CN114277070A

CN114277070A - 一种发酵生产l-鸟氨酸的方法

Info

Publication number: CN114277070A
Application number: CN202111432355.4A
Authority: CN
Inventors: 曹华杰; 谢沛; 岳明瑞; 郭永胜
Original assignee: Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Current assignee: Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了一种发酵生产L‑鸟氨酸的方法，包括以下步骤：(1)将L‑鸟氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28‑32℃，pH为6.8‑7.2，溶氧为20‑40％，搅拌转速150‑250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50‑0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，22℃保持1h，然后升温至28‑32℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为45‑50h；培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤2.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5‑2g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L‑鸟氨酸的培养液。采用本发明的方法可以实现L‑鸟氨酸的工业化生产，并显著提高了L‑鸟氨酸的产量。

Description

一种发酵生产L-鸟氨酸的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产L-鸟氨酸的方法。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)在生物体内的细胞中普遍存在，其生物活性在新陈代谢的过程中具有很大的作用。L-鸟氨酸作为产生尿素的中间产物，参与了瓜氨酸、精氨酸等氨基酸的新陈代谢，尤其是在鸟氨酸循环中起到重要作用，能够在很大程度上促进体内氨的排出以起到解毒作用，所以对于人体的肝脏细胞来说，L-鸟氨酸是非常重要的。在医学上，L-鸟氨酸也具有广泛的应用，在氨基酸保健品家族中具有重要的地位和广阔的市场前景，直接参与了抗菌性药物的生物或化学合成。

L-鸟氨酸的制备方法主要有：化学合成法、水解精氨酸法和微生物发酵法。其中：化学合成法制备L-鸟氨酸多采用工业原料为起始反应物，此方法在L-鸟氨酸制备的早期研究中应用较多，但化学法合成L-鸟氨酸的收率低，外消旋严重，分离困难。水解精氨酸法是以精氨酸为原料，在催化剂的作用下经过水解作用生成L-鸟氨酸和尿素，根据催化剂的不同，可分为碱水解精氨酸法和酶水解精氨酸法，水解精氨酸法制备L-鸟氨酸副产物较少，容易分离，但此法以精氨酸为原料，其经济效益要受制于精氨酸和L-鸟氨酸之间的市场差价。采用微生物发酵法制备L-鸟氨酸为近年来主要采用的制备工艺之一，它大大拓宽了L-鸟氨酸来源，推动了L-鸟氨酸的研究和应用。

目前对于微生物发酵法制备L-鸟氨酸的研究主要集中在生产菌株的构建和发酵工艺的改造上。通过改进菌种和工艺，L-鸟氨酸的发酵产量有了很大的提高。但是，微生物发酵法制备L-鸟氨酸仍存在菌种控制不稳定、补料发酵和连续发酵控制不易、难以实现工业化生产等问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产L-鸟氨酸的方法。采用本发明的方法可以实现L-鸟氨酸的工业化生产，并显著提高了L-鸟氨酸的产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产L-鸟氨酸的方法，包括以下步骤：

(1)将L-鸟氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28-32℃，pH为6.8-7.2，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速150-250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，22℃保持1h，然后升温至28-32℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为45-50h；

培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤2.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-2g/L；

(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L-鸟氨酸的培养液。

优选的，步骤(1)中，所述L-鸟氨酸生产菌由如下方法构建而成：

将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；

将pQE-N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE-N上，获得重组表达载体(pQE-argA)；

将获得的重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌中，即构建得到L-鸟氨酸生产菌。

更优选的，质粒pQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；重组表达载体(pQE-argA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，步骤(1)中，L-鸟氨酸生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的10-15％。

优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.06g/L、维生素B1 0.025g/L、生物素(VH)3mg/L、氨苄青霉素50ppm。

优选的，步骤(1)中，所述补料中含有葡萄糖70g/L、甜菜糖蜜10ml/L。

本发明的有益效果：

为提高发酵生产L-鸟氨酸的产量，实现工业化生产，本发明从菌株构建和发酵工艺优化两个方面进行了研究。具体来说：

本发明首先构建了能够高产L-鸟氨酸的生产菌，通过对L-鸟氨酸代谢途径进行综合分析，使用基因敲除方法对EMP途径、三羧酸循环、尿素循环等代谢途径进行了改造，使得更多的碳源流向L-鸟氨酸，从而显著提高了L-鸟氨酸的产量；通过对pQE-60质粒进行了改造，敲除了冗杂序列，增加了目的基因的表达量。敲除质粒中原本有的6-His序列，减小了N-乙酰谷氨酸合酶酶活性的丧失。同时通过代谢通路流量计算进行选择，质粒采用低拷贝质粒，启动子选择T5，在保证菌体正常代谢的情况下尽可能多的积累鸟氨酸；通过对argA基因进行过表达，能够解除或降低该酶对鸟氨酸合成速度的影响，提高了整条代谢途径的总速度。

