DE10144711A1

DE10144711A1 - Neue Gemische mikrobieller Enzyme

Info

Publication number: DE10144711A1
Application number: DE10144711A
Authority: DE
Inventors: Manfred Galle; Peter-Colin Gregory; Andreas Potthoff; Friederike Henniges
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Abbott Products GmbH
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2002-07-25
Also published as: KR20030067752A; ZA200304986B

Abstract

Es werden neue Gemische mikrobieller Enzyme beschrieben, welche eine konzentrierte Lipase von Rhizopus delemar und zusätzlich eine Protease von Aspergillus melleus sowie eine Amylase von Aspergillus oryzae enthalten. Weiterhin werden diese Gemische mikrobieller Enzyme enthaltende pharmazeutische Zubereitungen beschrieben. Die neuen pharmazeutischen Zubereitungen sind besonders gut geeignet zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion, insbesondere der auf Pankreasinsuffizienz beruhenden Maldigestion, in Säugetieren und Menschen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzymgemische, welche eine bestimmte Kombination mikrobieller Lipase, Pro tease und Amylase enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung diese Gemische mikrobieller Enzyme enthaltende pharmazeuti sche Zubereitungen. Diese neuen pharmazeutischen Zubereitun gen sind besonders gut geeignet zur Behandlung und/oder Pro phylaxe der Maldigestion bei Säugetieren und Menschen, insbe sondere der auf chronischer exokriner Pankreasinsuffizienz beruhenden Maldigestion.

Maldigestion bei Säugetieren und Menschen beruht meist auf einem Mangel an Verdauungsenzymen, insbesondere auf einem Mangel an endogener Lipase, aber auch an Protease und/oder Amylase. Die Ursache für einen solchen Mangel an Verdauungs enzymen liegt häufig in einer Unterfunktion des Pankreas (= Pankreasinsuffizienz), dem Organ, welches die meisten und wichtigsten endogenen Verdauungsenzyme produziert. Sofern eine krankhafte Pankreasinsuffizienz vorliegt, kann diese an geboren oder erworben sein. Erworbene chronische Pankreasin suffizienz kann beispielsweise auf Alkoholismus zurückzufüh ren sein. Angeborene Pankreasinsuffizienz kann beispielsweise auf die angeborene Erkrankung an Mukoviszidose zurückzuführen sein. Die Folgen des Mangels an Verdauungsenzymen können schwere Symptome von Unter- und Mangelernährung sein, welche einhergehen können mit einer erhöhten Anfälligkeit für Sekun därerkrankungen.

Als Therapie des Mangels an endogenen Verdauungsenzymen hat sich die Substitution mit gleichartig wirkenden exogenen Verdauungsenzymen oder Verdauungsenzymgemischen bewährt. Am häufigsten werden heute für diesen Zweck pharmazeutische Zu bereitungen (= Präparate) eingesetzt, welche Schweinepankrea tin (= Pankreatin) enthalten. Solche aus den Pankreasdrüsen von Schweinen gewonnene Verdauungsenzymgemische können wegen der großen Ähnlichkeit der darin enthaltenen Enzyme und Be gleitstoffe mit den im menschlichen Pankreassekret enthalte nen Inhaltsstoffen in nahezu idealer Weise für die Enzym- Substitutionstherapie am Menschen eingesetzt werden. Da einige der Bestandteile von Pankreatin - beispielsweise die Pankreaslipase und die Pankreasamylase - empfindlich gegen über sauren pH-Werten unter pH 5 sind, sollten für die orale Verabreichung vorgesehene Pankreatinpräparate zum Schutz ge gen säureinduzierte Denaturierung im Magen mit magensaftresi stenten Schutzschichten überzogen sein. Solche Schutzschich ten bewahren die säureempfindlichen Pankreatinbestandteile vor irreversibler Zerstörung und geben Ihren Inhalt erst nach der Magenpassage im oberen Dünndarmbereich frei, wo üblicher weise höhere, unschädliche pH-Werte - etwa zwischen pH 5,5 und pH 8 - vorherrschen. Gleichzeitig ist der obere Dünndarm bereich, beispielsweise das Duodenum der Ort, an dem in der Regel die Hauptmenge der enzymatisch gespaltenen Nahrungsbe standteile vom Körper resorbiert wird.

Da Pankreatin ein Naturprodukt ist, ist für seine Be reitstellung in qualitativ einheitlicher, hochwertiger Form ein recht erheblicher technischer Aufwand nötig. Zudem kann das Angebot an für die Verarbeitung zu Pankreatin geeigneten Rohstoffen Schwankungen unterliegen.

Es hat daher bereits verschiedentlich Versuche gegeben, für die Substitution von körpereigenen Verdauungsenzymen ähn lich gut wie Pankreatin geeignete Verdauungsenzymgemische mit demgegenüber verbesserten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.

Um für die Substitution von Verdauungsenzymen beim Men schen geeignet zu sein, müssen alle Substitutionsenzyme eine Reihe von Anforderungen erfüllen (vgl. z. B. G. Peschke, "Active Components and Galenic Aspects of Enzyme Prepara tions" in: Pancreatic Enzymes in Health and Disease, Heraus geber: P. G. Lankisch, Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1991, Seiten 55 bis 64; im folgenden zitiert als "Peschke"). So sollten diese Substitutionsenzyme u. a. gegenüber Pepsin sowie anderen körpereigenen Proteasen wie Pankreasproteasen stabil sein. Auch in Gegenwart körpereigener Gallensalze sollten Substitutionsenzyme ihre Aktivität beibehalten.

