CN116670296A - 用于制备糖产品和发酵产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种用于由纤维素材料制备糖产品的方法和一种用于由纤维素材料制备发酵产品的方法。

Description

用于制备糖产品和发酵产品的方法
技术领域
本申请涉及用于由纤维素材料制备糖产品的方法和由纤维素材料制备发酵产品的方法。
背景技术
纤维素材料主要由纤维素组成，并且也可以包含半纤维素和木质素。其为生产化石燃料的替代能源提供了一个有吸引力的平台。该材料是大量可获得的，并且可以转化为有价值的产品，例如糖或生物燃料，如生物乙醇。
由纤维素材料生产发酵产品在本领域是已知的并且通常包括预处理、水解、发酵和任选地回收发酵产品的步骤。
通常，产生的糖通过微生物如酵母转化为有价值的发酵产品如乙醇。发酵发生在分开的、优选厌氧的过程步骤中(在相同或不同的容器中)。
一般而言，酶生产的成本是由纤维素材料到发酵产品的整个生产过程中的主要成本因素。因此迄今为止，酶生产成本的降低是通过应用来自具有更广泛和/或更高(特异性)水解活性的单一或多种微生物来源的酶产品(参见WO 2008/008793)来实现的。这导致较低的酶需求、更快的转化率和/或更高的转化收率，并且因此导致较低的总体生产成本。
除了酶的优化之外，过程设计的优化是用于降低生产糖产品和发酵产品的总体成本的重要工具。例如，借助于糖降解产物造成的糖损失随着收率的降低而增加。由于糖降解产物能够抑制发酵，所以应优化过程设计以减少这些糖降解产物的量。
出于经济原因，因此期望包括旨在降低在涉及纤维素材料的预处理、水解和发酵的过程中的总体生产成本的新颖和创新性过程配置。
发明内容
本申请的一个目的是提供一种改进的用于由纤维素材料制备糖产品的方法和一种改进的用于由纤维素材料制备发酵产品的方法。这些方法通过使用特定的水解条件而得到改进。
具体实施方式
贯穿本说明书和所附权利要求书，用语“包括”和“包含”以及变体诸如“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(includes)”和“包括(including)”应被解释为包含性的。也就是说，在上下文允许的情况下，这些用语意图传达可能包含未具体列举的其它要素或整体。冠词“一个”和“一种”在本文中用来指代该冠词的语法对象的一个或多于一个(即一个或至少一个)。举例来说，“一个要素”可以意指一个要素或多于一个的要素。
本公开内容涉及一种用于由纤维素材料制备糖产品的方法，包括以下步骤：(a)使用酶组合物对纤维素材料进行酶促水解以获得糖产品，其中在酶促水解的至少一部分期间添加氧，该氧的添加量为每小时在纤维素材料中以500至1100μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸，和(b)任选地，回收糖产品。
本公开内容还涉及一种用于由纤维素材料制备发酵产品的方法，包括以下步骤：(a)使用酶组合物对纤维素材料进行酶促水解以获得糖产品，其中在酶促水解的至少一部分期间添加氧，该氧的添加量为每小时在纤维素材料中以500至1100μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸，(b)对经水解的纤维素材料进行发酵以产生发酵产品，和(c)任选地，回收发酵产品。
在酶促水解之后，经水解的纤维素材料可以经历至少一次固/液分离。固/液分离的方法和条件将取决于所使用的纤维素材料的类型并且完全在本领域技术人员的技术范围内。实例包括但不限于离心、旋风分离、过滤、倾析、筛分和沉降。在一个优选的实施方案中，固/液分离通过离心或沉降进行。在固/液分离期间，可以使用用于改善分离的手段和/或辅助工具。
在一个实施方案中，使纤维素材料在酶促水解之前经历预处理步骤。换句话说，在一个实施方案中，在酶促水解之前对纤维素材料进行预处理。以下描述不同的预处理方法。
在一个实施方案中，使纤维素材料在酶促水解之前经历洗涤步骤。在一个实施方案中，使纤维素材料在酶促水解之前经历至少一次固/液分离。因此，在使纤维素材料经历酶促水解之前，可以使其经历至少一次固/液分离。固/液分离可以在预处理步骤之前和/或之后进行。上文已经描述了用于固/液分离的合适方法和条件。
在一个实施方案中，使经酶促水解的纤维素材料经历固/液分离步骤，随后是解毒步骤和/或浓缩步骤。
在如本文所述的方法中，可以将纤维素材料添加到一个或多个水解反应器中。在一个实施方案中，在添加纤维素材料之前，酶组合物已经存在于一个或多个水解反应器中。在另一个实施方案中，可以将酶组合物添加到一个或多个水解反应器中。在一个实施方案中，在添加酶组合物之前，纤维素材料已经存在于一个或多个水解反应器中。在一个实施方案中，将纤维素材料和酶组合物同时添加到一个或多个水解反应器中。存在于一个或多个水解反应器中的酶组合物可以是水性组合物。
在一个实施方案中，酶促水解至少包括其中纤维素材料在至少第一水解反应器中水解的液化步骤，以及糖化步骤，其中经液化的纤维素材料在至少第一水解反应器中和/或在至少第二水解反应器中水解。糖化可以在与液化相同的水解反应器(即至少第一水解反应器)中进行，其也可以在分开的水解反应器(即至少第二水解反应器)中进行。因此，在酶促水解中，液化和糖化可以合并。可选地，液化和糖化可以是分开的步骤。液化和糖化可以在不同温度进行，但是也可以在单一温度进行。在一个实施方案中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选在60至85℃的温度进行，并且糖化优选在50至65℃的温度进行。
酶促水解可以在一个或多个水解反应器中进行，但也可以在一个或多个管状物或任何其它连续系统中进行。这在酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时也适用。液化步骤可以在一个或多个水解反应器中进行，但是也可以在一个或多个管状物或任何其它连续系统中进行，和/或糖化步骤可以在一个或多个水解反应器中进行，但是也可以在一个或多个管状物或任何其它连续系统中进行。在一个实施方案中，酶促水解在分批、补料分批和/或连续培养反应器中发生。要使用的水解反应器的实例包括但不限于补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流动搅拌反应器和连续活塞流塔式反应器。搅拌可以通过一个或多个叶轮、泵和/或静态混合器进行。
可以在酶促水解之前和/或期间添加在酶促水解中使用的酶。如上所指出的，当使纤维素材料在酶促水解之前经历固/液分离时，可以在固/液分离之前添加在酶促水解中使用的酶。可选地，它们也可以在固/液分离之后或固/液分离之前和之后添加。酶也可以在酶促水解期间添加。在酶促水解包括液化步骤和糖化步骤的情况下，可以在液化步骤期间和/或之后添加额外的酶。可以在糖化步骤之前和/或期间添加额外的酶。也可以在糖化步骤之后添加额外的酶。
在一个实施方案中，总酶促水解时间为10小时或更长、12小时或更长、14小时或更长、16小时或更长、18小时或更长、20小时或更长、30小时或更长、40小时或更长、50小时或更长、60小时或更长、70小时或更长、80小时或更长、90小时或更长、100小时或更长、110小时或更长、120小时或更长、130小时或更长、140小时或更长、150小时或更长、160小时或更长、170小时或更长、180小时或更长、190小时或更长、200小时或更长。
在一个实施方案中，总酶促水解时间为10至300小时、16至275小时、优选20至250小时、更优选30至200小时、最优选40至150小时。
在用于酶促水解的一个或多个水解反应器中的纤维素材料的粘度为10至20,000cP、10至15,000cP、优选10至10,000cP。
在方法包括包含液化步骤和糖化步骤的酶促水解的情况下，在液化步骤中纤维素材料的粘度为10至4000cP、10至2000cP、优选10至1000cP，和/或在糖化步骤中纤维素材料的粘度优选为10至1000cP。
可以利用Rheolab QC粘度计使用Rushton叶轮在用于水解的温度并且在<10的雷诺数确定粘度。
在酶促水解的至少一部分期间添加氧。在一个实施方案中，在整个酶促水解期间添加氧。可以在酶促水解期间连续或不连续地添加氧。在一个实施方案中，在酶促水解期间一次或多次地添加氧。也可以在酶促水解之前、在将纤维素材料添加到用于酶促水解的水解反应器期间、在将酶添加到用于酶促水解的水解反应器期间或其任何组合添加氧。将氧添加到在酶促水解中使用的一个或多个水解反应器中。
氧可以以多种形式添加。例如，氧可以作为氧气体、富氧气体如富氧空气或空气添加。如何添加氧的示例包括但不限于借助于喷射、电解、化学添加氧、从顶部填充用于酶促水解的一个或多个水解反应器(将水解产物投入罐中并且因此将氧引入到水解产物中)和将氧添加到所述一个或多个水解反应器的顶部空间来添加氧。当将氧添加到一个或多个水解反应器的顶部空间时，在使用小型水解反应器(即<1m3)的情况下，可以供应对于水解反应所必需的足够的氧。当使用大型(即商用)水解反应器(即＞1m3)时，经由顶部空间添加氧是不够的，并且需要通过例如将氧喷射或吹入纤维素材料中来添加氧。通常，可以控制和/或改变添加到一个或多个水解反应器中的氧的量。通过仅在所述一个或多个水解反应器中的部分水解时间期间添加氧，可以限制供应的氧。另一种选择是添加低浓度的氧，例如通过使用空气和再循环的空气(离开水解反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气进行。增加添加的氧的量可以通过在较长的水解时间段期间添加氧、通过添加较高浓度的氧或通过添加更多的空气来实现。控制氧浓度的另一种方式是添加氧消耗器和/或氧发生器。可以测量在纤维素材料的酶促水解期间的氧浓度，例如通过使用DO(溶解氧)电极进行。
在一个实施方案中，在将纤维素材料添加到所述一个或多个水解反应器中之前和/或期间和/或之后，将氧添加到用于酶促水解的一个或多个水解反应器。氧可以与进入一个或多个水解反应器的纤维素材料一起被引入。氧可以被引入到将进入一个或多个水解反应器的材料流中或与通过一个或多个水解反应器的外部回路的一个或多个水解反应器的内容物的一部分而一起被引入。
在酶促水解的至少一部分期间添加氧，其添加量为每小时在纤维素材料中以500至1100μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸。在一个优选的实施方案中，在酶促水解的至少一部分期间添加氧，其添加量为每小时在纤维素材料中以510至1090μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸。在一个更优选的实施方案中，在酶促水解的至少一部分期间添加氧，其添加量为每小时在纤维素材料中以520至1080μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸。在一个甚至更优选的实施方案中，在酶促水解的至少一部分期间添加氧，其添加量为每小时在纤维素材料中以530至1070μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸。在最优选的实施方案中，在酶促水解的至少一部分期间添加氧，其添加量为每小时在纤维素材料中以540至1050μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸。
在一个实施方案中，添加氧以在酶促水解期间维持0.0002-0.047mol O2/m3的氧浓度。在一个优选的实施方案中，添加氧以在酶促水解期间维持0.0002-0.002mol O2/m3的氧浓度。在一个优选的实施方案中，添加氧以在酶促水解期间维持0.002-0.016mol O2/m3的氧浓度。在一个优选的实施方案中，添加氧以在酶促水解期间维持0.016-0.047mol O2/m3的氧浓度。以上给出的“mol O2/m3”值指的是在标准大气压力和60℃的温度测得的值。当使用不同的压力和/或温度时，这些值会将是不同的。当使用不同的压力和/或温度时，计算“molO2/m3”值完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一个实施方案中，用于酶促水解和/或发酵的一个或多个反应器的体积为至少1m3。优选地，反应器的体积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3。通常，一个或多个反应器将小于3000m3或5000m3。在酶促水解中使用多个反应器的情况下，它们可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。在酶促水解包括分开的液化步骤和糖化步骤的情况下，用于液化步骤的一个或多个水解反应器以及用于糖化步骤的一个或多个水解反应器可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一个实施方案中，酶促水解在40-90℃、优选45-80℃、更优选50-70℃并且最优选55-65℃的温度进行。