培养基是提供菌种繁殖和合成各种代谢产物所需要的，培养基的组成对发酵的成败有着至关重要的影响。L-鸟氨酸发酵的碳源一般为葡萄糖，本发明对发酵培养基的组成进行了优化，增加了甜菜糖蜜作为碳源，能够为菌体生长提供粗蛋白、有机碱、矿物质等营养物质，还能降低成本。

合适的发酵条件对L-鸟氨酸发酵水平的提高也有显著的作用，本发明在诱导培养过程中，先将温度降至22℃并保持1h，加入诱导剂进行诱导，然后再将温度回升至28-32℃。通过上述温度的调节，一方面，降低温度可以保证诱导剂能够发挥作用；另一方面，回升温度可以提高菌株的生长代谢水平。

综上，本发明通过生产菌的构建和发酵工艺的优化，实现了L-鸟氨酸工业化生产，并显著提高了L-鸟氨酸的产量。

附图说明

图1：pQE-60质粒及其改造结构示意图；其中，A为pQE-60质粒的结构示意图；B为改造后的质粒pQE-N的结构示意图。

图2：对基因敲除后的菌株进行验证的结果；图中，A为poxB基因敲除验证结果，B为Pta基因敲除验证结果，C为ptsG基因敲除验证结果，D为argI基因敲除验证结果，E为sucA基因敲除验证结果，F为sucB基因敲除验证结果，G为iclR基因敲除验证结果，H为aceA基因敲除验证结果，I为aceB基因敲除验证结果。

图3：本发明构建的重组表达载体(pQE-argA)的结构示意图。

图4：本发明构建的重组表达载体(pQE-argA)的电泳验证。

图5：本发明构建的L-鸟氨酸生产菌的western blot验证结果；图中，右侧泳道为Marker。

图6：鸟氨酸的液相检测图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买得到。其中：

本实施例和对比例中所使用的大肠杆菌为Escherichia coli str.K-12substr.MG1655，原种购买自美国ATCC。

pQE-N质粒(图1B)是以pQE-60质粒(图1A)为基础经基因工程改造而成，pQE-N质粒的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对pQE-60质粒进行基因工程改造的目的是：一是减少载体的长度，提高其在大肠杆菌中的表达稳定性；二是降低诱导表达后对大肠杆菌菌体生长的影响。

实施例1：L-鸟氨酸生产菌的构建

1、大肠杆菌工程菌的构建：

采用Red同源重组技术将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，基因敲除的顺序为：先敲除poxB、pta、ptsG、argI基因，再敲除sucA、sucB基因，最后敲除iclR、aceA和aceB基因，获得大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsucAΔsucBΔargIΔaceAΔaceB)；具体过程如下：

1)线性打靶盒子的构建：

敲除不同基因所对应的同源臂引物如下：

PKD-ptsG-F：ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.6)

PKD-ptsG-R：AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.7)

PKD-poxB-F：AAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.8)

PKD-poxB-R：CATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.9)

PKD-pta-F：GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.10)

PKD-pta-R:TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.11)

PKD-iclR-F:ATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；(SEQ ID NO.12)

PKD-iclR-R:TATGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC。(SEQ ID NO.13)

PKD-sucA-F:TGAACCCGACGCGCGCCATCGGCCATATCAAGTCGATGTTGTTGCAACGTAATGCGTAA；(SEQ ID NO.14)

PKD-sucA-R:ATGAGTAGCGTAGATATTCTGGTCCCTGACCTGCCTGAATCCGTAGCCGATGCCACCGTC。(SEQ ID NO.15)

PKD-sucB-F：TGTCCGTTCACCAGAAACAGCAACAAGATCTGGTTAATGACGCGCTGAACGTCGAATAA；(SEQ ID NO.16)

PKD-sucB-R：ATGAACTTACATGAATATCAGGCAAAACAACTGTTTGCCCGCTATGGCTTACCAGCACCG。(SEQ ID NO.17)

PKD-argI-F：GGAAAATTTACGTATAGCAATAGAAAAATTTGGCTGGAAGAAAAAAACTATCACTGCATAA；(SEQ ID NO.18)

PKD-argI-R：ATGGCAAACCCGGAACAACTGGAAGAACAGCGTGAAGAAACACGTTTGATTATTGAAGAAT。(SEQ ID NO.19)

