BR112014013239B1 - Microrganismo para produção em simultâneo de l-aminoácido e riboflavina e método para a produção de l-aminoácido e riboflavina utilizando o mesmo - Google Patents
Microrganismo para produção em simultâneo de l-aminoácido e riboflavina e método para a produção de l-aminoácido e riboflavina utilizando o mesmo Download PDFInfo
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Abstract
MICROORGANISMO PARA PRODUÇÃO EM SIMULTÂNEO DE L-AMINOÁCIDO E RIBOFLAVINA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-AMINOÁCIDO E RIBOFLAVINA UTILIZANDO O MESMO. A presente invenção refere-se a um método de produção de L- aminoácido e riboflavina em concentrações elevadas em simultâneo, e a um microorganismo para a produção simultânea de L-aminoácido e riboflavina. Especificamente, a presente invenção refere-se a um microorganismo modificado para a produção de L-lisina ou L-treonina e riboflavina em simultâneo, em que o microorganismo pertencente a Corynebactehum sp. com capacidade para produzir L-lisina ou L-treonina é modificado com aumento da atividade de uma família de enzimas expressada por um operão rib que contém a família de genes da biossíntese da riboflavina. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a produção simultânea de L-lisina ou L-treonina e riboflavina utilizando o microorganismo modificado e refere-se a uma formulação ou formulação granulada, alimento e aditivo alimentar contendo L- lisina ou L-treonina e riboflavina produzidas a partir de um meio de cultura do microorganismo modificado.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método para produção de altas concentrações de L-aminoácido e riboflavina e um microrganismo para produção simultânea de L-aminoácido e riboflavina.
[002] Grãos de cereais, tal como milho, painço da índia, cevada e trigo, que são frequentemente utilizados nas rações, proporcionam normalmente 30-60% da quantidade necessária de aminoácidos. Deste modo, para satisfazer as necessidades remanescentes e manter o equilíbrio entre os aminoácidos essenciais, é necessária uma provisão adicional de aminoácidos. Do mesmo modo, todas as rações contêm determinadas quantidades de vitaminas e se qualquer vitamina não estiver presente numa quantidade suficiente, pode ocorrer uma deficiência da vitamina. Assim, as vitaminas deverão adicionalmente ser fornecidas de modo a se manter os seus níveis adequados, tal como os aminoácidos. Aminoácidos são os mais dispendiosos entre os componentes das rações e a provisão eficaz de aminoácidos pode ser considerada como um dos fatores que determina toda a capacidade de produção de animais. Em particular, L-lisina e L-treonina entre os aminoácidos tornam-se frequentemente os primeiros aminoácidos a limitar o crescimento dos animais. L-lisina e L-treonina podem ser produzidos por um processo de fermentação utilizando microrganismos e a L-lisina e a L- treonina produzidas pelo processo de fermentação são adicionadas à ração após purificação e concentração. Microrganismos que são tipicamente utilizados na fermentação de L-lisina são Corynebacterium sp. ou Escherichia coli, e foram reportados muitos exemplos que produziram L-lisina ao geneticamente modificar os microrganismos (Patente coreana N.° 10-0930203 e N.° 10-0924065, e Patente norte-americana N.° 7 871 801).
[003] Atualmente, estào a ser envidados esforços continuamente no sentido de aumentar a produção de L-lisina e L-treonina por meio de microrganismos modificados utilizando métodos de modificação genética. No entanto, com o crescimento da indústria, a capacidade de proporcionar quantidades maiores de L-lisina e L-treonina é extremamente necessária e, deste modo, estão a ser feitos esforços para desenvolver métodos com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de uma fora mais eficaz e mais económica.
[004] Embora as vitaminas sejam necessárias em quantidades pequenas, estas são compostos orgânicos essenciais que precisam existir para a manutenção das funções metabólicas normais, crescimento, funções reprodutoras e saúde dogado. Entre as vitaminas, riboflavina (vitamina B2) é uma vitamina hidrossolúvel que é biossintetizada em várias espécies de microrganismos e todos os tipos de plantas, mas que não é biossintetizada no corpo dos vertebrados, incluindo humanos, e assim é necessário que seja facultada por fontes externas. Um déficit de riboflavina pode causar anestros e infertilidade nos porcos (β/o/. Reprod. (1981) 25:659-665, J. Anim. Sei. (1984) 59:1567-1572). No caso das aves de criação, esta pode causar problemas a nível dos nervos, em particular, no nervos ciático e nervo braquial e pode adversamente afetar o crescimento dos embriões, resultando na morte dos embriões (the Korean Feeding Standard for Poultry, 2002, the Korean Ministry of Agriculture and Forestry). Deste modo, a riboflavina tem sido utilizada como um aditivo alimentar para o crescimento dos animais e, em particular, a própria riboflavina concentrada tem sido utilizada como alimento.
[005] A produção mundial atual de riboflavina é de 6 000 toneladas por ano, sendo que 75% é utilizado como aditivos alimentares e o remanescente é utilizado como alimentos e produtos farmacêuticos. Na produção de riboflavina, é utilizado um método de síntese química e um método de fermentação microbiana. Num método se síntese química, é produzida riboflavina de alta pureza a partir de um percursor, tal como D-ribose por meio de processo multifásico. O método de síntese química possui uma desvantagem por o material de partida ser dispendioso, o que consequentemente aumenta o custo de produção. Por este motivo, foi desenvolvido um método para produção de riboflavina por fermentação microbiana. O método de fermentação microbiana é um método em que um microrganismo que produz riboflavina é isolado da natureza ou um microrganismo que sofreu mutações por engenharia genética ou por um método químico/físico de modo a produzir riboflavina em excesso é colocado em cultura sob condições adequadas e depois a riboflavina é isolada da cultura. Em anos recentes, o método da fermentação foi primeiramente pesquisado considerando que é competitivo em termos de preço e amigo do ambiente. Riboflavina produzida pelo método de fermentação é adicionada à ração após purificação e concentração.