如本文所使用的纤维素材料包括任何含纤维素的材料。优选地，如本文所使用的纤维素材料包括木质纤维素和/或半纤维素材料。如本文所使用的纤维素材料可以还包含淀粉和/或蔗糖。适用于如本文所述的方法的纤维素材料包括生物质，例如原始生物质和/或非原始生物质，如农业生物质、商业有机物、建筑和拆除碎片、城市固体废物、废纸和庭院废物。生物质的常见形式包括树木、灌木和草、小麦、黑麦、燕麦、小麦秸秆、甘蔗、甘蔗秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、能源甘蔗、木薯、糖蜜、大麦、玉米、玉米秸秆、玉米纤维、玉米壳、玉米棒、油菜茎、大豆茎、甜高粱、玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)、干酒糟(DDGS)、来自碾磨(包括湿磨和干磨)谷物如玉米、小麦和大麦的产品和副产品(通常称为“麸皮或纤维”)以及城市固体废物、废纸和庭院废物。生物质还可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸及纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、灌木、藤条、玉米和玉米壳、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、短周期木本作物、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、藤本植物、甜菜、甜菜浆、小麦麸、燕麦壳及硬木和软木(不包括具有有害物质的木材)。此外，农业生物质包括从农业过程中产生的有机废料，包括农业和林业活动，具体包括林业木材废料。农业生物质可以是任何单独的上述物质或者其任何组合或混合物。
在一个实施方案中，在酶促水解之前对纤维素材料进行预处理。预处理方法在本领域是已知的并且包括但不限于加热、机械、化学改性、生物改性及其任何组合。在一个实施方案中，预处理是蒸汽处理、稀酸处理、有机溶剂处理、石灰处理、ARP处理或AFEX处理。通常进行预处理以增强纤维素材料对酶促水解的可及性和/或水解半纤维素和/或溶解纤维素材料中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素。在一个实施方案中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或者用稀酸或稀碱处理来处理纤维素材料。预处理方法的实例包括但不限于蒸汽处理(例如，在100至260℃、在7至45巴的压力、在中性pH处理1至10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽下、在120至200℃、在2至15巴的压力、在酸性pH，用0.1至5％H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2至30分钟)、有机溶剂处理(例如，在有机溶剂和蒸汽的存在下、在160至200℃、在7至30巴的压力、在酸性pH，用1至1.5％H2SO4处理30至60分钟)、石灰处理(例如，在水/蒸汽的存在下、在60至160℃、在1至10巴的压力、在碱性pH，用0.1至2％NaOH/Ca(OH)2处理60至4800分钟)、ARP处理(例如，在150至180℃、在9至17巴的压力、在碱性pH，用5至15％NH3处理10至90分钟)、AFEX处理(例如，在60至140℃、在8至20巴的压力、在碱性pH，用>15％NH3处理5至30分钟)。
可以洗涤纤维素材料。在一个实施方案中，可以在预处理之后洗涤纤维素材料。洗涤步骤可以用于去除可充当用于发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以本领域技术人员已知的方式进行。除了洗涤之外，确实存在其它解毒方法。纤维素材料也可以通过这些方法中的任一种(或任何组合)解毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、萃取、吸附、中和、过灰碱处理(overliming)、添加还原剂、添加解毒酶如漆酶或过氧化物酶、添加能够使水解产物解毒的微生物。
在一个实施方案中，水解步骤进行直至纤维素材料中的70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多的可用糖被释放。
在一个实施方案中，在酶促水解中纤维素材料的干物质含量为10％至40％(w/w)、11％至35％(w/w)、12％至30％(w/w)、13％至29％(w/w)、14％至28％(w/w)、15％至27％(w/w)、16％至26％(w/w)、17％至25％(w/w)。
在一个实施方案中，在水解中添加的酶组合物的量(本文也称为酶剂量或酶负荷)是低的。在一个实施方案中，酶组合物的量为10mg蛋白质/g干物质重量或更低、9mg蛋白质/g干物质重量或更低、8mg蛋白质/g干物质重量或更低、7mg蛋白质/g干物质重量或更低、6mg蛋白质/g干物质重量或更低、5mg蛋白质/g干物质或更低、4mg蛋白质/g干物质或更低、3mg蛋白质/g干物质或更低、2.5mg蛋白质/g干物质或更低、2mg蛋白质/g干物质或更低或1mg蛋白质/g干物质或更低(表示为蛋白质，单位为mg蛋白质/g干物质)。显然，酶组合物的量大于0。在一个实施方案中，酶组合物的量为5mg酶/g干物质重量或更低、4mg酶/g干物质重量或更低、3mg酶/g干物质重量或更低、2.5mg蛋白质/g干物质或更低、2mg酶/g干物质重量或更低、1mg酶/g干物质重量或更低、0.5mg酶/g干物质重量或更低、0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低、0.3mg酶/g干物质重量或更低、0.25mg酶/g干物质重量或更低、0.20mg酶/g干物质重量或更低、0.18mg酶/g干物质重量或更低、0.15mg酶/g干物质重量或更低或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为纤维素酶的总量，单位为mg酶/g干物质)。显然，酶的量大于0。
在一个实施方案中，酶组合物以1mg至20mg蛋白质/克纤维素材料中的葡聚糖干物质重量的量用于酶促水解。在一个实施方案中，酶组合物以1.5mg至15mg蛋白质/克纤维素材料中的葡聚糖干物质重量的量用于酶促水解。在一个实施方案中，酶组合物以2mg至12mg蛋白质/克纤维素材料中的葡聚糖干物质重量的量用于酶促水解。在一个实施方案中，酶组合物以2mg至10mg蛋白质/克纤维素材料中的葡聚糖干物质重量的量用于酶促水解。
在一个实施方案中，发酵(即步骤b)在一个或多个发酵反应器中进行。在一个实施方案中，发酵是利用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行的。在一个实施方案中，发酵通过产醇微生物进行以产生醇。在一个实施方案中，发酵通过产有机酸的微生物进行以产生有机酸。通过产醇微生物产生醇的发酵可以在其中进行酶促水解的一个或多个相同发酵反应器中进行。可选地，通过产醇微生物产生醇的发酵和通过产有机酸微生物产生有机酸的发酵可以在一个或多个分开的发酵反应器中进行，但是也可以在一个或多个相同的发酵反应器中进行。
在一个实施方案中，发酵通过酵母菌进行。在一个实施方案中，产醇微生物和/或产有机酸微生物是酵母菌。在一个实施方案中，产醇微生物能够发酵至少一种C5糖和至少一种C6糖。在一个实施方案中，产有机酸微生物能够发酵至少一种C6糖。在一个实施方案中，产醇微生物和产有机酸微生物是不同的微生物。在另一个实施方案中，产醇微生物和产有机酸微生物是相同的微生物，即产醇微生物也能够产生有机酸如琥珀酸。
在另一个方面，本公开内容因此包括发酵过程，其中微生物被用于发酵包含一种或多种糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可以包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物低聚物或聚合物，诸如例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等。为了从这样的碳水化合物中释放木糖或葡萄糖单元，可以将适当的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等)添加到发酵培养基中或者可以通过经修饰的宿主细胞产生。在后一种情况下，可以对经修饰的宿主细胞进行遗传改造以产生和分泌这样的碳水化合物酶。使用葡萄糖的低聚物或聚合物来源的一个额外优点在于，它能够实现在发酵期间保持(较)低浓度的游离葡萄糖(例如通过使用限速量的碳水化合物酶)。这反过来将防止抑制非葡萄糖糖如木糖的代谢和运输所需的系统。在一种优选的过程中，经修饰的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选的木糖)和葡萄糖二者，优选同时地发酵，在这种情况下优选使用对葡萄糖抑制不敏感的经修饰的宿主细胞以防止双峰生长。除了L-阿拉伯糖、任选的木糖(和葡萄糖)的来源作为碳源之外，发酵培养基将还包含经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物如酵母或丝状真菌生长的发酵培养基的组合物是本领域众所周知的。
发酵时间可以比相同条件下的常规发酵更短，其中酶促水解的一部分仍然需要在发酵过程中进行。在一个实施方案中，对于50g/l葡萄糖和来自碳水化合物材料的相应其它糖(例如50g/l木糖、35g/l L-阿拉伯糖和10g/l半乳糖)的糖组合物，发酵时间为100小时或更短、90小时或更短、80小时或更短、70小时或更短或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，发酵时间可以相应地减少。在一个实施方案中，乙醇产生步骤的发酵时间对于由C6糖制得的乙醇为10至50小时，而对于由C5糖制得的乙醇为20至100小时。在一个实施方案中，琥珀酸生产步骤的发酵时间为20至70小时。
发酵过程可以是需氧或厌氧发酵过程。厌氧发酵过程在本文中被定义为在不存在氧或其中基本不消耗氧、优选消耗小于5、2.5或1mmol/L/h、更优选消耗0mmol/L/h(即，耗氧量是不可检测的)并且其中有机分子同时充当电子供体和电子受体的情况下运行的发酵过程。在没有氧的情况下，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能通过氧化磷酸化被氧化。为了解决这个问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，由此再生NAD+。因此，在一个优选的厌氧发酵过程中，丙酮酸用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产品，如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方案中，发酵过程是厌氧的。厌氧过程是有利的，因为它比需氧过程便宜：需要较少的特殊设备。此外，预期厌氧过程会比需氧过程得到更高的产品收率。在需氧条件下，通常生物质收率比在厌氧条件下的更高。因此，通常在有氧条件下，预期的产品收率比在厌氧条件下的更低。
在另一个实施方案中，发酵过程是在氧受限条件下进行的。更优选地，发酵过程是需氧的并且在氧受限条件下进行的。氧受限发酵过程是其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移限制的过程。氧限制的程度由进入的气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性决定。优选地，在氧受限条件下的过程中，氧消耗的速率为至少5.5mmol/L/h、更优选为至少6mmol/L/h并且甚至更优选至少7mmol/L/h。
在一个实施方案中，醇发酵过程是厌氧的，而有机酸发酵过程是需氧的，但在氧受限条件下进行。
发酵过程优选在对于所用微生物是最佳的温度进行。因此，对于大多数酵母或真菌细胞，发酵过程在低于42℃、优选38℃或更低的温度进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，发酵过程优选在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度并且在高于20℃、22℃或25℃的温度进行。在一个实施方案中，醇发酵步骤和有机酸发酵步骤在25℃至35℃之间进行。