Üblicherweise wird angenommen, daß eine Substitution der z. B. krankheitsbedingt minderproduzierten körpereigenen Lipase den wichtigsten Bestandteil einer Substitutionsthera pie für Verdauungsenzyme beim Menschen darstellt. Es ist je doch seit längerem bekannt, daß die gleichzeitige Substitu tion minderproduzierter Protease und Amylase einen zusätzli chen günstigen Einfluß auf die betroffenen Patienten hat (vgl. z. B. Peschke, Seite 55; WO 96/38170, Seite 6). Pharma zeutische Zubereitungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion bei Säugetieren und Menschen sollten daher neben der lipolytischen auch die proteolytischen und amyloly tischen Aktivitäten des Körpers weitgehend substituieren. Wichtig ist hierbei, daß die verschiedenen in der pharmazeu tischen Zubereitung enthaltenen Substitutionsenzyme (Lipase, Protease, Amylase) ihre Aktivitäten an dem dafür vorgesehenen Wirkort (das ist in der Regel der obere Dünndarmbereich) je weils in ausreichender Höhe entfalten können. Da unter phy siologischen Bedingungen bei oder kurz nach der Nahrungsauf nahme im menschlichen Magen unter anderem meist ein höherer pH-Wert, beispielsweise pH 4-5, vorliegt, als im nüchternen Magen (ca. pH 1-2) und da der physiologische pH-Wert im obe ren Dünndarmbereich üblicherweise zwischen 5,5 und 8 liegt, können Verdauungsenzyme, welche über eine gute pH-Stabilität und eine gute pH-Aktivität in diesem pH-Bereich von etwa 4 bis 8 verfügen, als gut geeignet zur Substitution von Verdau ungsenzymen beim Menschen angesehen werden.

Aus der europäischen Patentanmeldung EP A 0 387 945 sind bereits Zubereitungen bekannt, welche neben einem Säugetier- Pankreasextrakt zusätzlich auch eine mikrobielle Lipase ent halten. Aufgrund des darin noch enthaltenen Anteils an tieri schem Pankreatin können solche Zubereitungen aber nicht durch einfach zu standardisierende Laborverfahren in stets gleich bleibender Qualität und beliebiger Menge hergestellt werden.

In der internationalen Patentanmeldung WO 96/38170 wer den Zubereitungen beschrieben, welche u. a. eine säurestabile Amylase von Aspergillus niger und gegebenenfalls eine säure stabile Lipase von Rhizopus javanicus enthalten und welche als Verdauungshilfsmittel eingesetzt werden können. Für die Substitution der körpereigenen proteolytischen Aktivität wer den in dieser Schrift aber keine konkreten Vorschläge ge macht. Statt dessen wird lediglich darauf verwiesen, daß die Möglichkeit besteht, alle anderen Bestandteile des menschli chen Pankreassekrets außer Lipase und Amylase durch Schweine pankreatin zu ersetzen. Dies weist darauf: hin, daß die in der WO 96/38170 beschriebenen Zubereitungen nicht für die Total substitution von körpereigenen Verdauungsenzymen vorgesehen oder geeignet sind.

Weiterhin werden in der Dissertation von S. Scheler, Titel: "Multiple unit-Zubereitungen aus Aspergillus oryzae- Enzymen hoher Aktivität mit optimierter digestiver Potenz", Universität Erlangen-Nürnberg, 1995, unter weitgehend gale nischen Gesichtspunkten eine Kombination der kommerziell er hältlichen Enzyme Lipase von Rhizopus oryzae, Protease von Aspergillus oryzae und Amylase von Asperqillus oryzae unter sucht. Jedoch ist beispielsweise die dort eingesetzte Lipase gegenüber körpereigener Pankreasprotease nicht von befriedi gender Stabilität.

Aus den vorstehenden Angaben wird deutlich, daß pharma zeutische Zubereitungen, welche zur Totalsubstitution körper eigener Verdauungsenzyme von Säugetieren und Menschen vorge sehen sind, sorgfältig auf die körpereigenen Bedingungen abgestimmte Substitutionsenzyme bzw. Gemische von Substitu tionsenzymen enthalten müssen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, verbesserte Gemische von Verdauungsenzymen sowie sol che Gemische enthaltende pharmazeutische Zubereitungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion bei Säugetie ren und Menschen bereitzustellen, welche körpereigene lipoly tische, proteolytische und amylolytische Enzymaktivitäten substituieren können und welche bei hoher spezifischer Akti vität der darin enthaltenen Substitutionsenzyme verhältnis mäßig geringe Dosierungsmengen erlauben. Gleichzeitig sollten die in den Verdauungsenzymgemischen enthaltenen Substitu tionsenzyme (Lipase, Protease, Amylase) sowohl einzeln, als auch im Gemisch miteinander alle Anforderungen, welche an zur Therapie beim Menschen vorgesehene Verdauungsenzyme gestellt werden, möglichst gut erfüllen. Beispielsweise sollten die Substitutionsenzyme eine gute pH-Stabilität und eine gute pH- Aktivität in dem an dem jeweiligen physiologischen Wirkort üblicherweise vorherrschenden pH-Bereich aufweisen. Ferner sollten die Substitutionsenzyme mit körpereigenen Wirkstoffen wie Gallensalzen oder körpereigenen Proteasen, beispielsweise Pepsin oder Pankreasproteasen, gut verträglich sein. Eine weitere Aufgabe bestand darin, für den erfindungsgemäßen Zweck solche Substitutionsenzyme auszuwählen, welche durch in bezug auf Verfahrensablauf und Produktmenge einfach stan dardisierbare Herstellungsverfahren in stets gleichbleibender Qualität und beliebiger Menge erhalten werden können.

