CZ20031900A3

CZ20031900A3 - Směs mikrobiálních enzymů

Info

Publication number: CZ20031900A3
Application number: CZ20031900A
Authority: CZ
Inventors: Manfred Galle; Peter-Colin Gregory; Andreas Potthoff; Friederike Henniges
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals Gmbh
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2003-10-15
Also published as: EP1381386A2; HUP0500560A3; US20040057944A1; AR032392A1; CN1487837A; NO20033261L; HUP0500560A2; CA2434808A1; WO2002060474A2; SK9292003A3; MXPA03005960A; IL157004A0; NO20033261D0; RU2003124078A; WO2002060474A3; CN1236817C; JP2004524838A; BR0206521A; NZ527148A; PL362646A1

Description

Tento vynález se týká nových směsí enzymů, které jsou tvořeny určitými kombinacemi mikrobiální lipázy, proteázy a antylázy. Dále se tento vynález týká farmaceutických přípravků obsahujících tyto směsi mikrobiálních enzymů. Tyto nové farmaceutické přípravky jsou zvláště vhodné k léčení a/nebo k prevenci poruch trávení u savců a u lidí, zvláště k léčení a/nebo prevenci poruch trávení souvisejících s chronickou exokrinní nedostatečností funkce slinivky břišní.

Dosavadní stav techniky

Poruchy trávení u savců a u lidí spočívají většinou v nedostatku trávicích enzymů, zvláště v nedostatku endogenní lipázy, ale rovněž v nedostatku proteázy a/nebo amylázy. Příčinou tohoto nedostatku trávicích enzymů je často nedostatečná funkce slinivky břišní, tj. orgánu, který produkuje většinu endogenních trávicích enzymů a nejdůležitější z těchto enzymů. Patologická nedostatečná funkce slinivky břišní může být vrozené nebo získané onemocnění. Získaná chronická nedostatečná funkce slinivky břišní může být například způsobena alkoholismem. Vrozená nedostatečná funkce slinivky břišní může být například způsobena vrozeným onemocněním mukoviszidózou. Symptomy nedo-

• ·· • · statku trávicích enzymů mohou být těžká podvýživa nebo nedostatečná výživa, které mohou mít za následek zvýšenou náchylnost k sekundárním onemocněním.

Jako vhodná terapie nedostatku endogenních trávicích enzymů se osvědčila substituce shodně působícími exogenními trávicími enzymy nebo směsmi trávicích enzymů. V současné době se pro tyto účely nej častěji používají farmaceutické přípravky (preparáty) obsahující pankreatin prasečí slinivky (zkráceně pankreatin). Tyto trávicí směsi enzymů, které jsou získávány ze slinivek prasat, mohou být vzhledem k velké podobnosti v nich obsažených enzymů a průvodních látek k látkám tvořícím sekret lidské slinivky břišní skoro ideálním způsobem používány pro enzymatickou substituční terapii u lidí. Protože některé součásti pankreatinu - například lipáza slinivky břišní a amyláza slinivky břišní - jsou citlivé na nízké hodnoty pH v oblasti pod pH 5, je třeba, aby pankreatinové preparáty určené pro perorální aplikace byly chráněny proti denaturaci kyselým prostředím v žaludku potažením ochrannými vrstvami odolnými proti působení žaludečních šťáv. Tyto ochranné vrstvy způsobují, že složky pankreatinu citlivé na kyseliny jsou chráněny před nevratným rozkladem a uvolňují se teprve po průchodu žaludkem v horní oblasti tenkého střeva, kde pH má obvykle vyšší nezávadné hodnoty - přibližně mezi 5,5 až 8. Zároveň je vrchní oblast tenkého střeva, například dvanácterník, místem, kde se zpravidla resorbuje hlavní podíl enzymaticky rozštěpených součástí potravy.

Protože pankreatin je přírodní látka, je pro jeho přípravu v kvalitativně jednotné, vysoce hodnotné formě, nutné vynaložit značné technické úsilí. Mimoto mohou být suroviny používané pro zpracování na pankreatin značně kolísavé kvality.

Proto byly činěny různé pokusy poskytnout směsi enzymů, které by jako náhrada tělu vlastních trávicích enzymů měly lepší vlastnosti než pankreatin.

• · · · ·· ····

Aby byly substituční enzymy vhodné jako náhrada lidských trávicích enzymů, musí splňovat řadu požadavků (viz například publikace G.Peschke: Active Components and Galenic Aspects of Enzyme Preparations v příručce Pancreatic Enzymys in Health and Disease, editor P. G. Lankisch, Springer Verlag Berlin, Heidelberg 1991, str. 55 až 64, která je v dalším textu uváděna jako Peschke). Je třeba, aby tyto substituční enzymy byly mimo jiné stálé v přítomnosti pepsinu, jakož i jiných tělu vlastních proteáz, jako jsou proteázy produkované slinivkou břišní. Tyto enzymy rovněž mají zachovávat svoji aktivitu v přítomnosti tělu vlastních žlučových solí.

