KR20080057665A - Ｌ―트레오닌 생산 변이주 및 이의 제조방법 - Google Patents

Ｌ―트레오닌 생산 변이주 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트레오닌 생산성이 향상된 형질전환된 미생물에 관한 것으로, 구체적으로는 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터로 형질전환된 트레오닌 생산 미생물에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환된 미생물은 L-트레오닌을 고수율로 생산할 수 있어, 인간 의약 및 약학산업, 사료산업, 특히 동물 사료에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
인공염색체, talB 프로모터, rmf 프로모터, metL 유전자, L-트레오닌

Description

Ｌ―트레오닌 생산 변이주 및 이의 제조방법 {Escherichia coli Variety Producing L-Threonine and Method for fabricating the same}
도 1은 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 "pccBac/PtalB-metL"의 제작도이다.
도 2는 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 "pccBac/Prmf-metL"의 제작도이다.
본 발명은 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터로 형질전환된 트레오닌 생산 미생물에 관한 것이다.
L-트레오닌(threonine)은 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용되는 필수 아미노산의 일종으로, 동물성 단백 질에는 부족하지 않으나 식물성 단백질에는 적게 들어 있어 채식 위주의 식습관을 가진 동물들에게서 부족되기 쉽다. L-트레오닌은 달걀에 들어 있는 단백질의 5.3 %, 우유 속에 들어 있는 단백질의 4 %를 차지하며, 카세인(casein) 등의 단백질 속에 인산에스테르의 형태로도 존재한다. 효모 및 세균에서는, 아스파르트산(aspartic acid)에서 호모세린(homoserine)을 거치거나 글리신(glycine)에 트레오닌알돌라아제(threonine aldolase)가 작용하여 합성되며, 대사(代謝)되어서 글리신, α-케토부틸산(α-ketobutylic acid), 2-아미노아세토아세트산(2-aminoacetoacetic acid) 등이 된다.
L-트레오닌은 주로 인공변이법 또는 유전자 재조합 방법을 이용하여 개발된 대장균 또는 코리네형 세균(Corynebacterium)을 이용한 발효법으로 생산된다. 인공변이주에 관한 공지기술로는 대장균 속(Escherichia coli species)에 속하고, 디아미노피메르산 및 메티오닌(methionine) 요구성을 가지며, 그의 생합성계가 트레오닌의 피드백 저해작용(feedback inhibition)을 저지하는 미생물을 이용하는 방법(일본 특허공고 제10037/81호)이 있다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)에 속하며 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(S-(2-aminoethyl)-L-cysteine) 및 α-아미노-β-히드록시발레릭산(α-amino-β-hydroxyvalerate) 내성을 지니며 메티오닌 요구성을 특징으로 하는 미생물을 이용한 방법이 공지되어 있다(Kangogaku Zasshi, et al , Agric . Biol . Chem ., 36:1611, 1972).
유전자 재조합 균주를 이용한 발효법으로는, 예를 들면, 아스파르토키나아제(aspartokinase), 호모세린디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase), 호모세 린 키나아제(homoserine kinase) 및 트레오닌 신타아제(threonine synthase)를 코딩하는 유전자 함유 트레오닌 오페론(operon)을 포함하는 DNA 단편이 플라스미드로 증폭된 재조합 대장균을 사용한 L-트레오닌 제조방법(일본 공개특허공보 제05-227977), 대장균 유래의 트레오닌 오페론을 트레오닌 생산 균주인 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)에서 증폭하는 방법(TURBA E, et al , Agric . Biol . Chem. 53:2269~2271, 1989) 등이 있다.
트레오닌 생합성 경로의 첫 단계 효소는 아스파르토키나제(aspartokinase, 이하 "AK"라 약칭함)로, 아스파라긴산(aspartate)과 ATP를 반응시켜 아스파르틸-β-포스페이트(Aspartyl-β-phosphate)를 생성시킨다. 대장균에서는 3가지 형태의 AK(AKⅠ, AKⅡ, AKⅢ)가 있는 것으로 보고되어 있다. 이 중 AKⅠ 및 AKⅡ는 호모세린디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase, 이하 "HD"라 약칭함)의 기능을 갖는 이중기능 효소(bifunctional enzyme)이다. AKⅠ을 코딩하는 유전자의 합성은 트레오닌과 이소류신(isoleucine)에 의해 억제(feedback repression)되며, AKⅠ의 활성은 트레오닌에 의해 저해(inhibition)되는 조절 기작을 갖는다. 한편, AKⅡ를 코딩하는 유전자의 합성은 메치오닌에 의해 억제되지만, AKⅡ의 활성은 저해를 받지 않는다. 반면, AKⅢ을 코딩하는 유전자의 합성은 리신(lysine)에 의해 억제되며, AKⅢ 활성도 리신에 의해 저해를 받는 조절 기작을 나타낸다. 세포 내에서 효소 활성비는 AKⅠ : AKⅡ : AKⅢ = 약 5 : 1 : 4를 나타낸다. 즉, 트레오닌 생합성에 있어서, AKⅠ 및 AKⅢ이 주요한 기능을 하며 AKⅡ는 미약한 기능을 하는 것으로 보고되어 있다(JEAN-CLAUDE PATTE, Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, 2nd Edition, ASM Press, 1996, Chap 32). 또한, AKⅠ 및 AKⅢ을 이용하여 고효율로 트레오닌 또는 리신을 제조하는 많은 공지의 기술이 알려져 있으며, 이들의 생산성 향상에 관한 공지의 사실들이 보고되어 있다(미국등록특허 제 5,661,012호, 한국공개특허 제10-2006-0101545호).