Gelöst wird die Aufgabe durch die Bereitstellung eines neuen Gemisches mikrobieller Enzyme, welches

a) eine konzentrierte Lipase von Rhizopus delemar,
b) eine neutrale Protease von Aspergillus melleus und
c) eine Amylase von Aspergillus oryzae

enthält. Erfindungsgemäße Gemische mikrobieller Enzyme können zusammen mit üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen in übli chen pharmazeutischen Zubereitungen enthalten sein. Diese pharmazeutischen Zubereitungen enthalten als Wirkstoffe aus schließlich erfindungsgemäße Gemische mikrobieller Enzyme von bestimmten Schimmelpilzen und sind zur Totalsubstitution kör pereigener Verdauungsenzyme von Säugetieren und Menschen ge eignet. Den in dem erfindungsgemäßen Gemisch mikrobieller Enzyme enthaltenen einzelnen Enzymen (Lipase, Protease, Amy lase) ist gemeinsam, daß sie im physiologischen bis pathophy siologischen pH-Bereich des Verdauungstraktes (etwa pH 4 bis 8) und insbesondere unter den bei oder kurz nach der Nah rungsaufnahme vorherrschenden Bedingungen gute pH-Stabilität und gute pH-Aktivität aufweisen. Die pharmazeutischen Zube reitungen zeichnen sich darüber hinaus durch eine gute Wirk samkeit und gute Verträglichkeit aus.

Die konzentrierte Lipase von Rhizopus delemar hat eine spezifische Aktivität von mindestens 1.800.000 FIP-E/g (= international standardisierte Enzym-Aktivitätseinheiten nach den Vorschriften der "Féderation International Pharma ceutique", Belgien, bestimmt). Lipasen von Schimmelpilzen des Stammes Rhizopus delemar sind an sich bekannt und können z. B. nach an sich bekannten Verfahren aus Kulturbrühen des entsprechenden Pilzes erhalten werden. Anschließend können die isolierten Lipasen z. B. auf an sich bekannte Weise von Begleitstoffen befreit und angereichert bzw. konzentriert werden. Vorzugsweise kann die Lipase (EC-Nr. 3.1.1.3) "Lipase D Amano 2000®" von Rhizopus delemar der Firma Amano Pharma ceuticals, Japan, eingesetzt werden. Diese Lipase weist - wie die natürliche Pankreaslipase - eine 1,3-Positionsspezifität gegenüber Fettsäureglyceriden auf. Die spezifische Aktivität liegt in Abhängigkeit von der Charge zwischen etwa 1.800.000 FIP-E/g und etwa 2.250.000 FIP-E/g. "Lipase D Amano 2000®" zeichnet sich durch eine hohe Stabilität gegenüber Pankreasprotease aus Pankreatin aus. So liegt die lipoly tische Aktivität von "Lipase D Amano 2000®" in einem Labor versuch nach zweistündiger Einwirkung von Pankreasprotease aus Pankreatin in einem pH-Bereich von pH 6 bis 8 noch bei 55% der Ausgangsaktivität. Die pH-Stabilität der "Lipase D Amano 2000®" lag in einem Laborversuch in einem pH-Bereich von pH 4 bis 8 bei 37°C über einen Zeitraum von 120 min. bei mindestens 70% der Ausgangsaktivität.

Als charakteristische Bestimmungsgröße für eine konzen trierte Lipase von Rhizopus delemar ist beispielsweise deren pH-Profil geeignet. Es wurde daher das pH-Profil der "Lipase D Amano 2000®" als spezifische Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten bei den ein zelnen pH-Werten wurden dabei nach einer Abwandlung der FIP- Methoden zur Bestimmung der Aktivität mikrobieller Lipasen gemessen. Zusätzlich wurden auch die pH-Profile in Gegenwart variabler Konzentrationen von Gallensalzen bestimmt.

a) Herstellung der Olivenölemulsion

44 g Gummi arabisch,
115 g Olivenöl und
400 ml Wasser
werden 15 min. lang im Elektromixer homogenisiert.

b) Herstellung der Galle-Dispert-Lösungen unterschiedlicher Konzentration

ohne Galle: 120 ml Wasser
0,5 mmol/l Galle: 120 ml Wasser + 200 mg Galle-Dispert (FIP-Standard)
5 mmol/l Galle: 120 ml Wasser + 2 g Galle-Dispert
10 mmol/l Galle: 120 ml Wasser + 4 g Galle-Dispert

c) Herstellung der Substratemulsion

480 ml Olivenölemulsion (vide supra)
160 ml Calciumchloridlösung (28,3 g CaCl₂

× 2 H₂

O/l Wasser) und
120 ml Galle-Dispert-Lösung (vide supra) der gewünschten Konzentration
werden gemischt.

d) Herstellung der Enzymlösung

50 mg "Lipase D Amano 2000®" (spezifische Aktivität be stimmt zu 2.230.000 FIP-E/g) werden in. 100 ml 1%iger Natriumchloridiösung gelöst. Von dieser Stammlösung wird 1 ml entnommen und mit Reinstwasser auf 200 ml verdünnt. Jeweils 1 ml der verdünnten Stammlösung (entsprechend 5,575 FIP-E) wird bei den folgenden Bestimmungen einge setzt.

