CN114350694A

CN114350694A - L-鸟氨酸生产菌及其构建方法

Info

Publication number: CN114350694A
Application number: CN202111431973.7A
Authority: CN
Inventors: 曹华杰; 岳明瑞; 谢沛; 郭永胜
Original assignee: Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Current assignee: Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114350694B

Abstract

本发明公开了一种L‑鸟氨酸生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；(2)将pQE‑N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE‑N上，获得重组表达载体；(3)将步骤(2)获得的重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L‑鸟氨酸生产菌。本发明在构建L‑鸟氨酸生产菌时，对L‑鸟氨酸代谢途径进行综合分析，通多个技术手段的组合使用，使得更多的碳源流向L‑鸟氨酸，从而显著提高了L‑鸟氨酸的产量。

Description

L-鸟氨酸生产菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种L-鸟氨酸生产菌及其构建方法。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)是细菌细胞膜和多肽类抗生素的组成成分，在生物体内，是尿酸循环的中间产物，对维持体内的氮平衡有重要作用。近年来，鸟氨酸的应用日益广泛，如在医药上可以与精氨酸一起用作保肝、强身、解毒剂类药剂的原料，在食品上可用于配制恢复疲劳的发泡饮料，其需求量也随之不断上升。

采用微生物发酵法制备L-鸟氨酸为近年来主要采用的制备工艺之一，它大大拓宽了L-鸟氨酸来源，推动了L-鸟氨酸的研究和应用。目前的相关研究主要集中在菌种选育和培养基优化上。其中，对于L-鸟氨酸生产菌株的研究，Shukuo Kinoshita等首先利用紫外、氰化物等传统的诱变技术，获得了谷氨酸棒杆菌瓜氨酸缺陷型突变株，成功的积累了L-鸟氨酸。R.J.Plachy等人选育了谷氨酸棒杆菌L-Arg^-和D-Arg^r的突变株进行发酵，获得了较好的效果，发酵液中积累的L-鸟氨酸达30g/L。

传统的诱变育种技术在L-鸟氨酸菌种改造上获得了极大的成功，但由于其突变的随机性，增加了育种的不确定性。用基因工程技术对菌种进行改造是技术发展的方向。但由于L-鸟氨酸是瓜氨酸和精氨酸生物合成的中间体，其代谢调控过程复杂，L-鸟氨酸难以有效积累。因此，通过基因工程技术构建L-鸟氨酸生产菌仍是目前的技术难点所在。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种L-鸟氨酸生产菌及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种L-鸟氨酸生产菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；

(2)将pQE-N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE-N上，获得重组表达载体(pQE-argA)；

(3)将步骤(2)获得的重组表达载体导入到步骤(1)获得的大肠杆菌工程菌中，即构建得到L-鸟氨酸生产菌。

优选的，步骤(1)中，基因敲除的顺序为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，再敲除sucA、sucB基因，最后敲除iclR、aceA和aceB基因。

上述敲除顺序的好处为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，增加EMP途径→TCA循环的流量；若直接敲除TCA循环中的基因，菌种延滞期会很长，传代时间长，导致构建工程菌的时间增加。另外，在敲除sucA、sucB基因以及iclR、aceA和aceB基因之后，如果菌株长的慢，可以在培养基中加入0.1g/L的琥珀酸，以提高菌株生长速度。因此，采用上述敲除顺序，可以极大缩短大肠杆菌工程菌的构建时间。

本发明虽然敲除了大肠杆菌的多个基因，但对大肠杆菌的生长并未产生明显的负面影响，这主要是因为：本发明选择敲除的基因均不是持家基因，故敲除后虽然延滞期稍有增加，但不会对菌种的生长造成影响。而且通过转种时间和补料，也能缩短延滞期的持续时间。此外，每次敲除之后都会进行传代培养，基本上三-四代后，菌种由于其适应性，菌种会适应这种被敲除基因的状态，初代培养时生长速度缓慢的情况会有明显改善。

优选的，步骤(2)中，质粒pQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)中，argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；作为优选，在将argA基因整合到质粒pQE-N前进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。argA基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，步骤(2)中，所述重组表达载体(pQE-argA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二方面，提供上述方法构建得到的L-鸟氨酸生产菌。

本发明的第三方面，提供上述L-鸟氨酸生产菌在发酵生产L-鸟氨酸中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明在构建L-鸟氨酸生产菌时，首先对L-鸟氨酸代谢途径进行综合分析，通过使用基因敲除方法对EMP途径、三羧酸循环、尿素循环等代谢途径进行了改造，使得更多的碳源流向L-鸟氨酸，从而显著提高了L-鸟氨酸的产量。具体来说：