본 연구자들은 L-트레오닌을 고효율로 생성하기 위해, 오랜 기간 아스파르트산 및 그 연관 아미노산 합성의 첫 단계 관여 효소인 AK의 유전자 증폭에 관한 연구를 수행해 왔으며, 이를 통해 L-트레오닌의 수율을 획기적으로 증대시킨 특허들을 획득한바 있다(대한민국 등록특허 제10-0009321, 제10-0427479호). 그러나, 그 후 상기 AK 효소의 증폭 등의 추가적인 개량을 통해서는 더 이상의 L-트레오닌 생산 수율 증대 효과를 얻지는 못하였다.
이에, 본 발명자들은 L-트레오닌을 고수율로 생산하고자 예의 노력하였으며, 그 결과, L-트레오닌의 생합성에 있어서 AKⅡ를 코딩하는 유전자는 메티오닌에 의해 저해를 받으나, AKⅡ의 활성은 아미노산에 의해 피드백 저해를 받지 않는다는 장점을 활용하여, 대장균에서 유전자의 발현이 매우 강한 rmf 유전자의 프로모터 또는 talB 유전자의 프로모터에 AKⅡ의 유전자인 metL을 결합시키고, 이를 인공염색체상에 도입하여 재조합 벡터를 제조한 다음, metL 과발현(over expression) 재조합 균주를 제작하였으며, 상기 균주가 L-트레오닌을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터를 숙주미생물에 도입하여 고효율로 L-트레오닌을 생산할 수 있는 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.
일 양태로서, 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 및 이의 제조방법을 제공한다.
다른 일 양태로서, 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 및 이의 제조방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 talB 유전자의 프로모터의 염기서열은 서열번호 9로 표시되고, 상기 rmf 유전자의 프로모터의 염기서열은 서열번호 10으로 표시될 수 있으나, 상기 염기서열 각각에 95% 이상의 상동성을 가지며 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터와 동일한 활성을 가지는 염기서열이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 바람직하게, 상기 metL 유전자는 서열번호 11로 표시될 수 있 으나, 상기 서열번호 11과 95% 이상의 상동성을 가지며 AKⅡ 효소활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 많은 재조합 균주의 문제점인 플라스미드의 안정성 문제를 극복하기 위해 발현용 벡터로 기존의 다중 복사 벡터(multi-copy plasmid)를 사용하는 대신, 항생제를 첨가하지 않아도 매우 안정하며 미생물 내에서 단일 카피로 존재하기 때문에 특정 유전자의 지나친 과발현(over-expression)으로 인한 부작용을 차단할 수 있는 장점을 지닌 인공염색체를 재조합 벡터로 사용한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인공염색체(Bacterial artificial chromosome, 이하 "Bac"라 약칭함)는 숙주세포의 염색체 복제에 독립적으로 복제할 수 있는, 염색체의 실체로서 존재하는 벡터, 즉 자가복제벡터일 수 있다. 선택적으로, 벡터는 숙주세포로 도입되었을 때, 숙주세포게놈으로 통합되어 이것이 통합된 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 인공염색체는 pBeloBac과 pccBac이 있으며, 바람직하게 pccBac (Copy Control Bacterial Artificial Vector, 이하 “pccBac”이라 표기함)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 인공염색체 pccBac 내로 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 도입하여 재조합 벡터를 완성하였으며, 이를 "pccBac/PtalB-metL"로 명명하였다(도 1). 또한, 본 발명의 다른 구체적인 실시예에서는, 상기 인공염색체 pccBac 내로 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 도입하여 재조합 벡터를 완성하였으며, 이를 "pccBac/Prmf-metL"로 명명하였다(도 2).
일 양태로서, 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터의 제조방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 인공염색체 재조합 벡터가 pccBac/PtalB-metL인 제조방법일 수 있다. 상기 재조합 벡터는 본 발명의 기술분야에서 알려진 공지의 다양한 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 예로, (a) talB 유전자 프로모터를 포함하는 DNA 단편(이하 "PtalB 단편"이라 약칭함)을 준비하는 단계; (b) L-트레오닌 생산 균주로부터 metL 유전자의 오픈 리딩 골격(open reading frame, 이하 "ORF"로 약칭함)을 포함하는 DNA 단편(이하 "metL 단편"이라 약칭함)을 준비하는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 준비한 PtalB 단편과, 상기 (b) 단계에서 준비한 metL 단편을 PCR 증폭하고 연결하여 PtalB-metL 단편을 준비하는 단계; (d) 상기 PtalB-metL 단편을 클로닝 벡터에 도입한 후 이를 제한효소로 처리한 DNA 단편(이하 "PtalB-metL/제한효소"라 약칭함)을 준비하는 단계; 및 (e) 상기 PtalB-metL/제한효소와 (d) 단계의 제한효소와 동일한 제한효소로 처리한 인공염색체 벡터를 라이게이션하는 단계를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터의 제조방법을 제공할 수 있다.