在一个实施方案中，发酵是利用发酵微生物进行的。在一个实施方案中，C5糖的醇(例如乙醇)发酵是利用C5发酵微生物进行的。在一个实施方案中，C6糖的醇(例如乙醇)发酵是利用C5发酵微生物或商业C6发酵微生物进行的。适用于乙醇生产的商购可得酵母包括但不限于BIOFERMTMAFT和XR(NABC-北美生物制品公司(NorthAmerican BioproductsCorporation)，GA，USA)、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre，USA)、FALITM(Fleischmann′s Yeast，USA)、FERMIOLTM(DSM Food Specialties)、GERT STRANDTM(GertStrandAB，Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology，WI，USA)。
在一个优选的实施方案中，发酵产品是醇并且发酵微生物是能够发酵至少一种C5糖的产醇微生物。
在一个实施方案中，产醇微生物和/或产有机酸微生物的繁殖在一个或多个繁殖反应器中进行。在繁殖之后，可以将产醇微生物和/或产有机酸微生物添加到一个或多个发酵反应器中。可选地，产醇微生物和/或产有机酸微生物的繁殖与通过产醇微生物和/或产有机酸微生物的发酵相结合以分别产生醇和/或有机酸。
在一个实施方案中，产醇微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，它还能够发酵至少一种C6糖。在一个实施方案中，本公开内容还描述了一种用于由纤维素材料制备乙醇的方法，包括以下步骤：(a)进行如本文所述的由纤维素材料制备糖产品的方法，(b)对经酶促水解的纤维素材料进行发酵以产生乙醇；和(c)任选地，回收乙醇。发酵可以利用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行。
在一个实施方案中，产有机酸的微生物是能够发酵至少一种C6糖的微生物。在一个实施方案中，本公开内容描述了一种用于由纤维素材料制备琥珀酸的方法，包括以下步骤：(a)进行如本文所述的由纤维素材料制备糖产品的方法，(b)对经酶促水解的纤维素材料进行发酵以产生琥珀酸；和(c)任选地，回收琥珀酸。发酵可以利用能够发酵至少一种C6糖的微生物进行。
产醇微生物可以是原核生物或真核生物。方法中使用的微生物可以是遗传改造的微生物。合适的产醇生物体的示例是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，汉逊酵母属(Hansenula)，伊萨酵母属(Issatchenkia)诸如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，毕赤酵母属(Pichia)诸如树干毕赤酵母(Pichiastipites)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)诸如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)，假丝酵母属(Candida)诸如拟热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或嗜酸嗜热假丝酵母(Candida acidothermophilum)，菅囊酵母属(Pachysolen)诸如嗜鞣菅囊酵母(Pachysolen tannophilus)；或者细菌，例如乳杆菌属(Lactobacillus)诸如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，地芽孢杆菌属(Geobacillus)，发酵单胞菌属(Zymomonas)诸如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，梭菌属(Clostridium)诸如Clostridiumphytofermentans，埃希菌属(Escherichia)诸如大肠杆菌(E.coli)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)诸如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在一个实施方案中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方案中，酵母属于酵母菌属，优选酿酒酵母种。用于本文所述方法中的酵母(例如酿酒酵母)能够转化己糖(C6)糖和戊糖(C5)糖。用于本文所述方法中的酵母(例如酿酒酵母)可以厌氧地发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除了葡萄糖之外，酵母还能够厌氧地使用L-阿拉伯糖和木糖。在一个实施方案中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化为所需的发酵产品，例如转化为乙醇。能够由L-阿拉伯糖产生乙醇的生物体，例如酿酒酵母菌株，可以通过从合适来源引入araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖乙醛酸)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来修饰宿主酵母而生产。可以将这样的基因引入到宿主细胞中以使其能够利用阿拉伯糖。这样的方法在WO2003/095627中有所描述。可以使用来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araA、araB和araD基因，并且在WO2008/041840中公开。可以使用来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的araA基因以及来自大肠杆菌(Escherichia coli)的araB和araD基因，并且在EP1499708中公开。在另一个实施方案中，araA、araB和araD基因可以源自棒杆菌属(Clavibacter)、节杆菌属(Arthrobacter)和/或革兰菌属(Gramella)中的至少一种，特别是密执安棒杆菌(Clavibactermichiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和/或凡赛提革兰氏菌(Gramellaforsetii)中的一种，如在WO 2009011591中公开的。在一个实施方案中，酵母可以还包含木糖异构酶基因的一个或多个拷贝和/或木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶的一个或多个拷贝。
酵母可以包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的实例是引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许增加细胞中通过戊糖磷酸途径的通量。在EP1468093和/或WO2006/009434中描述了遗传改造的酵母的示例。
合适的商业酵母的一个示例是RN1016，其是来自荷兰DSM的木糖和葡萄糖发酵酿酒酵母菌株。
在一个实施方案中，用于生产乙醇的发酵过程是厌氧的。厌氧已在本文前面定义。在另一个优选的实施方案中，用于生产乙醇的发酵过程是需氧的。在另一个优选的实施方案中，用于生产乙醇的发酵过程在氧受限条件下进行，更优选在需氧和氧受限条件下进行。氧受限条件已经在本文前面定义。
可选地，对于上述的发酵过程，可以使用至少两种不同的细胞，这意味着这个过程是共发酵过程。如上所述的发酵过程的所有优选实施方案也是这种共发酵过程的优选实施方案：发酵产品的身份、L-阿拉伯糖来源和木糖来源的身份、发酵条件(需氧或厌氧条件、氧受限条件、进行该过程的温度、乙醇的生产率、乙醇的收率)。
产有机酸微生物可以是原核生物或真核生物。方法中使用的微生物可以是遗传改造的微生物。合适的产有机酸生物体的实例是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)，诸如酿酒酵母；真菌，例如曲霉属(Aspergillus)菌株，诸如黑曲霉(Aspergillus niger)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，雪白丝衣霉(Byssochlamys nivea)，虎皮香菇(Lentinusdegener)，苑氏拟青霉(Paecilomyces varioti)和葡萄青霉(Penicillium viniferum)；以及细菌，例如产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheisucciniciproducers)MBEL 55E、大肠杆菌、丙酸杆菌(Propionibacterium)种、梳状菌属(Pectinatus sp.)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)如嗜淀粉拟杆菌(Bacteroidesamylophilus)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、反刍瘤胃亚菌(Prevotellaruminicola)、溶淀粉琥珀酸单胞菌(Succcinimonas amylolytica)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinisolvens)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)和琥珀噬纤维菌(Cytophaga succinicans)。在一个实施方案中，能够发酵至少一种C6糖的产有机酸微生物是酵母。在一个实施方案中，酵母属于酵母属，优选酿酒酵母种。用于如本文所述的有机酸的生产过程中的酵母(例如酿酒酵母)能够转化己糖(C6)糖。用于如本文所述方法中的酵母(例如酿酒酵母)可以厌氧地发酵至少一种C6糖。
可以减少总反应时间(或水解步骤和发酵步骤一起的反应时间)。在一个实施方案中，90％葡萄糖收率的总反应时间为300小时或更短、200小时或更短、150小时或更短、140小时或更短、130小时或更短、120小时或更短、110小时或更短、100小时或更短、90小时或更短、80小时或更短、75小时或更短或约72小时。相应地，可以以较低的葡萄糖收率达到较短的总反应时间。
可以通过如本文所述的方法生产的发酵产品可以是源自发酵的任何物质。它们包括但不限于醇(如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃(如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃(如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；以及气体(如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(C02)和一氧化碳(CO))。发酵产品还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。在一个优选的实施方案中，有机酸和/或醇在如本文所述的发酵过程中制备。在一个优选的实施方案中，琥珀酸和/或乙醇在如本文所述的发酵过程中制备。优选地，发酵产品是醇，优选乙醇。
发现了多种纤维素材料的如本文所述的有益效果，并且因此认为该有益效果对于所有种类的纤维素材料的水解都存在。发现了多种酶的有益效果，并且因此认为该有益效果对于所有类型的水解酶组合物都存在。
在一个实施方案中，如在本文所述的方法中使用的酶组合物包含至少一种纤维素酶和/或至少一种半纤维素酶。
在一个实施方案中，如在本文所述的方法中使用的酶组合物是真菌的完整发酵液的形式。
在一个实施方案中，如在本文所述的方法中使用的酶组合物包含β-葡糖苷酶(BG)、内切葡聚糖酶(EG)、裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、纤维二糖水解酶(CBH)、β-木糖苷酶和内切木聚糖酶(EX)。
内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣多糖或谷物β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷键被内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4，并且也可能能够水解还含有1，3-键的β-D-葡聚糖中的1，4-键。内切葡聚糖酶也可以称为纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1，4-内切葡聚糖水解酶、β-1，4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1，4-β-D-葡聚糖酶、内切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶或内切1，4-β-葡聚糖酶。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切葡聚糖酶中的至少一种是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。在酶组合物中存在更多的内切葡聚糖酶的情况下，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶或者GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一个优选的实施方案中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶。GH分类可以在CAZy网站上找到。