本发明分别敲除了：

ptsG基因，其编码葡萄糖糖-磷酸转移酶系统II(Glucose phosphotransferasesystem,PtsG)，通过敲除ptsG基因，能够阻止PEP和Glc生成Pyr，并且阻止葡萄糖的不均衡代谢。

poxB基因，编码丙酮酸脱氢酶(Pyruvate oxidase，PoxB)，通过敲除poxB基因，能够阻止Pyr生成Acetate。

Pta基因，编码磷酸转乙酰基酶(Phosphotransacetylase，Pta)，过敲除Pta基因，能够阻止乙酰coA生成Acetate。

iclR基因，编码异柠檬酸裂解酶阻遏物(aceBAKoperon repressor，IclR)，过敲除iclR基因，能够阻止异柠檬酸走向分支。

通过敲除aceA基因(编码isocitrate lyase)和aceB(malate synthase A)基因，能够阻止异柠檬酸生成苹果酸。

sucA基因编码[subunit of E1(0)component of 2-oxoglutaratedehydrogenase]、sucB基因编码(dihydrolipoyltranssuccinylase)，通过敲除sucA和sucB基因，能够阻止α-酮戊二酸生成琥珀酰辅酶A。

argI基因编码(ornithine carbamoyltransferase)，通过敲除argI基因能够阻止鸟氨酸继续代谢，积累鸟氨酸。

(2)本发明还对pQE-60质粒进行了改造，敲除了冗杂序列，增加了目的基因的表达量。敲除质粒中原本有的6-His序列，减小了N-乙酰谷氨酸合酶酶活性的丧失。同时通过代谢通路流量计算进行选择，质粒采用低拷贝质粒，启动子选择T5，在保证菌体正常代谢的情况下尽可能多的积累鸟氨酸。

(3)本发明在敲除上述基因之后，再外源导入argA基因，argA基因编码N-acetylglutamate synthase，中文名N-乙酰谷氨酸合酶，催化谷氨酸生成N-乙酰基氨基甲酸酯，是大肠杆菌中谷氨酸线性生成鸟氨酸代谢途径中的限速酶。通过对argA基因进行过表达，能够解除或降低该酶对鸟氨酸合成速度的影响，提高了整条代谢途径的总速度。

综上，本发明通过上述技术手段的组合，成功构建得到高产L-鸟氨酸的生产菌，显著提高了发酵生产L-鸟氨酸的产量。

附图说明

图1：pQE-60质粒及其改造结构示意图；其中，A为pQE-60质粒的结构示意图；B为改造后的质粒pQE-N的结构示意图。

图2：对基因敲除后的菌株进行验证的结果；图中，A为poxB基因敲除验证结果，B为Pta基因敲除验证结果，C为ptsG基因敲除验证结果，D为argI基因敲除验证结果，E为sucA基因敲除验证结果，F为sucB基因敲除验证结果，G为iclR基因敲除验证结果，H为aceA基因敲除验证结果，I为aceB基因敲除验证结果。

图3：argA基因优化前的密码子相对适应度。

图4：argA基因优化后的密码子相对适应度。

图5：本发明构建的重组表达载体(pQE-argA)的结构示意图。

图6：本发明构建的重组表达载体(pQE-argA)的电泳验证。

图7：本发明构建的L-鸟氨酸生产菌的western blot验证结果；图中，右侧泳道为Marker。

图8：鸟氨酸的液相检测图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：

本实施例和对比例中所使用的大肠杆菌为Escherichia coli str.K-12substr.MG1655，原种购买自美国ATCC。

pQE-N质粒(图1B)是以pQE-60质粒(图1A)为基础经基因工程改造而成，pQE-N质粒的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对pQE-60质粒进行基因工程改造的目的是：一是减少载体的长度，提高其在大肠杆菌中的表达稳定性；二是降低诱导表达后对大肠杆菌菌体生长的影响。

需要说明的是，本发明中pQE-N质粒的构建方法以及L-鸟氨酸生产菌的构建方法，均采用的是现有的基因工程技术的手段，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对其进行生物保藏。

实施例1：大肠杆菌工程菌的构建

采用Red同源重组技术将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，基因敲除的顺序为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，再敲除sucA、sucB基因，最后敲除iclR、aceA和aceB基因，获得大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsucAΔsucBΔargIΔaceAΔaceB)；具体过程如下：

