CN101946002B - 具有提高的l-苏氨酸生产率的大肠杆菌菌株和利用其生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生产L-苏氨酸的大肠杆菌和利用其生产L-苏氨酸的方法，在所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌中，染色体上的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子被替换为半胱氨酸合酶(cysK)基因的启动子。重组大肠杆菌可以以高产率生产L-苏氨酸，并且因此可以广泛地用在医药、制药、和饲料工业中，特别是用在动物饲料中。

Description

具有提高的L-苏氨酸生产率的大肠杆菌菌株和利用其生产L-苏氨酸的方法
相关专利申请的交叉参考
本申请要求于2008年1月8日提交至韩国知识产权局的韩国专利申请号10-2008-0002310的利益，其公开内容通过引用完全结合在本文中。
发明背景
1.发明领域
本发明的一个或多个实施方案涉及具有提高的L-苏氨酸生产率的生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)菌株，和利用其生产L-苏氨酸的方法，在所述生产L-苏氨酸的大肠杆菌中，染色体上的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子被替换为半胱氨酸合酶(cysK)基因的启动子。
2.相关领域描述
L-苏氨酸是一种必需氨基酸，而且广泛用作动物饲料添加剂或食品添加剂，还用作医药流体或药物合成的原料。尽管动物蛋白包含足够量的L-苏氨酸，但是植物蛋白缺乏L-苏氨酸。因此，在主要为食草性饲料的动物中可能缺乏L-苏氨酸，并且因此L-苏氨酸特别地广泛用作动物饲料的添加剂。
L-苏氨酸主要利用通过人工诱变或遗传重组开发的大肠杆菌(E.coli)或棒杆菌(Corynebacterium)通过发酵方法生产。为了生产L-苏氨酸，使用来源于大肠杆菌(E.coli)野生型菌株、棒杆菌属(Corynebacteria sp.)、沙雷氏菌属(Seratia sp.)、或普罗威登斯菌属(Providencia sp.)的突变菌株。突变菌株的实例包括氨基酸类似物-抗性或药物-抗性突变菌株，和二氨基庚二酸(diaminopimellic acid)、甲硫氨酸、赖氨酸、或异亮氨酸营养缺陷型突变菌株，其也具有氨基酸类似物-抗性或药物-抗性。在利用突变菌株生产L-苏氨酸的方法中，日本专利号10037/81公开了利用属于大肠杆菌物种、具有二氨基庚二酸和甲硫氨酸营养缺陷型表型、且突变以使L-苏氨酸的生物合成不受苏氨酸的反馈抑制影响的微生物的方法。
使用重组菌株的发酵方法也可以用于生产L-苏氨酸。例如，日本专利申请公开号05-227977公开了一种利用以质粒形式向其中引入由编码天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、和苏氨酸合酶的基因组成的苏氨酸操纵子的重组大肠杆菌生产L-苏氨酸的方法，和利用其中引入来源于大肠杆菌的苏氨酸操纵子的生产苏氨酸的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)生产L-苏氨酸的方法(TURBA E，等Agric.Biol.Chem.(农业生物化学)53：2269～2271，1989)。
通常，特定基因在微生物中的表达可以通过增加该基因在该微生物中的拷贝数而提高。为此，使用为微生物提供更多拷贝数的质粒[Sambrook等，Molecular Cloning(分子克隆)，2th，1989，1.3-1.5]。即，通过将靶基因插入到其拷贝数保持在高水平的质粒中和然后用所获得的重组质粒转化微生物，可以将基因数目增加到与每单一微生物中的质粒的拷贝数一样多。利用该方法也已经进行了提高苏氨酸生产率的尝试，并且报道了部分成功(美国专利号5,538,873)。然而，这种利用质粒的技术在大多数情形中仅诱导特定基因的过量表达，由此对宿主微生物产生很重的负担。此外，在重组菌株的培养过程中，质粒可能丢失，由此降低质粒的稳定性。为了解决利用其中引入质粒的重组菌株生产苏氨酸的方法的这些问题，已经开发了向培养物中添加抗生素和利用表达可控的质粒的方法[Sambrook等.Molecular Cloning(分子克隆)，2th，1989，1.5-1.6，1.9-1.11]。在利用表达可控的质粒的情形中，为了在生长阶段过程中减轻对宿主微生物的负担并且获得大量的细胞，在不发生质粒上靶基因表达的条件下培养宿主微生物，并且在宿主微生物充分生长后，诱导基因的暂时性表达，由此获得靶物质。然而，利用表达可控的质粒的方法仅在终基因产物为蛋白或次级代谢物时可以使用。在基因产物为在微生物开始生长时同时产生的主要代谢物的情形中，必须在生长阶段过程中诱导靶基因表达。否则，很难预见主要代谢物的累积。由于苏氨酸属于主要代谢物，后一种情形也适用于苏氨酸。