[006] Um método típico para produzir riboflavina utilizando a levedura Candida famata é divulgado na patente norte-americana N.° 5 231 007. Na produção industrial de riboflavina, Eremothecium ashbyii e Ashbya gossypíi (WO N.° 95/26406), que pertencem a Ascomycetes, são as mais frequentemente utilizadas. Para além disso, as bactérias Bacillus subtilis foram também referidas como uma estiroe que pode ser utilizada para a produção de riboflavina. Muitos exemplos que produziram riboflavina ao modificar geneticamente as bactérias acima foram reportados (EP N.° 0821063, Patente norte-americana N.° 5 837 528 e Patente norte-americana No. 5 334 510) e os autores da presente invenção produziram igualmente riboflavina utilizando as bactérias acima (Patente coreana N.° 10-0542573). Para além disso, foi igualmente reportado um exemplo que produziu 4,5 g/L de riboflavina utilizando um microrganismo modificado para expressar em excesso um gene que codifica uma enzima relacionada com a biossíntese da riboflavina (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (1999), 22:8-8).
[007] Os requisitos para componentes nas rações animais são de aproximadamente 1-5 g/kg de L-lisina, aproximadamente 0,6-3,3 g/kg de L- treonina e 2-4 g/kg de riboflavina, o que é aproximadamente 0,1% das necessidades de L-lisina (NRC 1998. National Academy of Sciences- National Research Council, Washington, D.C.). No entanto, L-lisina e riboflavina são separadamente produzidas por processos de fermentação, são sujeitas a processos de purificação e de concentração antes de se adicionarem à ração e são individualmente transferidas para uma unidade de produção de rações compostas. Por este motivo, podem aumentar o custo de produção da ração. Se a concentração de riboflavina num microrganismo que produza tanto L-lisina como riboflavina atingir 0,1% da concentração de L-lisina, a adição da cultura microbiana pode satisfazer os requisitos para os aditivos para rações. No entanto não foram ainda reportadas tentativas para atingir este número.
[008] No caso de microrganismos Corynebacterium sp., a riboflavina é biossintetizada através de duas vias, a partir da ribulose 5-fosfato (Ru5P), que é um produto da via das pentoses-fosfato (PPP), e guanosina trifosfato (GTP) que é um produto de metabolismo de purinas. Na biossíntese de riboflavina encontra-se envolvida uma família de genes que consiste em um gene GTP ciclohidrolase II (RibA), gene pirimidina deaminase-reductase (RibG), gene riboflavina sintase sub-unidade alfa (RibC) e gene riboflavina sintase subunidade beta (RibH) (doravante referida como “familia do gene da biossíntese da riboflavina”). A família do gene da biossíntese da riboflavina forma um operon (pperon rib) com ribulose-5-fosfato-3-epimerase (Rpe, NCgl1536) que se encontra envolvido na via das pentoses-fosfato e tanto o Rpe como o RibA competem na utilização de Ru5P como um substrato (FIG. 1). Por outras palavras, a Rpe biossintetiza D-xilose-5-fosfato a partir de Ru5P para mediar um processo intermédio, no qual um produto metabólico produzido na via pentose-fosfato entra na via glicolítica, e a RibA biossintetiza 3,4-dihidroxi-2- butanona-4-fosfato que é um intermediário da biossíntese da riboflavina (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, [//www.genome.jp/kegg]).
[009] A via das pentoses-fosfato em Corynebacterium é a fonte principal de poder redutor (NADPH) que está envolvida na biossíntese da lisina e a correlação direta entre a regeneração de NADPH e biossíntese de L-lisina foi reportada na literatura (Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002; Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Ohnishi et al., Microbiol Lett 242:265-274, 2005).
[010] A via das pentoses-fosfato é catalisada por glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH), 6-fosfogluconolactonase, 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGD), Rpe, ribose-5-fosfato isomerase (RpiA), transcetolase e transaldolase e o produto metabólico final produzido por esta via entra no processo glicolítico.
[011] Como um resultado dos estudos sobre a aplicação da via das pentoses-fosfato, EP 01941065 (Junho, 2001) e EP 02781875 (Dezembro, 2002) divulga uma variante de enzima a qual produz diretamente NADPH, a qual possui uma resistência de feedback negativa. Para além disso, foram divulgadas as invenções que se referem a estirpes de Corynebacterium produtoras de lisina que expressam em excesso transcetolase e transaldolase (EP 1109915, EP 1179076, e EP 1179084). Mais ainda, foi reportado um aumento na produção de L-lisina numa estirpe de Corynebacterium que expressa em excesso Rpe ou RpiA (DE10037611 e DE10037612).
[012] Deste modo, é possível observar que à medida que a produção de L-lisina numa estirpe de Corynebacterium aumenta, a dependência da estirpe da via das pentoses-fosfato também aumenta. No entanto, a via de biossíntese da riboflavina que é elemento chave da presente invenção deriva da via das pentoses-fosfato e, deste modo, se for intensificado um fluxo de carbono para a via de biossíntese da riboflavina, uma fonte de carbono a ser introduzida na via glicolítica através da via das pentoses-fosfato irá verter, resultando numa diminuição do rendimento de produção de L-lisina por unidade de fonte de carbono aplicada. Por outras palavras, pode considerar-se que a via de biossíntese da riboflavina numa estirpe produtora de L-lisina que implique um fluxo de carbono suficiente na via das pentoses-fosfato é competitiva com a via das pentoses-fosfato. Igualmente, se um fluxo de carbono que é introduzido na via de biossintese de riboflavina aumenta, a produção de L-lisina pode ser adversamente afetada.
[013] Deste modo, os microrganismos que produzem L-lisina e riboflavina em simultâneo podem encontrar-se presentes na natureza, mas os resultados da produção de L-lisina e riboflavina podem ser competitivos entre eles. Por este motivo, não foram ainda reportadas tentativas para aumentar a produção de riboflavina num microrganismo industrial, o qual produz uma grande quantidade de L-lisina, para um nível industrialmente útil.