1)线性打靶盒子的构建：

敲除不同基因所对应的同源臂引物如下：

PKD-ptsG-F：ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.6)

PKD-ptsG-R：AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.7)

PKD-poxB-F：AAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.8)

PKD-poxB-R：CATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.9)

PKD-pta-F：GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.10)

PKD-pta-R:TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.11)

PKD-iclR-F:ATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.12)

PKD-iclR-R:TATGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.13)

PKD-sucA-F:TGAACCCGACGCGCGCCATCGGCCATATCAAGTCGATGTTGTTGCAACGTAATGCGTAA；(SEQ ID NO.14)

PKD-sucA-R:ATGAGTAGCGTAGATATTCTGGTCCCTGACCTGCCTGAATCCGTAGCCGATGCCACCGTC。(SEQ ID NO.15)

PKD-sucB-F：TGTCCGTTCACCAGAAACAGCAACAAGATCTGGTTAATGACGCGCTGAACGTCGAATAA；(SEQ ID NO.16)

PKD-sucB-R：ATGAACTTACATGAATATCAGGCAAAACAACTGTTTGCCCGCTATGGCTTACCAGCACCG。(SEQ ID NO.17)

PKD-argI-F：GGAAAATTTACGTATAGCAATAGAAAAATTTGGCTGGAAGAAAAAAACTATCACTGCATAA；(SEQ ID NO.18)

PKD-argI-R：ATGGCAAACCCGGAACAACTGGAAGAACAGCGTGAAGAAACACGTTTGATTATTGAAGAAT。(SEQ ID NO.19)

PKD-aceA-F：GTTAGCGTAAACCACCACATAACTATGGAGC；(SEQ ID NO.20)

PKD-aceA-R：ACAACCGTTGCTGACTGTAGGCCGGATAAGG。(SEQ ID NO.21)

PKD-aceB-F：GCATTGCACGCCTGTCGGCAAATAACCCGCT；(SEQ ID NO.22)

PKD-aceB-R：GGTACTGAACGCGGAACTGGCGAAACAGGG。(SEQ ID NO.23)

将过夜培养的含有重组质粒pKD46的菌株MG1655/pKD46，按照1％的接种量接入装有50mLSOB培养基的300mL的三角瓶中，培养至OD600为0.1-0.2，加入10mM的阿拉伯糖，诱导重组酶的表达。菌体生长至OD600为0.5-0.6，冰浴菌液5min，然后4℃，4000rpm离心收集菌体，然后利用无菌的超纯水或1-10％的甘油水溶液洗涤菌体三次。

2)电感受态的制备：

在1L LB培养液中加入1ml过夜培养的菌液。37℃摇床中培养至OD600约为0.6-0.8。将培养液转移到250ml或500ml的离心管中，冰上冷冻10-60min。4℃，2600g离心10min，收集细胞。用加有10％灭菌甘油的溶液1L重悬细胞颗粒。4℃，2600g离心30min。

3)电击转化：

利用电穿孔仪，2500v，电击含有重组片断的菌液，然后迅速加入1mL冰浴的SOC培养基，然后转入无菌的EP管中，37℃下，孵育1h。

4)复苏与涂布：

涂布氨苄霉素抗性平板，培养，挑取克隆，利用菌落PCR检测目的基因是否敲除。

5)抗性基因去除：

将质粒pCP20转入成功敲除基因的菌株中，并在30℃下培养8h，后转入42℃培养过夜。pCP20在42℃下诱导表达FLP内切酶从而将FRT位点间的抗性基因从基因组上切除掉。敲除后先通过影印法验证，再通过test引物进行验证。

敲除不同基因后所使用的Test引物如下：

Test-ptsG-F：CCTGTACACGGCGAGGCTCT；(SEQ ID NO.24)

Test-ptsG-R:AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC。(SEQ ID NO.25)

Test-poxB-F:TCCCCCTCCGTCAGATGA；(SEQ ID NO.26)

Test-poxB-R:GGTATCACTGCGTAAATCAA。(SEQ ID NO.27)

Test-Pta-F:TCAGCTGGCGGTGCTGTTT；(SEQ ID NO.28)

Test-Pta-R:ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG。(SEQ ID NO.29)

Test-iclR-F:TAAAAGCGACCACCACG；(SEQ ID NO.30)

Test-iclR-R:GCGATTAACAGACACCCT。(SEQ ID NO.31)

Test-sucA-F:TATGCAGGCCGCCCGGCCT；(SEQ ID NO.32)

Test-sucA-R:CTACTCCGCGCGAAGCAGAAGA。(SEQ ID NO.33)