또한 일 양태로서, 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터의 제조방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 인공염색체 재조합 벡터가 pccBac/Prmf-metL인 제조방법일 수 있다. 상기 재조합 벡터는 본 발명의 기술분야에서 알려진 공지의 다양한 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 예로, (a) rmf 유전자 프로모터를 포함하는 DNA 단편(이하 "Prmf 단편"이라 약칭함)을 준비하는 단계; (b) L-트레오닌 생산 균주로부터 "metL 단편"을 준비하는 단계; (c) 상기 (a) 단계에서 준비한 PtalB 단 편과 상기 (b) 단계에서 준비한 metL 단편을 PCR 증폭하고 연결하여 Prmf-metL 단편을 준비하는 단계; (d) 상기 Prmf-metL 단편을 클로닝 벡터에 도입한 후 이를 제한효소로 처리한 DNA 단편(이하 "Prmf-metL/제한효소"라 약칭함)을 준비하는 단계; 및 (e) 상기 Prmf-metL/제한효소와 (d) 단계의 제한효소와 동일한 제한효소로 처리한 인공염색체 벡터를 라이게이션하는 단계를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터의 제조방법을 제공할 수 있다.
하지만, metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자의 염기서열을 포함하는 DNA 단편을 인공염색체인 Bac 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조할 수 있는 것이라면 상기한 방법에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 재조합 벡터를 제조하기 위한 어떠한 공지의 방법도 이용될 수 있다.
상기 재조합 벡터의 제조방법들에 있어서, 클로닝 벡터는 공지의 임의의 클로닝 벡터도 사용될 수 있으며, 바람직하게, pCR2.1-TOPO일 수 있다. pCR2.1-TOPO을 클로닝 벡터로 사용할 경우, 이의 클로닝 벡터 산물들을 각각 "TOPO2.1/PtalB-metL", "TOPO2.1/Prmf-metL"로 각각 명명하였다.
상기 인공염색체 벡터는 바람직하게, pccBac일 수 있다. pccBac를 인공염색체 벡터로 사용하여 재조합벡터를 제조하였을 경우, 이를 각각 "pccBac/Ptal-metL", "pccBac/Prmf-metL"로 명명하였다.
상기 재조합 벡터 pccBac/Ptal-metL 또는 pccBac/Prmf-metL의 제조방법 각각의 (a) 단계에 있어서, Ptal 단편은 L-트레오닌 생산 균주의 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 1과 2를 프라이머로 이용하여 PCR 증폭하여 수득할 수 있다. 또한, Prmf 단편은 L-트레오닌 생산 균주의 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 5와 6을 프라이머로 이용하여 PCR 증폭하여 수득할 수 있다. 상기 L-트레오닌 생산 균주는 바람직하게는 대장균, 더욱 바람직하게는 대장균 야생주 W3110가 바람직하다.
또한, 상기 재조합 벡터 pccBac/Ptal-metL의 제조방법에 있어서, (b) 단계의 metL 단편은 L-트레오닌 생산 균주의 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 3과 4를 프라이머로 이용하여 PCR 증폭하여 수득할 수 있다. 또한, 상기 재조합 벡터 pccBac/Prmf-metL의 제조방법에 있어서, (b) 단계의 metL 단편은 L-트레오닌 생산 균주의 게놈 DNA를 주형으로, 서열번호 7과 8을 프라이머로 이용하여 PCR 증폭하여 수득할 수 있다. 상기 L-트레오닌 생산 균주는 바람직하게는 대장균, 더욱 바람직하게는 대장균 야생주 W3110가 바람직할 수 있으나, metL의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 함유하는 대장균 균주라면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터 pccBac/Ptal-metL의 제조방법에 있어서, (c) 단계의 PtalB-metL 단편은 상기 (a) 단계에서 준비한 Ptal 단편과 (b) 단계에서 준비한 metL 단편을 프라이머 없이 PCR 증폭한 다음, 이에 서열번호 1과 4의 프라이머를 첨가하여 추가로 PCR 증폭하여 수득할 수 있다. 또한, 상기 재조합 벡터 pccBac/Prmf-metL의 제조방법에 있어서, (c) 단계의 Prmf-metL 단편은 상기 (a) 단계에서 준비한 Prmf 단편과 (b) 단계에서 준비한 metL 단편을 프라이머 없이 PCR 증폭한 다음, 이에 서열번호 5와 8의 프라이머를 첨가하여 추가로 PCR 증폭하여 수득할 수 있다.
일 양태로서, 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 제조된 형질전환 미생물 및 이의 제조방법을 제공한다.