PKD-aceA-F：GTTAGCGTAAACCACCACATAACTATGGAGC；(SEQ ID NO.20)

PKD-aceA-R：ACAACCGTTGCTGACTGTAGGCCGGATAAGG。(SEQ ID NO.21)

PKD-aceB-F：GCATTGCACGCCTGTCGGCAAATAACCCGCT；(SEQ ID NO.22)

PKD-aceB-R：GGTACTGAACGCGGAACTGGCGAAACAGGG。(SEQ ID NO.23)

将过夜培养的含有重组质粒pKD46的菌株MG1655/pKD46，按照1％的接种量接入装有50mLSOB培养基的300mL的三角瓶中，培养至OD₆₀₀为0.1-0.2，加入10mM的阿拉伯糖，诱导重组酶的表达。菌体生长至OD600为0.5-0.6，冰浴菌液5min，然后4℃，4000rpm离心收集菌体，然后利用无菌的超纯水或1-10％的甘油水溶液洗涤菌体三次。

2)电感受态的制备：

在1LLB培养液中加入1ml过夜培养的菌液。37℃摇床中培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8。将培养液转移到250ml或500ml的离心管中，冰上冷冻10-60min。4℃，2600g离心10min，收集细胞。用加有10％灭菌甘油的溶液1L重悬细胞颗粒。4℃，2600g离心30min。

3)电击转化：

利用电穿孔仪，2500v，电击含有重组片断的菌液，然后迅速加入1mL冰浴的SOC培养基，然后转入无菌的EP管中，37℃下，孵育1h。

4)复苏与涂布：

涂布氨苄霉素抗性平板，培养，挑取克隆，利用菌落PCR检测目的基因是否敲除。

5)抗性基因去除：

将质粒pCP20转入成功敲除基因的菌株中，并在30℃下培养8h，后转入42℃培养过夜。pCP20在42℃下诱导表达FLP内切酶从而将FRT位点间的抗性基因从基因组上切除掉。敲除后先通过影印法验证，再通过test引物进行验证。

敲除不同基因后所使用的Test引物如下：

Test-ptsG-F：CCTGTACACGGCGAGGCTCT；(SEQ ID NO.24)

Test-ptsG-R:AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC。(SEQ ID NO.25)

Test-poxB-F:TCCCCCTCCGTCAGATGA；(SEQ ID NO.26)

Test-poxB-R:GGTATCACTGCGTAAATCAA。(SEQ ID NO.27)

Test-Pta-F:TCAGCTGGCGGTGCTGTTT；(SEQ ID NO.28)

Test-Pta-R:ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG。(SEQ ID NO.29)

Test-iclR-F:TAAAAGCGACCACCACG；(SEQ ID NO.30)

Test-iclR-R:GCGATTAACAGACACCCT。(SEQ ID NO.31)

Test-sucA-F:TATGCAGGCCGCCCGGCCT；(SEQ ID NO.32)

Test-sucA-R:CTACTCCGCGCGAAGCAGAAGA。(SEQ ID NO.33)

Test-sucB-F:CTCCGCCTCTCCGGCGGTAG；(SEQ ID NO.34)

Test-sucB-R:GTGGGTTATGCCTGTACTAC。(SEQ ID NO.35)

Test-argI-F:TAAATACACTAAATCCTCC；(SEQ ID NO.36)

Test-argI-R:TACTGGAAGATGGCAGCGA。(SEQ ID NO.37)

Test-aceA-F:TGATTTCCTGACCCTGCCAGGCTACCGCCTG；(SEQ ID NO.38)

Test-aceA-R:GCGTTCACGCCGCATCCGGCAATCGGTGCAC。(SEQ ID NO.39)

Test-aceB-F:TGGCGGGCGCGTATGTGGG；(SEQ ID NO.40)

Test-aceB-R:CCAAAGCGGGTACTGGCTG。(SEQ ID NO.41)

影印法验证结果：能在LB培养基上生长，但是不能在含有氨苄霉素的LB培养基上生长。

test引物验证结果如图2所示。结果表明：大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因已被成功敲除，大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsucAΔsucBΔargIΔaceAΔaceB)构建成功。

2、重组表达载体的构建：

将argA基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示)进行密码子优化和添加酶切位点处理，处理后的argA基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

将经密码子优化和添加酶切位点处理的argA基因(SEQ ID NO.3所示)整合到用AccⅢ和sphⅠ双酶切处理后的pQE-N质粒上，获得重组表达载体(pQE-argA)；其结构示意图如图3所示。