Test-sucB-F:CTCCGCCTCTCCGGCGGTAG；(SEQ ID NO.34)

Test-sucB-R:GTGGGTTATGCCTGTACTAC。(SEQ ID NO.35)

Test-argI-F:TAAATACACTAAATCCTCC；(SEQ ID NO.36)

Test-argI-R:TACTGGAAGATGGCAGCGA。(SEQ ID NO.37)

Test-aceA-F:TGATTTCCTGACCCTGCCAGGCTACCGCCTG；(SEQ ID NO.38)

Test-aceA-R:GCGTTCACGCCGCATCCGGCAATCGGTGCAC。(SEQ ID NO.39)

Test-aceB-F:TGGCGGGCGCGTATGTGGG；(SEQ ID NO.40)

Test-aceB-R:CCAAAGCGGGTACTGGCTG。(SEQ ID NO.41)

影印法验证结果：能在LB培养基上生长，但是不能在含有氨苄霉素的LB培养基上生长。

test引物验证结果如图2所示。结果表明：大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因已被成功敲除，大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsucAΔsucBΔargIΔaceAΔaceB)构建成功。

实施例2：重组表达载体的构建

将argA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示)进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的argA基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；密码子优化前、后的密码子相对适应度如图3和图4所示。

将经密码子优化和添加酶切位点处理的argA基因(SEQ ID NO.3所示)整合到用AccⅢ和sphⅠ双酶切处理后的pQE-N质粒上，获得重组表达载体(pQE-argA)；其结构示意图如图5所示。

将构建的重组表达载体进行电泳验证，结果如图6所示。结果表明：argA基因(SEQID NO.3所示)已成功整合到pQE-N质粒上。所构建的重组表达载体(pQE-argA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例3：L-鸟氨酸生产菌的构建

将实施例2构建的重组表达载体导入到实施例1构建的大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ ptsGΔ poxBΔ ptaΔ iclRΔ sucAΔ sucBΔ argIΔ aceAΔaceB)中，获得转化子。

将转化子在AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，挑出能够在AMP平板中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。

对阳性转化子进行western blot验证，结果如图7所示。结果表明：在大小为49.5Kda处有电泳条带，与目标蛋白相符。说明实施例2构建的重组表达载体已成功导入到受体菌中。由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的L-鸟氨酸生产菌。

对比例1：

以大肠杆菌Escherichia coli str.K-12substr.MG1655作为L-鸟氨酸生产菌A。

对比例2：

以实施例1构建的大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔ ptsGΔ poxBΔ ptaΔiclRΔ sucAΔ sucBΔ argIΔ aceAΔ aceB)作为L-鸟氨酸生产菌B。

对比例3：

将实施例2构建的重组表达载体按实施例3的方法导入到大肠杆菌Escherichiacoli str.K-12substr.MG1655中，构建得到L-鸟氨酸生产菌C。

试验例：

将实施例3、对比例1-对比例3构建的L-鸟氨酸生产菌接入同样组成的发酵培养基中，发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.06g/L、维生素B₁ 0.025g/L、生物素(VH)3mg/L、氨苄青霉素50ppm。

在相同进行发酵培养，发酵培养的温度为30℃，pH为7.0；

发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，22℃保持1h，然后升温至30℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为48h；

培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤2g/L时开始补糖，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-2g/L；所述补料中含有葡萄糖70g/L、甜菜糖蜜10ml/L。

培养结束后进行破菌处理，分离上清液，对上清液中的L-鸟氨酸含量进行测定，具体方法如下：

色谱柱为Waters SpherisorbNH2，250mm×4.6mm，id 5μm；流动相为0.05M磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈(40：60，体积比)；检测波长：210nm；流速为1.0ml/min；进样量为20uL。鸟氨酸与其他杂质峰的分离度大于10。在上述条件下，鸟氨酸的保留时间为17.8min，分离度符合要求(图8)。

取鸟氨酸对照品适量，精密称定，用乙腈-水(50：50，体积比)配制含鸟氨酸1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、4.50mg/mL的溶液，即含鸟氨酸浓度为0.75～2.24mg/mL的溶液，依次进样，记录色谱图，以鸟氨酸的峰面积对浓度进行线性回归，得线性方程。