다른 일 양태로서, 본 발명은 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 제조된 형질전환 미생물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용 가능한 숙주 미생물은 그람음성 박테리아에 속하는 미생물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균 속(Escherichia coli species)에 속하는 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
특히, 인공염색체에 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자 또는 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 DNA 단편이 도입된 pccBac 벡터로 형질전환된 변이 균주는 L-트레오닌 생산용 숙주 미생물을 사용할 수 있다. 이러한 숙주 미생물의 예로는 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지고, 메티오닌 영양 요구성, L-트레오닌 유사체에 대한 내성, 이소류신 리키형 요구성, L-리신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티릭산 내성을 가지며, L-트레오닌을 생산할 수 있는 대장균에 속하는 미생물; 내재적 PEP 카르복시화효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)를 코딩하는 유전자(ppc)와 트레오닌 오페론에 함유된 유전자 외에 추가로 1 카피 이상의 ppc 유전자와 트레오닌 오페론에 함유된 thrA, thrB, thrc 유전자가 염색체 DNA 중 에 삽입된 변이 미생물이 포함된다. 상기 L-메티오닌 유사체는, 예를 들면 D,L-메티오닌(methionine), 노르류신(norleucine), α-메틸메티오닌(α-methylmethionine) 및 L-메티오닌-D,L-설폭시민(L-methionine-D,L-sulphoximine)으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다. 또한 상기 L-트레오닌 유사체를 예로 들면, α-아미노-β-히드록시 발레릭산(α-amino-β-hydroxyvalerate) 및 D,L-트레오닌 히드록사메이트(D,L-threonine hydroxamate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다. 또한 L-리신(L-lysine) 유사체는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(S-(2-aminoethyl)-L-cysteine) 및 δ-메틸-L-리신(δ-methyl-L-lysine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다. 또 다른 변이 미생물의 예에는, L-트레오닌 생합성 중간체인 옥살초산(oxaloacetate, OAA)을 포스포에놀 파이루베이트(PEP: phosphoenolpyruvate)로 전환하는데 관여하는 pckA 유전자가 불활성화된 미생물, 또는 옥살로아세테이트로부터 아스파르트산(aspartate)으로의 전환을 촉매할 수 있는 TyrB 단백질의 유전자 발현을 억제하는 TyrR이 불활성화된 미생물 또는 포도당 유입에 관여하는 galP 유전자의 발현을 억제하는 galR 유전자가 불활성화된 미생물이 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예에서는, 숙주세포로서 에세리키아 콜라이 (Escherichia coli) KCCM 10541를 사용하여, 인공염색체 재조합벡터 pccBac/Ptal-metL로 형질전환된 미생물(기탁번호 KCCM10817P, 이하 "CA030018"로 명명함) 및 인공염색체 재조합벡터 pccBac/Prmf-metL로 형질전환된 미생물(기탁번호 KCCM10816P, 이하 "CA030017"로 명명함)을 제공한다.
또한, 본 발명은 일 양태로서, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 L-트레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 L-트레오닌을 생산하는 방법에서, 상기 형질전환된 미생물의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예로는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.
구체적인 일 양태로, 본 발명의 L-트레오닌을 생산하는 방법은 (a) metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 또는 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; (b) 배지 또는 미생물 내에 L-트레오닌을 농축하는 단계; 및 (c) 농축산물 중에 남아 있는 L-트레오닌과 임의의 발효 배지 및/또는 바이오매스의 성분 전체 또는 이들의 일부 (≥0 내지 100)를 단리하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다. 바람직하게, 상기 형질전환된 미생물이 pccBac/Ptal-metL로 형질전환된 미생물인 CA030018 또는 pccBac/Prmf-metL로 형질전환된 미생물인 CA030017일 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한 다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당(glucose), 과당(fructose), 자당(sucrose), 유당(lactose), 맥아당(maltose), 전분(starch) 및 셀룰로스(cellulose)와 같은 탄수화물(carbohydrate), 대두유(Soybean Oil), 해바라기유(Regular sunflower oil), 피마자유(castor oil), 코코넛유(coconut oil)와 같은 지방, 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(Stearic acid) 및 리놀레산(Linoleic acid)과 같은 지방산, 글리셀롤(glycerol) 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산(organic acids) 등이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액 (CSL: corn steep liquor) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소(urea, CO(NH2)2), 황산암모늄(ammonium sulfate, (NH4)2SO4), 염화암모늄(ammonium chloride, NH4Cl), 인산암모늄(ammonium phosphate, (NH4)2HPO4), 탄산암모늄(ammonium carbonate, (NH4)2CO3) 및 질산암모늄(ammonium nitrate, NH4NO3)과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원(phosphorus source)으로서, 인산이수소칼륨(KH2PO4), 인산수소이칼륨(K2HPO4), 및 대응되는 소듐(Na)-함유 염(salt)이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식 으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태(aerobic condition)를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양기간은 원하는 L-트레오닌의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.
배양물로부터의 L-트레오닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
하기 실시예에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 pccBac/Ptal-metL로 형질전환된 미생물인 CA030018 및 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 pccBac/Prmf-metL로 형질전환된 미생물인 CA030017은 L-트레오닌을 고효율로 생산하는 균주임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 일 양태로, 본 발명의 방법에 따라 제조 및 분리된 L-트레오닌을 통상의 사료첨가제 성분과 혼합하여 L-트레오닌 함유 사료첨가제를 제조하는 방법 및 이의 가축 사료첨가제를 제공한다. 구체적인 일 양태로, 본 발명의 사료첨가제 제조 방법은 (a) metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터 또는 metL 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; (b) 배지 또는 미생물 내에 L-트레오닌을 농축하는 단계; (c) 농축산물 중에 남아 있는 L-트레오닌과 임의의 발효 배지 및/또는 바이오매스의 성분 전체 또는 이들의 일부 (≥0 내지 100)를 단리하는 단계; 및 (d) 통상의 사료첨가제 성분을 혼합하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다. 바람직하게, 상기 형질전환된 미생물이 pccBac/Ptal-metL로 형질전환된 미생물인CA030018 또는 pccBac/Prmf-metL로 형질전환된 미생물인 CA030017일 수 있다.