将构建的重组表达载体进行电泳验证，结果如图4所示。结果表明：argA基因(SEQID NO.3所示)已成功整合到pQE-N质粒上。所构建的重组表达载体(pQE-argA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3、L-鸟氨酸生产菌的构建：

将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsucAΔsucBΔargIΔaceAΔaceB)中，获得转化子。

将转化子在AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，挑出能够在AMP平板中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。

对阳性转化子进行western blot验证，结果如图5所示。结果表明：在大小为49.5Kda处有电泳条带，与目标蛋白相符。说明实施例2构建的重组表达载体已成功导入到受体菌中。由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的L-鸟氨酸生产菌。

实施例2：L-鸟氨酸的发酵生产

(1)菌种活化：

将实施例1构建的L-鸟氨酸生产菌划线接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板中，30℃、培养24h。

(2)一级种培养：

从平板划取1接种环菌体接到一级种子培养基(添加50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基)中，在30℃、pH7.0、转速20rpm的条件下培养18h。

(3)二级种培养：

以1％(体积分数)接种量，将一级种子液接种于二级种子培养基(添加50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基)中，30℃、溶氧(DO)20-40％，培养至OD_600nm值0.4(稀释100倍)。

(4)发酵培养：

将L-鸟氨酸生产菌的二级种子液接种至含有发酵培养基的发酵罐(18L)中进行发酵培养，二级种子液的接种量为发酵培养基重量的10％，发酵培养的温度为30℃，pH为7.0，溶氧(DO)为20-40％，搅拌转速200rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，22℃保持1h，然后升温至30℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为48h；

发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.08g/L、FeSO₄0.06g/L、维生素B1 0.025g/L、生物素(VH)3mg/L、氨苄青霉素50ppm。

培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤2.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-2g/L；补料中含有葡萄糖70g/L、甜菜糖蜜10ml/L。

(5)诱导培养结束后进行放罐，将放罐后的发酵液采用均质机进行破菌处理，均质处理的条件为：均质压力12,000PSI，均质流量200L/Hr；均质处理后离心，分离上清，即生产得到含有L-鸟氨酸的培养液。

上述发酵生产过程中，溶氧(DO)采用溶氧电极测定，溶氧以溶氧电极在空气中的溶氧水平设定为100％，以饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧为0。OD600和pH值采用取样测定。

对比例1：

以以大肠杆菌Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655作为L-鸟氨酸生产菌，按实施例2的方法进行发酵，生产得到培养液A。

对比例2：

以实施例1中构建的大肠杆菌工程菌(Escherichia coliΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsucAΔsucBΔargIΔaceAΔaceB)作为L-鸟氨酸生产菌，按实施例2的方法进行发酵，生产得到培养液B。

对比例3：

将实施例1中构建的重组表达载体pQE-argA导入到大肠杆菌Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655中，构建得到L-鸟氨酸生产菌，按实施例2的方法进行发酵，生产得到培养液C。

对比例4：

将实施例2中的发酵培养基的组成调整为：

发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.06g/L、维生素B10.025g/L、生物素(VH)3mg/L、氨苄青霉素50ppm。

将补料的组成调整为：葡萄糖70g/L。

其余条件同实施例2，生产得到培养液D。

对比例5：

将实施例2中的发酵培养基的组成调整为：

发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.06g/L、维生素B10.025g/L、生物素(VH)3mg/L、氨苄青霉素50ppm。

将补料的组成调整为：甜菜糖蜜10ml/L。

其余条件同实施例2，生产得到培养液E。

对比例6：

将实施例2中的诱导培养条件调整为：

发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，诱导培养整个过程均保持温度为22℃，诱导培养时间为48h。

其余条件同实施例2，生产得到培养液F。

试验例：

对实施例2、对比例1-对比例6中生产的培养液中的L-鸟氨酸进行测定。测定方法如下：

色谱柱为Waters SpherisorbNH2，250mm×4.6mm，id 5μm；流动相为0.05M磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈(40：60)；检测波长：210nm；流速为1.0ml/min；进样量为20uL。鸟氨酸与其他杂质峰的分离度大于10。在上述条件下，鸟氨酸的保留时间为17.8min，分离度符合要求(图6)。

取鸟氨酸对照品适量，精密称定，用乙腈-水(50：50)配制含鸟氨酸1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、4.50mg/mL的溶液，即含鸟氨酸浓度为0.75～2.24mg/mL的溶液，依次进样，记录色谱图，以鸟氨酸的峰面积对浓度进行线性回归，得线性方程。