Von den vorstehend angegebenen Substratemulsionen, in welchen bestimmte Gallensalzkonzentrationen vorliegen, werden jeweils Proben von 19 ml auf 37°C thermostatisiert. In ver schiedenen Proben von Substratemulsionen werden dann durch Zugabe von 0,1 M NaOH bzw. 1 M HCl pH-Werte von 3, 4, 5, 6, 7 und 8 eingestellt. Zu den so vorbereiteten Proben von Sub stratemulsionen werden anschließend jeweils 1 ml der vorste hend angegebenen Enzymlösung zugegeben (Anmerkung: um die optimale Titrationsrate zu bestimmen, kann die geeignete Menge von in der Enzymlösung idealerweise enthaltenen Lipase grundsätzlich auf an sich bekannte Weise durch eine Verdün nungsreihe ermittelt werden). Nach erfolgter Zugabe wird 10 min. lang eine pH-Stat-Titration mit 0,1 M NaOH durchge führt. Danach wird innerhalb von 30 sec. eine Endpunktstitra tion bis auf pH 9 durchgeführt, um freigesetzte Fettsäuren vollständig zu dissoziieren. Der insgesamt benötigte Ver brauch an 0,1 M NaOH wird in Lipase-Aktivitätseinheiten E umgerechnet: eine Lipase-Aktivitätseinheit E entspricht dabei einem Verbrauch von 1 µMol je Minute. Die ermittelten Lipase- Aktivitätseinheiten können durch Bezug auf die jeweils einge setzte Menge an Trockenenzymen in g umgerechnet werden in Einheiten von E/mg. Zur Erstellung des pH-Profiles werden die Einheiten von E/mg für jeden untersuchten pH-Wert und jede untersuchte Gallensalzkonzentration in Tabelle 1 tabelliert und die tabellierten Werte werden in Fig. 1 graphisch aufge tragen.

Aus dem vorstehend angegebenen pH-Profil läßt sich das pH-Optimum für "Lipase D Amano 2000®" als Maximalwert der Lipaseaktivität bei der FIP-Standardgallensalzkonzentration von 0,5 mmol/l zu ca. pH 7 bestimmen.

Die neutrale Protease von Aspergillus melleus weist eine spezifische Aktivität von mindestens 7.500 FIP-E/g auf. Ihr pH-Optimum liegt zwischen pH 6 und pH 8. Neutrale Proteasen von Schimmelpilzen des Stammes Aspergillus melleus sind an sich bekannt und können z. B. nach an sich bekannten Verfah ren aus Kulturbrühen des entsprechenden Pilzes erhalten wer den. Anschließend können die isolierten Proteasen gewünsch tenfalls auf an sich bekannte Weise von Begleitstoffen be freit und angereichert bzw. konzentriert werden.

Vorzugsweise kann die neutrale Protease "Prozyme 6®" von Aspergillus melleus der Firma Amano Pharmaceuticals, Japan, eingesetzt werden. Diese mikrobielle Protease weist eine spe zifische Aktivität von etwa 7.800 FIP-E/g auf. Die pH-Stabi lität der Protease "Prozyme 6®" in einem pH-Bereich von pH 5 bis 8 bei 37°C lag über einem Zeitraum von 120 min. in einem Laborversuch bei mindestens 60% der Ausgangsaktivität.

Als charakteristische Bestimmungsgröße für eine neutrale Protease von Aspergillus melleus ist beispielsweise deren pH- Profil geeignet. Es wurde daher das pH-Profil der Protease "Prozyme 6®" als spezifische Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert bestimmt.

Hierzu werden verschiedene Substratlösungen hergestellt, entsprechend den Vorschriften der FIP-Methode zur Aktivitäts bestimmung mikrobieller Proteasen. In Abwandlung der FIP-Vor schriften wird als Substratlösung eine 4%ige Hämoglobinlö sung anstelle von Casein verwendet. Zusätzlich werden in Ab wandlung der FIP-Vorschriften in verschiedenen Substratlösun gen durch Zugabe von entsprechenden Mengen 1M NaOH bzw. 1M HCl verschiedene pH-Werte von jeweils 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8 eingestellt. Zu den Substratlösungen werden Proben von "Pro zyme 6®" zugegeben.

Anschließend werden in den Substratlösungen unterschied licher pH-Werte die Proteaseaktivitäten der "Prozyme 6®"- Proben entsprechend den vorstehend genannten Vorschriften der FIP bestimmt. Die in den einzelnen Proben gefundenen Enzymak tivitäten werden auf den in dieser Meßreihe gefundenen Maxi malwert (= 100%) normiert. Die für "Prozyme 6®" gefundenen Meßwerte für das pH-Profil sind in Tabelle 2 tabelliert und in Fig. 2 graphisch aufgetragen. "Prozyme 6®" ist somit im physiologischen pH-Bereich optimal wirksam.