본 발명의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미하며, 이에는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 발명에서의 "통상의 사료첨가제"란 사료관리법상의 보조사료에 해당하는 것으로, 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다. 본 발명에서의 가축은 축산법 제2조 제1호 및 동법 시행규칙 제2조 각호에서 정의하고 있는, 야생습성이 순화되어 사육하기에 적합하며 농가의 소득증대에 기여할 수 있는 가축을 의미하며, 예로 소, 말, 노새, 당나귀, 염소, 산양, 면양, 사슴, 돼지, 토끼, 개, 가금류 등 일수 있으며, 가금류에는 닭, 칠면조, 오리, 타조, 거위, 메추리 등이 있으나, 사육하여 축산물을 얻기에 적합한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 따른 사료 첨가제는 액체, 및 또한 고체 형태로 추가 가공될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 예시에 불과하며 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.
실시예 1. 인공염색체상에 talB 유전자의 프로모터와 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터의 제작.
실시예 1-1. PtalB 단편의 준비
talB 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 단편 390bp를 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생주인 W3110의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하였고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)을 사용하여 연쇄중합 반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 1과 2이며, PCR 반응조건은 변성(denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(annealing) 55℃ 30초, 신 장(elongation) 72℃ 2분30초이며, 이를 30회 반복 수행하였다.
상기 PCR 결과물(이하, "PtalB 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리(鎔離)하여 수득하였다.
실시예 1-2. metL 단편의 준비
Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 L-트레오닌 생산 균주 10541의 염색체 DNA를 추출하였다. metL의 오픈 리딩 골격(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)을 포함하는 DNA 단편 2433bp를 증폭하기 위하여, 상기 추출한 염색체 DNA를 주형으로부터 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 3과 4이며, PCR 반응조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분30초이며, 이를 30회 반복 수행하였다.
상기 PCR 결과물(이하, "metL 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
실시예 1-3. PtalB - metL 단편의 준비
상기 실시예 1-1에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 2와, 상기 실시예 1-2에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 3은 20쌍의 염기서열이 상보적이다. 따라서, 실시예 1-1에서 수득한 PtalB 단편과, 실시예 1-2에서 수득한 metL 단편은 하나의 단편으로 연결될 수 있다. PtalB 단편과 metL 단편을 연결하기 위하여, PCR HL premix kit(BIONEER)을 이용하여 상기 PtalB 단편과 metL 단편을 프라이머 없이, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분30초의 PCR 반응조건으로 5회 PCR 증폭한 다음, 상기 중합반응액에 실시예 1-1에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 1과 실시예 1-2에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 4를 프라이머로 첨가하여 동일한 PCR 조건하에서 추가로 25회 PCR 반응을 수행하였다.
상기 PCR 결과물(이하, "PtalB-metL 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
실시예 1-4. PtalB - metL / EcoR Ⅰ 단편의 준비
상기 실시예 1-3에서 수득한 PtalB-metL 단편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen사 제품, 이하 동일함)를 이용하여 클로닝 벡터 pCR2.1-TOPO에 라이게이션(ligation)한 후, 대장균 Top10 세포(Invitrogen 사, 이하 동일함)로 형질전환시키고, 이를 암피실린(ampicillin, 100mg/L) 함유 LB(Lurina-Bertani, 이하 "LB"라 약칭하며, 조성은 박토 트립톤 10 g/L, 박토 효모엑기스 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L이고, 이하 동일함) 고체 배지에 도말하였으며, 이를 37℃에서 밤새 배양하였다.
상기 배양한 콜로니 한 백금이를 암피실린 함유 LB 액체 배지(조성은 상기 LB 고체 배지와 동일함) 3 mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트(QIAGEN사 제품)로 플라스미드 DNA를 회수한 후 크기를 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). 이를 "TOPO2.1/PtalB-metL"로 명명하였으며, talB 프로모터와 metL 유전자 내에 변이가 없음을 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하였다.
상기 플라스미드를 제한효소 EcoRⅠ로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하여 2.8kb 정도의 DNA 단편을 얻었으며, 이를 "PtalB-metL/EcoRⅠ 단편"으로 명명하였다.
실시예 1-5. 인공염색체 재조합 벡터 pccBac / PtalB - metL 의 제조
상기 실시예 1-4에서 준비한 PtalB-metL/EcoRⅠ단편과 상기 실시예 1-4에서 사용한 동일한 제한효소인 EcoRⅠ로 처리된 리니어(linear) 인공염색체인 pccBac 벡터(EPICENTRE사 제품, 이하 동일함)를 Rapid DNA ligation kit(ROCHE사 제품, 이하 동일함)을 이용하여 30분간 라이게이션한 후, 대장균 Top10 세포로 형질전환시키고, 이를 클로람페니콜 (chrolamphenicol, 15mg/L) 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3 mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트(QIAGEN사 제품, 이하 동일함)를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수한 후, 인공염색체 재조합 벡터의 크기를 확인하였으며(데이터는 나타내지 않음), 서열번호 1과 4를 프라이머로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 인공염색체 재조합벡터를 "pccBac/PtalB-metL"로 명명하였다.