鸟氨酸：A＝601675C-61023，r为0.9998。表明鸟氨酸浓度为0.75～2.24mg/mL，峰面积(A)与鸟氨酸浓度(C)呈良好的线性关系。

采用上述线性方程对不同生产菌在相同培养条件下得到的上清液中的L-鸟氨酸含量进行测定，结果见表1。

表1：

组别	L-鸟氨酸产量
		实施例2	95g/L
对比例1	0.5g/L
		对比例2	32g/L
对比例3	15g/L
		对比例4	75g/L
对比例5	62g/L
		对比例6	80g/L

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司

<120> 一种发酵生产L-鸟氨酸的方法

<130> 2021

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2529

<212> DNA

<213> pQE-N质粒

<400> 1

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga 120

ggatccagat cttaatagta attagctgag cttggactcc tgttgataga tccagtaatg 180

acctcagaac tccatctgga tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt 240

ggtgagaatc caagctagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 300

aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 360

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 420

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 480

tgcccgcctg atgaatgctc atccggactc gagaaatcat aaaaaattta tttgctttgt 540

gagcggataa caattataat agattcaatt gtgagcggat aacaatttca cacagaattc 600

attaaagagg agaaattaag catgccggcc gtaatagtaa ttaacatgtg agcaaaaggc 660

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 720

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 780

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 840

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 900

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 960

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1020

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 1080

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 1140

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 1200

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 1260

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 1320

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 1380

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 1440

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 1500

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 1560

cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 1620

gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 1680

gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 1740

tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 1800

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 1860

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 1920

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 1980

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 2040

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 2100

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 2160

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 2220

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 2280

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 2340

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 2400

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 2460

taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 2520

cgtcttcac 2529

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> argA基因

<400> 2

atgccttttc aatctcccac tttaccatcc ttgccggctc ctgaacgtct tcccgagcag 60

catcgccaat tcgttgattg gctccgacag gtcgccccat atattcacaa atttcggggt 120

caaaccttcg tagtgggcat cccgggagaa atggcagcga catcaggggc tctaaatgcc 180

ctgatacagg acttatcgtt gcttcatagt attggtatcc acatagttat tgtcaacggc 240

tgtagacctc aaatcaatga gcagctcagg ctacgtggac aagtacccca gtaccataac 300

gggctgcgca taacggatgc agtggcgtta gaatgcgcta aggaggccgc aggtgcgatt 360

cgatatgaca tggaagctgg ctttagccaa ggattgccaa atactccgat ggccaacgca 420

gggatccggg ttgtctctgg taatttcacc cttgcgagac ctgtaggcat agtggatgga 480

gttgaccacg tctactccgg ggtagtgagg aaagttgatg ctgtctcaat tcagcgtgcc 540

ctcgacaacc aacagatcgt actactgtcg aatataggtc atagtgcaac aggcgaggcg 600

tttaacttag ctatggaaga ggtggccgca gcgacggcta tggccttgga tgcagacaag 660

cttgttttcc tcgcggaagt ccccggagta cacggggatg acggtcgcat tcaaactgag 720

atcagcgaag ctcgagcccg ggcactactg gcgagagatg acttaacctt gccacttagg 780

atatatctct ctgctgccct aaaagcatgt gagggcggag tggcgcgttc ccatattgtt 840

ccgtttgctg tcgatgggtc agtactgtta gaattctttt tgcacgacgg tgtgggcaca 900

atggttgtcg aggaaacgct tgaggccctc cgcgaagcaa ctatcgatga cgtaggaggg 960

atactagcgc tgattcagcc tttagaggct gatggtacct tggtgaagcg agaccgggcc 1020

cttatcgaag cagagatagg caatttcaca gttattgaac atgatcaagt catctttgga 1080

tgcgcggcta tgtacgcctt ccccgaggaa agaatggcag agatggcgtg tctcgctgta 1140

aacccaacgg tgcagtcgca aggggacggt gaaaggctac tgcagcgtat agagcaacgc 1200

gcccgagaag caggcattac tcagttattt gttttgacca cacggacggc gcactggttc 1260

cttaaaagag gatttgtcat ggggagtgta gatgacctcc cgggtagcag gcgtaatcta 1320

tataactggc aacgccgatc tcaggtgctg ttaaagactt tg 1362

<210> 3

<211> 1372

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaatgcc gttccagtct ccgaccctgc cgtctctgcc ggctccggaa cgtctgccgg 60