Obvykle se předpokládá, že náhrada v důsledku nemoci v nedostatečné míře produkované tělu vlastní lipázy je nejdůležitější součástí při terapii nahrazující lidské trávicích enzymy. Již delší dobu je však známo, že náhrada současně v nedostatečné míře produkované proteázy a zároveň i amylázy má dodatečný příznivý vliv na stav nemocných (viz například Peschke, str. 55; WO 96/38170, str. 6). Farmaceutické přípravky k léčení a/nebo prevenci poruch trávení u savců a u lidí by tedy vedle lipolytické aktivity měly také nahrazovat značnou měrou i proteolytickou a amylolytickou aktivitu těla. Je důležité, aby různé ve farmaceutickém přípravku obsažené substituční enzymy (lipáza, proteáza, amyláza) mohly dostatečnou měrou uplatnit svoji aktivitu na příslušném místě působení (což je zpravidla vrchní oblast tenkého střeva). Protože za fyziologických podmínek při příjmu stravy nebo krátce po něm je v lidském žaludku mimo jiné většinou vyšší hodnota pH, například 4 až 5, než v prázdném žaludku (pH asi 1 až 2), a protože fyziologická hodnota pH v horní části tenkého střeva je obvykle 5,5 až 8, mohou být za vhodnou náhradu lidských trávicích enzymů považovány enzymy, které jsou dostatečně stálé proti působení kyselého prostředí a které mají dobrou aktivitu v kyselém prostředí v oblasti hodnot pH v rozmezí 4 až 8.

·· ···· ·· ·· • · · ♦ · • · · · · • ······ • · · · • · · ·

V evropské patentové přihlášce EP A 0 387 945 jsou popsány přípravky, které obsahují vedle extraktu ze savčí slinivky obsahují i lipázu mikrobiálního původu. Vzhledem k tomu, že však tyto přípravky obsahují i jistý podíl zvířecího pankreatinu, nemohou být připravovány jednoduchým a standardizovaným způsobem ve stále stejné kvalitě a v libovolném množství.

V mezinárodní patentové přihlášce WO 96/38170 jsou popsány přípravky, které obsahují mimo jiné amylázu stálou v kyselém prostředí získávanou z Aspergillus niger a případně lipázu stálou v kyselém prostředí získanou z Rhizopus javanicus, a které jsou vhodné pro použití jako přípravky podporující trávení. Přípravky vhodné pro náhradu tělu vlastní proteolytické aktivity však v tomto dokumentu nejsou popsány. Místo toho je pouze poukázáno na skutečnost, že existuje nahradit všechny ostatní součásti sekretu lidské slinivky břišní mimo lipázy a amyláza pankreatinem získávaným z prasečí slinivky. Z toho je zřejmé, že přípravky popsané v dokumentu WO 96/38170 nejsou určeny pro úplnou náhradu tělu vlastních trávicích enzymů, ani nejsou k tomuto účelu vhodné.

V disertační práci S. Schelera nazvané Multiple unitZubereitungen aus Aspergillus oryzae-Enzymen hoher Aktivitat mít optimierter digestiver Potenz, Universitát ErlangenNůrnberg, 1995, jsou zkoumány do značné míry z hlediska problémů galenických přípravků kombinace průmyslově vyráběných enzymů, konkrétně lipázy získávané z Rhizopus oryzae, proteázy získávané z Aspergillus oryzae a amylázy získávané z Aspergillus oryzae. Avšak například v těchto přípravcích používaná lipáza je nedostatečně stálá proti tělu vlastní proteáze produkované slinivkou břišní.

Z toho co bylo uvedeno je zřejmé, že farmaceutické přípravky, které jsou určeny pro úplnou náhradu lidských a savčích tělu vlastních trávicích enzymů, musejí obsahovat substituční enzymy resp. směsi substitučních enzymů, pečlivě přizpůsobené ·· ···· tělesným podmínkám uživatele.

Podstata vynálezu

Úkolem tohoto vynálezu bylo proto poskytnout zlepšené směsi trávicích enzymů, jakož i farmaceutické přípravky obsahující tyto směsi, vhodné k léčení a/nebo prevenci poruch trávení lidí a savců, které mohou nahradit tělu vlastní lipolytické, proteolytické a amylolytické enzymatické aktivity a které při vyšší specifické aktivitě v nich obsažených substitučních enzymů dovolují aplikaci relativně nízkých dávek. Současně je úkolem tohoto vynálezu, aby všechny substituční enzymy obsažené v těchto směsích trávicích enzymů (lipáza, proteáza, amyláza) jak jednotlivě, tak ve formě jejich vzájemných směsí, splňovaly co nejlépe všechny požadavky, které jsou kladeny na enzymy používané při léčení lidí. Například je třeba, aby tyto substituční enzymy byly dostatečně stálé v kyselém prostředí a aby měly v kyselém prostředí dostatečnou aktivitu při pH obvyklém na příslušném místě jejich fyziologického působení. Dále je třeba, aby byly tyto substituční enzymy dobře snášenlivé s tělu vlastními účinnými látkami jako jsou žlučové soli nebo tělu vlastní proteázy, například pepsin nebo proteázy produkované slinivkou břišní. Dalším úkolem tohoto vynálezu bylo zvolit pro účely tohoto vynálezu takové substituční enzymy, které by bylo možno co se týká použitého výrobního postupu a množství získávat jednoduše standardizovanou technologií, ve stálé kvalitě a v libovolném množství.

Tento úkol je řešen poskytnutím nové směs mikrobiálních enzymů, která obsahuje

a) koncentrovanou lipázu z Rhizopus delemar, ···· ·· ····

b) neutrální proteázu z Aspergillus melleus a

c) amylázu z Aspergillus oryzae.