실시예 2. 인공염색체상에 rmf 유전자의 프로모터와 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터의 제작.
실시예 2-1. Prmf 단편의 준비
rmf 유전자의 프로모터를 포함하는 DNA 단편 317bp를 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생주인 W3110의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하였고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 5와 6이며, PCR 반응조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분30초이며, 이를 30회 반복 수행하였다.
상기 PCR 결과물(이하, "Prmf 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
실시예 2-2. metL 단편의 준비
Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 L-트레오닌 생산 균주 10541 염색체 DNA를 추출하였다. metL의 ORF를 포함하는 DNA 단편 2433bp를 증폭하기 위하여, 상기 추출한 염색체 DNA를 주형으로부터 PCR HL premix kit를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 서열번호 7과 8이며, PCR 반응조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분30초이며, 이를 30회 반복 수행하였다.
상기 PCR 결과물(이하 "metL 단편"이라 명명함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
실시예 2-3. Prmf - metL 단편의 준비
상기 실시예 2-1에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 6과, 상기 실시예 2-2 에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 7은 20쌍의 염기서열이 상보적이다. 따라서, 실시예 2-1에서 수득한 Prmf 단편과, 실시예 2-2에서 수득한 metL 단편은 하나의 단편으로 연결될 수 있다. Prmf 단편과 metL 단편을 연결하기 위하여, PCR HL premix kit를 이용하여 상기 Prmf 단편과 metL 단편을 프라이머 없이, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분30초의 PCR 반응조건으로 5회 PCR 증폭한 다음, 상기 중합반응액에 실시예 2-1에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 5와 실시예 2-2에서 PCR 프라이머로 사용한 서열번호 8을 프라이머로 첨가하여 동일한 PCR 조건하에서 추가로 25회 PCR 반응을 수행하였다.
상기 PCR 결과물(이하, "Prmf-metL 단편"이라 약칭함)은 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
실시예 2-4. Prmf - metL / EcoR Ⅰ 단편의 준비
상기 실시예 2-3에서 수득한 Prmf-metL 단편을 TA 클로닝 키트를 이용하여 클로닝 벡터 pCR2.1-TOPO에 라이게이션한 후, 대장균 Top10 세포로 형질전환시키고, 이를 암피실린(ampicillin, 100mg/L) 함유 LB 고체 배지에 도말하였으며, 이를 37℃에서 밤새 배양하였다.
상기 배양한 콜로니 한 백금이를 암피실린 함유 LB 액체 배지 3mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수한 후 크기를 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). 이를 "TOPO2.1/Prmf-metL"로 명명하였으며, rmf 프로모터와 metL 유전자 내에 변이가 없음을 DNA 시퀀싱을 통해 확 인하였다.
상기 플라스미드를 제한효소 EcoRⅠ로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하여 2.8kb 정도의 DNA 단편을 얻었으며, 이를 "Prmf-metL/EcoRⅠ 단편"으로 명명하였다.
실시예 2-5. 인공염색체 재조합 벡터 pccBac / PtalB - metL 의 제조
상기 실시예 2-4에서 준비한 Prmf-metL/EcoRⅠ단편과 상기 실시예 2-4에서 사용한 동일한 제한효소인 EcoRⅠ로 처리된 리니어 인공염색체인 pccBac 벡터를 Rapid DNA ligation kit을 이용하여 30분간 라이게이션한 후, 대장균 Top10 세포로 형질전환시키고, 이를 클로람페니콜 15 mg/L 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.
상기 배양한 콜로니 한 백금이를 클로람페니콜 함유 LB 액체 배지 3 mL에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수한 후, 인공염색체 재조합 벡터의 크기를 확인하였으며(데이터는 나타내지 않음), 서열번호 5와 8을 프라이머로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 인공염색체 재조합벡터를 "pccBac/Prmf-metL"로 명명하였다.
실시예3 . 형질전환 미생물의 제조 및 이의 L-트레오닌 생산성 비교
실시예 3-1. 형질전환 미생물의 제조
실시예 1-5, 2-5에서 제조된 두 종류의 인공염색체 재조합벡터 pccBac/PtalB-metL 및 pccBac/Prmf-metL 각각을 L-트레오닌 생산 균주인 KCCM 10541에 전기 천공법으로 도입한 다음, 이를 클로람페니콜 함유 LB 고체 배지에 도말하여 성장한 형질전환된 미생물 콜로니를 수득하였다. pccBac/PtalB-metL로 형질전환된 KCCM10541는 "KCCM10541/pccBac-PtalB-metL"로, pccBac/Prmf-metL로 형질전환된 KCCM10541는 "KCCM10541/pccBac-Prmf-metL"로 편의상 명명한다.