Aus dem vorstehend angegebenen pH-Profil läßt sich das pH-Optimum für "Prozyme 6®" als Maximalwert der Proteaseak tivität zu ca. pH 8 bestimmen.

Die erfindungsgemäß eingesetzte Amylase (EC-Nr. 3.2.1.1) von Aspergillus oryzae ist eine α-Amylase und weist eine spe zifische Aktivität von mindestens 40.000 FIP-E/g (gemessen bei pH 5,8) auf. Das pH-Optimum liegt im pH-Bereich von pH 4 bis 6,5. Amylasen von Schimmelpilzen des Stammes Aspergillus oryzae sind an sich bekannt und können z. B. nach an sich be kannten Verfahren aus Kulturbrühen des entsprechenden Pilzes erhalten werden. Anschließend können die isolierten Amylasen gewünschtenfalls auf an sich bekannte Weise von Begleitstof fen befreit und angereichert bzw. konzentriert werden. Vor zugsweise können die Amylasen "Amylase A1®" von Aspergillus melleus der Firma Amano Pharmaceuticals, Japan und "Amylase EC®" von Aspergillus melleus der Firma Extrakt-Chemie, Deutschland, eingesetzt werden. "Amylase A1®" ist bevorzugt.

Die mikrobielle Amylase "Amylase A1®" weist eine spezi fische Aktivität von etwa 52.000 FIP-E/g (gemessen bei pH 5,8) auf. Die pH-Stabilität der "Amylase A1®" in einem pH-Bereich von pH 5 bis 8 bei 37°C lag über einen Zeitraum von 120 min. in einem Laborversuch bei mindestens 85% der Ausgangsaktivität. In weiteren Laborversuchen wurden gute Stabilitäten der "Amylase A1®" gegenüber Pankreasprotease aus Pankreatin (gemessen im pH-Bereich pH 6 bis 8), gegenüber "Prozyme 6®" (gemessen im pH-Bereich pH 4 bis 8) sowie gegen über Pepsin festgestellt.

Als charakteristische Bestimmungsgröße für eine Amylase von Aspergillus oryzae ist beispielsweise deren pH-Profil ge eignet. Es wurde daher das pH-Profil der "Amylase A1®" als spezifische Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert bestimmt.

Es werden verschiedene Substratlösungen hergestellt, entsprechend den Vorschriften der FIP-Methode zur Aktivitäts bestimmung mikrobieller Amylasen. In Abwandlung der FIP-Vor schriften werden in verschiedenen Substratlösungen durch vor herige Zugabe entsprechender Mengen von 5 M NaOH bzw. 5 M HCl zu dem gemäß FIP-Methode verwendeten Acetatpuffer verschie dene pH-Werte von jeweils 3,25; 4; 5; 6; 6,8 und 7,4 einge stellt. Zu den Substratlösungen werden Proben von "Amylase A1®" zugegeben.

Anschließend werden in Substratlösungen unterschied licher pH-Werte-die Amylaseaktivitäten der "Amylase A1®"- Proben entsprechend den vorstehend genannten Vorschriften der FIP bestimmt. Die in den einzelnen Proben gefundenen Enzymak tivitäten werden auf den in dieser Meßreihe gefundenen Maxi malwert (= 100%) normiert. Die für "Amylase A1®" gefundenen Meßwerte für das pH-Profil sind in Tabelle 3 tabelliert und in Fig. 3 graphisch aufgetragen.

Aus dem vorstehend angegebenen pH-Profil läßt sich das pH-Optimum für "Amylase A1®" als Maximalwert der Amylaseak tivität zu ca. pH 5 bestimmen.

Die mikrobielle Amylase "Amylase EC®" weist eine spezi fische Aktivität von etwa 42.500 FIP-E/g (gemessen bei pH 5,8) auf. Daneben sind noch geringe Anteile von β-Amylase nachweisbar. Das pH-Optimum (gemessen nach der vorstehend für Amylase A1®" angegebenen Methode) liegt bei etwa pH 5. Die pH-Stabilität der "Amylase EC®" in einem pH-Bereich von pH 6 bis 8 bei 37°C lag über einem Zeitraum von 120 min. in einem Laborversuch bei mindestens 80% der Ausgangsaktivität. In weiteren Laborversuchen wurden gute Stabilitäten der "Amylase EC®" gegenüber Pankreasprotease aus Pankreatin (gemessen im pH-Bereich pH 6 bis 8), gegenüber "Prozyme 6®" (gemessen im pH-Bereich pH 4 bis 8) sowie gegenüber Pepsin festgestellt.

Für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können vorzugsweise oral applizierbare Dosierungsformen ge wählt werden, beispielsweise Pulver, Pellets oder Micro spheres, welche gewünschtenfalls in Kapseln oder Sachets abgefüllt oder zu Tabletten verpreßt werden können oder auch flüssige pharmazeutische Zubereitungen wie Suspensionen oder Lösungen. Die einzelnen Enzyme Lipase, Protease und Amylase, können dabei gemeinsam oder räumlich voneinander getrennt vorliegen. Sofern die einzelnen Enzyme nicht räumlich vonein ander getrennt vorliegen, ist eine trockene Verarbeitung und/oder Lagerung bevorzugt. Die pharmazeutischen Zubereitun gen können weiterhin übliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten. Als Hilfs- und/oder Trägerstoffe kommen beispiels weise mikrokristalline Cellulosen, Polyethylenglykole, bei spielsweise PEG 4000, oder auch niedere Alkohole, insbeson dere geradkettige oder verzweigte C₁-C₄-Alkohole wie 2-Pro panol, sowie Wasser in Frage.