Směsi mikrobiálních enzymů podle tohoto vynálezu mohou být obsaženy společně s obvyklými pomocnými prostředky a/nebo nosiči v běžných farmaceutických přípravcích. Tyto farmaceutické přípravky obsahují jako účinné látky výhradně směsi mikrobiálních enzymů podle tohoto vynálezu produkované určitými plísněmi a jsou vhodné jako úplná náhrada tělu vlastních trávicích lidských a savčích enzymů. Jednotlivé enzymy obsažené ve směsích mikrobiálních enzymů podle tohoto vynálezu (lipáza, proteáza, amyláza) se vyznačují tím, že mají ve fyziologické až patofyziologické oblasti pH v zažívacím ústrojí(pH 4 až 8) a zvláště při podmínkách, které v zažívacím ústrojí existují při příjmu potravy nebo krátce po něm, dobrou odolnost proti kyselosti a dobrou aktivita. Příslušné farmaceutické přípravky se nadto vyznačují dobrou účinností a dobrou snášenlivostí.

Koncentrovaná lipáza získávaná z Rhizopus delemar má specifickou aktivitu alespoň 1 800 000 jednotek FlP/g (= mezinárodně standardizované jednotky enzymatické aktivity podle předpisů Foderation International Pharmaceutique, Belgie). Kmen Rhizopus delemar je považován za podkmen kmene Rhizopus oryzae. Lipázy produkované plísněmi kmene Rhizopus delemar jsou známými látkami a mohou být získávány například známými postupy využívajícími kultivaci odpovídající plísně. Postupy fermentace těchto plísní a izolace enzymatických produktů produkovaných těmito plísněmi jsou odborníkům v dané oblasti známy, a jsou například popsány v příslušných biotechnologických učebnicích (viz například B.H.Diekmann, H.Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991) nebo z příslušných odborných publikací. Následně mohou být izolované lipázy zbaveny známými způsoby průvodních látek a obohaceny resp. zkoncentrovány až na specifickou aktivitu podle tohoto vynálezu. S výhodou může být po·· ····

užita lipáza (č. EC® 3.1.1.3) lipáza D Amano 2000®, (rovněž označovaná jako lipáza D2®) z Rhizopus delemar vyráběná firmou Amano Pharmaceuticals, Japonsko. Tato lipáza vykazuje podobně jako přirozené lipázy slinivky břišní 1,3 stereospecificitu vzhledem ke glyceridům mastných kyselin. Specifická aktivita je v závislosti na náboji v rozmezí

800 000 jednotek FlP/g až 2 250 000 jednotek FlP/g. Lipáza D Amano 2000® se vyznačuje vysokou stabilitou proti působení proteázy obsažené v pankreatinu. V důsledku toho je laboratorně stanovená lipolytická aktivita lipázy D Amano 2000® po dvojhodinovém působení proteázy z pankreatinu při pH 6 až 8 ještě 55 % výchozí aktivity. Laboratorně stanovená stabilita lipázy D Amano 2000® v oblasti pH 4 až 8 při 37 °C byla po 120 minutách alespoň 70 % výchozí aktivity.

Pro charakterizaci koncentrovaných lipáz získaných z Rhizopus delemar je například vhodný jejich pH-profil. pH-Profil lipázy D Amano 2000® je závislost specifické aktivity na pH. Specifické aktivity při jednotlivých hodnotách pH se stanovují způsobem podobným stanovení specifické aktivity v jednotkách FIP u mikrobiálních lipáz. Dodatečně se rovněž zjistí pHprofily v přítomnosti různých koncentrací žlučových solí.

a) příprava emulze olivového oleje:

g arabské gumy,

115 g olivového oleje a 400 ml vody se po dobu 15 min. homogenizují v mixéru.

b) příprava roztoků Galle-Dispert o různých koncentracích: bez žluči: 120 ml vody

0,5 mmol/1 žluči: 120 ml vody + 200 mg Galle-Dispert (FIPStandard) mmol/1 žluči: 120 ml vody + 2 g Galle-Dispert 10 mmol/1 žluči: 120 ml vody + 4 g Galle-Dispert

c) příprava emulze substrátu:

• 9 9·9·

99 • 9 9 9

9 9 9 « 9 9 9 9

9 ·

99 ·« 999« • 9

9 9

smísí se

480 ml emulze olivového oleje (viz shora)

160 ml roztoku chloridu vápenatého (28,3 g CaCl₂.2H₂O v 11 vody) a

120 ml roztoku Galle-Dispert (viz shora) o požadované koncentraci

d) příprava roztoku enzymu:

mg lipázy D Amano 2000® (specifická aktivita 2 230 000 jednotek FlP/g) se rozpustí ve 100 ml jednoprocentního roztoku chloridu sodného. 1 ml tohoto základního roztoku se zředí destilovanou vodou na 200 ml. Pro další stanovení se použije vždy 1 ml tohoto zředěného základního roztoku (odpovídajícího 5,575 jednotek FIP) .