이를 표 1에서 나타낸 트레오닌 역가 배지를 사용하여 삼각플라스크에서 배양한 후, L-트레오닌 생산을 확인하였다(표 2).
실시예 3-2. 형질전환 미생물의 L-트레오닌 생산성 비교
상기 실시예 3-1에서 제조한 형질전환 미생물을 표 1의 트레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크에서 배양하여 L-트레오닌 생산성 향상을 확인하였다.
조성물 농도 (리터당)
포도당 70 g
KH2PO4 2 g
(NH4)2SO4 25 g
MgSO4·7H2O 1 g
FeSO4·7H2O 5 mg
MnSO4·4H2O 5 mg
DL-메티오닌 0.15 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 30 g
pH 6.8
33℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 KCCM10541, KCCM10541/pccBac/PtalB-metL, KCCM10541/pccBac/Prmf-metL 각각의 균주를 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 이의 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2에서 나타낸 바와 같이, 모 균주인 KCCM10541 균주는 48시간 배양하였을 경우 22.5 g/L의 L-트레오닌을 생산하였으나, KCCM10541/pccBac/PtalB-metL 균주는 23.8 g/L의 L-트레오닌을 생산하여 모균주에 비해 1.3g/L의 향상된 L-트레오닌 생산성을 나타내었다. 또한, KCCM10541/pccBac/Prmf-metL 균주는 24.9g/L로 L- 트레오닌을 생산하여 모균주에 비해 2.6 g/L의 향상된 L-트레오닌 생산성을 나타내고 있음을 확인하였다(표 2). 따라서 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 인공염색체 재조합 벡터로 L-트레오닌 생산 균주를 형질전환시킬 경우, L-트레오닌의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었으며, 상기 형질전환된 미생물을 각각 "CA030018" 및 “CA030017"로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하 "KCCM"라 약칭함)에 기탁하였다(각각의 기탁번호는 KCCM10817P 및 KCCM10816P임).
균주 L-트레오닌 (g/L)
KCCM10541 (모균주) 22.5
KCCM10541/pccBac/PtalB-metL 23.8
KCCM10541/pccBac/Prmf-metL 25.1
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 L-트레오닌 생합성 경로의 첫 단계 효소인 아스파르토키나제(AK)의 활성 강화를 위하여, AKⅡ를 코딩하는 metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 metL 유전자 과발현 인공염색체 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 트레오닌 생산 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 미생물은 고수율로 L-트레오닌을 생산할 수 있어 인간 의약 및 약학산업, 사료산업, 특히 동물 사료에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
<110> CJ Corp. <120> Escherichia coli Variety Producing L-Threonine and Method for fabricating the same <130> PA9611-781KR <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer For PCR of Ptal Fragment <400> 1 gaaactgcac aaatccggtg 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR of Ptal Fragment <400> 2 catgatagta tttctcttta aac 23 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR of metL fragment <400> 3 gtttaaagag aaatactatc atgagtgtga ttgcgcaggc 40 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR of metL fragment <400> 4 acccgaaaac atgagtaccg 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR of Ptal fragment <400> 5 tggccggtgt ctggagtc 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR of Ptal fragment <400> 6 gcctcgtttc cctcatactg 20 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR of metL fragment <400> 7 cagtatgagg gaaacgaggc atgagtgtga ttgcgcaggc 40 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR of metL fragment <400> 8 acccgaaaac atgagtaccg 20 <210> 9 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> talB Promoter Sequence <400> 9 gaaactgcac aaatccggtg cgaaaagtga accaacaacc tgcgccgaag agcaggtaaa 60 tcattaccga tccccaaagg acgctgttaa tgaaggagaa aaaatctggc atgcatatcc 120 ctcttattgc cggtcgcgat gactttcctg tgtaaacgtt accaattgtt taagaagtat 180 atacgctacg aggtacttga taacttctgc gtagcataca tgaggttttg tataaaaatg 240 gcgggcgata tcaacgcagt gtcagaaatc cgaaacagtc tcgcctggcg ataaccgtct 300 tgtcggcggt tgcgctgacg ttgcgtcgtg atatcatcag ggcagaccgg ttacatcccc 360 ctaacaagct gtttaaagag aaatactatc 390 <210> 10 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rmf Promoter Sequence <400> 10 tggccggtgt ctggagtcag gaagccgctt ctattgcaca agagataaag cgtctacctt 60 aattataaag atttgtaaat ataaccgtct ccggtatgtt gcctgaggcg gtttttttgt 120 ttctaacgtg cggaaaaatt tgttcctctt cacatttttt gtacaaccga catgcccgtg 180 tagctcacaa atatgacagt ggcgtgaatt ttgcgcattg