高い二次疾患の傾向を伴いうる。
【0003】
内因性消化酵素の不足の治療法として同じような働きのある外因性消化酵素もしくは消化酵素混合物による補充が有利であることが証明された。この目的のために今日では、ブタパンクレアチン(=パンクレアチン)を含有する医薬調製物(=処方)が最も頻繁に使用される。ブタの膵臓腺から得られる消化酵素混合物はその中に含有されている酵素および随伴物質(Begleitstoffe)と、ヒトの膵臓分泌物中に含有されている含有物質との大きな類似性に基づいてほぼ理想的な方法でヒトにおける酵素補充療法のために使用することができる。パンクレアチンの成分のいくつか、たとえば膵臓リパーゼおよび膵臓アミラーゼは、pH5を下回る酸性のpH値に対して敏感であるので、経口投与を想定したパンクレアチン調製物は胃の中で酸により誘発される変性に対する保護のために胃液耐性の保護層で被覆しなくてはならない。このような保護層は酸に敏感なパンクレアチン成分を不可逆的な分解から保護し、かつ胃を通過した後で初めて、比較的高い、無害なpH値、たとえばpH5.5〜pH8が支配的である上部の小腸領域でその内容物を放出する。上部の小腸領域、たとえば十二指腸は同時に、通常酵素により分解した栄養成分の主要量が身体に吸収される場所である。
【0004】
パンクレアチンは天然産物であるので、品質的に均一で高価な形で提供するためには極めて高い技術コストが必要である。さらにパンクレアチンへの加工のために適切な原料の供給は変動がある。
【0005】
従ってすでに、身体固有(koerpereigenen)の消化酵素を補充するために、パンクレアチンと比較して改善された特性を有する、パンクレアチンと同様に好適な消化酵素混合物を提供する種々の試みがなされている。
【0006】
ヒトにおける消化酵素の補充のために適切であるためには、全ての補充酵素が一連の要求を満足しなくてはならない(たとえばB. G. Peschke, ”Active Components and Galenic Aspects of Enzyme Preparations”、Pancreatic Enzymes in Health and Disease、P. G. Lankisch編、Springer Verlag Berlin, Heidelberg、1991年、第55〜64頁を参照のこと;以下では「Peschke」として引用する)。これらの補充酵素は特にペプシンならびにその他の身体固有のプロテアーゼ、たとえば膵臓プロテアーゼに対して安定化されているべきである。身体固有の胆汁酸塩の存在下でも補充酵素はその活性を維持すべきである。
【0007】
通常は病気によって条件付けられて産生が低下した身体固有のリパーゼの補充は、ヒトにおける消化酵素のための補充療法の重要な構成要素である。しかし以前から、産生の低下したプロテアーゼとアミラーゼとを同時に補充することは該当する患者に付加的な有利な影響を与えることが公知である(たとえばPeschke、第55頁;WO96/38170号、第6頁)。従って哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するための医薬調製物は脂肪分解活性以外に、蛋白分解およびデンプン分解活性もまた十分に代用すべきである。この場合に重要なことは、医薬調製物中に含まれている種々の補充酵素(リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ)がこのために想定された作用部位(これは通常、上部小腸領域である)でその活性をそのつど十分な高さで発揮することができることである。生理学的条件下ではヒトの胃の中で栄養摂取の際もしくはその直後に特に多くの場合、空の胃内(約pH1〜2)よりも高いpH値、たとえばpH4〜5が存在し、かつ上部の小腸領域での生理学的なpH値は通常、5.5〜8であるので、ヒトの場合、この約4〜8のpH範囲で良好なpH安定性および良好なpH活性を有する消化酵素が消化酵素の補充のために好適であると考えられる。
【0008】
欧州特許出願EP−A0387945号からすでに、哺乳動物の膵臓抽出物以外にさらに微生物リパーゼを含有する調製物が公知である。しかしその中になお含有されている動物性パンクレアチンの割合に基づいてこのような調製物は、簡単に標準化すべき実験室法によって常に同じ品質および任意の量で製造することはできない。
【0009】