Ze shora uvedených emulzí substrátů, s určitými koncentracemi žlučových solí se odeberou vzorky o objemu 19 ml a zahřejí se na 37 °C. V různých vzorcích emulzí substrátů se potom přídavkem 0,1M NaOH resp. 1M HCl nastaví pH na hodnoty 3, 4, 5,

6, 7 a 8. K takto připraveným vzorkům emulzí substrátů se následně přidá vždy po 1 ml shora uvedených roztoků enzymů (Poznámka: pro stanovení optimální rychlosti titrace se vhodné množství lipázy obsažené v roztoku enzymů stanoví známým způsobem pomocí zřeďovací řady). Potom se přídavkem 0,lM NaOH prováděným po dobu 10 minut provede dotitrování na určitou hodnotu pH. Následně se během 30 sekund provede titrace do koncového bodu až na pH 9, aby se dosáhlo úplné disociace uvolněných mastných kyselin. Celková spotřeba 0,1M NaOH se přepočte na jednotky aktivity lipázy: jedna jednotky aktivity lipázy přitom odpovídá spotřebě 1 pmol za minutu. Takto stanovené jednotky aktivity lipázy mohou být podle příslušné hmotnosti použitého suchého enzymu přepočteny na jednotky/mg. pHprofily jsou získány tak, že stanovené hodnoty jednotky/mg pro každou ze zkoumaných hodnot pH jsou zaneseny do Tabulky 1 pro různé koncentrace žluči, a tyto tabelováné hodnoty jsou • · · · • · · ·» • · ♦ • » * *

- 9 »***

graficky znázorněny na obr. 1.

Tabulka 1 pH-profil lipázy D Amano 2000®

pH	bez žluči	0,5 mmol/1 žluči	5 mmol/1 žluči	10 mmol/1 žluči
3	608	416	500	300
4	936	972	1076	480
5	1432	1342	960	1076
6	1048	1570	1382	1220
7	1024	2092	1832	988
8	308	732	1104	64
9	0	0	200	0

Z takto určeného pH-profilu je možno stanovit pH-optimum pro lipázu D Amano 2000® jako maximální hodnotu aktivity lipázy při standardní koncentraci žlučových solí 0,5 mmol/1 přibližné při pH 7.

Neutrální proteáza Aspergillus melleus vykazuje specifickou aktivitu alespoň 7500 jednotek FlP/g. pH-Optimum je v tomto případě mezi pH 6 až 8. Neutrální proteázy plísní kmene Aspergillus melleus jsou známy a mohou být například získány pomocí známých postupů za použití kultivačních medií vhodných pro příslušný druh plísní. Postupy fermentace plísní a izolace enzymatických produktů vytvářených těmito plísněmi jsou odborníkům v dané oblasti známy,, a jsou popsány například v příslušných učebnicích Biotechnologie (viz například H. Diekmann, H. Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991) nebo z příslušných odborných publikací. Následně mohou v případě potřeby tyto izolované proteázy být známým způsobem zbaveny znečišťujících lá'·* • · * • · * • 9 • · » · •

··· 9 ·« *·»· ·

• * • 9 • · »· * 9 «··· # · *

9 9

9 · » · 9 tek a obohaceny, případně zkoncentrovány, aby byly dosaženy specifické aktivity podle tohoto vynálezu.

S výhodou může být použita neutrální proteáza Prozyme 6® (případně označovaná rovněž jako alkalická proteináza č.

EC® 3.4.21.63) z Aspergillus melleus, vyráběná japonskou firmou Amano Pharmaceuticals. Tato mikrobiální proteáza hydrolyzuje 1,4-a-D-glukozidické vazby polysacharidů, která obsahuje alespoň tři 1, 4-a-D-glukózové jednotky a vykazuje specifickou aktivitu asi 7800 jednotek FlP/g. Laboratorním stanovením pHstability proteázy Prozyme 6® v oblasti pH 5 až 8 při 37 °C bylo zjištěno, že po 120 minutách byla tato aktivita alespoň 60 % výchozí aktivity.

Jako charakteristická veličina pro neutrální proteázy získané z Aspergillus melleus je vhodný například jejich pHprofil. Proto byl stanoven pH-profil proteázy Prozyme 6® jako závislost specifické aktivity tohoto enzymu na hodnotě pH.

K tomuto účelu se připravují různé roztoky substrátů podle předpisů metody FIP pro stanovení aktivity proteáz vylučovaných slinivkou břišní. Na rozdíl od předpisů FIP se jako roztok substrátu použije místo kaseinu čtyřprocentní roztok hemoglobinu. Následně se na rozdíl od předpisů FIP v různých roztocích substrátů přídavkem odpovídajících množství 1M NaOH případně 1M HCI nastaví různé hodnoty pH, konkrétně 2, 3, 4,

5, 6, 7 a 8. K těmto roztokům substrátů se přidají vzorky Prozyme 6®.

Následně se v těchto roztocích substrátů s rozdílnými hodnotami pH stanoví aktivity proteáz ve vzorcích Prozyme 6® za použití předpisů FIP popsaných dříve. Enzymatické aktivity nalezené pro jednotlivé vzorky se porovnají s maximální hodnotou nalezenou v této měřicí řadě (= 100 %). Hodnoty pH-profilu nalezené pro Prozyme 6® jsou tabelovány v Tabulce 2 graficky znázorněny na obr. 2. Je zřejmé, že Prozyme 6® je optimálně účinný ve fyziologické oblasti pH.

Tabulka 2 • · • · 99· · ·· »·· ·

pH-profil Prozyme 6® v procentech aktivity při optimálním pH (=100%)

PH	aktivita(%)
2	1
3	0
4	63
5	67
6	77
7	77
8	100

Z takto zjištěného pH-profilu je možno určit, že optimální pH pro Prozyme 6®, při kterém je dosahováno maximální hodnoty aktivity proteázy, je asi 8.