Die erfindungsgemäß eingesetzten mikrobiellen Substitu tionsenzyme zeichnen sich durch eine gute Stabilität über weite pH-Bereiche aus und können daher ohne weitere Behand lung (wie Befilmung) direkt für die Herstellung oral zu applizierender pharmazeutischer Zubereitungen eingesetzt wer den. Zu diesem Zweck können die einzelnen Substitutionsenzyme (Lipase, Protease und Amylase) gemeinsam oder räumlich von einander getrennt pelletiert werden. Zur weiteren Erhöhung der pH-Stabilität kann es vorteilhaft sein, die einzelnen Substitutionsenzyme mit einer geeigneten, an sich bekannten magensaftresistenten Schicht zu befilmen. Sofern nicht alle Substitutionsenzyme magensaftresistent befilmt werden sollen, ist es zweckmäßig, die einzelnen Sorten von Substitutionsen zymen voneinander getrennt zu pelletieren und die Pellets einer Enzymsorte jeweils getrennt zu befilmen. Insbesondere kann es zweckmäßig sein, die Protease und/oder die Lipase je weils einzeln zu pelletieren und magensaftresistent zu befil men. Gewünschtenfalls können auch alle drei im Enzymgemisch vorliegenden Enzyme gemeinsam magensaftresistent befilmt wer den oder es können zwei Enzyme magensaftresistent befilmt werden, während ein Enzym nicht befilmt wird.

Die hohen spezifischen Aktivitäten der erfindungsgemäß eingesetzten Substitutionsenzyme erlauben es, verhältnismäßig kleine Dosierungsformen mit dennoch hoher Wirksamkeit zur Verfügung zu stellen. Beispielsweise kann in einer Ausfüh rungsform die pharmazeutische Zubereitung als oral applizier bare Kapsel der Größe 0 vorliegen. Auch in einer solchen Dosierungsform können etwa 10.000-50.000 FIP-E Lipase, 8.000 FIP-E Amylase und 200 FIP-E Protease vorliegen. Zweck mäßigerweise liegen die Substitutionsenzyme Lipase, Amylase und Protease in einem Verhältnis von ca. 50-500 FIP-E: 40-120 FIP-E: 1 FIP-E vor.

Die Eignung erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zuberei tungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion in Säugetieren und Menschen kann mit dem nachfolgend angegebenen in-vitro-Testmodell zur Bestimmung der Fettverdauung belegt werden:

1. Nachweis der Fettverdauung in einer Schweinefuttertestnah rung

Es wird der Einfluß eines Gemisches erfindungsgemäß einsetz barer mikrobieller Enzyme auf den Fettabbau in einer auch an dere Nahrungsbestandteile enthaltenden Schweinefutter-Test- nahrung untersucht. Der Zusatz einer Calciumchlorid-Lösung dient dabei der Ausfällung freigewordener Fettsäuren als Cal ciumseifen.

A) Herstellung der Schweinefuttertestnahrung

Die nachfolgend angegebenen Bestandteile:
64,8 g "Altromin 9021®"-Fertignahrung (Fa. Altromin GmbH, Deutschland, Fettgehalt ca. 2-3%, im wesentlichen bestehend aus geschrotetem Weizen)
3,85 g "Sojamin®"-Proteingemisch (Fa. Lukas Meyer, Deutschland)
24,5 g Gummi Arabisch (Fa. Merck KGaA, Deutschland)
26,7 g Sojaöl (Fa. Roth, Deutschlanc(; Haupt-Fettbe standteil; mittleres Molekulargewicht = 932 g/mol)
wurden mit 265 ml Reinstwasser vermischt und anschließend 15 min. lang im Haushaltsmixer homogenisiert. Das erhal tene Homogenisat wurde mit Reinstwasser bis auf ein Volu men von 450 ml aufgefüllt.

B) Herstellung der Galle-Dispert-Lösung

1,35 g Galle-Dispert (FIP-Standard; Lipase activation mixture) wurden in 50 ml Reinstwasser gelöst.

C) Herstellung der Enzymlösungen 1. Lipaselösung

63,1 mg "Lipase D Amano 2000®" der Fa. Amano Pharmaceuti cals, Japan (spezifische Aktivität bei pH 7 bestimmt zu 1.888.137 FIP-E/g) wurden in 10 ml Reinstwasser gelöst. Von dieser Stammlösung wurden 250 µl für die nachfolgende Messung eingesetzt.

2. Proteaselösung

319 mg "Prozyme 6®" der Fa. Amano Pharmaceuticals, Japan (spezifische Aktivität bei pH 7,5 bestimmt zu 7.812 FIP-E/g) wurden in 10 ml Reinstwasser gelöst. Von dieser Stammlösung wurden 250 µl für die nachfolgende Messung eingesetzt.

3. Amylaselösung

595 mg "Amylase EC®" der Fa. Extrakt-Chemie, Deutsch land (spezifische Aktivität bei pH 5,8 bestimmt zu 13.466 FIP-E/g) wurden in 10 ml Reinstwasser gelöst. Von dieser Stammlösung wurden 1.000 µl für die nachfolgende Messung eingesetzt.