[014] Sob as circunstancias acima referidas, os autores da presente invenção têm feito grandes esforços no sentido de desenvolver um microrganismo que produza L-lisina e riboflavina em simultâneo. Como resultado, os autores da presente invenção aplicaram adaptabilidade de ácido glucônico de alta concentração numa estirpe de Corynebacterium com capacidade de produção de L-lisina por mutação artificial de modo a aumentar o fluxo de carbono na via pentose-fosfato, desenvolvendo assim uma estirpe mutante com capacidade aumentada para produzir riboflavina comparativamente à estirpe progenitor, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina a um nível semelhante do da estirpe progenitor. Igualmente, os autores da presente invenção descobriram que, mesmo quando o promotor da família do gene da biossintese de riboflavina numa estirpe de Corynebacterium que produz L-lisina é substituído por um forte promotor heterogéneo, a estirpe de Corynebacterium pode produzir L-lisina e riboflavina em simultâneo em altas concentrações, sendo que o mesmo efeito é igualmente observado numa estirpe de Corynebacterium com capacidade de produção de L-treonina, deste modo completando a presente invenção.
[015] É objeto da presente invenção apresentar um método para produzir L-lisina ou L-treonina e riboflavina, que inclua: cultura de um microrganismo que seja obtido pela modificação de um microrganismo da espécie do género Corynebacterium com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado; e produzindo L-lisina ou L-treonina e riboflavina por um processo de fermentação.
[016] Outro objeto da presente invenção é apresentar um microrganismo Corynebacterium glutamicum modificado, o qual é obtido pela indução de mutação aleatória num microrganismo Corynebacterium glutamicum com capacidade de produção de L-lisina a alta concentração de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina a um nível elevado, em que o microrganismo Corynebacterium glutamicum modificado é depositado sob o n° de acesso KCCM11223P.
[017] Ainda um outro objeto da presente invenção é apresentar um microrganismo Corynebacterium sp. modificado para produzir L-lisina ou L- treonina e riboflavina em simultâneo, o qual é modificado ao se intensificar a atividade de uma família de enzima que é expressada pelo operon rib que compreende a família de genes da biossíntese de riboflavina num microrganismo da espécie Corynebacterium com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado.
[018] Ainda um outro objeto da presente invenção é apresentar uma formulação ou formulação granular que inclua L-aminoácido e riboflavina, a qual é preparada por meio de cultura do microrganismo acima mencionado e L- aminoácido granulado e riboflavina,
[019] Ainda um outro objeto da presente invenção é apresentar uma formulação ou formulação granular que inclua L-aminoácido e riboflavina, a qual é preparada por meio de cultura do microrganismo acima mencionado e L- aminoácido granulado e riboflavina, Efeitos vantajosos
[020] A presente invenção pode apresentar um microrganismo desenvolvido que produz, em simultâneo, altas concentrações de L- aminoácido, tal como, L-lisina ou L-treonina o qual é produzido industrialmente em grandes quantidades e riboflavina, as quais são utilizadas como ração animal essencial e o método para produzir L-aminoácido e riboflavina. Deste modo, a presente invenção pode apresentar os efeitos de produção de rações convenientemente e reduzir o custo de produção e pode apresentar uma estirpe eficaz para produzir L-aminoácido e aditivos de alimentos vitamínicos.
[021] FIG. 1 mostra que a via glicolítica e a via da biossíntese da riboflavina competem em termos de utilização com a ribulose-5-fosfato.
[022] FIG. 2 mostra que um promotor forte é introduzido para montante ou para dentro do operon rib para intensificar a atividade tanto da família da enzima que é codificada pelo operon rib como da família da enzima da biossíntese da riboflavina.
[023] FIG. 3 mostra um vetor pDZ-Pmrb construído de forma a introduzir um promotor de SEQ ID NO: 5.
[024] FIG. 4 mostra um vetor pDZ-lysCP1-ribG construído de forma a introduzir um promotor de SEQ ID NO: 6.
[025] Doravante, os termos presentemente utilizados serão definidos.
[026] Tal como presentemente utilizado, o termo "operon rib" refere-se a um operon que inclui uma família de genes da biossíntese da riboflavina que consiste de gene ribG codificador da pirimidina deaminase-reductase (RibG, NCgl1535), gene ribC codificador da riboflavina sintase sub-unidade alfa (RibC, NCgl1534), gene ribA codificador da GTP ciclohidrolase II (RibA) e gene ribH codificador da riboflavina sintase sub-unidade beta (RibH, NCgl1532) (doravante referida como “família de genes da biossíntese da riboflavina”) e gene rpe codificador da ribulose-5-fosfato-3-epimerase (Rpe, NCgl1536) que se encontra envolvido na via pantose-fcsfato (FIG. 2). A informação sobre genes do operon encontra-se disponível a partir de bases de dados púbicas (por ex. NCBI GenBank).
[027] Tal como presentemente utilizado, o termo "L-aminoácido" refere-se a um aminoácido selecionado do grupo que consiste de L-lisina, L-treonina, L- valina, L-isoleucina, L-triptofano e L-metionina. Especificamente, o aminoácido é L-lisina ou L-treonina.
[028] Um aspecto da presente invenção contém um método para produzir L-lisina ou L-treonina e riboflavina, incluindo:
[029] cultura de um microrganismo que seja obtido pela modificação de um microrganismo Corynebacterium dp. com capacidade de produção de L- lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado; e produzindo L-lisina ou L-treonina e riboflavina por um processo de fermentação.
[030] Num exemplo específico da presente invenção, foi descoberto que a produção de L-lisina ou L-treonina no microrganismo modificado foi mantida ao mesmo nível do da estirpe progenitora, enquanto a produção de riboflavina aumentou em cerca de 70-80 vezes, e em particular, a proporção entre a produção de lisina e a produção de riboflavina foi de aproximadamente 1:0,005 ou a proporção entre a produção de teonina E a produção de riboflavina foi de aproximadamente 1:0,03 (Quadrosl a 6). Esta constatação sugere que L- aminoácido e riboflavina produzidos em simultâneo pelo microrganismo da presente invenção são adequados para utilização como aditivos para rações.