国際特許出願WO96/38170号には、特にアスペルギルス−ニガーからの酸安定性のアミラーゼおよび場合によりリゾープス−ジュバニクスからの酸安定性のリパーゼを含有しており、かつ消化助剤として使用することができる調製物が記載されている。しかし身体固有の蛋白分解活性の補充に関してこの文献中では具体的な提案はされていない。その代わりに単に、リパーゼおよびアミラーゼ以外のヒトの膵臓分泌物のその他の全ての成分をブタパンクレアチンにより交換する可能性が存在することが示唆されているのみである。このことはWO96/38170号中に記載されている調製物が、身体固有の消化酵素の完全な補充のためのものではないか、または適切ではないことを示唆している。
【0010】
さらにS. Schelerの論文:”Multiple unit−Zubereitung aus Aspergillus oryzae−Enzymen hoher Aktivitaet mit optimierter digestiver Potenz”、Erlangen−Nuerunberg大学(1995年)では、ほぼ製剤的な観点で、市販されている酵素であるリゾープス−オリゼのリパーゼ、アスペルギルス−オリゼのプロテアーゼおよびアスペルギルス−オリゼのアミラーゼの組合せが試験されている。しかしたとえばここで使用されているリパーゼは身体固有の膵臓プロテアーゼに対して十分な安定性を有していない。
【0011】
前記の課題から、哺乳動物およびヒトの、身体固有の消化酵素を完全に補充するために想定されている医薬調製物は、身体固有の条件に慎重に適合させた補充酵素もしくは補充酵素の混合物を含有していなくてはならないことが明らかになる。
【0012】
従って本発明の課題は、哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するために、身体固有の脂肪分解、蛋白質分解およびデンプン分解酵素活性を補充することができ、かつその中に含有されている補充酵素の高い比活性において比較的わずかな投与量が可能である、消化酵素の改善された混合物ならびにこのような混合物を含有する医薬調製物を提供することである。同時に消化酵素混合物中に含有されている補充酵素(リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ)は、単独でも、相互の混合物としても、ヒトにおける治療のために想定された消化酵素に対して課される全ての要求をできる限り良好に満足すべきである。たとえば補充酵素は、そのつどの生理学的な作用部位で通常支配的なpH範囲で、良好なpH安定性および良好なpH活性を有しているべきである。さらに補充酵素は身体固有の作用物質、たとえば胆汁塩または身体固有のプロテアーゼ、たとえばペプシンもしくは膵臓プロテアーゼと良好に相容性であるべきである。その他の課題は本発明による目的のために、プロセス経過および生成物量に関して簡単に標準化することができる製造法により常に一定の品質および任意の量で得ることができる補充酵素を選択することである。
【0013】
前記課題は
a)リゾープス−デレマの濃縮リパーゼ、
b)アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼおよび
c)アスペルギルス−オリゼのアミラーゼ
を含有する新規の微生物酵素の混合物を提供することにより解決される。本発明による微生物酵素の混合物は通例の助剤および/または担体材料と共に通常の医薬調製物中に含有されていてもよい。これらの医薬調製物は作用物質としてもっぱら特定の糸状菌の本発明による微生物酵素の混合物を含有しており、かつ哺乳動物およびヒトの身体固有の消化酵素の完全補充のために適切である。本発明による微生物酵素の混合物中に含有されている個々の酵素(リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ)に共通していることは、消化官の生理学的ないし病態生理学的pH範囲(約pH4〜8)および特に栄養摂取の際もしくはその直後に支配的な条件下で良好なpH安定性および良好なpH活性を有していることである。該医薬調製物はさらに、良好な効果および良好な相容性により優れている。
【0014】