鸟氨酸：A＝601675C-61023，r为0.9998。表明鸟氨酸浓度为0.75～2.24mg/mL，峰面积(A)与鸟氨酸浓度(C)呈良好的线性关系。

采用上述线性方程对不同生产菌在相同培养条件下得到的上清液中的L-鸟氨酸含量进行测定，结果见表1。

表1：

生产菌	L-鸟氨酸产量(g/L)
		实施例3构建的L-鸟氨酸生产菌	90
对比例1构建的L-鸟氨酸生产菌A	0-0.2
		对比例2构建的L-鸟氨酸生产菌B	30
对比例3构建的L-鸟氨酸生产菌C	12

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司

<120> L-鸟氨酸生产菌及其构建方法

<130> 2021

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2529

<212> DNA

<213> pQE-N质粒

<400> 1

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga 120

ggatccagat cttaatagta attagctgag cttggactcc tgttgataga tccagtaatg 180

acctcagaac tccatctgga tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt 240

ggtgagaatc caagctagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 300

aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 360

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 420

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 480

tgcccgcctg atgaatgctc atccggactc gagaaatcat aaaaaattta tttgctttgt 540

gagcggataa caattataat agattcaatt gtgagcggat aacaatttca cacagaattc 600

attaaagagg agaaattaag catgccggcc gtaatagtaa ttaacatgtg agcaaaaggc 660

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 720

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 780

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 840

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 900

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 960

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1020

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 1080

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 1140

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 1200

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 1260

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 1320

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 1380

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 1440

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 1500

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 1560

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 1620

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 1680

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 1740

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 1800

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 1860

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 1920

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 1980

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 2040

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 2100

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 2160

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 2220

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 2280

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 2340

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 2400

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2460

taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 2520

cgtcttcac 2529

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> argA基因

<400> 2

atgccttttc aatctcccac tttaccatcc ttgccggctc ctgaacgtct tcccgagcag 60

catcgccaat tcgttgattg gctccgacag gtcgccccat atattcacaa atttcggggt 120

caaaccttcg tagtgggcat cccgggagaa atggcagcga catcaggggc tctaaatgcc 180

ctgatacagg acttatcgtt gcttcatagt attggtatcc acatagttat tgtcaacggc 240

tgtagacctc aaatcaatga gcagctcagg ctacgtggac aagtacccca gtaccataac 300

gggctgcgca taacggatgc agtggcgtta gaatgcgcta aggaggccgc aggtgcgatt 360

cgatatgaca tggaagctgg ctttagccaa ggattgccaa atactccgat ggccaacgca 420

gggatccggg ttgtctctgg taatttcacc cttgcgagac ctgtaggcat agtggatgga 480

gttgaccacg tctactccgg ggtagtgagg aaagttgatg ctgtctcaat tcagcgtgcc 540

ctcgacaacc aacagatcgt actactgtcg aatataggtc atagtgcaac aggcgaggcg 600

tttaacttag ctatggaaga ggtggccgca gcgacggcta tggccttgga tgcagacaag 660

cttgttttcc tcgcggaagt ccccggagta cacggggatg acggtcgcat tcaaactgag 720

atcagcgaag ctcgagcccg ggcactactg gcgagagatg acttaacctt gccacttagg 780

atatatctct ctgctgccct aaaagcatgt gagggcggag tggcgcgttc ccatattgtt 840

ccgtttgctg tcgatgggtc agtactgtta gaattctttt tgcacgacgg tgtgggcaca 900

atggttgtcg aggaaacgct tgaggccctc cgcgaagcaa ctatcgatga cgtaggaggg 960

atactagcgc tgattcagcc tttagaggct gatggtacct tggtgaagcg agaccgggcc 1020

cttatcgaag cagagatagg caatttcaca gttattgaac atgatcaagt catctttgga 1080

tgcgcggcta tgtacgcctt ccccgaggaa agaatggcag agatggcgtg tctcgctgta 1140

aacccaacgg tgcagtcgca aggggacggt gaaaggctac tgcagcgtat agagcaacgc 1200

gcccgagaag caggcattac tcagttattt gttttgacca cacggacggc gcactggttc 1260

cttaaaagag gatttgtcat ggggagtgta gatgacctcc cgggtagcag gcgtaatcta 1320

tataactggc aacgccgatc tcaggtgctg ttaaagactt tg 1362

<210> 3

<211> 1372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaatgcc gttccagtct ccgaccctgc cgtctctgcc ggctccggaa cgtctgccgg 60