aacagcaccg tcagttcgtt gactggctgc gtcaggttgc tccgtacatc cacaaattcc 120

gtggtcagac cttcgttgtt ggtatcccgg gtgaaatggc tgctacctct ggtgctctga 180

acgctctgat ccaggacctg tctctgctgc actctatcgg tatccacatc gttatcgtta 240

acggttgccg tccgcagatc aacgaacagc tgcgtctgcg tggtcaggtt ccgcagtacc 300

acaacggtct gcgtatcacc gacgctgttg ctctggaatg cgctaaagaa gctgctggtg 360

ctatccgtta cgacatggaa gctggtttct ctcagggtct gccgaacacc ccgatggcta 420

acgctggtat ccgtgttgtt tctggtaact tcaccctggc tcgtccggtt ggtatcgttg 480

acggtgttga ccacgtttac tctggtgttg ttcgtaaagt tgacgctgtt tctatccagc 540

gtgctctgga caaccagcag atcgttctgc tgtctaacat cggtcactct gctaccggtg 600

aagctttcaa cctggctatg gaagaagttg ctgctgctac cgctatggct ctggacgctg 660

acaaactggt tttcctggct gaagttccgg gtgttcacgg tgacgacggt cgtatccaga 720

ccgaaatctc tgaagctcgt gctcgtgctc tgctggctcg tgacgacctg accctgccgc 780

tgcgtatcta cctgtctgct gctctgaaag cttgcgaagg tggtgttgct cgttctcaca 840

tcgttccgtt cgctgttgac ggttctgttc tgctggaatt cttcctgcac gacggtgttg 900

gtaccatggt tgttgaagaa accctggaag ctctgcgtga agctaccatc gacgacgttg 960

gtggtatcct ggctctgatc cagccgctgg aagctgacgg taccctggtt aaacgtgacc 1020

gtgctctgat cgaagctgaa atcggtaact tcaccgttat cgaacacgac caggttatct 1080

tcggttgcgc tgctatgtac gctttcccgg aagaacgtat ggctgaaatg gcttgcctgg 1140

ctgttaaccc gaccgttcag tctcagggtg acggtgaacg tctgctgcag cgtatcgaac 1200

agcgtgctcg tgaagctggt atcacccagc tgttcgttct gaccacccgt accgctcact 1260

ggttcctgaa acgtggtttc gttatgggtt ctgttgacga cctgccgggt tctcgtcgta 1320

acctgtacaa ctggcagcgt cgttctcagg ttctgctgaa aaccctggca tg 1372

<210> 4

<211> 454

<212> PRT

<213> argA基因编码的蛋白

<400> 4

Met Pro Phe Gln Ser Pro Thr Leu Pro Ser Leu Pro Ala Pro Glu Arg

1 5 10 15

Leu Pro Glu Gln His Arg Gln Phe Val Asp Trp Leu Arg Gln Val Ala

20 25 30

Pro Tyr Ile His Lys Phe Arg Gly Gln Thr Phe Val Val Gly Ile Pro

35 40 45

Gly Glu Met Ala Ala Thr Ser Gly Ala Leu Asn Ala Leu Ile Gln Asp

50 55 60

Leu Ser Leu Leu His Ser Ile Gly Ile His Ile Val Ile Val Asn Gly

65 70 75 80

Cys Arg Pro Gln Ile Asn Glu Gln Leu Arg Leu Arg Gly Gln Val Pro

85 90 95

Gln Tyr His Asn Gly Leu Arg Ile Thr Asp Ala Val Ala Leu Glu Cys

100 105 110

Ala Lys Glu Ala Ala Gly Ala Ile Arg Tyr Asp Met Glu Ala Gly Phe

115 120 125

Ser Gln Gly Leu Pro Asn Thr Pro Met Ala Asn Ala Gly Ile Arg Val

130 135 140

Val Ser Gly Asn Phe Thr Leu Ala Arg Pro Val Gly Ile Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Asp His Val Tyr Ser Gly Val Val Arg Lys Val Asp Ala Val Ser

165 170 175

Ile Gln Arg Ala Leu Asp Asn Gln Gln Ile Val Leu Leu Ser Asn Ile

180 185 190

Gly His Ser Ala Thr Gly Glu Ala Phe Asn Leu Ala Met Glu Glu Val

195 200 205

Ala Ala Ala Thr Ala Met Ala Leu Asp Ala Asp Lys Leu Val Phe Leu

210 215 220

Ala Glu Val Pro Gly Val His Gly Asp Asp Gly Arg Ile Gln Thr Glu

225 230 235 240

Ile Ser Glu Ala Arg Ala Arg Ala Leu Leu Ala Arg Asp Asp Leu Thr

245 250 255

Leu Pro Leu Arg Ile Tyr Leu Ser Ala Ala Leu Lys Ala Cys Glu Gly

260 265 270

Gly Val Ala Arg Ser His Ile Val Pro Phe Ala Val Asp Gly Ser Val

275 280 285

Leu Leu Glu Phe Phe Leu His Asp Gly Val Gly Thr Met Val Val Glu

290 295 300

Glu Thr Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala Thr Ile Asp Asp Val Gly Gly