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼは、少なくとも1800000FIP−U/g(=ベルギーの国際薬学連盟(Federation International Pharmaceutic)の規定により決定された、国際的に標準化された酵素活性単位)の比活性を有している。菌株リゾープス−デレマは菌株リゾープス−オリゼの亜種であると見なされている。菌株リゾープス−デレマの糸状菌のリパーゼは自体公知であり、かつたとえば相応する菌の培養ブロスから自体公知の方法により得ることができる。糸状菌を発酵させるため、およびこれらの糸状菌から形成された酵素産物を単離するための方法は、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから(たとえばH. Diekmann, H. Metz, ”Grundlage und Praxis der Biotechnologie”、Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991を参照のこと)、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き、単離したリパーゼからたとえば自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。有利にはリパーゼ(EC番号3.1.1.3)は、日本の天野エンザイム株式会社(Amano Pharmaceuticals)のリゾープス−デレマの”Lipase D Amano 2000 (R)(Lipase D2 (R)とも呼ばれる)を使用することができる。これらのリパーゼは、天然の膵臓リパーゼと同様に、脂肪酸グリセリドに対して1,3−位特異性を有する。比活性はバッチに依存して約1800000FIP−U/gから約2250000FIP−U/gの間である。”Lipase D Amano 2000 (R)”は、パンクレアチンからの膵臓プロテアーゼに対する高い安定性により優れている。たとえば実験室試験において”Lipase D Amano 2000 (R)”の脂肪分解活性はpH6〜8のpH範囲でパンクレアチンからの膵臓プロテアーゼを2時間作用させた後で、なお初期活性の55%である。”Lipase D Amano 2000 (R)”のpH安定性は、37℃、120分以上の時間でpH4〜8のpH範囲での実験室試験において初期活性の少なくとも70%である。
【0015】
リゾープス−デレマの濃縮リパーゼにとって特徴的なパラメータとしてたとえばそのpHプロファイルが適切である。従って”Lipase D Amano 2000 (R)”のpHプロファイルは比活性としてpH値に依存して決定した。この場合、個々のpH値での比活性は微生物リパーゼの活性を決定するためのFIP法の変更により測定された。さらにpHプロファイルは胆汁酸塩の可変的な濃度の存在下でも決定された。
【0016】
a)オリーブ油エマルションの製造
アラビアゴム 44g、
オリーブ油 115gおよび
水 400ml
を電動ミキサー中で15分間均質化する。
【0017】
b)異なった濃度の胆汁−ディスパート (Dispert) 溶液の製造
胆汁不含: 水120ml、
胆汁 0.5ミリモル/l: 水120ml+ディスパート溶液(FIP標準)200mg、
胆汁 5ミリモル/l: 水120ml+ディスパート溶液2g、
胆汁10ミリモル/l: 水120ml+ディスパート溶液4g。
【0018】
c)基質エマルションの製造
オリーブ油エマルション(vide supra) 480ml
塩化カルシウム溶液(CaCl2×2H2O 28.3g/l水)160mlおよび
所望の濃度の胆汁ディスパート溶液(vide supra) 120ml
を混合した。
【0019】
d)酵素溶液の製造
”Lipase D Amano 2000 (R)”(2230000FIP−U/gの比活性を測定)50mgを1%濃度の塩化ナトリウム溶液100ml中に溶解した。このストック溶液(Stammloesung)から1mlを採取し、かつ純水を用いて200mlに希釈した。そのつど、希釈したストック溶液の1ml(5575FIP−Uに相応)を次の測定の際に使用する。
【0020】
特定の胆汁酸塩濃度がその中に存在する前記の基質エマルションからそのつど19mlの試料を37℃にサーモスタット処理する。次いで基質エマルションの種々の試料を0.1MのNaOHもしくは1MのHClの添加により3、4、5、6、7および8のpH値に調整する。こうして準備した基質エマルションの試料に、引き続きそのつど1mlの前記の酵素溶液を添加する(注釈:最適な滴定速度を決定するために、酵素溶液中に理想的に含有されているリパーゼの適量は基本的に自体公知の方法により希釈列により確認することができる)。添加を行った後、0.1MのNaOHを用いてpH−スタット−滴定を10分間実施する。その後、遊離した脂肪酸を完全に解離するために、30秒以内にpH9まで終点滴定を実施する。合計して必要とされる0.1MのNaOHの消費量をリパーゼの活性単位Uに換算する:この場合、リパーゼの活性単位Uは毎分1μモルの消費量に相応する。確認されたリパーゼの活性単位はそのつど使用される乾燥酵素のgで表される量に関連させることによりU/mgの単位に換算することができる。pHプロファイルを調整するためにU/mgの単位はそれぞれの異なったpH値およびそれぞれの試験した胆汁酸塩濃度に関して第1表にまとめてあり、かつ表の値を第1図ではグラフにプロットする。