因此，为了提高作为主要代谢物的苏氨酸的生产率，美国专利号5,939,307中公开了将参与苏氨酸生物合成的基因插入到微生物的染色体DNA中，而不使用将具有苏氨酸生物合成相关的基因的质粒引入到微生物中的方法。已经广泛开发了增加苏氨酸生物合成相关的基因及其表达的方法，但是仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。
为了增加L-苏氨酸的生产率，已经集中进行了关于由草酰乙酸盐(酯)(oxaloacetate)到苏氨酸的生物合成途径的研究。关于其，我们意欲首先通过提高参与紧接在L-苏氨酸生物合成之前的步骤的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性而诱导碳沿着由磷酸烯醇丙酮酸盐(酯)(phosphoenolpyruvate)向草酰乙酸盐(酯)流动。为此，我们研究并且发现了能够生产L-苏氨酸的微生物菌株，其中染色体上的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子被替换为编码半胱氨酸合酶(cysK)的基因的启动子，从而增加编码ppc的基因的表达，ppc为糖酵解后L-苏氨酸生物合成中的第一个酶，以高产率生产L-苏氨酸，因此完成了本发明。
发明概述
本发明的一个或多个实施方案提供能够以高产率生产L-苏氨酸的大肠杆菌(E.coli)菌株。
本发明的一个或多个实施方案还提供利用所述大肠杆菌菌株生产L-苏氨酸的方法，其中可以高效地生产L-苏氨酸。
附图简述
本发明的上述和其它特点和优点通过参考附图详细地描述其示例性的实施方案而变得更清楚，在所述附图中：
图1是举例说明构建重组载体pUC-PcysK的方法图；和
图2是举例说明构建重组载体pUCpcysKmloxP的方法图。
发明详述
本发明提供一种生产L-苏氨酸的微生物，其中染色体上的天然磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子被替换为半胱氨酸合酶(cysK)基因的启动子。
在所述生产L-苏氨酸的微生物中，ppc的表达以这样的方式增加，即编码ppc的基因的启动子被替换为cysK基因的启动子，并且因此可以提高L-苏氨酸的生产率，所述ppc将糖酵解后产生的磷酸烯醇丙酮酸盐(酯)(phosphoenolpyruvate)转化为L-苏氨酸生物合成的起始原料草酰乙酸盐(酯)(oxaloacetate)。
所述微生物可以包括能够生产L-苏氨酸的原核或真核细胞，其中染色体上的ppc基因的启动子被替换为cysK基因的启动子。例如，所述微生物可以是属于埃希氏菌(Escherichia)属、欧文氏菌(Erwinia)属、沙雷氏菌(Seratia)属、普罗威登斯菌(Providencia)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、或短杆菌(Brevibacterium)属的微生物菌株。特别地，所述微生物可以是属于肠杆菌(Enterobacteriaceae)科的微生物，并且更特别地是属于埃希氏菌属的微生物。最特别地，所述微生物可以是大肠杆菌CA030031(KCCM 10910P)。
大肠杆菌CA030031来源于大肠杆菌KCCM 10541，大肠杆菌KCCM10541来源于生产L-苏氨酸的大肠杆菌，KFCC 10718(韩国专利公布号92-8395)。大肠杆菌KFCC 10718具有L-甲硫氨酸类似物抗性，甲硫氨酸营养缺陷型表型，L-苏氨酸类似物抗性，渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型，L-赖氨酸类似物抗性，和α-氨基丁酸抗性，并且能够生产L-苏氨酸。因此，除了野生型微生物之外，所述微生物可以包括用于生产L-苏氨酸的突变体微生物。例如，所述突变体微生物可以是这样的微生物，其具有L-甲硫氨酸类似物抗性，甲硫氨酸营养缺陷型表型，L-苏氨酸类似物抗性，渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型，L-赖氨酸类似物抗性，和α-氨基丁酸抗性，并且属于能够生产L-苏氨酸的大肠杆菌。
在一个实施方案中，所述微生物可以是具有甲硫氨酸营养缺陷型表型和针对苏氨酸类似物、赖氨酸类似物、异亮氨酸类似物和甲硫氨酸类似物的抗性的大肠杆菌。例如，所述L-甲硫氨酸类似物可以是选自由下列各项组成的组的至少一种化合物：D，L-甲硫氨酸，正亮氨酸，α-甲基甲硫氨酸，和L-甲硫氨酸-D，L-亚砜亚胺(L-methionine-D，L-sulfoximine)，L-苏氨酸类似物可以包括选自由下列各项组成的组的至少一种化合物：α-氨基-β-羟基戊酸和D，L-苏氨酸异羟肟酸(D，L-threonine hydroxamate)，并且L-赖氨酸类似物可以是选自由下列各项组成的组的至少一种化合物：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-赖氨酸。所述突变体微生物的实例可以包括其中参与将草酰乙酸盐(酯)(OAA)转化成磷酸烯醇丙酮酸盐(酯)(phosphoenol pyruvate)(PEP)(其是参与L-苏氨酸生物合成的中间体)的pckA基因被失活的微生物，其中抑制参与将草酰乙酸盐(酯)转化成天冬氨酸盐(酯)的lysC基因的tyrR基因被失活的微生物，或其中抑制参与葡萄糖输入的galP基因表达的galR基因被失活的微生物。