Amyláza použitá při postupech podle tohoto vynálezu (č.

EC® 3.21.1.1) získaná z Aspergillus oryzae je ce-amyláza vykazující specifickou aktivitu alespoň 40 000 jednotek FlP/g (měřeno při pH 5,8). Optimální pH leží v oblasti hodnot pH mezi 4 až 6,5. Amylázy získávané z plísní kmene Aspergillus oryzae jsou známé a mohou být připravovány známými postupy za použití kultivačních médií vhodných pro kultivaci odpovídajících plísní. Postup fermentace těchto plísní a izolace plísní produkujících tyto enzymatické látky jsou odborníkům v dané oblasti známy, a jsou popsány například v příslušných učebnicích biotechnologií (viz například H. Diekmann, H. Metz, Grundlagen und Praxis der Biotechnologie, Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1991) nebo v příslušných odborných publikacích. Následně mohou být v případě potřeby izolované amylázy známým způsobem zbaveny průvodních látek a obohaceny případně zkoncentrovány až na specifické aktivity odpovídající požadavkům tohoto vynálezu. S výhodou mohou být použity amylázy Amyla·· ··· · • ·

se Al získávaná z Aspergillus melleus japonskou firmou Amano Pharmaceuticals a amyláza Amylase EC®” získávaná z Aspergillus melleus německou firmou Extrakt-Chemie. Přednost je dávána amyláze Amylase Al® .

Mikrobiální amyláza Amylase Al® vykazuje specifickou aktivitu asi 52 000 jednotek FlP/g (měřeno při pH 5,8). Amyláza Amylase Al® vykazovala stabilitu v oblasti pH od 5 do 8 odpovídající alespoň 85 % výchozí aktivity po dobu 120 minut při 37 °C. Dalšími laboratorními zkouškami byla zjištěna dobrá odolnost amylázy Amylase Al® proti vlivu proteázy slinivky břišní z pankreatinu (měřeno v oblasti pH 6 až 8), proti vlivu Prozyme 6® (měřeno v oblasti pH 4 až 8), jakož i proti vlivu pepsinu.

Jako charakteristika amyláz získaných z Aspergillus oryzae je vhodný jejich pH-profil. Proto byl stanoven pH-profil amylázy Amylase Al® jako závislost její specifické aktivity na pH.

K tomuto účelu se připravují různé roztoky substrátů podle předpisů metody FIP pro stanovení aktivity amylázy vylučovaných slinivkou břišní. Na rozdíl od předpisů FIP se v různých roztocích substrátů přídavkem odpovídajících množství 5M NaOH případně 5M HC1 nastaví různé hodnoty pH, konkrétně 3,25; 4;

5; 6; 6,8 a 7,4. K těmto roztokům substrátů se přidají vzorky amylázy Amylase Al® .

Následně se v těchto roztocích substrátů s rozdílnými hodnotami pH stanoví aktivity amylázy ve vzorcích amylázy Amylase Al® za použití dříve uvedených předpisů FIP. Enzymatické aktivity nalezené pro jednotlivé vzorky se porovnají s maximální hodnotou nalezenou v této měřicí řadě (= 100 %). Hodnoty pH-profilu nalezené pro amylázy Amylase Al® jsou tabelovány v Tabulce 3 a graficky znázorněny na obr. 3.

• · · · • · ··· ·

Tabulka 3 pH-profil Amylase Al® v procentech aktivity při optimálním pH (=100%)

PH	aktivita (%)
3,25	33
4	60
5	100
5, 8	87
6	80
6,8	33
7,4	10

Z takto zjištěného pH-profilu je možno určit, že optimální pH pro amylázy Amylase Al®, při kterém je dosahováno maximální hodnoty aktivity proteázy, je přibližně 5.

Mikrobiální amyláza Amylase EC® vykazuje specifickou aktivitu asi 42 500 jednotek FlP/g (měřeno při pH 5,8). Vedle toho je možno prokázat i nízké podíly β-amylázy. Optimum aktivity (měřeno dříve uvedeným způsobem pro amylázu Amylase Al®) je přibližně při pH rovném 5. Amyláza Amylase Al® vykazovala stabilitu v oblasti pH od 6 do 8 odpovídající alespoň 80 % výchozí aktivity po 120 min. při 37 °C. Dalšími laboratorními zkouškami byla zjištěna dobrá odolnost amylázy Amylase EC® proti vlivu proteázy slinivky břišní z pankreatinu (měřeno v oblasti pH 6 až 8), proti vlivu Prozyme 6® (měřeno v oblasti pH 4 až 8), jakož proti vlivu pepsinu.

Lékovými formami vhodnými pro farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu jsou pevné perorálně dávkovatelné lékové formy, například prášek, peletky nebo mikrosféry, které je v případě potřeby možno slisovat do kapslí nebo plnit do sáčků.

V úvahu připadají případně rovněž kapalné farmaceutické přípravky jako suspenze nebo roztoky. Jednotlivé enzymy lipáza, • · . · ·· · ·· · • · · · · . · ··· • ······ . . · · · · • · . . . · ····

- 14 - ·· ·· ... ·· ·· proteáza a amyláza mohou být použity ve směsi, nebo jako jednotlivé, navzájem oddělené látky. Pokud jednotlivé enzymy nejsou od sebe odděleny, je vhodnější suchá léková forma a/nebo skladování v suchém stavu. Farmaceutické přípravky mohou dále obsahovat obvyklé pomocné látky a nosiče. Jako pomocné látky a/nebo nosiče připadají v úvahu například mikrokrystalické celulózy, polyethylenglykoly, například PEG 4000, nebo nižší alkoholy, zvláště nerozvětvené nebo rozvětvené alkoholy C1-C4 jako 2-propanol a také voda.