【0021】
前記のpHプロファイルから”Lipase D Amano 2000 (R)”に関して、0.5ミリモル/lのFIP−標準胆汁塩濃度でのリパーゼ活性の最大値として至適pHはpH約7に決定することができる。
【0022】
アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼは少なくとも7500FIP−U/gの比活性を有する。その至適pHはpH6〜pH8である。菌株アスペルギルス−メレウスの糸状菌の中性プロテアーゼは自体公知であり、かつたとえば自体公知の方法により相応する菌類の培養ブロスから得ることができる。糸状菌の発酵法およびこれらの糸状菌から形成される酵素産物の単離法は、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから(たとえばH. Diekmann, H. Metz, ”Grundlagen und Praxis der Biotechnologie”、Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991を参照のこと)、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き、単離したプロテアーゼから所望の場合には自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。
【0023】
有利には中性プロテアーゼは、日本の天野エンザイム社のアスペルギルス−メレウスからの”Prozyme (R)”(場合により”アルカリ性蛋白分解酵素”とも呼ばれる。EC番号3.4.21.63)を使用することができる。この微生物プロテアーゼは多糖類の少なくとも3つの1,4−α−D−グルコース単位を有する1,4−α−D−グルコシド結合を加水分解し、比活性約7800FIP−U/gを有する。このプロテアーゼのpH安定性はph5〜8のpH範囲および37℃で実験室試験において120分以上で初期活性の少なくとも60%である。
【0024】
アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼに関する特徴的なパラメータとしてたとえばそのpHプロファイルが適切である。従ってプロテアーゼ”Prozyme 6 (R)”のpHプロファイルは比活性としてpH値に依存して測定された。
【0025】
このために、膵臓プロテアーゼの活性を測定するためのFIP法の規定に相応して種々の基質溶液を製造した。FIP規定の変更において基質溶液として4%濃度のヘモグロビン溶液をカゼインの代わりに使用する。さらにFIP規定の変更において種々の基質溶液中で相応する量の1MのNaOHもしくは1MのHClを添加することにより、そのつど2、3、4、5、6、7および8の種々のpH値を調整する。基質溶液に”Prozyme 6 (R)”の試料を添加する。
【0026】
引き続き異なったpH値の基質溶液中で”Prozyme 6 (R)”試料のプロテアーゼ活性を前記のFIPの規定に従って決定する。個々の試料中で検出される酵素活性をこの測定列中で検出される最大値(=100%)へと標準化する。”Prozyme 6 (R)”に関して検出されるpHプロファイルのための測定値は第2表に記載されており、かつ第2図でグラフにプロットされている。したがって”Prozyme 6 (R)”は生理学的なpH範囲で最適に作用する。
【0027】
前記のpHプロファイルから”Prozyme 6 (R)”に関してプロテアーゼ活性の最大値として至適pHはpH約8に決定することができる。
【0028】