D) Vorbereitung der Meßlösung

15,5 ml der vorgenannten Schweinefutter-Testnahrung wur den mit 2 ml der vorgenannten Galle-Dispert-Lösung sowie nacheinander mit den drei vorgenannten Enzymlösungen C)1. bis C)3. versetzt und mit Reinstwasser auf 29 ml aufge füllt.

E) Durchführung der Messung

Die vorbereitete Meßlösung wurde auf 37°C temperiert und durch Endpunkttitration mit 1 M NaCH auf pH 7 einge stellt. Unmittelbar nach Zugabe der drei Enzymlösungen wurde eine pH-Stat-Titration für 20 min. gestartet und der Verbrauch an 1 M NaOH wurde alle 10 sec. registriert. Während der Titration wurde 1 ml einer 4 M Calciumchlo ridlösung in Schritten von 50 µl manuell so zudosiert, daß eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wurde.

F) Ergebnis

Die in der Schweinefutter-Testnahrung enthaltenen Fette (= Fettsäuretriglyceride) waren nach 20 min. Reaktions zeit zu ca. 67% hydrolisiert worden. Dies entspricht einem über 100%igen Abbau zu den physiologischen Hydroly seprodukten, den 2-Fettsäuremonoglyceriden (Werte über 100% sind auf spontane Umlagerung der 2-Fettsäuremono glyceride zu 1- bzw. 3-Fettsäuremonoglyceriden und nach folgende lipolytische Spaltung zurückzuführen).

Die gute Fettverdauungsleistung eines die erfindungsge mäß einsetzbaren Enzyme enthaltenden Verdauungsenzymgemisches kann auch in vitro an einer Olivenöl-Testnahrung belegt wer den.

Die besonders gute Eignung der erfindungsgemäßen pharma zeutischen Zubereitungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion in Säugetieren und Menschen, insbesondere der auf Pankreasinsuffizienz beruhenden Maldigestion, kann auch anhand von in-vivo-Tiermodellen, beispielsweise an pan kreasinsuffizienten Schweinen, belegt werden:

2. Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen Enzymgemisches am pan kreasinsuffizienten Schwein in vivo

Die Versuche wurden an neun adulten weiblichen Göttingen Miniaturschweinen der Linie Ellegaard (33-40 kg Körperge wicht) durchgeführt, welchen jeweils eine ileocaecale Umlei tungskanüle eingesetzt worden war. Die Umleitungskanüle diente zur Sammlung des Chymus der Versuchstiere. Sechs die ser Tiere wurde darüber hinaus der Pankreasgang ligiert (= Testtiere). Die übrigen drei Tiere behielten einen intak ten Pankreasgang und dienten der Kontrolle der Versuchsergeb nisse (= Kontrolltiere). Der Test wurde mit insgesamt drei verschiedenen Dosierungen eines erfindungsgemäßen Enzymgemi sches durchgeführt. Es wurden die folgenden Enzymdosierungen verabreicht:

Dosis 1:
111.833 FIP-E/Mahlzeit "Lipase D Amano 2000®"
1.775 FIP-E/Mahlzeit "Prozyme 6®"
89.760 FIP-E/Mahlzeit "Amylase A1®"

Dosis 2:
223.665 FIP-E/Mahlzeit "Lipase D Amano 2000®"
3.551 FIP-E/Mahlzeit "Prozyme 6®"
179.520 FIP-E/Mahlzeit "Amylase A1®"

Dosis 3:
335.498 FIP-E/Mahlzeit "Lipase D Amano 2000®"
5.326 FIP-E/Mahlzeit "Prozyme 6®"
269.280 FIP-E/Mahlzeit "Amylase A1®"

Je Dosis wurden alle Tiere über einen Zeitraum von 22 Tagen täglich zweimal mit je 250 g eines fettreichen Versuchsfut ters gefüttert, weiches 170 g Haltungsfutter für Miniatur schweine (Altromin®, Fa. Lukas Meyer; im wesentlichen doppelt geschroteter Weizen), 10 g Eiweißkonzentrat (Sojamin 90®, Fa. Lukas Meyer), 70 g Sojaöl (Fa. Roth) und 0,625 g Cr₂O₃ (als nicht-resorbierbarer Marker, Fa. Roth), vermischt mit 1 l Wasser, enthielt. Dem Futter nur der Testtiere wurden zu sätzlich die einzelnen Enzyme des erfindungsgemäßen Enzymge misches in der entsprechenden Menge kurz vor der Fütterung zugemischt. Zusätzlich wurde mit fünf der Testtiere eine Testreihe durchgeführt, worin deren Versuchsfutter kein Enzymgemisch beigefügt wurde. Die bei dieser Testreihe ermit telten Ergebnisse werden nachfolgend als "Nullwerte" angege ben. Jeweils am 20. bis 22. Tag des Untersuchungszeitraumes wurden den Versuchstieren über 12 Stunden. Chymusproben aus der Umleitungskanüle entnommen und diese wurden auf Ihren Gehalt an Rohfett, Rohprotein und Stärke untersucht. Die Fütterungsversuche und deren Auswertung wurden auf an sich bekannte Weise durchgeführt (vgl. P. C. Gregory, R. Tabeling, J. Kamphues, "Biology of the Pancreas in Growing Animals"; Developments in Animal and Veterinary Sciences 28 (1999) 381-394, Elsevier, Amsterdam; Hrsg.: S. G. Pierzynowski und R. Zabielski).