在本发明的微生物中，染色体上ppc基因的启动子被替换为cysK基因的启动子，从而增加其表达。本文所用的cysK基因的启动子可以来源于具有高表达率的cysK基因，并且可以具有核苷酸序列SEQ ID NO：10。
本发明还提供生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括：培养具有提高的L-苏氨酸生产率的转化的微生物，其中染色体上天然ppc基因的启动子被替换为cysK基因的启动子；并且从所述微生物的培养物中分离L-苏氨酸。
在生产L-苏氨酸的方法中，所述转化的微生物可以是大肠杆菌，例如，大肠杆菌CA030031(KCCM 10910P)。
现在，将参考下述实施例更充分地描述本发明的一个或多个实施方案。然而，这些实施例仅是出于举例说明的目的提供的，并不意欲限制本发明的范围。
实施例1：构建重组载体pUCpcysKmloxP
(1)制备Pcysk片段
为了获得包含cysK基因的启动子(SEQ ID NO：10)的0.3kb DNA片段，使用QIAGEN Genomic-tip系统提取大肠杆菌野生型菌株W3110的基因组DNA(gDNA)，并且利用所述gDNA作为模板和PCR HL预混合试剂盒(由韩国BIONEER供应)进行聚合酶链式反应(PCR)。为了扩增cysK基因的启动子，使用引物SEQ ID NOS：1和2按下述进行PCR：在94℃变性30秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸2.5分钟，30个循环。
PCR产物用KpnI和EcoRV消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱以获得0.3Kb DNA片段(以下，称为“PcysK片段”)。
(2)构建重组载体pUC-PcysK
图1是举例说明构建包含cysK基因的启动子的重组载体pUC-PcysK的方法图。
质粒pUC19(纽英伦生物实验室(New England Biolabs)，美国)和根据实施例1-(1)获得的PcysK片段分别用限制性酶KpnI和SmaI消化，并且彼此连接，从而构建载体pUC-PcysK。
(3)构建重组载体pUCpcysKmloxP
图2是举例说明构建重组载体pUCpcysKmloxP的方法图。
通常，在通过一步失活引起的基因缺失实验中，当一个基因缺失时，在染色体DNA上保留一种重组酶识别位点loxP的序列。已经报道由于在染色体DNA上保留的loxP序列，当另外修饰菌株进行进一步开发时，效率可能被极大的降低(Nagy A.，Genesis(起源)，26：99，2000)。Suzuki已经提议了使用称为lox71和lox 66的loxP突变体的改进的基因缺失方法(Appl.Environ.Microbiol.(应用环境微生物学)71：8472，2005)。因此，为了通过使用loxP突变体更有效地用cysK基因的启动子替换染色体上的ppc基因的启动子，我们构建了载体pUCpcysKmloxP，其具有突变的loxP-CmR-loxP盒和cysK基因的启动子二者。
如图2所示，使用质粒pACYC184(纽英伦生物实验室(New EnglandBiolab))作为模板，使用引物SEQ ID NOS：3和4，按下述进行PCR：在94℃变性30秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸1分钟，30个循环，以获得1.1kb的PCR片段。根据实施例1-(2)构建的载体pUC-PcysK和使用pACYA184作为模板获得的1.1kb DNA片段分别用限制性酶NdeI/KpnI消化，彼此连接，并且转化到大肠杆菌中。然后，利用通用方法，选择具有与载体准确连接的DNA的细胞，并且从所述细胞的培养物中纯化质粒pUCpcysKmloxP。
实施例2：制备重组大肠杆菌KCCM 10541-PcyK-ppc
为了用cysK基因的启动子替换染色体上编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(SEQ ID NO：9)的天然启动子，对大肠杆菌KCCM 10541进行已知的一步失活法(Warner等，PNAS，6；97(12)：6640，2000)。