Substituční enzymy mikrobiálního původu podle tohoto vynálezu se vyznačují dobrou stálostí v širokém rozmezí hodnot pH a mohou proto být bez dalších úprav (jako je potažení ochranným povlakem) použity přímo pro přípravu farmaceutických přípravků pro perorální aplikaci. Za tímto účelem mohou jednotlivé substituční enzymy (lipáza, proteáza a amyláza) být peletizovány ve směsi, nebo navzájem odděleny. Je-li to požadováno, mohou být tyto jednotlivé substituční enzymy opatřeny vhodnými, z dosavadního stavu techniky známými ochrannými povlaky odolnými proti působení žaludečních šťáv. Pokud těmito ochrannými povlaky není možno opatřit všechny substituční enzymy, je vhodné peletizovat jednotlivé druhy substitučních enzymů odděleně a potahování peletek provádět u každého enzymu zvlášť.

Zvláště může být vhodná oddělená peletizace a potahování povlakem odolným proti působení žaludečních šťáv u proteáz a/nebo lipáz. Je-li to požadováno, je možno potahovat povlakem odolným proti působení žaludečních šťáv také všechny tři enzymy přítomné ve směsi enzymů společně, nebo je možno potahovat povlakem odolným proti působení žaludečních šťáv dva enzymy a jeden enzym ponechat bez tohoto ochranného povlaku.

Vysoké specifické aktivity substitučních enzymů podle tohoto vynálezu umožňují použití relativně malých dávek, které se přesto vyznačují vyšší účinností. Možná je na například léková forma pro perorální použití, kterou je kapsle velikosti 0. I • · • · • · · · «· ···· • · · ·

v této lékové formě může být obsaženo 10 000 až 50 000 jednotek FIP lipázy, 8000 jednotek FIP amylázy a 200 jednotek FIP proteázy. Účelným poměrem substitučních enzymů lipázy, amylázy a proteázy je poměr těchto látek 50 až 500 jednotek FIP : 40 až 120 jednotek FIP : 1 jednotka FIP.

Vhodnost farmaceutických přípravků podle tohoto vynálezu pro léčení a/nebo prevenci poruchy trávení lidí a savců může být prokázána pomocí dále uvedené zkoušky trávení tuků in vitro.

1. Odbourávání tuků ve zkušebním krmivu pro prasata

Byl zkoumán vliv směsi mikrobiálních enzymů použité v postupech podle tohoto vynálezu na odbourávání tuku ve zkušebním krmivu pro prasata obsahujícím vedle tuků i další složky. Přídavkem roztoku chloridu vápenatého, který byl součástí použitého postupu, bylo dosaženo vysrážení uvolněných mastných kyselin ve formě vápenatých mýdel.

A) Příprava zkušebního krmivá pro prasata

64,8 g krmivá Altromin 9021®” (výrobce Altromin GmbH, Německo, obsah tuku 2 až 3 %, v podstatě pšeničný šrot),

3,85 g bílkovinné směsi Sojamin®B (výrobce Lukas Meyer, Německo)

24,5 g arabské gumy (výrobce Merck KGaA, Německo) a

26,7 g sójového oleje (výrobce Roth, Německo; hlavní tuková složka; střední molekulová hmotnost = 932 g/mol) bylo smíšeno s 265 ml přečištěné vody a takto získaná směs byla následně homogenizována v kuchyňském mixéru po dobu 15 min. Do získaného homogenizátu byla přidána voda v takovém množství, aby celkový objem směsi byl 450 ml.

B) Příprava roztoku přípravku Galle-Dispert

1,35 g přípravku Galle-Dispert (FlP-standard, aktivační směs • · · • · · · ·· ·· lipáz) se rozpustí v 50 ml přečištěné vody.

C) Příprava roztoků enzymů

1. Roztok lipázy

63,1 mg lipázy D Amano 2000®, výrobce Amano Pharmaceuticals, Japonsko (specifická aktivita při pH 7 rovna 1 888 137 jednotek FlP/g) se rozpustí v 10 ml přečištěné vody. Z tohoto základního roztoku se použije 250 μΐ na dále popsaná měření.

2. Roztok proteázy

319 mg Prozyme 6®, výrobce Amano Pharmaceuticals, Japonsko (specifická aktivita při pH 7,5 rovna 7812 jednotek FlP/g) se rozpustí v 10 ml přečištěné vody. Z tohoto základního roztoku se použije 250 μΐ na dále popsaná měření.

3. Roztok amylázy

595 mg amylázy Amylase EC®, výrobce Extrakt-Chemie, Německo (specifická aktivita při pH 5,8 rovna 13 466 jednotek FlP/gj se rozpustí v 10 ml přečištěné vody. Z tohoto základního roztoku se použije 1000 μΐ na dále popsaná měření.

D) Příprava měřicího roztoku

15,5 ml dříve uvedeného zkušebního krmivá pro prasata se smísí s 2 ml dříve uvedeného roztoku přípravku Galle-Dispert a následovně se třemi dříve uvedenými roztoky enzymů C)1 až C)3 a takto získaný roztok se doplní přečištěnou vodou na celkový objem 29 ml.