在一个实施方案中，酶组合物包含内切葡聚糖酶，其来自木霉属(Trichoderma)，如里氏木霉(Trichoderma reesei)；来自曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)或白曲霉(Aspergillus kawachii)；来自欧文氏菌属(Erwinia)，例如软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；来自镰刀菌属(Fusarium)，如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；来自梭孢壳属(Thielavia)，如太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)；来自腐质霉属(Humicola)，如灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var：thermoidea)或特异腐质霉(Humicola insolens)；来自Melanocarpus，如Melanocarpusalbomyces；来自脉孢菌属(Neurospora)，如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；来自毁丝霉属(Myceliophthora)，如嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；来自枝鼻菌属(Cladorrhinum)，如多生枝鼻菌(Cladorrhinumfoecundissimum)；和/或来自金孢子菌属(Chrysosporium)，如勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)菌株。在一个实施方案中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于，解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655、WO 00/70031、WO 05/093050)；褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；以及褐色嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
在一个实施方案中，内切葡聚糖酶是热稳定的内切葡聚糖酶。如本文所使用的“热稳定的”内切葡聚糖酶意指当在10至30分钟之间测量活性时，内切葡聚糖酶具有在45℃至90℃范围内的最佳温度。热稳定的内切葡聚糖酶可以例如从嗜热或耐热真菌分离，或者可以由技术人员设计并人工合成。在一个实施方案中，热稳定的内切葡聚糖酶可以从嗜热或耐热丝状真菌分离或获得，或者从非嗜热或非耐热真菌分离，但被发现是热稳定的。在一个实施方案中，热稳定的内切葡聚糖酶是真菌的。在一个实施方案中，热稳定的内切葡聚糖酶从嗜热或耐热真菌获得。“嗜热真菌”是指在45℃或更高的温度生长的真菌。“耐热”真菌是指在20℃或更高的温度(具有接近55℃的最高温度)生长的真菌。
在一个实施方案中，热稳定的内切葡聚糖酶从以下属的真菌获得，包括但不限于腐质霉属、根毛霉属(Rhizomucor)、毁丝霉属、踝节菌属(Rasamsonia)、篮状菌属(Talaromyces)、青霉菌属(Penicillium)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、曲霉属、柱顶孢霉属(Scytalidium)、拟青霉属(Paecilomyces)、毛壳菌属(Chaetomium)、束梗孢属(Stibella)、棒囊壳属(Corynascus)、畸枝霉属(Malbranchea)或梭孢壳属。这些属的优选物种包括但不限于灰腐质霉高温变种、疏绵毛状腐质霉(Humicolalanuginosa)、透明嗜热腐殖霉菌(Humicola hyalothermophilia)、嗜热毁丝霉、黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea)、Rasamsonia byssochlamydoides、埃默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)、Rasamsonia argillacea、Rasamsonia eburnean、Rasamsoniabrevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、杆孢篮状菌(Talaromyces bacillisporus)、莱色篮状菌(Talaromyces leycettanus)、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lenuginosus)、星状嗜热丝孢菌(Thermomyces stellatus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)、嗜热栖热菌(Thermoascus thermophilus)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、柱孢青霉(Penicillium cylindrosporum)、土曲霉、烟曲霉、嗜热色串孢(Scytalidium thermophilum)、丝衣霉状拟青霉(Paecilomycesbyssochlamydoides)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、橄榄色毛壳菌(Chaetomium olivicolor)、嗜热束梗孢(Stibella thermophila)、瘤孢棒囊壳(Corynascus sepedonium)、樟绒枝霉(Malbranchea cinnamonmea)和太瑞斯梭孢壳霉。
在一个优选的实施方案中，热稳定的内切葡聚糖酶从踝节菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属或青霉菌属的真菌获得。
如本文所使用的，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端的非还原性β-D-葡萄糖残基的水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可以对于β-D-葡糖苷具有广泛的特异性并且还可以水解以下中的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可被称为苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
在一个实施方案中，酶组合物包含来自曲霉属的β-葡糖苷酶，诸如米曲霉(Aspergillus oryzae)，如在WO 02/095014中公开的米曲霉，或在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或者烟曲霉，如在WO 2005/047499中作为SEQ ID NO：2或在WO 2014/130812中作为SEQ ID NO：5公开的烟曲霉，或者烟曲霉β-葡糖苷酶变体，如在WO 2012/044915中公开的变体，如具有以下替换的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO：5进行编号)，或者棘孢曲霉、黑曲霉或白曲霉。在另一个实施方案中，β-葡糖苷酶源自青霉菌属，如在WO 2007/019442中作为SEQ ID NO：2公开的巴西青霉(Penicillium brasilianum)，或源自木霉属，如里氏木霉，如在US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554、US 2004/0102619中描述的那些。在一个实施方案中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方案中，β-葡糖苷酶源自太瑞斯梭孢壳霉(WO 2011/035029)或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)(WO2007/019442)。在一个优选的实施方案中，酶组合物包含来自踝节菌属，如埃默森罗萨氏菌的β-葡糖苷酶(参见WO 2012/000886或WO 2012/000890)。
如本文所使用的，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1，4-β-D-糖苷键水解(从而从链的末端释放纤维二糖)的任何多肽。这种酶也可被称为纤维素酶1，4-β-纤维二糖苷酶、1，4-β-纤维二糖水解酶、1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、外切-1，4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在一个实施方案中，纤维二糖水解酶是纤维二糖水解酶I如GH7纤维二糖水解酶I。
在一个优选的实施方案中，纤维二糖水解酶I从踝节菌属、篮状菌属、曲霉属、木霉属或青霉菌属的真菌获得。在一个优选的实施方案中，纤维二糖水解酶I从埃默森罗萨氏菌、埃默森篮状菌、莱色篮状菌、烟曲霉、里氏木霉或埃默森青霉物种的真菌获得。
在一个实施方案中，酶组合物包含来自曲霉属如烟曲霉的纤维二糖水解酶I，如WO2011/057140中的SEQ ID NO：6或WO 2014/130812中的SEQ ID NO：6中所公开的Cel7ACBHI，或者CBHI如在WO 2013/028928或WO 2015/081139中所公开的那些；来自木霉属，如里氏木霉；来自毛壳菌属，如嗜热毛壳菌；来自篮状菌属，如莱色篮状菌(例如，如在WO 2015/187935或WO 2016/082771中所公开的那些)，或来自青霉菌属，如埃默森青霉(例如，如在WO2011/057140中所公开的那些)。在一个优选的实施方案中，酶组合物包含来自踝节菌属如埃默森罗萨氏菌的纤维二糖水解酶I(参见WO 2010/122141)。
在一个实施方案中，如在本文所述的方法中使用的酶组合物可以包含半纤维素酶。如本文所述的，本公开内容的酶组合物优选包含半纤维素酶。应理解“一种半纤维素酶”是指“至少一种半纤维素酶”。因此，本公开内容的酶组合物可以包含多于一种的半纤维素酶。在一个实施方案中，半纤维素酶包括β-木糖苷酶和/或内切木聚糖酶。
如本文所使用的，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1，4-β-D-木聚糖水解以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可以水解木二糖。β-木糖苷酶也可被称为木聚糖1，4-β-木糖苷酶、1，4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1，4-β-木糖苷酶或木二糖酶(xylobiase)。
在一个实施方案中，β-木糖苷酶包括GH3 β-木糖苷酶。这意味着酶组合物中的β-木糖苷酶中的至少一种是GH3 β-木糖苷酶。在一个实施方案中，酶组合物中的所有μ-木糖苷酶都是GH3 β-木糖苷酶。
在一个实施方案中，酶组合物包含来自粗糙脉孢菌、烟曲霉或里氏木霉的β-木糖苷酶。在一个优选的实施方案中，酶组合物包含来自踝节菌属如埃默森罗萨氏菌的β-木糖苷酶(参见WO 2014/118360)。
如本文所使用的，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷键被内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切-1，4-β-木聚糖酶或1，4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。一种可选方案是EC 3.2.1.136，一种葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中的1，4木糖苷键的酶。