[031] O microrganismo modificado é o microrganismo Corynebacterium sp. modificado por produzir L-aminoácido e riboflavina em simultâneo, o qual é obtido pela modificação dum microrganismo Corynebacterium sp. com capacidade de produção de L-aminoácido de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-aminoácido, como um resultado de intensificar a atividade de uma família de enzimas que é expressada pelo operon rib incluindo a família de genes da biossintese da riboflavina. Especificamente, pode ser o microrganismo Corynebacterium sp. mutante por produzir L-aminoácido e riboflavina em simultâneo, o qual é obtido pela modificação dum microrganismo Corynebacterium sp. com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina, como um resultado de intensificar a atividade de uma família de enzimas que é expressada pelo operon rib incluindo a família de genes da biossíntese da riboflavina.
[032] O microrganismo Corynebacterium dp. utilizado na presente invenção pode ser qualquer estirpe de da espécie de Corynebacterium com capacidade de produzir L-aminoácido e exemplos destes incluem, mas não se limitam a, Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032), Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539), Brevibacterium flavumi (ATCC 14067) e Brevibacterium fermentum (ATCC 13869). Mais especificamente, Corynebacterium glutamicum pode ser utilizada, exemplos específicos da mesma incluem, mas não se limitam a, KFCC10881 (Patente Coreana No. 0159812), KFCC11074 (Patente Coreana No. 0292299), KFCC11001 (Patente Coreana No. 0253424) e KCCM11222P. Num exemplo específico da presente invenção, um microrganismo mutante foi produzido ao se modificar KFCC10881 como uma estirpe progenitor para aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado. Em particular, um microrganismo mutante foi produzido ao se modificar KCCM11222P como uma estirpe progenitora para aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-treonina a um nível elevado.
[033] O microrganismo Corynebacterium sp. com capacidade de produzir L-lisina pode ser um microrganismo que produza L-lisina com eficácia aumentada. Métodos para aumentar a eficácia de produção de L-lisina incluem um método para amplificar um gene que está envolvido na via da biossíntese da L-lisina ou para modificar o promotor do gene para aumentar a atividade enzimática. Exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese da L-lisina incluem aspartate aminotransferase, aspartoquinas, aspartato semialdeído desidrogenase, piruvato carboxilase, dihidrodipicolato reductase, dhidrodipicolinato sintase, diaminopimeato decarboxilase e semelhantes As patente anteriores relacionadas com promotores derivados das bactérias do tipo Coryne incluem W009/096690 que se refere-se ao promotor melhorado de dihidrodipicolinato reductase e Patente Coreana Concedida No. 0930203 que divulga os promotores melhorados de aspartoquinase e aspartato semialdeído desidrogenase. Também a Patente Coreana Concedida No. 0924065 divulga um método de melhorar a produção de L-lisina ao introduzir uma ou mais cópias dos genes relacionados com a biossíntese acima mencionada e ao substituir os promotores dos genes com fortes promotores exógenos.
[034] O microrganismo Corynebacterium sp. com capacidade de produzir L-treonina pode ser um microrganismo que produza L-treonina com eficácia aumentada. De forma a optimizar a capacidade de produzir L-treonina, podem ser utilizados métodos convencionais pelos especialistas na técnica tais como, não só a aquisição demutantes auxotróficos, mutantes resistentes análogos, mutantes regulatórios de metabolismo, mas também a construção de estirpes recombinantes com atividade aumentada da enzima biosintética de L-teonina. Por exemplo, uma estirpe mutante ou uma estirpe recombinante pode ser modificada de modo a que a enzima biosintética da L-treonina não se submeta a inibição de feedback, ou uma estirpe recombinante pode ser modificada para aumentar a expressão do gene das enzimas biosintéticas da L-treonina. Na modificação da estirpe que produz L-treonina por estes métodos, as propriedades, tais como auxotrofia, resistência análoga e mutações regulatórias do metabolismo podem ser facultadas isoladamente ou em combinação. Se a atividade da enzima biosintética da L-treonina for intensificada, a atividade de uma ou mais destas enzimas pode igualmente ser intensificada. Exemplos do gene codificador da enzima biosintética L-treonina incluem o gene da aspartoquinase III (lysC), o gene aspartato semialdeído desidrogenase (asd), gene aspartoquinase I (thrA), gene homoserina quinase (thrB) e gene treonina sintase (thrC) os quais se encontram incluídos no operon thr. A atividade da enzima biosintética L-treonina pode ser aumentada ao se introduzir uma mutação para o gene codificador da enzima ou ao se amplificar o gene para aumentar a atividade intracelular da enzima. Isto é possível utilizando tecnologia de recombinação genética. Também a produção de L- treonina pode ser aumentada ao se eliminar a atividade L-treonina desidrogenase relacionada com a degradação da treonina. Para além das enzimas do sistema de degradação de L-treonina, a produção de L-treonina pode ser aumentada ao se reduzir ou eliminar enzimas que se encontram envolvidas na via glicolítica, o ciclo TCA ou o processo de cadeia respiratória, o qual afeta de modo adverso a produção de L-treonina, as enzimas que regulam a expressão dos genes ou as enzimas do sistema de biossintese do subproduto. Exemplos de um método para melhorar a eficácia de produção de L-treonina incluem um método para modificar o microrganismo para intensificar a expressão de enzimas que se encontram envolvidas na via da biossintese da L-treonina. Enzimas que se encontram envolvidas na biossintese da L-treonina incluem homoserina desidrogenase, homoserina quinase, treonina sintase e exportador de treonina. Outros exemplos de um método para aplicar ou intensificar a capacidade para produzir L-treonina incluem um método para introdução de uma mutação para tornar a homoserina desidrogenase resistente ao feedback por treonina (Patente norte-americana No 6,649,379). Num exemplo específico da presente invenção, o microrganismo mutante KFCC10881 -THR (número de acesso: KCCM11222P) foi produzido ao modificar KFCC10881 para ter resistência ao análogo AHV L-treonina (2- amino-3-hidroxi-valerato).