E) Prováděni měření

Připravený měřicí roztok se zahřeje na 37 °C a titrací do koncového bodu 1M NaOH se pH nastaví na hodnotu 7. Bezprostředně po přídavku uvedených třech roztoků enzymů se započne s titrací do konstantního pH, která se provádí po dobu 20 minut, přičemž se každých 10 sekund zaznamenává spotřeba 1M NaOH. Během titrace se v dávkách po 50 pm postupně přidá • · · ·· · ·· ··· ·

celkově 1 ml 4M roztoku chloridu vápenatého takovou rychlostí, že se dosáhne maximální reakční rychlosti.

F) Výsledek

Tuky (= triglyceridy mastných kyselin), obsažené ve zkušebním krmivu pro prasata, byly po 20 minutách zhydrolyzovány na ze 67 %. To odpovídá více než stoprocentnímu odbourání 2monoglyceridů mastných kyselin na fyziologické produkty (hodnoty vyšší než 100 % jsou způsobeny spontánní přeměnou 2mononoglyceridů mastných kyselin na 1- případně 3- mononoglyceridy mastných kyselin a následujícím lipolytickým štěpením).

Dobrá trávicí účinnost trávicí směsi enzymů podle tohoto vynálezu může být rovněž prokázána zkouškami in vitro na zkušební potravě s olivovým olejem.

Zvláště dobrá způsobilost farmaceutických přípravků pro léčení a/nebo prevenci poruch trávení u lidí a savců, zvláště při léčení poruch vznikajících v důsledku nedostatečné funkce slinivky břišní, může být rovněž prokázána pokusy na zvířatech in vivo, přičemž těmito zvířaty mohou být například prasata s nedostatečnou funkcí slinivky břišní:

2. Zkoumání účinnosti směsi enzymů podle tohoto vynálezu in vivo na prasatech s nedostatečnou funkcí slinivky břišní

Pokusy byly prováděny na devíti dospělých samicích prasete Gottingen Miniaturschwein, Linie Ellegaard (tělesná hmotnost 33 až 40 kg), u kterých byly zavedeny ileocekální obchvatné kanyly. Tyto obchvatné kanyly sloužily ke shromažďování chymu zvířat. U šesti z těchto zvířat (pokusná zvířata) byl uzavřen vývod slinivky břišní. Ostatní tři zvířata byla kontrolní zvířata, s neporušeným vývodem slinivky břišní. Zkouška byla prováděna s celkem třemi různými dávkami enzymatické směsi podle tohoto vynálezu. Byly použity tyto dávky enzymatické směsi:

·· 9» ·· ···· 99 9999 ···»·· 9 9 9 9 • ······ · 9 · 9 9 9

9 · · · 9 9 9 9 • · 9» ·· · ·· · *

Dávka 1: 111 833 jednotek FIP lipázy D Amano 2000® na 1 krmnou dávku

1775 jednotek FIP Prozyme 6® na 1 krmnou dávku 89 7 60 jednotek FIP Amylase Al® na 1 krmnou dávku

Dávka 2: 223 665 jednotek FIP lipázy D Amano 2000® na 1 krmnou dávku

3551 jednotek FIP Prozyme®6 na 1 krmnou dávku 179 520 jednotek FIP Amylase Al® na 1 krmnou dávku

Dávka 3: 335 498 jednotek FIP lipázy D Amano 2000® na krmnou dávku

5326 jednotek FIP Prozyme 6® na 1 krmnou dávku

69 280 jednotek FIP Amylase 1® na 1 krmnou dávku

Všechna zvířata byla vždy po dobu 22 dní krmena dvakrát denně krmnými dávkami o celkové hmotnosti 250 g, sestávajícími ze 170 g základní krmné směsi pro zakrslá prasata (Altromín®, výrobce firma Lukas Meyer; v podstatě dvakrát šrotovaná pšenice), 10 g bílkovinného koncentrátu (Sojamin 90®, výrobce firma Lukas Meyer), 70 g sojového oleje (výrobce firma Roth) a 0, 625 g Cr₂Oa (neresorbovatelný markér, výrobce firma Roth), ve směsi sil vody. V odpovídajících množstvích byly do krmení zkušebních zvířat krátce před krmením přidány jednotlivé enzymy enzymatických směsí podle tohoto vynálezu. Následně byla s pěti pokusnými zvířaty provedena série pokusů, při kterých jim do krmení nebyly žádné enzymy přidávány. Výsledký získané v této sérii pokusů byly použity jako nulové hodnoty. Vždy ve 20. až 22. dni pokusu byl pokusným zvířatům odebírány po dobu 12 hodin vzorky chymu z obchvatných kanyl. V těchto vzorcích byl měřen obsah tuku a škrobu. Pokusy a jejich vyhodnocení byly prováděny známým způsobem (viz P.C.Gregory,

R. Tabeling, J.Kamphues, Biology of the Pancreas in Growing Animals; Developments in Animal and Veterinary Sciences 28 (1999) 381-394, Eisevier, Amsterdam; vydavatel