在一个实施方案中，内切木聚糖酶包括GH10木聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切木聚糖酶中的至少一种是GH10木聚糖酶。在一个实施方案中，酶组合物中的所有内切木聚糖酶都是GH10木聚糖酶。
在一个实施方案中，酶组合物包含来自棘孢曲霉(参见WO 94/21785)、烟曲霉(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO 2011/041405)、青霉菌属(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳霉NRRL 8126(参见WO 2009/079210)、莱色篮状菌、褐色嗜热裂孢菌或囊状长毛盘菌GH10(参见WO 2011/057083)的内切木聚糖酶。在一个优选的实施方案中，酶组合物包含来自踝节菌属如埃默森罗萨氏菌(参见WO 02/24926)的内切木聚糖酶。
如本文所使用的，裂解性多糖单加氧酶是最近被CAZy归类在家族AA9(辅助活性家族9)或家族AA10(辅助活性家族10)中的酶。因此，存在AA9裂解性多糖单加氧酶和AA10裂解性多糖单加氧酶。裂解性多糖单加氧酶能够打开结晶葡聚糖结构并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解性多糖单加氧酶也可以影响纤维寡糖。根据最新文献，(参见Isaksen等人，Journal ofBiological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)的蛋白质是裂解性多糖单加氧酶。GH61最初基于对在一个家族成员中极弱的内切-1，4-β-d-葡聚糖酶活性的测量被归类为内切葡聚糖酶，但最近被CAZy重新归类到家族AA9中。CBM33(家族33碳水化合物结合模块)也是一种裂解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等人，Journal ofBiological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)。CAZy最近将CBM33重新归类到家族AA10中。
在一个实施方案中，裂解性多糖单加氧酶包括AA9裂解性多糖单加氧酶。这意味着酶组合物中的裂解性多糖单加氧酶中的至少一种是AA9裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方案中，酶组合物中的所有裂解性多糖单加氧酶都是AA9裂解性多糖单加氧酶。
在一个实施方案中，酶组合物包含来自嗜热子囊菌属如橙色嗜热子囊菌的裂解性多糖单加氧酶，如在WO 2005/074656中作为SEQ ID NO：2并且在WO2014/130812和WO 2010/065830中作为SEQ ID NO：1描述的酶；或来自梭孢壳属，如太瑞斯梭孢壳霉，如在WO 2005/074647中作为SEQ ID NO：8或在WO2014/130812和WO 2008/148131以及WO 2011/035027中作为SEQ ID NO：4描述的酶；或来自曲霉属，如烟曲霉，如在WO 2010/138754中作为SEQ IDNO：2或在WO2014/130812中作为SEQ ID NO：3描述的酶；或来自青霉菌属(Penicillium)，例如埃默森青霉，如在WO 2011/041397中作为SEQ ID NO：2或在Wo2014/130812中作为SEQ IDNO：2公开的酶。其它合适的裂解性多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(参见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉(参见WO 2011/005867)，嗜热子囊菌属(参见WO 2011/039319)和坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(参见WO 2011/041504)。可以包含在酶组合物中的其它纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/11 7432、WO 2007/071818、WO 2007/071 820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593(仅举几例)。在一个优选的实施方案中，裂解性多糖单加氧酶来自踝节菌属，例如埃默森罗萨氏菌(参见WO 2012/000892)。
在一个实施方案中，酶组合物包含来自曲霉属如烟曲霉的纤维二糖水解酶II，如在WO 2014/130812中的SEQ ID NO：7的酶；或者来自木霉属如里氏木霉的纤维二糖水解酶II；或来自篮状菌属如莱色篮状菌的纤维二糖水解酶II；或来自梭孢壳属如太瑞斯梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II，如来自太瑞斯梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。在一个优选的实施方案中，酶组合物包含来自踝节菌属例如埃默森罗萨氏菌的纤维二糖水解酶II(参见WO 2011/098580)。
酶组合物优选包含至少两种活性，尽管组合物通常会包含多于两种的活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。酶组合物可以包含多于一种的酶活性/活性类别。酶组合物可以包含一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在一个实施方案中，酶组合物包含至少两种纤维素酶。如本文所使用的，纤维素酶是能够降解或修饰纤维素的任何多肽。至少两种纤维素酶可以含有相同或不同的活性。酶组合物可以还包含至少一种不同于纤维素酶的酶，例如半纤维素酶或果胶酶。如本文所使用的，半纤维素酶是能够降解或修饰半纤维素的任何多肽。如本文所使用的，果胶酶是能够降解或修饰果胶的任何多肽。至少一种其它酶可以具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的附加活性。本文提到了这样的辅助活性的示例。
在一个实施方案中，如本文所述的酶组合物包含一类、两类、三类、四类或更多种类的纤维素酶，例如内切葡聚糖酶、裂解性多糖单加氧酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II和β-葡糖苷酶中的一种、两种、三种或四种或者全部。
在一个实施方案中，如在如本文所述的方法中使用的酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、裂解性多糖单加氧酶、纤维二糖水解酶II、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶和内切木聚糖酶。
在一个实施方案中，酶组合物还包含一种或多种以下提及的酶。
如本文所使用的，β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1，3-键和1，4-键的β-D-葡聚糖中的1，4-β-D-糖苷键的水解的任何多肽。这样的多肽可以作用于地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖，但不作用于仅含有1，3-键或1，4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可被称为地衣多糖酶、1，3-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1，3-1，4葡聚糖酶、地衣多糖酶或混合键β-葡聚糖酶。这种类型的酶的替代品是EC 3.2.1.6，其被描述为内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶。当葡萄糖残基(其还原基团涉及待水解的键)本身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1，3-键或1，4-键。可选名称包括内切-1，3-β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、1，3-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖。
如本文所使用的，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)(EC3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。可以包含在酶组合物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO2009/073383)和巨多孔菌(M giganteus)(参见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
如本文所使用的，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸。这种酶也可被称为α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷醛酸酶。这些酶也可以水解4-O-甲基化葡萄糖醛酸，其也可以作为木聚糖中的取代基存在。替代品是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1，2-葡糖醛酸苷酶，其催化α-1，2-(4-O-甲基)葡糖醛酰基键的水解。可以包含在酶组合物中的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的α-葡糖醛酸糖苷酶：棒曲霉(Aspergillus clavatus)、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、特异腐质霉(参见WO 2010/014706)、金灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(参见WO 2009/068565)和里氏木霉。
如本文所使用的，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和低聚木糖的脱乙酰化的任何多肽。这样的多肽可以催化来自聚合物木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯或对硝基苯基乙酸酯(但通常不是来自三乙酰甘油)的乙酰基的水解。这样的多肽通常不作用于乙酰化甘露聚糖或果胶。可以包含在酶组合物中的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于来自以下的乙酰木聚糖酯酶：棘孢曲霉(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(参见WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(Myceliophtera thermophila)(参见WO 2010/014880)、粗糙脉孢菌、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)和太瑞斯梭孢壳霉NRRL 8126(参见WO 2009/042846)。在一个优选的实施方案中，酶组合物包含来自踝节菌属如埃默森罗萨氏菌(参见WO 2010/000888)的乙酰木聚糖酯酶。
如本文所使用的，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酰-糖+H2O＝阿魏酸+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。它通常可以催化来自酯化糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团的水解，该酯化糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲酯通常是较差的底物。这种酶也可被称为肉桂酰水解酶、阿魏酰酯酶或羟基肉桂酰酯酶。它也可被称为半纤维素酶辅助酶，因为它可以帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁的半纤维素和果胶。可以包含在酶组合物中的阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)的实例包括但不限于来自以下的阿魏酸酯酶：特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌、金灰青霉(参见WO2009/127729)和太瑞斯梭孢壳霉(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)。