[035] Especificamente, o microrganismo Corynebacterium sp. pode ser um microrganismo Corynebacterium sp. modificado por produzir altas concentrações de L-aminoácido e riboflavina, o qual é obtido pela modificação dum microrganismo Corynebacterium sp. sp. com capacidade de produção de L-aminoácido de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-aminoácido a um nível elevado, como um resultado de intensificar a atividade de enzimas que são expressadas pelo operon rib. Para além disso, pode ser um microrganismo obtido por se intensificar a atividade da enzima que é expressada pela família de genes da biossíntese da riboflavina do operon rib.
[036] O método para intensificar a atividade da enzima pode ser, por exemplo, um ou mais selecionados do grupo que consiste de um método para aumentar o número de cópias intracelulares de um gene codificador de cada enzima do "operon ou família de enzimas" (doravante referidas como "família de enzimas"), um método para introduzir uma mutação numa sequência regulatória de expressão para o gene cromossómico codificador de cada enzima da família de enzimas, um método para substituir a sequência regulatória de expressão para o gene cromossómico codificador de cada enzima da família de enzimas com uma sequência com atividade forte, um método para substituir o gene cromossómico codificador da enzima com um gene modificado para aumentar a atividade da família de enzimas e um método para introduzir uma mutação no gene cromossómico codificador de cada enzima ou da família de enzimas para intensificar a atividade da família de genes, não se limitando, no entanto, as estas funções. Este método pode ser realizado por vários métodos conhecido da técnica. Especificamente, o método pode ser um método de substituição da sequência regulatória pelo gene cromossómico que codifica a família de enzimas, a qual é expressada pelo operon rib, com um promotor forte, um método de introdução de um promotor forte a montante do gene cromossómico que codifica o RibG (pirimidina deaminase-reductase) localizado à frente da família de genes da biossíntese da riboflavina ou um método para aumentar o número de cópias intracelulares do gene que codifica tanto a família de enzimas que é expressada pelo operon rib tanto como a família de enzimas que é expressada pela família de genes da biossíntese da riboflavina.
[037] A Expressão "aumentar o número de cópias intracelulares" pode incluir o caso em que o gene codificador da enzima se encontra operacionalmente ligado no cromossoma para expressar a enzima de forma estável ou o caso em que um vetor que inclui o gene codificador da enzima é operacionalmente transformado para o cromossoma para expressar a enzima de fora estável. Tal como presentemente utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma construção ADN que contém a sequência de nucleotídeos de um gene operacionalmente ligado a uma sequência regulatória adequada de modo a expressar o gene alvo numa célula hospedeira adequada.
[038] Com base nos resultados obtidos pelo aumento do número de cópias do gene que codifica a enzima que é expressada pelo operon rib no ADN cromossómico, qualquer pessoa especialista na técnica poderia verificar que um aumento no número de cópias do gene que codifica a enzima que é expressada pelo operon rib fora do cromossoma, por um vetor, uma modificação da região regulatória do gene que codifica a enzima que é expressada pelo operon rib dentro ou fora do cromossoma ou uma modificação do próprio gene para aumentar a expressão teria o mesmo resultado.
[039] Quando um vetor é utilizado, é possível preparar um microrganismo com atividade intensificada da enzima que é expressada pelo operon rib, ao transformar um microrganismo da espécie Corynebacterium com capacidade de produção de L-aminoácido com um vetor recombinante com uma sequência de nucleotídeos introduzida na mesma. O vetor que pode ser utilizado na presente invenção não é especificamente limitado e um vetor conhecido pode ser utilizado na presente invenção. Exemplos de vetores que podem ser utilizados na presente invenção incluem vetores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322 e pMW118. Num exemplo específico da presente invenção, foi utilizado vpECCG117.
[040] Em procariotas, a sequência regulatória inclui um promotor com capacidade de iniciar a transcrição, qualquer operador para regular esta transcrição, um local de ligação de ribossoma(RBS) adequado que codifica um local de ligação mARN adequado, uma sequência para regular a terminação da transcrição e uma sequência para regular a terminação da translação.
[041] Em substituição ao promotor inerente localizado a montante do gene que codifica a enzima, pode ser utilizado um promotor optimizado com uma mutação de substituição de nucleotídeo gerado a partir do promotor inerente ou promotor heterogéneo. Exemplos do promotor heterogéneo incluem o promotor pcj7, o promotor lysCPI, o promotor EF-Tu, o promotor groEL, o promotor aceA, o promotor aceB e semelhantes. Especificamente, pode ser utilizado o promotor pcj7 ou o promotor lysCPI da Corynebacterium. Mais especificamente, pode ser utilizado o promotor lysCPI.
[042] Tal como presentemente utilizado, o termo "promotor lysCPI" refere- se a um promotor optimizado por substituição de nucleotídeos de uma região promotora do gene codificador do aspartato quinase e aspartato semialdeído desidrogenase e um promotor forte que aumenta o nível de expressão do gene do aspartato quinase para melhorar a atividade enzimática de forma a que esta seja aproximadamente 5 vezes mais do que a do tipo selvagem (WO 2009/096689). O promotor lysCPI pode ser resíduos de nucleotídeo 1 a 353 (SEQ ID NO: 6) of SEQ ID NO: 17, que inclui a sequência do promotor lysCPI e a parte do gene lysC-asd. Especificamente, o vetor foi construído de modo a que um promotor optimizado de SEQ ID NO: 5 incluindo uma mutação de substituição de nucleotídeo ou o promotor optimizado do gene lyc C, lysCPI da SEQ ID NO: 6, com uma forte atividade e indução de expressão pode ser introduzida no cromossoma da célula hospedeira. Métodos para expressar em excesso o gene alvo incluem um método para optimizer um promotor ao substituir alguns nucleotídeos da sequência promotora inerente por outros nucleotídeos para aumentar o nível de expressão ou um método para substituir um promotor por um promotor de outro gene com um nível de expressão elevada (WO 2009/096689).