S. G.Pierzynowski a R.Zabielski).

9999 ·· ♦» • 9 9 9

9 9 9

9 999

9 9

9999

9 9

9 9 9

99

Při těchto in vivo pokusech stanovená zdánlivá precekální stravitelnost surového tuku, surových proteinů a škrobu je udána v dále uvedené tabulce 4 v procentech původně zvířetem pozřených absolutních množství tuků, proteinů a škrobu. Hodnoty označené precekální stravitelnost jsou hodnoty zdánlivé precekální stravitelnosti, které se odlišují od skutečné precekální stravitelnosti tím, že mohou zahrnovat rovněž nízké endogenní podíly zkoumaných látek, například endogenních proteinů. Hodnoty precekální stravitelnosti sV se stanoví pomocí dále uvedeného vzorce v chymu pokusných zvířat postupem podle Markera:

- mn - % indikátoru v potravě % výživné látky v chymu_ ^s % indikátoru v chymu ^x % výživné látky v potravě xlOO)

Tabulka 4

Stanovení precekální stravitelnosti surových tuků, surových proteinů a škrobu in vivo

	precekální stravitelnost (%)
surový tuk	surové proteiny	škrob
nulové hodnoty	29,0 + 9,8	33,7 + 5,2	63,8 + 6,7
koncentrace 1	43,5 + 9,9	56,3 + 4,5	71,9 ± 9,3
koncentrace 2	52,1 ± 8,3	64,0 ± 3,7	74,2 ± 5,8
koncentrace 3	55,3 ± 8,0	68,7 + 3,3	.81,6 + 3,7
kontrolní pokus	97,6 ± 0,02	82,3 + 1,5	96,9 + 0,5

Všechny hodnoty v tabulce jsou střední hodnoty s udanou standardní odchylkou

Z uvedených výsledků pokusů je zřejmé, že podávání enzymatické směsi podle tohoto vynálezu způsobuje významné zlepšení stravitelnosti tuků, bílkovin a sacharidů u prasat s nedostatečnou funkcí slinivky břišní a že toto zlepšení je závislé na použité dávce enzymatické směsi.

444 4

4444 ·4 44

4 4 4 4 4 4 « 4 4

4 4 4 4 4 4 44 4 • 444444 44 44 4 4

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ze 400 g lipázy D Amano 2000®, 400 g PEG 4000 a 1,200 g Vivapur® (= mikrokrystalická celulóza) byly za přídavku malého množství 2-propanolu a vody připraveny známým způsobem peletky o průměru 0,7 až 1,4 mm.

Ze 7,000 g Amylase Al®, 2,000 g PEG 4000 a 1,000 g Vivapur® byly za přídavku malého množství 2-propanolu a vody připraveny známým způsobem peletky o průměru 0,7 až 1,7 mm.

Z 1,750 g Prozyme 6®, 500 g PEG 4000 a 250 g Vivapur® byly za přídavku malého množství 2-propanolu a vody připraveny známým způsobem peletky o průměru 0,7 až 1,7 mm.

Tyto peletky byly plněny do želatinové kapsle o velikosti 0 tak, že bylo použito 32 mg lipázových peletek 325 mg amylázových peletek a 40 mg proteázových peletek. Takto získaná léková forma měla tyto aktivity jednotlivých enzymů na jednu kapsli:

lipáza: 10 000 jednotek FIP proteáza: 200 jednotek FIP amyláza: 8000 jednotek FIP

Claims

1 800 000 jednotek FlP/g.

1. Směs enzymů vyznačující se tím, že obsahuje

a) koncentrovanou lipázu z Bhizopus delemar,

b) neutrální proteázu z Aspergillus melleus a

c) amylázu z Aspergillus oryzae.

2. Směs enzymů podle nároku 1, vyznačující se tím, že lipáza vykazuje specifickou aktivitu alespoň

3. Směs enzymů podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteáza vykazuje specifickou aktivitu alespoň 7500 jednotek FlP/g.

4. Směs enzymů podle nároku 1, vyznačující se tím, že pH-optimum proteázy je v rozmezí hodnot pH 6 až 8.

5. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje směs enzymů podle nároku 1 a obvyklé pomocné látky a/nebo nosiče.

β.

Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že tímto přípravkem, který má formu prášků, peletek, mikrosfér, kapslí, sáčků, tablet, je suspenze nebo roztok.

7. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že alespoň jeden z těchto enzymů, kterými jsou lipáza, proteáza a amyláza, je samostatně peletizován.

8. Přípravek podle jednoho z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že alespoň jeden z enzymů, kterými jsou lipáza, proteáza a amyláza, je opatřen povlakem Odolným proti působení žaludečních šťáv.

99 9999

99 99

9. Přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že proteáza a/nebo lipáza jsou peletizovány jednotlivě a jsou potaženy vrstvou odolnou proti působení žaludečních šťáv.

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 999 9 9 99 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

10. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že poměr enzymů lipáza : amyláza : proteáza je 50 až 500 jednotek FIP : 40 až 120 jednotek FIP : 1 jednotka FIP.

11. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že jedna dávka tohoto přípravku obsahuje alespoň 10 000 jednotek FIP lipázy, 8000 jednotek FIP amylázy a 200 jednotek FIP proteázy.

12. Použití směsi enzymů podle nároku 1 k přípravě léčiva pro léčení a/nebo prevenci poruch trávení u savců a lidí.

13. Použití podle nároku 12, vyznačující se tím, že poruchy trávení jsou způsobeny nedostatečnou funkcí slinivky břišní.

14. Použití koncentrované lipázy z Rhizopus delemar, se specifickou aktivitou alespoň 1 800 000 jednotek FlP/g k přípravě léčiva pro léčení a/nebo prevenci poruch trávení u savců a li-