Die bei dem vorgenannten in-vivo-Versuch ermittelte schein bare präcaecale Verdaulichkeit von Rohfett, Rohprotein und Stärke in den Versuchstieren wird in der nachfolgenden Tabelle A jeweils in Prozentwerten, bezogen auf die ursprüng lich gefütterte absolute Menge an Fett, Protein bzw. Stärke angegeben. Die als "praecaecale Verdaulichkeit" angegebenen Werte entsprechen der "scheinbaren praecaecalen Verdaulich keit", welche sich von der tatsächlichen praecaecalen Verdau lichkeit dadurch unterscheiden, daß sie auch noch geringe Mengen an endogenen Anteilen der untersuchten Stoffe, bei spielsweise endogene Proteine, beinhalten können. Die prä caecalen Verdaulichkeiten wurden mit Hilfe der nachfolgend angegebenen Formel aus dem Chymus der Versuchstiere nach der Marker-Methode bestimmt:
praecaecale Verdaulichkeit sV

Tabelle A Bestimmung der präcaecalen Verdaulichkeiten von Rohfett, Roh protein und Stärke in den Versuchstieren in vivo

Alle Werte sind als Mittelwerte mit Standardabweichungen an gegeben.

Aus den angegebenen Versuchsergebnissen wird deutlich, das durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Enzymgemisches eine signifikante Verbesserung der Verdaulichkeit von Fetten, Eiweißen und Kohlenhydraten beim pankreasinsuffizienten Schwein erzielt wird und daß diese Verbesserung dosisabhängig ist.

Beispiel I

Aus 400 g "Lipase D Amano 2000®", 400 g PEG 4000 und 1.200 g Vivapur®" (= mikrokriställine Cellulose) wurden unter Zusatz von wenig 2-Propanol und Wasser auf an sich bekannte Weise Pellets von 0,7-1,4 mm Durchmesser hergestellt.

Aus 7.000 g "Amylase A1®", 2.000 g PEG 4000 und 1.000 g "Vivapur®" wurden unter Zusatz von wenig 2-Propanol und Was ser auf an sich bekannte Weise Pellets von 0,7-1,7 mm Durchmesser hergestellt.

Aus 1.750 g "Prozyme 6®", 500 g PEG 4000 und 250 g "Vivapur®" wurden unter Zusatz von wenig 2-Propanol und Wasser auf an sich bekannte Weise Pellets von 0,7-1,7 mm Durchmesser her gestellt.

Von den vorstehend hergestellten Pellets wurden jeweils 32 mg Lipase-Pellets, 325 mg Amylase-Pellets und 40 mg Protease- Pellets in eine Gelatine-Kapsel der Größe 0 abgefüllt. Man erhielt eine Dosierungsform mit folgenden Aktivitäten pro Kapsel:
Lipase ca. 10.000 FIP-E
Protease ca. 200 FIP-E
Amylase ca. 8.000 FIP-E

Claims

1. Enzymgemisch, dadurch gekennzeichnet, daß es

enthält.

2. Enzymgemisch nach Anspruch 1, worin die Lipase eine spezifische Aktivität von mindestens 1.800.000 FIP-E/g auf weist.

3. Enzymgemisch nach Anspruch 1, worin die Protease eine spezifische Aktivität von mindestens 7.500 FIP-E/g aufweist.

4. Enzymgemisch nach Anspruch 1, worin die Protease ein pH-Optimum zwischen pH 6 und pH 8 aufweist.

5. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Enzymgemisch nach Anspruch 1 sowie übliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.

6. Zubereitung nach Anspruch 5, welche in Form von Pul ver, Pellets, Microspheres, Kapseln, Sachets, Tabletten, als Suspension oder Lösung vorliegt.

7. Zubereitung nach Anspruch 5, worin mindestens eines der Enzyme, ausgewählt aus Lipase, Protease und Amylase, ein zeln pelletiert vorliegt.

8. Zubereitung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin mindestens eines der Enzyme, ausgewählt aus Lipase, Protease und Amylase, mit einer magensaftresistenten Schicht befilmt ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, worin Protease und/oder Lipase einzeln pelletiert vorliegen und mit einer magensaft resistenten Schicht befilmt sind.

10. Zubereitung nach Anspruch 5, worin das Verhältnis der Enzyme Lipase : Amylase : Protease jeweils 50-500 FIP-E: 40-120 FIP-E: 1 FIP-E beträgt.

11. Zubereitung nach Anspruch 5, welche pro Dosierungs einheit mindestens 10.000 FIP-E Lipase, 8.000 FIP-E Amylase und 200 FIP-E Protease enthält.

12. Verwendung einer Zubereitung nach Anspruch 5 zur Be handlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion in Säugetieren und Menschen.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Maldigestion durch Pankreasinsuffizienz verursacht wird.

14. Verwendung einer konzentrierten Lipase von Rhizopus delemar, welche eine spezifische Aktivität von mindestens 1.800.000 FIP-E/g aufweist, zur Herstellung eines Arzneimit tels für die Behandlung und/oder Prophylaxe der Maldigestion in Säugetieren und Menschen.