aacagcaccg tcagttcgtt gactggctgc gtcaggttgc tccgtacatc cacaaattcc 120

gtggtcagac cttcgttgtt ggtatcccgg gtgaaatggc tgctacctct ggtgctctga 180

acgctctgat ccaggacctg tctctgctgc actctatcgg tatccacatc gttatcgtta 240

acggttgccg tccgcagatc aacgaacagc tgcgtctgcg tggtcaggtt ccgcagtacc 300

acaacggtct gcgtatcacc gacgctgttg ctctggaatg cgctaaagaa gctgctggtg 360

ctatccgtta cgacatggaa gctggtttct ctcagggtct gccgaacacc ccgatggcta 420

acgctggtat ccgtgttgtt tctggtaact tcaccctggc tcgtccggtt ggtatcgttg 480

acggtgttga ccacgtttac tctggtgttg ttcgtaaagt tgacgctgtt tctatccagc 540

gtgctctgga caaccagcag atcgttctgc tgtctaacat cggtcactct gctaccggtg 600

aagctttcaa cctggctatg gaagaagttg ctgctgctac cgctatggct ctggacgctg 660

acaaactggt tttcctggct gaagttccgg gtgttcacgg tgacgacggt cgtatccaga 720

ccgaaatctc tgaagctcgt gctcgtgctc tgctggctcg tgacgacctg accctgccgc 780

tgcgtatcta cctgtctgct gctctgaaag cttgcgaagg tggtgttgct cgttctcaca 840

tcgttccgtt cgctgttgac ggttctgttc tgctggaatt cttcctgcac gacggtgttg 900

gtaccatggt tgttgaagaa accctggaag ctctgcgtga agctaccatc gacgacgttg 960

gtggtatcct ggctctgatc cagccgctgg aagctgacgg taccctggtt aaacgtgacc 1020

gtgctctgat cgaagctgaa atcggtaact tcaccgttat cgaacacgac caggttatct 1080

tcggttgcgc tgctatgtac gctttcccgg aagaacgtat ggctgaaatg gcttgcctgg 1140

ctgttaaccc gaccgttcag tctcagggtg acggtgaacg tctgctgcag cgtatcgaac 1200

agcgtgctcg tgaagctggt atcacccagc tgttcgttct gaccacccgt accgctcact 1260

ggttcctgaa acgtggtttc gttatgggtt ctgttgacga cctgccgggt tctcgtcgta 1320

acctgtacaa ctggcagcgt cgttctcagg ttctgctgaa aaccctggca tg 1372

<210> 4

<211> 454

<212> PRT

<213> argA基因编码的蛋白

<400> 4

Met Pro Phe Gln Ser Pro Thr Leu Pro Ser Leu Pro Ala Pro Glu Arg

1 5 10 15

Leu Pro Glu Gln His Arg Gln Phe Val Asp Trp Leu Arg Gln Val Ala

20 25 30

Pro Tyr Ile His Lys Phe Arg Gly Gln Thr Phe Val Val Gly Ile Pro

35 40 45

Gly Glu Met Ala Ala Thr Ser Gly Ala Leu Asn Ala Leu Ile Gln Asp

50 55 60

Leu Ser Leu Leu His Ser Ile Gly Ile His Ile Val Ile Val Asn Gly

65 70 75 80

Cys Arg Pro Gln Ile Asn Glu Gln Leu Arg Leu Arg Gly Gln Val Pro

85 90 95

Gln Tyr His Asn Gly Leu Arg Ile Thr Asp Ala Val Ala Leu Glu Cys

100 105 110

Ala Lys Glu Ala Ala Gly Ala Ile Arg Tyr Asp Met Glu Ala Gly Phe

115 120 125

Ser Gln Gly Leu Pro Asn Thr Pro Met Ala Asn Ala Gly Ile Arg Val

130 135 140

Val Ser Gly Asn Phe Thr Leu Ala Arg Pro Val Gly Ile Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Asp His Val Tyr Ser Gly Val Val Arg Lys Val Asp Ala Val Ser

165 170 175

Ile Gln Arg Ala Leu Asp Asn Gln Gln Ile Val Leu Leu Ser Asn Ile

180 185 190

Gly His Ser Ala Thr Gly Glu Ala Phe Asn Leu Ala Met Glu Glu Val

195 200 205

Ala Ala Ala Thr Ala Met Ala Leu Asp Ala Asp Lys Leu Val Phe Leu

210 215 220

Ala Glu Val Pro Gly Val His Gly Asp Asp Gly Arg Ile Gln Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Glu Ala Arg Ala Arg Ala Leu Leu Ala Arg Asp Asp Leu Thr

245 250 255

Leu Pro Leu Arg Ile Tyr Leu Ser Ala Ala Leu Lys Ala Cys Glu Gly

260 265 270

Gly Val Ala Arg Ser His Ile Val Pro Phe Ala Val Asp Gly Ser Val

275 280 285

Leu Leu Glu Phe Phe Leu His Asp Gly Val Gly Thr Met Val Val Glu

290 295 300

Glu Thr Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala Thr Ile Asp Asp Val Gly Gly