305 310 315 320

Ile Leu Ala Leu Ile Gln Pro Leu Glu Ala Asp Gly Thr Leu Val Lys

325 330 335

Arg Asp Arg Ala Leu Ile Glu Ala Glu Ile Gly Asn Phe Thr Val Ile

340 345 350

Glu His Asp Gln Val Ile Phe Gly Cys Ala Ala Met Tyr Ala Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Arg Met Ala Glu Met Ala Cys Leu Ala Val Asn Pro Thr Val

370 375 380

Gln Ser Gln Gly Asp Gly Glu Arg Leu Leu Gln Arg Ile Glu Gln Arg

385 390 395 400

Ala Arg Glu Ala Gly Ile Thr Gln Leu Phe Val Leu Thr Thr Arg Thr

405 410 415

Ala His Trp Phe Leu Lys Arg Gly Phe Val Met Gly Ser Val Asp Asp

420 425 430

Leu Pro Gly Ser Arg Arg Asn Leu Tyr Asn Trp Gln Arg Arg Ser Gln

435 440 445

Val Leu Leu Lys Thr Leu

450

<210> 5

<211> 3779

<212> DNA

<213> pQE-argA

<400> 5

ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60

attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga 120

ggatccagat cttaatagta attagctgag cttggactcc tgttgataga tccagtaatg 180

acctcagaac tccatctgga tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt 240

ggtgagaatc caagctagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 300

aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 360

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 420

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 480

tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatg ccgttccagt ctccgaccct gccgtctctg 540

ccggctccgg aacgtctgcc ggaacagcac cgtcagttcg ttgactggct gcgtcaggtt 600

gctccgtaca tccacaaatt ccgtggtcag accttcgttg ttggtatccc gggtgaaatg 660

gctgctacct ctggtgctct gaacgctctg atccaggacc tgtctctgct gcactctatc 720

ggtatccaca tcgttatcgt taacggttgc cgtccgcaga tcaacgaaca gctgcgtctg 780

cgtggtcagg ttccgcagta ccacaacggt ctgcgtatca ccgacgctgt tgctctggaa 840

tgcgctaaag aagctgctgg tgctatccgt tacgacatgg aagctggttt ctctcagggt 900

ctgccgaaca ccccgatggc taacgctggt atccgtgttg tttctggtaa cttcaccctg 960

gctcgtccgg ttggtatcgt tgacggtgtt gaccacgttt actctggtgt tgttcgtaaa 1020

gttgacgctg tttctatcca gcgtgctctg gacaaccagc agatcgttct gctgtctaac 1080

atcggtcact ctgctaccgg tgaagctttc aacctggcta tggaagaagt tgctgctgct 1140

accgctatgg ctctggacgc tgacaaactg gttttcctgg ctgaagttcc gggtgttcac 1200

ggtgacgacg gtcgtatcca gaccgaaatc tctgaagctc gtgctcgtgc tctgctggct 1260

cgtgacgacc tgaccctgcc gctgcgtatc tacctgtctg ctgctctgaa agcttgcgaa 1320

ggtggtgttg ctcgttctca catcgttccg ttcgctgttg acggttctgt tctgctggaa 1380

ttcttcctgc acgacggtgt tggtaccatg gttgttgaag aaaccctgga agctctgcgt 1440

gaagctacca tcgacgacgt tggtggtatc ctggctctga tccagccgct ggaagctgac 1500

ggtaccctgg ttaaacgtga ccgtgctctg atcgaagctg aaatcggtaa cttcaccgtt 1560

atcgaacacg accaggttat cttcggttgc gctgctatgt acgctttccc ggaagaacgt 1620

atggctgaaa tggcttgcct ggctgttaac ccgaccgttc agtctcaggg tgacggtgaa 1680

cgtctgctgc agcgtatcga acagcgtgct cgtgaagctg gtatcaccca gctgttcgtt 1740

ctgaccaccc gtaccgctca ctggttcctg aaacgtggtt tcgttatggg ttctgttgac 1800

gacctgccgg gttctcgtcg taacctgtac aactggcagc gtcgttctca ggttctgctg 1860

aaaaccctgg catgccggcc gtaatagtaa ttaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1920

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1980

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 2040

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 2100

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 2160

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 2220

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 2280

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 2340

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 2400

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 2460

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 2520

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2580

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2640

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2700

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2760

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2820

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 2880

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2940

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3000

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 3060

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 3120

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 3180

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 3240

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 3300

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 3360

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 3420

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 3480

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 3540

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3600

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3660

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 3720

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcac 3779

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD-ptsG-F

<400> 6

acgtaaaaaa agcacccata ctcaggagca ctctcaattg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- ptsG -R