本発明により使用されるアスペルギルス−オリゼのアミラーゼ(EC番号3.21.1.1)はα−アミラーゼであり、かつ少なくとも40000FIP−U/g(pH5.8で測定)の比活性を有する。至適pHはpH4〜6.5のpH範囲である。菌株アスペルギルス−オリゼの糸状菌のアミラーゼは自体公知であり、かつたとえば自体公知の方法により相応する菌の培養ブロスから得られる。糸状菌の発酵のため、およびこの糸状菌から形成される酵素生成物の単離の方法は、、たとえばバイオテクノロジーの関連テキストから(たとえばH. Diekmann, H. Metz, ”Grundlagen und Praxis der Biotechnologie”、Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991を参照のこと)、または関連する専門書から当業者に公知である。引き続き単離したアミラーゼから所望の場合には自体公知の方法で随伴物質を除去し、かつ本発明により所望される比活性まで富化するか、もしくは濃縮することができる。有利にはアミラーゼは天野エンザイム社(日本)のアスペルギルス−メレウスの”Amylase A1 (R)”およびExtrakt−Chemie社(ドイツ)の”Amylase EC (R)”を使用することができる。”Amylase A1 (R)”が有利である。
【0029】
微生物アミラーゼである”Amylase A1 (R)”は約52000FIP−U/g(pH5.8で測定)の比活性を有する。”Amylase A1 (R)”のpH安定性はpH5〜8のpH範囲で37℃、120分以上での実験室試験で初期活性(Anfangsaktivitaet)の少なくとも85%である。さらなる実験室試験でパンクレアチンからの膵臓プロテアーゼ(pH6〜8のpH範囲で測定)、”Prozyme 6 (R)”(pH4〜8のpH範囲で測定)ならびにペプシンと比較して、”Amylase A1 (R)”の良好な安定性が確認された。
【0030】
アスペルギルス−オリゼのアミラーゼに関する特徴的なパラメータとしてたとえばそのpHプロファイルが適切である。従って”Amylase A1 (R)”のpHプロファイルを比活性としてpH値に依存して測定した。
【0031】
微生物アミラーゼの活性を測定するためのFIP法の規定に相応して種々の基質溶液を製造する。FIP規定の変更において種々の基質溶液中で相応する量の5MのNaOHもしくは5MのHClをFIP法により使用されるアセテート緩衝液に予め添加することにより、そのつど3.25;4;5;6;6.8および7.4の種々のpH値を調整する。基質溶液に”Amylase A1 (R)”の試料を添加する。
【0032】
引き続き異なったpH値の基質溶液中で”Amylase A1 (R)”試料のアミラーゼ活性を前記のFIPの規定に従って決定する。個々の試料中で検出される酵素活性をこの測定列中で検出される最大値(=100%)へと標準化する。”Amylase A1 (R)”に関して検出されるpHプロファイルのための測定は第3表に記載されており、かつ第3図でグラフにプロットされている。
【0033】
前記のpHプロファイルから”Amylase A1 (R)”に関してアミラーゼ活性の最大値としてpH約5までの至適pHを決定することができる。
【0034】
微生物アミラーゼである”Amylase EC (R)”は、約42500FIP−U/g(pH5.8で測定)の比活性を有する。さらになお少量のβ−アミラーゼが検出可能である。至適pH(前記の”Amylase A1 (R)”のために記載した方法により測定)はpH約5である。pH6〜8のpH範囲で37℃、120分以上で実験室試験での”Amylase EC (R)”のpH安定性は初期活性の少なくとも80%である。さらなる実験室試験で、パンクレアチンからの膵臓プロテアーゼ(pH6〜8のpH範囲で測定)、”Prozyme 6 (R)”(pH4〜8のpH範囲で測定)ならびにペプシンと比較して、”Amylase EC (R)”の良好な安定性が確認された。
【0035】
本発明による医薬調製物のために有利には固体の経口投与可能な投与形、たとえば粉末、ペレットまたはマイクロスフェアを選択することができる、これらを所望の場合にはカプセルまたはサッシェに充填するか、または圧縮成形して錠剤にすることができる。液状の医薬調製物、たとえば懸濁剤または液剤もまた場合により考えられる。この場合、個々の酵素リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼは一緒に、または空間的に相互に分離して存在していてもよい。個々の酵素が相互に空間的に分離されて存在していない場合には、乾燥した加工および/または貯蔵が有利である。医薬調製物はさらに通例の助剤および/または担体材料を含有していてもよい。助剤および/または担体材料としてたとえば微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、たとえばPEG4000または低級アルコール、特に直鎖状もしくは分枝鎖状のC1〜C4−アルコール、たとえば2−プロパノールならびに水が考えられる。