305 310 315 320

Ile Leu Ala Leu Ile Gln Pro Leu Glu Ala Asp Gly Thr Leu Val Lys

325 330 335

Arg Asp Arg Ala Leu Ile Glu Ala Glu Ile Gly Asn Phe Thr Val Ile

340 345 350

Glu His Asp Gln Val Ile Phe Gly Cys Ala Ala Met Tyr Ala Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Arg Met Ala Glu Met Ala Cys Leu Ala Val Asn Pro Thr Val

370 375 380

Gln Ser Gln Gly Asp Gly Glu Arg Leu Leu Gln Arg Ile Glu Gln Arg

385 390 395 400

Ala Arg Glu Ala Gly Ile Thr Gln Leu Phe Val Leu Thr Thr Arg Thr

405 410 415

Ala His Trp Phe Leu Lys Arg Gly Phe Val Met Gly Ser Val Asp Asp

420 425 430

Leu Pro Gly Ser Arg Arg Asn Leu Tyr Asn Trp Gln Arg Arg Ser Gln

435 440 445

Val Leu Leu Lys Thr Leu

450

<210> 5

<211> 3779

<212> DNA

<213> pQE-argA

<400> 5

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga 120

ggatccagat cttaatagta attagctgag cttggactcc tgttgataga tccagtaatg 180

acctcagaac tccatctgga tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt 240

ggtgagaatc caagctagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 300

aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 360

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 420

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 480

tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatg ccgttccagt ctccgaccct gccgtctctg 540

ccggctccgg aacgtctgcc ggaacagcac cgtcagttcg ttgactggct gcgtcaggtt 600

gctccgtaca tccacaaatt ccgtggtcag accttcgttg ttggtatccc gggtgaaatg 660

gctgctacct ctggtgctct gaacgctctg atccaggacc tgtctctgct gcactctatc 720

ggtatccaca tcgttatcgt taacggttgc cgtccgcaga tcaacgaaca gctgcgtctg 780

cgtggtcagg ttccgcagta ccacaacggt ctgcgtatca ccgacgctgt tgctctggaa 840

tgcgctaaag aagctgctgg tgctatccgt tacgacatgg aagctggttt ctctcagggt 900

ctgccgaaca ccccgatggc taacgctggt atccgtgttg tttctggtaa cttcaccctg 960

gctcgtccgg ttggtatcgt tgacggtgtt gaccacgttt actctggtgt tgttcgtaaa 1020

gttgacgctg tttctatcca gcgtgctctg gacaaccagc agatcgttct gctgtctaac 1080

atcggtcact ctgctaccgg tgaagctttc aacctggcta tggaagaagt tgctgctgct 1140

accgctatgg ctctggacgc tgacaaactg gttttcctgg ctgaagttcc gggtgttcac 1200

ggtgacgacg gtcgtatcca gaccgaaatc tctgaagctc gtgctcgtgc tctgctggct 1260

cgtgacgacc tgaccctgcc gctgcgtatc tacctgtctg ctgctctgaa agcttgcgaa 1320

ggtggtgttg ctcgttctca catcgttccg ttcgctgttg acggttctgt tctgctggaa 1380

ttcttcctgc acgacggtgt tggtaccatg gttgttgaag aaaccctgga agctctgcgt 1440

gaagctacca tcgacgacgt tggtggtatc ctggctctga tccagccgct ggaagctgac 1500

ggtaccctgg ttaaacgtga ccgtgctctg atcgaagctg aaatcggtaa cttcaccgtt 1560

atcgaacacg accaggttat cttcggttgc gctgctatgt acgctttccc ggaagaacgt 1620

atggctgaaa tggcttgcct ggctgttaac ccgaccgttc agtctcaggg tgacggtgaa 1680

cgtctgctgc agcgtatcga acagcgtgct cgtgaagctg gtatcaccca gctgttcgtt 1740

ctgaccaccc gtaccgctca ctggttcctg aaacgtggtt tcgttatggg ttctgttgac 1800

gacctgccgg gttctcgtcg taacctgtac aactggcagc gtcgttctca ggttctgctg 1860

aaaaccctgg catgccggcc gtaatagtaa ttaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1920