如本文所使用的，香豆酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰-糖+H(2)O＝香豆酸+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可被称为反式-4-香豆酰酯酶、反式-对香豆酰酯酶、对香豆酰酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也属于EC3.1.1.73，所以也可被称为阿魏酰酯酶。
如本文所使用的，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中的末端非还原性α-D-半乳糖残基的水解的任何多肽。这样的多肽也可能能够水解α-D-岩藻糖苷。这种酶也可被称为蜜二糖酶。
如本文所使用的，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中的末端非还原性β-D-半乳糖残基的水解的任何多肽。这样的多肽也可能能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可被称为外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所使用的，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1，4-β-D-甘露糖苷键的随机水解的任何多肽。这种酶也可被称为甘露聚糖内切-1，4-β-甘露糖苷酶或内切-1，4-甘露聚糖酶。
如本文所使用的，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中的末端非还原性β-D-甘露糖残基的水解的任何多肽。这种酶也可被称为甘露聚糖酶(mannanase)或聚甘露糖酶(mannase)。
如本文所使用的，内切-聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸和其它半乳糖醛酸聚糖中的1，4-α-D-半乳糖苷醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可被称为聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶(pectinase)、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1，4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所使用的，果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化以下反应的任何酶：果胶+n H2O＝n甲醇+果胶酸。该酶也可被称为果胶酯酶、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲酯酶、果胶酶、果胶酯酶或果胶甲酯水解酶(pectin pectylhydrolase)。
如本文所使用的，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中的1，4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。该酶也可被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶、内切-1，4-β-半乳聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳糖水解酶。
如本文所使用的，果胶乙酰酯酶在本文中被定义为具有乙酰酯酶活性的任何酶，其催化果胶的GalUA残基的羟基基团处的乙酰基基团的脱乙酰化。
如本文所使用的，内切果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲酯的消除性裂解以产生在其非还原端处具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-烯醛酸糖基基团的寡糖的任何酶。该酶也可被称为果胶裂解酶、果胶反式-消去酶；内切-果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛酸反式消去酶、果胶甲基反式消去酶、果胶裂解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所使用的，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性裂解以产生在其非还原端处具有4-脱氧-α-D-半乳-4-烯醛酸基糖基基团的寡糖的任何酶。该酶也可以是已知的聚半乳糖醛酸反式消去酶、果胶酸反式消去酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、内切果胶甲基反式消去酶、果胶酸反式消去酶、内切半乳糖醛酸反式消去酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1，4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PPase-N、内切-α-1，4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式-消去酶、聚半乳糖醛酸反式-消去酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所使用的，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷中或鼠李半乳糖醛酸聚糖中的末端非还原性α-L-鼠李糖残基的水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所使用的，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原端水解果胶酸(从而释放二半乳糖醛酸)的任何多肽。该酶也可被称为外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶、外切聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切聚半乳糖醛酸酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所使用的，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下反应的任何多肽：(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1，4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸。该酶也可被称为半乳糖醛酸聚糖1，4-α-半乳糖醛酸苷酶、外切聚半乳糖醛酸酶、聚(半乳糖醛酸)水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶、外切聚-D-半乳糖醛酸酶或聚(1，4-a-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所使用的，外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯果胶)的还原端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳糖-4-烯醛酸糖基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶可被称为果胶酸二糖-裂解酶、果胶酸外切-裂解酶、外切果胶酸反式消去酶、外切果胶酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸-反式-消去酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原-端-二糖-裂解酶。
如本文所使用的，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构(由二糖[(1，2-a-L-鼠李糖酰-(1，4)-a-半乳糖醛酸]组成)中以内切-方式水解半乳糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间的键的任何多肽。
如本文所使用的，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够通过β-消除以内切方式切割鼠李半乳糖醛酸聚糖中的α-L-Rhap-(1→4)-a-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所使用的，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶是催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中的交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基的主链的脱乙酰化的任何多肽。
如本文所使用的，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切-方式从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所使用的，木糖半乳糖醛酸酶是通过以内切-方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木糖半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木糖半乳糖醛酸聚糖水解酶。
如本文所使用的，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所使用的，内切-阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1，5-阿拉伯聚糖中的1，5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可被称为内切-阿拉伯糖酶、阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶、内切-α-1，5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1，5-a-L-阿拉伯聚糖1，5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽与其它部分如糖之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶在EC 3.4下进行表征，并且适用于本文所述的方法。一些具体类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等)的酶。在植物中，脂质被用作结构成分以限制水分流失和病原体感染。这些脂质包括衍生自脂肪酸的蜡质，以及角质和软木脂。
“木质素酶”包括可以水解或分解木质素聚合物的结构的酶。可以分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，以及本领域中描述的已知用于解聚或以其它方式破坏木质素聚合物的其它酶。还包括能够水解在半纤维素糖(尤其是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下酶的组：木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应但也可以催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以使用的己糖基转移酶的一个示例是β-葡聚糖基转移酶。这样的酶可能能够催化(1，3)(1，4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡醛酸苷酶”包括催化葡糖醛酸苷例如β-葡糖醛酸糖苷的水解以产生醇的酶。许多葡糖醛酸苷酶已被表征并可能适合使用，例如β-葡糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.31)、透明质酸-葡糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.36)、葡萄糖醛酸-二磺基葡糖胺葡糖醛酸苷酶(3.2.1.56)、甘草酸β-葡糖醛酸苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.139)。