[043] Tal como presentemente utilizado, o termo "transformação" significa toda uma ação de introduzir um gene para a célula hospedeira, da espécie Corynebacterium pela sua expressão na célula hospedeira. Neste sentido, o promotor e o gene são polinucleotídeos, incluindo ADN e ARN. Desde que o gene possa ser introduzido na célula hospedeira e expressado no mesmo, pode ser utilizado qualquer tipo do gene. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira numa forma de cassete de expressão que é uma construção de polinucleotídeos que inclui todos os elementos para expressar o gene. A cassete de expressão inclui um promotor o qual se encontra operacionalmente ligado ao gene, um sinal de terminação de transcrição, um RBS e um sinal de terminação de translação. A cassete de expressão pode ser uma forma de um vetor de expressão com capacidade de auto-replicação. O gene pode igualmente ser introduzido na célula hospedeira por si próprio ou numa construção de nucleotídeos para se ligar operacionalmente à sequência necessária para expressão na célula hospedeira.
[044] Métodos para transformar o vetor da presente invenção incluem qualquer método para introduzir ácido nucleico numa célula e uma técnica padrão de transformação adequada conhecida na técnica que possa ser selecionada dependendo da célula hospedeira. Exemplos do método de transformação incluem eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCI2), micro injeção, um método polietilenoglicol (PEG), um método DEAE-dextrano, um método lipossoma catiônico, um método acetato de lítio DMSO e semelhantes.
[045] A célula hospedeira na presente invenção pode ser uma célula na qual o ADN é introduzido com alta eficácia e expressado com alta eficácia. Especificamente, o microrganismo da espécie Corynebacterium pode ser utilizado com acima descrito. Mais especificamente, podem ser utilizados Corynebacterium glutamicum, em particular Corynebacterium glutamicum KFCC10881. Tal como o microrganismo que tem capacidade de produzir L- treonina, qualquer microrganismo capaz de produzir L-treonina pode ser utilizado sem limitação. Especificamente, KFCC10881-THR (número de acesso: KCCM11222P) pode ser utilizado.
[046] Especificamente, o microrganismo pode ser obtido por substituição do promotor localizado a montante da região cromossómica, a qual codifica a família de enzimas que é expressada pelo operon rib com o promotor de SEQ ID NO: 5, ou por substituição do promotor a montante do gene ribG com o promotor de SEQ ID NO: 6. Num exemplo específico da presente invenção, o promotor da estirpe KFCC10881 foi substituído pelo promotor de SEQ ID NO: 5, e como resultado, foi mostrado que a concentração média de L-lisina não sofreu alterações, mas a concentração média da riboflavina aumentou aproximadamente 61 vezes (Quadro 2). Igualmente, foi descoberto que, quando o promotor a montante do gene ribG foi substituído pelo promotor de SEQ ID NO: 6, a concentração média de riboflavina aumentou aproximadamente 73 vezes (Quadro 3), e quando o número de cópias do operon rib aumentou, a concentração média de riboflavina aumentou 66 vezes (Quadro 4). Para alem disso, foi igualmente descoberto que, quando o promotor da estirpe KFCC10881-THR produtor de L-treonina foi substituído pelo promotor de SEQ ID NO: 5 ou 6, a concentração média de L-treonina raramente sofreu alterações, mas as concentrações de riboflavina aumentaram em 56 vezes e 66 vezes, respectivamente (Quadro 6).
[047] Especificamente, um microrganismo da espécie Corynebacterium com a capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina pode ser modificado para produzir uma lata concentração de riboflavina juntamente com uma alta concentração de L-lisina ou L-treonina, ao introduzir um promotor forte na frente do gene codificador de Rpe (ribulose-5-fosfato-3-epimerase) localizado a montante do operon rib ou introduzindo um promotor forte a montante do gene codificador de RibG (pirimidina deaminase-reductase) localizado na frente da família de genes da biossíntese da riboflavina (FIG. 2), para intensificar a atividade da família de enzimas codificada pelo operon rib ou família de genes da biossíntese da riboflavina. Num exemplo específico da presente invenção, foi descoberto que foi observada uma mutação numa sequência de nucleotídeos de -10° a -16° resíduos nucleotídeos do rpe localizado a montante do operon rib da estirpe KCCM11223P. Deste modo, a região promotora esperada (SEQ ID NO: 5) do operon rib da estirpe KCCM11223P foi clonada e depois introduzida no cromossoma de uma estirpe progenitora com capacidade de produção de L-lisina e, como resultado, foi descoberto que a produção de riboflavina na estirpe aumentou para um nível semelhante do da estirpe KCCM11223P enquanto a produção de L-lisina se manteve (Quadro 2). Consequentemente, previu-se que a produção de riboflavina aumentaria pela intensificação do operon rib, e foi introduzido um forte promotor a montante do ribG localizado na frente da família de genes da biossintese da riboflavina no operon rib. Como resultado, foi mostrado que a produção de riboflavina na estirpe modificada aumentou em aproximadamente 73 vezes por comparação à estirpe progenitora (Quadro 3). Mais ainda, foi descoberto que, mesmo quando o número de cópias do operon rib aumentou, a produção de riboflavina aumentou para um nível semelhante ao nível de utilização do promotor forte (Quadro 4). Para além disso, quando o promotor a montante de rpe na estirpe progenitora com capacidade de produção de L-treonina foi substituído pelo promotor de SEQ ID NO: 5, de acordo com a presente invenção, e quando um promotor forte foi introduzido a montante de ribG, foi descoberto que a produção de riboflavina aumentou em aproximadamente 60-70 vezes enquanto a produção de L-treonina se manteve a um nível semelhante ao da estirpe progenitora (Quadro 6). Assim, foi descoberto que o microrganismo da espécie Corynebacterium, da presente invenção, obtido pela modificação da estirpe progenitora para aumentar a produção de riboflavina ao mesmo tempo que mantém a produção de aminoácido a um nível elevado pode produzir altas concentrações de L-aminoácido e riboflavina ao mesmo tempo.