acggcagtta tgattcgcgg 240 tattgcttaa ctgtgattgc acatttagta atcactgttt tcttttccac cagaaaccag 300 tatgagggaa acgaggc 317 <210> 11 <211> 2433 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> metL Gene Sequence <400> 11 atgagtgtga ttgcgcaggc aggggcgaaa ggtcgtcagc tgcataaatt tggtggcagt 60 agtctggctg atgtgaagtg ttatttgcgt gtcgcgggca ttatggcgga gtactctcag 120 cctgacgata tgatggtggt ttccgccgcc ggtagcacca ctaaccagtt gattaactgg 180 ttgaaactaa gccagaccga tcgtctctct gcgcatcagg ttcaacaaac gctgcgtcgc 240 tatcagtgcg atctgattag cggtctgcta cccgctgaag aagccgatag cctcattagc 300 gcttttgtca gcgaccttga gcgcctggcg gcgctgctcg acagcggtat taacgacgca 360 gtgtatgcgg aagtggtggg ccacggggaa gtatggtcgg cacgtctgat gtctgcggta 420 cttaatcaac aagggctgcc agcggcctgg cttgatgccc gcgagttttt acgcgctgaa 480 cgcgccgcac aaccgcaggt tgatgaaggg ctttcttacc cgttgctgca acagctgctg 540 gtgcaacatc cgggcaaacg tctggtggtg accggattta tcagccgcaa caacgccggt 600 gaaacggtgc tgctggggcg taacggttcc gactattccg cgacacaaat cggtgcgctg 660 gcgggtgttt ctcgcgtaac catctggagc gacgtcgccg gggtatacag tgccgacccg 720 cgtaaagtga aagatgcctg cctgctgccg ttgctgcgtc tggatgaggc cagcgaactg 780 gcgcgcctgg cggctcccgt tcttcacgcc cgtactttac agccggtttc tggcagcgaa 840 atcgacctgc aactgcgctg tagctacacg ccggatcaag gttccacgcg cattgaacgc 900 gtgctggcct ccggtactgg tgcgcgtatt gtcaccagcc acgatgatgt ctgtttgatt 960 gagtttcagg tgcccgccag tcaggatttc aaactggcgc ataaagagat cgaccaaatc 1020 ctgaaacgcg cgcaggtacg cccgctggcg gttggcgtac ataacgatcg ccagttgctg 1080 caattttgct acacctcaga agtggccgac agtgcgctga aaatcctcga cgaagcggga 1140 ttacctggcg aactgcgcct gcgtcagggg ctggcgctgg tggcgatggt cggtgcaggc 1200 gtcacccgta acccgctgca ttgccaccgc ttctggcagc aactgaaagg ccagccggtc 1260 gaatttacct ggcagtccga tgacggcatc agcctggtgg cagtactgcg caccggcccg 1320 accgaaagcc tgattcaggg gctgcatcag tccgtcttcc gcgcagaaaa acgcatcggc 1380 ctggtattgt tcggtaaggg caatatcggt tcccgttggc tggaactgtt cgcccgtgag 1440 cagagcacgc tttcggcacg taccggcttt gagtttgtgc tggcaggtgt ggtggacagc 1500 cgccgcagcc tgttgagcta tgacgggctg gacgccagcc gcgcgttagc cttcttcaac 1560 gatgaagcgg ttgagcagga tgaagagtcg ttgttcctgt ggatgcgcgc ccatccgtat 1620 gatgatttag tggtgctgga cgttaccgcc agccagcagc ttgctgatca gtatcttgat 1680 ttcgccagcc acggtttcca cgttatcagc gccaacaaac tggcgggagc cagcgacagc 1740 aataaatatc gccagatcca cgacgccttc gaaaaaaccg ggcgtcactg gctgtacaat 1800 gccaccgtcg gtgcgggctt gccgatcaac cacaccgtgc gcgatctgat cgacagcggc 1860 gatactattt tgtcgatcag cgggatcttc tccggcacgc tctcctggct gttcctgcaa 1920 ttcgacggta gcgtgccgtt taccgagctg gtggatcagg cgtggcagca gggcttaacc 1980 gaacctgacc cgcgtgacga tctctctggc aaagacgtga tgcgcaagct ggtgattctg 2040 gcgcgtgaag caggttacaa catcgaaccg gatcaggtac gtgtggaatc gctggtgcct 2100 gctcattgcg aaggcggcag catcgaccat ttctttgaaa atggcgatga actgaacgag 2160 cagatggtgc aacggctgga agcggcccgc gaaatggggc tggtgctgcg ctacgtggcg 2220 cgtttcgatg ccaacggtaa agcgcgtgta ggcgtggaag cggtgcgtga agatcatccg 2280 ttggcatcac tgctgccgtg cgataacgtc tttgccatcg aaagccgctg gtatcgcgat 2340 aaccctctgg tgatccgcgg acctggcgct gggcgcgacg tcaccgccgg ggcgattcag 2400 tcggatatca accggctggc acagttgttg taa 2433

Claims (6)

  1. metL 유전자의 프로모터를 talB 유전자의 프로모터 또는 rmf 유전자의 프로모터로 교체한 metL 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 트레오닌 생산 미생물.
  2. 제1항에 있어서, talB 유전자의 프로모터 염기서열이 서열번호 9로 표시되는 트레오닌 생산 미생물.
  3. 제1항에 있어서, rmf 유전자의 프로모터의 염기서열이 서열번호 10으로 표시되는 트레오닌 생산 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, metL 유전자의 염기서열이 서열번호 11로 표시되는 트레오닌 생산 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCCM10816P로 표시되는 트레오닌 생산 미생물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCCM10817P로 표시되는 트레오닌 생산 미생물.
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