扩展蛋白(expansin)与植物细胞生长期间的细胞壁结构的松动有关。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键而不具有水解活性。以这种方式，它们被认为允许纤维素纤维的滑动以及细胞壁的扩大。扩张蛋白(Swollenin)(一种扩展蛋白样蛋白)含有N-端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C-端扩展蛋白样结构域。如本文所述的，扩展蛋白样蛋白或扩张蛋白样蛋白可以包含这样的结构域中的一个或二者和/或可以破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地同时不会产生可检测量的还原糖。
纤维素诱导蛋白，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产品(参见Foreman等人，J.Biol.Chem.278(34)，31988-31997，2003)，纤维素/纤维小体整合蛋白，例如cipA或cipC基因的多肽产品，或者支架蛋白或支架蛋白样蛋白。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可以将纤维素裂解性亚基组织成多酶复合物。这是通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域和每个酶促单元上的锚定蛋白结构域)的相互作用实现的，。支架蛋白亚基还带有介导纤维小体与其底物的附接的纤维素结合模块(CBM)。支架蛋白或纤维素整合蛋白可以包含这样的结构域中的一个或二者。
过氧化氢酶；术语“过氧化氢酶”是指催化将两个过氧化氢转化为氧气和两个水的过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)。过氧化氢酶活性可以通过基于以下反应在240nm处监测过氧化氢的降解来确定：2H2O2→2H2O+O2。该反应在25℃利用10.3mM底物(H2O2)和大约100单位酶/ml在50mM磷酸盐pH 7.0中进行。在16-24秒内通过分光光度法监测吸光度，这应对应于从0.45到0.4的吸光度降低。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为pH 7.0和25℃每分钟降解一微摩尔的H2O2。
如本文所使用的，术语“淀粉酶”是指水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉二者)中的α-1，4-糖苷键的酶，如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1，4-α-麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖l，4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖l，4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)，以及水解α-1，6-糖苷键(为支链淀粉中的分支点)的酶，如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和限制糊精酶(EC 3.2.1.142)。
如本文所使用的，葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)是外切葡糖水解酶，其催化α-1，4和α-1，6糖苷键的水解以从淀粉以及相关多糖和寡糖的非还原端释放β-D-葡萄糖。它们也被称为淀粉葡糖苷酶、葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶或1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶。它们催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖。大多数的葡糖淀粉酶是多结构域酶(由通过不同长度的O-糖基化接头区域连接到淀粉结合结构域的催化结构域组成)。如本文所使用的，葡糖淀粉酶还包括α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)。葡糖淀粉酶可以是GH15葡糖淀粉酶、GH31葡糖淀粉酶、GH97葡糖淀粉酶或其任何组合。如本文所述的酶组合物可以包含葡糖淀粉酶。如本文所使用的葡糖淀粉酶属于结构家族GH15、GH31或GH97。葡糖淀粉酶可以是真菌葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以是来自以下的葡糖淀粉酶：曲霉属、木霉属、踝节菌属、青霉菌属、根霉属、嗜热丝孢菌属(仅举几例)。葡糖淀粉酶也可以是工程改造的葡糖淀粉酶，如包含一个或多个突变、缺失和/或插入的变体酶。
酶组合物可以由以上提及的每一类酶的一个成员、一个酶类的若干成员或这些酶类的任何组合组成。如本文所述的酶组合物中的不同酶可以从不同来源获得。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的各组分可以同时提供(即本身作为单一组合物)或分开或顺序提供。
在一个实施方案中，酶组合物中的酶源自真菌，优选丝状真菌，或者酶包含真菌酶，优选丝状真菌酶。在一个实施方案中，一组核心的(木质)纤维素降解酶(即纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)可以源自埃默森罗萨氏菌。如果需要，可以用来自其它来源的额外酶活性来补充这组酶。这样的额外活性可源自经典来源和/或由遗传修饰生物体产生。因此，酶组合物可以包含来自不同于踝节菌属的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。在一个实施方案中，它们可以与一种或多种踝节菌属酶一起使用，或者它们可以在没有额外的踝节菌属酶存在的情况下使用。
“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式(如由Hawksworth等人在安斯沃斯和比斯比的真菌词典(Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi)第8版(1995)，CAB International，University Press，Cambridge，UK中定义的)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长进行的，并且碳分解代谢是必需有氧的。丝状真菌菌株包括但不限于以下的菌株：枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属、拟青霉属、金孢子菌属、麦角菌属(Claviceps)、方定抱腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、翘孢霉属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、毛霉内座壳属(Endothia mucor)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰刀属、Geosmithia、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属、稻温菌属(Magnaporthe)、毛霉属(mucor)、毁丝霉属、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢属(Pyricularia)、踝节菌属、根毛霉属、根霉属、Scylatidium、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属、嗜热子囊菌属、嗜热丝孢菌属、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓孔菌属(Trametes)、木霉属和毛癣菌属(Trichophyton)。
几种丝状真菌菌株在许多培养物保藏中心(如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物GmbH(DSM)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构专利保藏中心北方研究中心(NRRL))中很容易为公众所用。这样的菌株的实例包括黑曲霉CBS513.88、米曲霉ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC 14488-14491、ATCC11601、ATCC 12892、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)CBS 455.95、桔青霉(Penicillium citrinum)ATCC 38065、产黄青霉P2、埃默森篮状菌CBS 393.64、产黄头孢霉(Acremonium chrysogenum)ATCC 36225或ATCC 48272、里氏木霉ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921、酱油曲霉(Aspergillus sojae)ATCC 11906、勒克瑙金孢子菌C1、Garg 27K、VKM F-3500-D、ATCC 44006及其衍生物。
酶(例如以完整发酵液的形式)可以通过利用合适的微生物(例如丝状真菌)发酵合适的底物来制备，其中酶由微生物产生。可以改变微生物以改进或制备酶。例如，可以通过经典的菌株改良程序或通过重组DNA技术来使微生物突变。因此，本文提及的微生物可以原样用于产生酶，或者可以被改变以增加产量或产生改变的酶，其可包括异源酶，例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶，因此酶最初不是由该微生物产生的。优选地，使用真菌、更优选丝状真菌来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，使用诱导由产酶微生物表达酶的底物。
在一个实施方案中，酶组合物是完整发酵液。在一个实施方案中，酶组合物是真菌、优选丝状真菌的完整发酵液，优选踝节菌属的完整发酵液。完整发酵液可以由非重组和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一个实施方案中，丝状真菌是包含一种或多种可以与丝状真菌同源或异源的基因的重组丝状真菌。在一个实施方案中，丝状真菌是包含一种或多种可以与丝状真菌同源或异源的基因的重组丝状真菌，其中一种或多种基因编码可以降解纤维素底物的酶。完整发酵液可以包含本文所述的多肽中的任一种或其任何组合。
优选地，酶组合物是完整发酵液，其中细胞被杀灭，即无活力的。在一个实施方案中，完整发酵液包含多肽、一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基。
通常，在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养丝状真菌。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行培养。适用于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶产生的合适培养基、温度范围和其它条件是本领域已知的。可以通过将丝状真菌生长至稳定期并将丝状真菌在限制碳条件下维持足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段来制备完整发酵液。一旦酶如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶由丝状真菌分泌到发酵培养基中，完整发酵液就可以被使用。完整发酵液可以包含丝状真菌。在一个实施方案中，完整发酵液包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级分离的内容物。通常，完整发酵液包含在丝状真菌生长至饱和、在碳受限制条件下孵育以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)之后存在的用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方案中，完整发酵液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。可以使用本领域已知的方法杀灭完整发酵液中存在的丝状真菌细胞以产生细胞杀灭的完整发酵液。例如，添加有机酸导致细胞的杀灭。如果需要，细胞还可以被裂解和/或透化。在一个实施方案中，完整发酵液是细胞杀灭的完整发酵液，其中含有丝状真菌细胞的完整发酵液被杀灭。换言之，完整发酵液包含比活细胞更多的无活力细胞，优选仅包含无活力细胞。在一些实施方案中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀灭细胞以产生丝状真菌发酵的细胞杀灭的完整发酵液。在一些实施方案中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌并将细胞杀灭的发酵混合物的pH调节至合适的pH来杀灭细胞。在一个实施方案中，将完整发酵液与有机酸混合。