首先，使用根据实施例1构建的质粒pUCpcysKmloxP作为模板，通过使用引物SEQ ID NOS：5和8按下述进行PCR：在94℃变性30秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸1分钟，30个循环，以获得DNA片段，并且使用QIAGEN试剂盒(PCR纯化试剂盒)纯化所获得的DNA片段。随后，进一步使用引物SEQ ID NOS：6和7，和所纯化的DNA片段作为模板按下述进行PCR：在94℃变性30秒，在55℃退火30秒和在72℃延伸1分钟，30个循环。纯化所得到的DNA片段，通过电穿孔将所纯化的DNA片段引入到大肠杆菌KCCM 10541中，大肠杆菌KCCM 10541中已引入载体pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)97(12)，6640-6645(2000))，并在含有15μg/mL氯霉素的Luria-Bertani(LB)平板上选择单个菌落。所选的菌株是其中所述DNA片段插入到ppc基因的启动子位点中的菌株。通过去除抗生素抗性基因，将载体pJW168(BMG Biothechnol.(BMG生物技术)2001；1：7.Epub 2001年9月26日)引入到所选的菌株中，以制备重组大肠杆菌KCCM 10541-PcyK-ppc，其中ppc基因的天然启动子被替换为cysK基因的启动子。
实施例3：比较重组微生物之间的L-苏氨酸生产率
将根据实施例2制备的重组微生物培养在Erlenmeyer瓶中的苏氨酸滴定培养基中，如下表1所示，并且验证L-苏氨酸的生产率是否得到提高。
表1
  组成   浓度(/L)
  葡萄糖   70g
  KH2PO4   2g
  (NH4)2SO4   25g
  MgSO4.7H2O   1g
  FeSO4.7H2O   5mg
  MnSO4.4H2O   5mg
  DL-甲硫氨酸   0.15g
  酵母提取物   2g
  碳酸钙   30g
  pH   6.8
将1白金圈的在LB固体培养基中在培养箱中33℃过夜培养的大肠杆菌KCCM 10541和大肠杆菌KCCM 10541-PcysK-ppc分别接种在25ml表1所示的滴定培养基中，并且在培养箱中在33℃200rpm下培养48小时。结果显示在下表2中。
如表2所示，当将亲代菌株大肠杆菌KCCM 10541培养48小时时，其产生29.8g/L L-苏氨酸，而实施例2的大肠杆菌KCCM 10541-PcysK-ppc产生34.7g/L L-苏氨酸，其具有比亲代菌株高4.9g/L的生产率。因此，证实了其中ppc基因的启动子替换为cysK基因的启动子的重组菌株具有提高的L-苏氨酸生产率。转化的大肠杆菌KCCM 10541-PcysK-ppc命名为大肠杆菌CA030031，并且于2007年12月20日保藏在韩国微生物培养中心(KoreanCulture Center of Microorganisms)(KCCM)(保藏号：KCCM 10910P)。
表2
  菌株   L-苏氨酸(g/L)
  KCCM10541(亲代菌株)   29.8
  KCCM10541-PcysK-ppc   34.7
如上所述，根据本发明，在其中染色体上的ppc基因的启动子被替换为cysK基因的启动子的微生物中，ppc基因的表达增加，由此将L-苏氨酸的生产率显著提高16％以上，其中ppc是将磷酸烯醇丙酮酸盐(酯)转化为L-苏氨酸生物合成前体草酰乙酸盐(酯)的酶。所述微生物可以以高产率生产L-苏氨酸，并且因此可以广泛用在医药、制药、和饲料工业中，特别是用于动物饲料。
尽管已经参考本发明的示例性实施方案特别显示和描述了本发明，但是本领域普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行形式和细节的各种改变。
Figure IPA00001205448900011
Figure IPA00001205448900031
Figure IPA00001205448900041

Claims (3)

1.生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，其中染色体上的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子被替换为半胱氨酸合酶(cysK)基因的启动子，并且其中所述半胱氨酸合酶(cysK)基因的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示的序列。
2.权利要求1的大肠杆菌菌株，其为大肠杆菌CA030031，其KCCM保藏号为KCCM 10910P。
3.生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括：培养权利要求1或2所述的大肠杆菌菌株；并且从所述大肠杆菌菌株的培养物中分离L-苏氨酸。 
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