【0036】
本発明により使用される微生物補充酵素は広いpH範囲にわたる良好な安定性により優れており、かつ従ってそれ以上の処理(たとえばフィルム被覆)を行わなくても直接、経口投与すべき医薬調製物の製造のために使用することができる。この目的のために個々の補充酵素(リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ)は一緒に、または空間的に相互に分離してペレット化することができる。所望の場合には個々の補充酵素を自体公知の適切な胃液耐性の層によりフィルム被覆することもできる。全ての補充酵素を胃液耐性にフィルム被覆すべきではない場合、補充酵素のそれぞれの種類を相互に別々にペレット化し、かつ1種類の酵素のペレットをそのつど別々にフィルム被覆することが有利である。プロテアーゼおよび/またはリパーゼをそのつど単独でペレット化し、かつ胃液耐性にフィルム被覆することが特に有利でありうる。所望の場合には酵素混合物中に存在する酵素の3種類全てを一緒に胃液耐性にフィルム被覆するか、または1種類の酵素をフィルム被覆せず、2種類の酵素を胃液耐性にフィルム被覆することができる。
【0037】
本発明により使用される補充酵素の高い比活性は、比較的小さいにも関わらず、高い効果をもたらす投与形を可能にする。たとえば1つの実施態様では医薬調製物は、経口投与可能な、サイズ0のカプセルとして存在していてもよい。このような投与形中にリパーゼ約10000〜50000FIP−U、アミラーゼ8000FIP−Uおよびプロテアーゼ200FIP−Uが存在していてもよい。有利には補充酵素リパーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼは約50〜500FIP−U:40〜120FIP−U:1FIP−Uの比で存在する。
【0038】
本発明による医薬調製物の、哺乳動物およびヒトにおける消化不良の治療および/または予防のための適性を、以下に記載する、脂肪の消化を測定するためのインビトロ試験モデルにより証明することができる。
【0039】
1.ブタ用飼料試験栄養における脂肪の消化の検出
その他の栄養成分も含有するブタ用飼料の試験栄養中での脂肪の分解に対する、本発明により使用可能な微生物酵素の混合物の影響を調査する。この場合、塩化カルシウム溶液の添加は遊離する脂肪酸をカルシウムけん化物として沈澱させることに役立つ。
【0040】
A)ブタ用飼料の試験栄養の製造
以下に記載する成分:
”Altromin 9021 (R)”−完成栄養(Altromin GmbH社、ドイツ、脂肪含有率約2〜3%、実質的に挽き割り小麦からなる) 64.8g
”Sojamin (R)”タンパク質混合物(Lukas Meyer社、ドイツ) 3.85g
アラビアゴム(Merck KGaA社、ドイツ) 24.5g
大豆油(Roth社、ドイツ;主な脂肪成分;平均分子量=932g/モル)
26.7g
を純水265mlと混合し、かつ引き続き家庭用ミキサー中で15分間均質化した。得られるホモジネートに体積が450mlになるまで純水を満たした。
【0041】
B)胆汁−ディスパート溶液の製造
胆汁−ディスパート溶液1.35g(FIP−標準;リパーゼ活性化混合物)を純水50ml中に溶解した。
【0042】
C)酵素溶液の製造
1.リパーゼ溶液
天野エンザイム社(日本)の”Lipase D Amano 2000 (R)”(pH7での比活性は1888137FIP−U/gが測定された)63.1mgを純水10ml中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために250μlを使用した。
【0043】
2.プロテアーゼ溶液
天野エンザイム社(日本)の”Prozyme 6 (R)”(pH7.5での比活性は7812FIP−U/gが測定された)319mgを純水10ml中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために250μlを使用した。
【0044】
3.アミラーゼ溶液
Extrakt−Chemie社(ドイツ)の”Amylase EC (R)”(pH5.8での比活性は13466FIP−U/gが測定された)595mgを純水10ml中に溶解した。このストック溶液から次の測定のために1000μlを使用した。
【0045】
D)測定溶液の準備