[048] Especificamente, o microrganismo da espécie Corynebacterium modificado que produz L-lisina e riboflavina em simultâneo pode ser um Corynebacterium glutamicum (número de acesso: KCCM11223P) modificada pela indução de mutação aleatória numa Corynebacterium glutamicum com capacidade de produção de L-lisina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina a um nível elevado. Mais ainda, pode ser um Corynebacterium glutamicum modificado (número de acesso: KCCM11220P, KCCM11221P ou KCCM11223P) obtida pela modificação do microrganismo da espécie Corynebacterium com capacidade de produção de L-lisina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina a um nível elevado e como resultado de intensificar a atividade da família de enzimas que é expressada pelo operon rib que inclui a família de genes da biossíntese da riboflavina.
[049] Ao realizarem a mutagênese aleatória para aumentar o fluxo de carbono na via pentose-fosfato da estirpe produtora de L-lisina, os autores da presente invenção descobr-ram uma colônia microbiana com uma cor amarelo vivo e descobriram que a produção de riboflavina no microrganismo mutante aumentou em aproximadamente 60 vezes, enquanto a produção de L-lisina se manteve a um nível semelhante ao da estirpe progenitora (Quadro 1). Os autores da presente invenção determinaram que esta característica da estirpe mutante é útil na produção de aditivos alimentares que devem conter aminoácido e riboflavina a uma proporção constante. Deste modo, a estirpe mutante de acordo com a presente invenção foi denominada “Corynebacterium glutamicum CA01-2183” ou “KFCC10881-YC” e depositada junto do Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Coreia) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCCM11223P. Para além disso, a estirpe mutante obtida pela introdução do promotor Pmrb no promotor do operon rib da estirpe progenitora KFCC10881 foi “Corynebacterium glutamicum CA01-2162” ou “KFCC10881 ::Pmrb" e depositada junto do Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Coreia) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCCM11221P. Para além disso, a estirpe obtida ela introdução de lysCPI a montante do códon de iniciação do gene ribG da estirpe progenitora KFCC10881 foi denominada “Corynebacterium glutamicum CA01-2161” ou “KFCC10881::lysCP1_ribG”. Foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Coreia) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCCM11220P.
[050] A proporção de L-aminoácido e riboflavina no meio de cultura fermentada, produzida em simultâneo pelo método da presente invenção é 1:0.0001-0.1. Se o L-aminoácido é L-lisina, a proporção de L-lisina e riboflavina é especificamente 1:0.001-0.05, e mais especificamente 1:0.003-0.01. Se o L- aminoácido é L-treonina, a proporção de L-treonina e riboflavina é especificamente 1:0,001-0,, e mais especificamente 1:0,005-0,05.
[051] A cultura do microrganismo da espécie Corynebacterium pode ser realizada num meio adequado por vários métodos de cultura conhecidos na técnica (Chmiel, Bipprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik ,Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994). Exemplos do método de cultura incluem cultura descontínua, cultura semi-descontínua e cultura contínua. Exemplos da cultura em batelada incluem a cultura em batelada e cultura em batelada repetida, sem se restringir a estas.
[052] Para além disso, um meio que pode ser utilizado na cultura da presente invenção pode ser um meio adequado conhecido na técnica dependendo do método de cultura e estirpe selecionados ("Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology, Washington D.C., EUA, 1981). O meio que é utilizado na presente invenção contém várias fontes de carbono, fontes de azoto e elementos característicos. O meio para cultura de microrganismos Corynebacterium pode conter como fontes de carbono, sacarose, glicose, frutose, gordura, ácidos gordos, álcool, ácidos orgânicos e semelhantes. Exemplos específicos de fontes de carbono que podem ser utilizadas na presente invenção incluem hidratos de carbono, tais como melaço, glicose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco, ácidos gordos tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois tais como glicerol e etanol e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Estas fontes de carbono podem ser utilizadas numa quantidade adequada. Exemplos de fontes de azoto que podem ser utilizadas na presente invenção incluem fontes de azoto orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina, hidrolisados de bolo de soja e fontes de azoto inorgânicas, tais como, ureia, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. Estas fontes de azoto podem ser utilizadas individualmente ou em combinação. O meio pode conter, como fontes de fósforo, sais monobásicos de fosfato de potássio, sais dibásicos de fosfato de potássio e respectivos sais que contêm sódio. O meio pode conter sais de metal tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Para além disso, o meio pode conter aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Estas fontes ou precursores podem ser adicionados ao meio numa forma descontínua ou contínua.
[053] Compostos, tais como hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, amónia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados ao meio duma forma adequada durante a cultura como forma de ajustar o pH do meio de cultura. Para além disso, durante a cultura, pode ser utilizado um agente anti- espuma, tal como, éster poli glicólico de ácido graxo para suprimir a formação de espuma. Mais ainda, de modo a manter o meio de cultura num estado aeróbico, pode ser injetado oxigênio ou gás que contenha oxigênio (por ex. ar) no meio de cultura. O meio de cultura pode ser tipicamente mantido a uma temperatura que oscile entre 20 °C e 45 °C, e especificamente entre 25 °C e 40 °C. No que respeita ao período de cultura, a cultura pode ser continuada até que se obtenha o nível desejado de L-aminoácido. Especificamente, o período de cultura pode ser de 10-160 horas.
[054] O método da presente invenção pode ainda incluir uma fase de granulação do meio de cultura fermentado que inclui L-aminoácido e riboflavina. O meio de cultura fermentado pode conter um sedimento bacteriano ou pode estar isento de sedimento bacteriano. Para se remover o sedimento bacteriano, o método pode ainda incluir uma fase de remoção de sedimento bacteriano do meio de cultura fermentado que contenha L-treonina e riboflavina.