如本文所使用的，术语“完整发酵液”是指通过细胞发酵产生的制品，其不经历或经历最少的回收和/或纯化。例如，完整发酵液是在微生物培养物生长至饱和、碳受限条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)并分泌到细胞培养基中时产生的。通常，完整发酵液是未分级分离的并且包含用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物细胞，优选无活力的细胞。
在一个实施方案中，可以将完整发酵液分级分离，并且可以使用经分级分离的内容物中的一种或多种。例如，可以从完整发酵液中去除被杀灭的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些组分的酶组合物。
完整发酵液可以还包含防腐剂和/或抗微生物剂。这样的防腐剂和/或试剂是本领域已知的。在一个实施方案中，用于杀灭细胞的有机酸可以还具有防腐剂和/或抗微生物剂的功能。
如本文所述的完整发酵液通常是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施方案中，可以去除不溶性组分以提供澄清的完整发酵液。
在一个实施方案中，可以向完整发酵液补充一种或多种不是由丝状真菌内源表达的或以相对低水平表达的酶活性，以促进纤维素底物(例如，针对可发酵糖如葡萄糖或木糖)的降解。可以将补充的一种或多种酶作为补充物添加到完整发酵液中，即将它们掺入到完整发酵液中。额外的酶可以以完整发酵液的形式补充，或者可以作为纯化的或最低限度回收和/或纯化的酶来补充。
在一个实施方案中，完整发酵液可以补充有至少另一种完整发酵液。该另一种完整发酵液可以源自相同类型的真菌或另一种类型的真菌，例如第一种完整发酵液可以源自踝节菌属，而第二种完整发酵液可以源自踝节菌属或曲霉属。
在一个实施方案中，完整发酵液是过表达一种或多种酶以改善纤维素底物的降解的重组丝状真菌发酵的完整发酵液。可选地，完整发酵液是非重组丝状真菌发酵的完整发酵液和过表达一种或多种酶以改善纤维素底物的降解的重组丝状真菌的完整发酵液的混合物。在一个实施方案中，完整发酵液是过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌发酵的完整发酵液。可选地，完整发酵液是非重组丝状真菌发酵的完整发酵液和过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌发酵的完整发酵液的混合物。
在一个实施方案中，如本文所述的酶组合物具有2.0至5.5的pH。优选地，酶组合物具有2.5至5.0的pH。更优选地，酶组合物具有3.0至4.5的pH。因此，酶组合物中的酶能够在低pH工作。
在一个实施方案中，在如本文所述的用于制备酶组合物的方法中使用的一个或多个酶生产反应器的体积为至少1m3。优选地，酶生产反应器的体积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3。一般来说，一个或多个酶生产反应器将小于300m3。
在如本文所述的用于制备酶组合物的方法中，将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)群在适合生长的条件下、在液体或固体培养基中进行培养。在一个实施方案中，将微生物细胞在补料分批培养、分批培养、连续培养或其任何组合中进行培养。优选地，将丝状真菌在补料分批培养中进行培养。本领域技术人员熟知各种培养模式及其条件。在一个实施方案中，培养在需氧条件下进行。本领域技术人员熟知用于需氧培养的发酵罐设计，诸如例如搅拌罐和泡罩塔。
实施例
实施例1
在维素材料的酶促水解期间的木糖酸生产
使用浓度为15％(w/w)干物质的经酸预处理的玉米秸秆进行酶促水解。经酸预处理的玉米秸秆含有占干物质13％(w/w)的总木聚糖(包括不溶性木聚糖、可溶性木聚糖低聚物和木糖)。将经预处理的玉米秸秆用水稀释，并用10％(w/w)NH4OH-溶液将pH调节至pH4.5。使用1.5升反应器以1kg规模进行酶促水解。将pH控制在4.5，并且将酶促水解期间的温度控制在62℃。
根据在WO 2011/000949中描述的接种和发酵程序生产TEC-210。
使用缩二脲法确定TEC210纤维素酶混合物样品的蛋白质浓度。在缩二脲反应中，铜(II)离子被还原为铜(I)，其在碱性溶液中与肽键的氮和碳形成复合物。紫色指示蛋白质的存在。根据Lambert-Beer定律，颜色的强度以及因此在546nm处的吸收与蛋白质浓度成正比。肽在该测定中也有响应，将它们通过对样品进行10kD过滤并从“原样”样品中减去该10kD滤液的结果来排除。
用水(含有0.2g/L吐温80)制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0.5、1、2、5、10和15mg/m1)，以生成校准曲线。将TEC210纤维素酶混合物样品用水适当稀释，以落在BSA校准线的结果内(基于重量)，并以>14000×g离心5分钟。收集每个稀释样品的上清液并进一步称为样品-上清液。接下来，将每个稀释样品的500μL样品-上清液转移到含有10kD过滤器的离心反应管中，并在15-20℃离心按所需的那么长时间，以获得至少200μL的滤液，将其进一步称为样品-上清液-10kD滤液。
从所有样品-上清液、样品-上清液-10kD滤液和BSA稀释液中，将200μL转移到1.5mL反应管中，向其中添加800μL BioQuant缩二脲试剂并充分混合。接下来，将所有的混合物在室温下孵育至少30分钟。在546nm处测量混合物的吸收，其中水样品用作空白测量。使用在546nm处给出在BSA校准线范围内的吸收值的TEC-210纤维素酶混合物样品的稀释液，经由BSA校准线来计算样品的总蛋白质浓度。从样品-上清液中测得的蛋白质浓度减去样品-上清液-10kD滤液中测得的蛋白质浓度，以得到TEC-210纤维素酶混合物样品中的最终蛋白质浓度。
接下来，将纤维素酶混合物TEC210以2.5mg(蛋白质)/g干物质的剂量添加到经预处理的玉米秸秆中。所有反应器在氮气层下以150rpm的搅拌器速度操作前6小时，以液化粘性给料(以100mL/min的速率用氮气连续冲洗反应器的顶部空间)。在6小时之后，用空气流(100mL/min)代替氮气流，并且继续水解66小时，从而导致72小时的总水解时间。
通过搅拌器速度(这控制了氧从反应器的顶部空间到反应混合物中的引入)控制反应混合物中的氧浓度。向反应器的顶部空间连续供应新鲜空气(含有20-21％的氧)以确保顶部空间中存在足够的氧。不同反应器中的搅拌器速度为100-120-140-170-200rpm。与这些搅拌器速度值相对应的在酶促水解期间的估算氧浓度为100rpm(0.0002-0.002molO2/m3)-120rpm(0.002-0.016mol O2/m3)-140rpm(0.016-0.047mol O2/m3)-170rpm(0.047-0.078mol O2/m3)-200rpm(0.078-0.109mol O2/m3)，其中未测量氧浓度，而是基于之前的实验估算的。
对照实验在氮气层下以150rpm的搅拌器速度进行，以尽可能多地排除氧。
在实验期间抽取时间样品以测量葡萄糖和木糖酸的量。将样品立即以4000×g离心8分钟。上清液通过0.20μm尼龙过滤器过滤，并且将滤液在4℃储存直至分析。根据NREL技术报告NREL/TP-510-42623(2008年1月)，使用配备有Aminex HPX-87H柱的HPLC来测量样品的葡萄糖浓度。
使用利用(A)Milli-Q净化水和(B)5mM NaOH、(C)100mM NaOH作为流动相的梯度洗脱，利用配备有IonPacAS11-HC柱(2.0×250mm)(Thermo Fisher)、配备有IonPac AG11-HC保护柱(2×50mm)(Thermo Fisher)的ICS3000双重LC系统(Thermo Fisher)来进行木糖酸的定量。梯度以80％A和20％B开始，持续8分钟，接着在10分钟内线性增加到85％A和15％C，并在10分钟内线性增加到70％A和30％C。随后，梯度在1分钟内回到起始条件，并平衡10分钟。将流速保持在0.38ml/min(使用25μl的注射体积)，并且将柱温设置为30℃。检测是在抑制电导率的情况下进行的，并且木糖酸在tr＝7.0min时洗脱。
使用D-木糖酸钙盐(Santa Cruz Biotechnology)和外部校准来确定木糖酸浓度。通过从在t＝72小时测量的浓度减去在t＝6小时测量的浓度来计算在通气期间产生的木糖酸的量。然后通过用将产生的木糖酸量除以产生这个量所花费的小时数(即66小时(72小时-6小时))来计算产生速度，并将其表示为每小时每升水解产物产生的μmol木糖酸(μmol/L/h)。接下来，如下计算在1小时内产生的以μmol/kg木聚糖计的木糖酸量：
木糖酸(μmol/L/h)×(颗粒因子/密度)/木聚糖(kg/kg水解产物)
其中使用的颗粒因子(pellet factor)为0.947，密度为1.044kg/L并且木聚糖为0.019kg/kg的15％干物质水解产物。
结果在表1中呈现，并且清楚地表明，当在氧添加期间产生每小时500-1100μmol木糖酸/kg木聚糖时，获得了高葡萄糖释放。
表1：在72小时后的葡萄糖释放和在纤维素材料的酶促水解过程中的木糖酸产生速度。
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Claims (13)

1.一种用于由纤维素材料制备糖产品的方法，包括以下步骤：
a)使用酶组合物对所述纤维素材料进行酶促水解以获得糖产品，其中在所述酶促水解的至少一部分期间添加氧，所述氧的添加量为每小时在所述纤维素材料中以500至1100μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸，和
b)任选地，回收所述糖产品。
2.一种用于由纤维素材料制备发酵产品的方法，包括以下步骤：
a)使用酶组合物对所述纤维素材料进行酶促水解以获得糖产品，其中在所述酶促水解的至少一部分期间添加氧，所述氧的添加量为每小时在所述纤维素材料中以500至1100μmol木糖酸/kg木聚糖的量形成木糖酸，
b)对经水解的纤维素材料进行发酵以产生发酵产品，和
c)任选地，回收所述发酵产品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述酶促水解之前对所述纤维素材料进行预处理。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶促水解中的干物质含量为10％至40％(w/w)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述酶组合物为真菌的完整发酵液的形式。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中用于所述酶促水解的反应器具有1m3或更大的体积。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中用于所述酶促水解的反应器具有50m3或更大的体积。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述酶促水解在50℃至70℃的温度进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述酶促水解在分批、补料分批和/或连续培养反应器中发生。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中添加氧以在所述酶促水解期间维持0.0002-0.047mol O2/m3的氧浓度。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述酶组合物包含至少一种纤维素酶和/或至少一种半纤维素酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述酶组合物包含β-葡糖苷酶(BG)、内切葡聚糖酶(EG)、裂解性多糖单加氧酶(LPMO)、纤维二糖水解酶(CBH)、β-木糖苷酶和内切木聚糖酶(EX)。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中所述发酵利用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行。
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