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1980

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 2040

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 2100

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 2160

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 2220

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 2280

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 2340

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 2400

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 2460

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 2520

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2580

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2640

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2700

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2760

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2820

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 2880

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2940

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3000

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 3060

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 3120

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 3180

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 3240

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 3300

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 3360

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 3420

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 3480

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 3540

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3600

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3660

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 3720

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcac 3779

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD-ptsG-F

<400> 6

acgtaaaaaa agcacccata ctcaggagca ctctcaattg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- ptsG -R

<400> 7

agccatctgg ctgccttagt ctccccaacg tcttacggaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- poxB -F

<400> 8

aaacttgtta ccgttatcac attcaggaga tggagaaccg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- poxB -R

<400> 9

catggcatgt ccttattatg acgggaaatg ccacccttta tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- pta -F

<400> 10

gtaacccgcc aaatcggcgg taacgaaaga ggataaaccg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- pta -R

<400> 11

tcagatatcc gcagcgcaaa gctgcggatg atgacgagaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- iclR -F

<400> 12

atgaaaatga tttccacgat acagaaaaaa gagactgtcg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- iclR -R

<400> 13

tatgatgggc agaatattgc ctctgcccgc cagaaaaaga tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- sucA -F

<400> 14

tgaacccgac gcgcgccatc ggccatatca agtcgatgtt gttgcaacgt aatgcgtaa 59

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> PKD- sucA -R

<400> 15

atgagtagcg tagatattct ggtccctgac ctgcctgaat ccgtagccga tgccaccgtc 60

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- sucB -F

<400> 16

tgtccgttca ccagaaacag caacaagatc tggttaatga cgcgctgaac gtcgaataa 59

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> PKD- sucB -R

<400> 17

atgaacttac atgaatatca ggcaaaacaa ctgtttgccc gctatggctt accagcaccg 60

<210> 18

<211> 61

<212> DNA

<213> PKD- argI -F

<400> 18

ggaaaattta cgtatagcaa tagaaaaatt tggctggaag aaaaaaacta tcactgcata 60

a 61

<210> 19

<211> 61

<212> DNA

<213> PKD- argI -R

<400> 19

atggcaaacc cggaacaact ggaagaacag cgtgaagaaa cacgtttgat tattgaagaa 60

t 61

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> PKD-aceA-F

<400> 20

gttagcgtaa accaccacat aactatggag c 31

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> PKD-aceA-R

<400> 21

acaaccgttg ctgactgtag gccggataag g 31

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> PKD-aceB-F

<400> 22

gcattgcacg cctgtcggca aataacccgc t 31

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> PKD-aceB-R

<400> 23

ggtactgaac gcggaactgg cgaaacaggg 30

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Test- ptsG -F

<400> 24

cctgtacacg gcgaggctct 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Test- ptsG -R

<400> 25

aataacacct gtaaaaaagg cagcc 25

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Test- poxB -F

<400> 26

tccccctccg tcagatga 18

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Test- poxB -R

<400> 27

ggtatcactg cgtaaatcaa 20

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- Pta -F

<400> 28

tcagctggcg gtgctgttt 19

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> Test- Pta -R

<400> 29

accggaaata gtgattattt ccgg 24

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> Test- iclR -F

<400> 30

taaaagcgac caccacg 17

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> Test- iclR -R

<400> 31

gcgattaaca gacaccct 18

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- sucA -F

<400> 32

tatgcaggcc gcccggcct 19

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> Test- sucA -R

<400> 33

ctactccgcg cgaagcagaa ga 22

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Test- sucB -F

<400> 34

ctccgcctct ccggcggtag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Test-sucB -R

<400> 35

gtgggttatg cctgtactac 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> Test-argI -F

<400> 36

taaatacact aaatcctcc 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Test-argI -R

<400> 37

tactggaaga tggcagcga 19

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> Test- aceA -F

<400> 38

tgatttcctg accctgccag gctaccgcct g 31

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> Test- aceA -R

<400> 39

gcgttcacgc cgcatccggc aatcggtgca c 31

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- aceB-F

<400> 40

tggcgggcgc gtatgtggg 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- aceB -R

<400> 41

ccaaagcggg tactggctg 19

Claims

1.一种L-鸟氨酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将pQE-N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE-N上，获得重组表达载体；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，基因敲除的顺序为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，再敲除sucA、sucB基因，最后敲除iclR、aceA和aceB基因。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，质粒pQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，在将argA基因整合到质粒pQE-N前进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的argA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.由权利要求1-5任一项所述的构建方法构建的L-鸟氨酸生产菌。

7.权利要求6所述的L-鸟氨酸生产菌在发酵生产L-鸟氨酸中的应用。