<400> 7

agccatctgg ctgccttagt ctccccaacg tcttacggaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- poxB -F

<400> 8

aaacttgtta ccgttatcac attcaggaga tggagaaccg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- poxB -R

<400> 9

catggcatgt ccttattatg acgggaaatg ccacccttta tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- pta -F

<400> 10

gtaacccgcc aaatcggcgg taacgaaaga ggataaaccg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- pta -R

<400> 11

tcagatatcc gcagcgcaaa gctgcggatg atgacgagaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- iclR -F

<400> 12

atgaaaatga tttccacgat acagaaaaaa gagactgtcg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- iclR -R

<400> 13

tatgatgggc agaatattgc ctctgcccgc cagaaaaaga tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- sucA -F

<400> 14

tgaacccgac gcgcgccatc ggccatatca agtcgatgtt gttgcaacgt aatgcgtaa 59

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> PKD- sucA -R

<400> 15

atgagtagcg tagatattct ggtccctgac ctgcctgaat ccgtagccga tgccaccgtc 60

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> PKD- sucB -F

<400> 16

tgtccgttca ccagaaacag caacaagatc tggttaatga cgcgctgaac gtcgaataa 59

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> PKD- sucB -R

<400> 17

atgaacttac atgaatatca ggcaaaacaa ctgtttgccc gctatggctt accagcaccg 60

<210> 18

<211> 61

<212> DNA

<213> PKD- argI -F

<400> 18

ggaaaattta cgtatagcaa tagaaaaatt tggctggaag aaaaaaacta tcactgcata 60

a 61

<210> 19

<211> 61

<212> DNA

<213> PKD- argI -R

<400> 19

atggcaaacc cggaacaact ggaagaacag cgtgaagaaa cacgtttgat tattgaagaa 60

t 61

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> PKD-aceA-F

<400> 20

gttagcgtaa accaccacat aactatggag c 31

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> PKD-aceA-R

<400> 21

acaaccgttg ctgactgtag gccggataag g 31

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> PKD-aceB-F

<400> 22

gcattgcacg cctgtcggca aataacccgc t 31

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> PKD-aceB-R

<400> 23

ggtactgaac gcggaactgg cgaaacaggg 30

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Test- ptsG -F

<400> 24

cctgtacacg gcgaggctct 20

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Test- ptsG -R

<400> 25

aataacacct gtaaaaaagg cagcc 25

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Test- poxB -F

<400> 26

tccccctccg tcagatga 18

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Test- poxB -R

<400> 27

ggtatcactg cgtaaatcaa 20

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- Pta -F

<400> 28

tcagctggcg gtgctgttt 19

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> Test- Pta -R

<400> 29

accggaaata gtgattattt ccgg 24

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> Test- iclR -F

<400> 30

taaaagcgac caccacg 17

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> Test- iclR -R

<400> 31

gcgattaaca gacaccct 18

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- sucA -F

<400> 32

tatgcaggcc gcccggcct 19

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> Test- sucA -R

<400> 33

ctactccgcg cgaagcagaa ga 22

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Test- sucB -F

<400> 34

ctccgcctct ccggcggtag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Test-sucB -R

<400> 35

gtgggttatg cctgtactac 20

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> Test-argI -F

<400> 36

taaatacact aaatcctcc 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> Test-argI -R

<400> 37

tactggaaga tggcagcga 19

<210> 38

<211> 31

<212> DNA

<213> Test- aceA -F

<400> 38

tgatttcctg accctgccag gctaccgcct g 31

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> Test- aceA -R

<400> 39

gcgttcacgc cgcatccggc aatcggtgca c 31

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- aceB-F

<400> 40

tggcgggcgc gtatgtggg 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Test- aceB -R

<400> 41

ccaaagcggg tactggctg 19

Claims

1.一种发酵生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将L-鸟氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28-32℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40％，搅拌转速150-250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，22℃保持1h，然后升温至28-32℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为45-50h；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述L-鸟氨酸生产菌由如下方法构建而成：

将pQE-N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE-N上，获得重组表达载体；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，质粒pQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；重组表达载体的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，L-鸟氨酸生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的10-15％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH₄)₂SO₄5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、MnSO₄ 0.08g/L、FeSO₄ 0.06g/L、维生素B1 0.025g/L、生物素3mg/L、氨苄青霉素50ppm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补料中含有葡萄糖70g/L、甜菜糖蜜10ml/L。