前記のブタ用飼料の試験栄養15.5mlに、前記の胆汁ディスパート溶液2mlならびに前記の3つの酵素溶液C)1.〜C)3.を順次添加し、かつ純水29mlで満たした。
【0046】
E)測定の実施
準備した測定溶液を37℃に温度調節し、かつ終点滴定により1MのNaOHを用いてpH7に調整した。3つの酵素溶液を添加した直後に、20分間のpHスタット滴定を開始し、かつ1MのNaOHの消費を10秒ごとに記録した。滴定の間、4Mの塩化カルシウム溶液1mlを50μlの段階で、最大の反応速度が達成されるように手動で計量供給した。
【0047】
F)結果
ブタ用飼料−試験栄養中に含有されている脂肪(=脂肪酸トリグリセリド)は、20分間の反応時間後に約67%まで加水分解されていた。これは生理学的な加水分解産物2−脂肪酸モノグリセリドに対して100%を越える分解に相応する(100%を越える値は、2−脂肪酸モノグリセリドの1−もしくは3−脂肪酸モノグリセリドへの、およびその後の脂肪分解による分解への自発貯蔵(spontane Umlagerung)に起因する)。
【0048】
本発明により使用可能な酵素を含有する消化酵素混合物の良好な脂肪の消化能はインビトロでもオリーブ油の試験栄養により証明することができる。
【0049】
哺乳動物およびヒトにおける消化不良、特に膵機能不全に起因する消化不良の治療および/または予防のために本発明による医薬調製物の特に良好な適性は、インビトロの動物モデルに基づいて、たとえば膵機能不全のブタを用いて証明することもできる:
2.インビトロでの膵機能不全によるブタにおける本発明による酵素混合物の効果
9匹のエレガード(Ellegaard)系統のメスのゲッティンゲン成ミニブタ(体重33〜40kg)を用いて試験を実施し、その際、該ミニブタには回盲部シャント(Umleitungskanuele)を使用した。シャントは試験動物のキームスの回収のために使用した。これらの動物の6匹はさらに膵路を結紮した(=試験動物)。残りの3匹の動物は無損傷の膵路を維持しており、かつ試験結果のコントロールに使用した(=対照動物)。試験は合計して異なった3つの投与量の本発明による酵素混合物を用いて実施した。以下の酵素用量を投与した:
投与量に応じて全ての動物に22日間にわたって毎日2回、ミニブタ用の飼育飼料(Altromin (R)、Lukas Meyer社;実質的に二回挽き割りにした小麦)170g、タンパク質コンセントレート(Sojamin 90 (R)、Lukas Meyer社)10g、大豆油(Roth社)70gおよびCr2O3(非吸収性のマーカーとして、roth社)0.625gと、水1lとを混合して含有している脂肪分の多い試験飼料をそのつど250g与えた。試験動物のみの飼料に付加的に本発明による酵素混合物の個々の酵素を相応する量で食餌の少し前に混合した。さらに試験動物の5匹で、その試験飼料が酵素混合物を添加されていない試験列を実施した。この試験列で得られた結果を以下では「ゼロ値」として記載する。そのつど試験期間の20日〜22日目に試験動物から12時間にわたってシャントからキームスを採取し、かつ該キームスの粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの含有率を調査した。食餌試験およびその評価は自体公知の方法で実施した(P. C. Gregory、R. Tabeling、J. Kamphues、”Biology of the Pancreas in Growing Animals”;Developments in Animal and Veterinary Sciences 28(1999)、第381〜394頁、Elsevier、アムステルダム;S. G. PierzynowskiおよびR. Zabielski編)。
【0050】
前記のインビトロ試験において確認された、試験動物における粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの前盲腸の見かけの消化率を以下の表Aにそのつど本来与えられた脂肪、タンパク質もしくはデンプンの絶対量に対するパーセント値で記載する。「前盲腸の消化率」として記載される値は「前盲腸の見かけの消化率」に相応し、これは実際の前盲腸の消化率とは異なって、試験物質の内因性の成分、たとえば内因性タンパク質をなおわずかな量で含有している可能性がある。前盲腸の消化率は試験動物のキームスからマーカー法により以下に記載する式に基づいて決定することができる:
【0051】
【数1】
【0052】
表A:
試験動物の粗脂肪、粗蛋白およびデンプンの前盲腸消化率のインビボ測定
【0053】
【表1】
【0054】
全ての値は標準偏差を有する平均値として記載されている。
【0055】
記載の試験結果から、本発明による酵素混合物の投与により膵機能不全のブタにおいて脂肪、タンパク質および炭水化物の消化率の著しい改善が達成され、かつこの改善は投与量に依存していることが明らかである。
【0056】
例I:
”Lipase D Amano 2000 (R)”400g、PEG 4000 400gおよび”Vivapur (R)”(=微結晶性セルロース)1200gから、少量の2−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径0.7〜1.4mmのペレットを製造した。
【0057】
”Amylase A1 (R)”7000g、PEG 4000 2000gおよび”Vivapur (R)”(=微結晶性セルロース)1000gから、少量の2−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径0.7〜1.7mmのペレットを製造した。
【0058】
”Prozyme 6 (R)”1750g、PEG 4000 500gおよび”Vivapur (R)”250gから、少量の2−プロパノールおよび水の添加下に自体公知の方法で直径0.7〜1.7mmのペレットを製造した。
【0059】
前記で製造したペレットからそのつどリパーゼペレット32mg、アミラーゼペレット325mgおよびプロテアーゼペレット40mgをサイズ0のゼラチンカプセルに充填した。1カプセルあたり、次の活性を有する投与形が得られた:
リパーゼ 約10000FIP−U、
プロテアーゼ 約200FIP−U、
アミラーゼ 約8000FIP−U。
【図面の簡単な説明】
【図1】
Lipase D Amano 2000 (R)のpHプロファイルの表およびグラフを示す。
【図2】
Prozyme 6 (R)のpHプロファイルの表およびグラフを示す。
【図3】
Amylase A1 (R)のpHプロファイルの表およびグラフを示す。
Claims (14)
- 酵素混合物において、
a)リゾープス−デレマの濃縮リパーゼ、
b)アスペルギルス−メレウスの中性プロテアーゼおよび
c)アスペルギルス−オリゼのアミラーゼ
を含有することを特徴とする酵素混合物。 - リパーゼが少なくとも1800000FIP−U/gの比活性を有する、請求項1記載の酵素混合物。
- プロテアーゼが少なくとも7500FIP−U/gの比活性を有する、請求項1記載の酵素混合物。
- プロテアーゼがpH6〜pH8の至適pHを有する、請求項1記載の酵素混合物。
- 医薬調製物において、請求項1記載の酵素混合物ならびに通例の助剤および/または担体材料を含有することを特徴とする医薬調製物。
- 粉末、ペレット、マイクロスフェア、カプセル、サッシェ、錠剤の形で、懸濁液もしくは溶液として存在する、請求項5記載の調製物。
- リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼから選択される酵素の少なくとも1種が単独でペレット化されて存在している、請求項5記載の調製物。
- リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼから選択される酵素の少なくとも1種が胃液耐性の層でフィルム被覆されている、請求項5から7までのいずれか1項記載の調製物。
- プロテアーゼおよび/またはリパーゼが単独でペレット化されて存在しており、かつ胃液耐性の層でフィルム被覆されている、請求項8記載の調製物。
- 酵素リパーゼ:アミラーゼ:プロテアーゼの比がそれぞれ50〜500FIP−U:40〜120FIP−U:1FIP−Uである、請求項5記載の調製物。
- 用量単位あたりリパーゼを少なくとも10000FIP−U、アミラーゼを8000FIP−Uおよびプロテアーゼを200FIP−U含有する、請求項5記載の調製物。
- 哺乳動物およびヒトの消化不良を治療および/または予防するための薬剤を製造するための請求項1記載の酵素混合物の使用。
- 消化不良が膵機能不全に起因する、請求項12記載の使用。
- 哺乳動物およびヒトにおける消化不良を治療および/または予防するための薬剤を製造するための、少なくとも1800000FIP−U/gの比活性を有するリゾープス−デレマの濃縮リパーゼの使用。
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