[055] Se o meio de cultura fermentado contiver sedimento bacteriano, pode ser produzida uma formulação granular, a qual não requer uma operação de filtração para remover o sedimento bacteriano e possui uma propriedade baixa de absorção de humidade mesmo quando um agente de impedimento de absorção de humidade não seja adicionado à mesma. Igualmente, a formulação granular possui boa fluidez e elevada densidade aparente e o teor de aminoácido da mesma pode ser controlado. O método de granulação ode ser realizado utilizando o método descrito em, por exemplo, no pedido Registo de Patente Coreana No. 0838200 ou No. 0338578. Especificamente, o método de granulação pode incluir a fase de: concentrar o cado de fermentação; adicionando um excipiente ao concentrado para formar um concentrado misto; introduzindo sementes particuladas com um tamanho de 200-500 /zni numa máquina de granulação; e pulverizando o concentrado misto a partir do fundo da máquina de granulação ao mesmo tempo que se adiciona ar quente para revestir as sementes particuladas com o concentrado enquanto de formam o granulado, não se limitando, no entanto, a tal.
[056] Se o caldo de fermentação não contiver sedimento bacteriano, o método de granulação pode incluir a fase de: filtração do meio de cultura fermentado para remover o sedimento bacteriano; concentração do filtrado; secagem do concentrado para formar o granulado; e revestimento dos grânulos com um agente de revestimento tal como um excipiente ou um agente de impedimento de absorção de humidade, não se limitando a estas.
[057] O sedimento bacteriano pode ser removido do meio de cultura fermentado ao se separar L-aminoácido e riboflavina utilizando métodos, tais como, de centrifugação, de filtração, cromatografia de permuta iónica e cristalização. Especificamente, L-aminoácido e riboflavina podem ser separados por centrifugação do meio de cultura fermentado a baixa velocidade para remover o sedimento bacteriano e separar o sobrenadante por cromatografia de permuta iónica, mas não se limitando a tal.
[058] Num outro aspecto, a presente invenção apresenta um microrganismo Corynebacterium glutamicum modificado, o qual é obtido pela indução de mutação aleatória num microrganismo Corynebacterium glutamicum com capacidade de produção de L-lisina a alta concentração de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina a um nível elevado, em que o microrganismo Corynebacterium glutamicum modificado é depositado sob o n° de acesso KCCM11223P.
[059] O microrganismo encontra-se descrito acima.
[060] Ainda num outro aspecto, a presente invenção apresenta um microrganismo Corynebacterium sp. modificado para produzir L-lisina ou L- treonina e riboflavina, o qual é obtido ao se intensificar a atividade de uma família de enzima que é expressada pelo operon rib que compreende a família de genes da biossíntese de riboflavina num microrganismo da espécie Corynebacterium com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado.
[061] Presentemente, o microrganismo, a intensificação da família de enzimas e o microrganismo de Corynebacterium sp. são acima descritos.
[062] Ainda num outro aspecto, a presente invenção apresenta uma formulação granular preparada por um método que inclui: a) cultura de um microrganismo que seja obtido pela modificação de um microrganismo de Corynebacterium sp. com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado; e produzindo L-lisina ou L-treonina e riboflavina por um processo de fermentação; e b) granulação do meio de cultura fermentado da fase a), que inclui L-lisina ou L-treonina e riboflavina.
[063] Especificamente, o aminoácido pode ser L-lisina ou L-treonina. O microrganismo modificado encontra-se descrito acima.
[064] O método para preparação da formulação granular pode ainda incluir uma fase de remoção do sedimento bacteriano do meio de cultura fermentado da fase a) que inclui L-lisina ou L-treonina e riboflavina. Por outras palavras, tal como acima descrito, a formulação granular da presente invenção pode conter ou não sedimento bacteriano.
[065] Especificamente, a proporção de L-lisina ou L-treonina: riboflavina na formulação granular pode ser 1:0,0001-0,01 tal como acima descrito.
[066] Tal como presentemente utilizado, o termo "formulação granular" significa formulação tipo grânulo que ultrapassa as desvantagens das formulações de energia convencionais, tais como geração de pó e perda de produto.
[067] Ainda num outro aspecto, a presente invenção apresenta uma formulação que inclui L-lisina ou L-treonina e riboflavina, a formulação é preparada por um método que inclui: a) cultura de um microrganismo que seja obtido pela modificação de um microrganismo de Corynebacterium sp. com capacidade de produção de L-lisina ou L-treonina de modo a aumentar a produção de riboflavina, mantendo ao mesmo tempo a produção de L-lisina ou L-treonina a um nível elevado; e produzindo L-lisina ou L-treonina e riboflavina por um processo de fermentação; e
[068] b) remoção de um sedimento bacteriano do meio de cultura fermentado da etapa a) que inclui L-lisina ou L-treonina e riboflavina.
[069] Especificamente, a proporção de L-lisina ou L-treonina: riboflavina na formulação pode ser 1:0,0001 -0,01 tal como acima descrito.
[070] Ainda num outro aspecto, a presente invenção apresenta um alimento ou aditivo alimentar, o qual inclui a formulação granular acima descrita ou a formulação que inclui L-lisina, L-treonina e riboflavina.
[071] Em altas concentrações de L-lisina ou L-treonina e riboflavina produzidas num exemplo específico da presente invenção, a proporção de lisina: riboflavina era de aproximadamente 1:0,005 ou a proporção de L- treonina:riboflavina era de 1:0,03 (ver Quadros 1 a 6).. Os requisitos para componentes nos alimentos animais são de aproximadamente 1-5 g/kg para L- lisina, aproximadamente 0,6-3,3 g/kg para L-treonina e 2-4 g/kg para riboflavina, o que é aproximadamente 0,1% das necessidades de L-lisina (NRC 1998. National Academy of Sciences- National Research Council, Washington, D.C.), e toxicidade e administração de grandes quantidades de L-lisina ou L- treonina e riboflavina não foram reportadas. Deste modo, foi descoberto que L- aminoácido e riboflavina produzidos em simultâneo pelo método da presente invenção são adequados para utilização como aditivos alimentares.
[072] Especificamente, o aminoácido pode ser L-lisina ou L-treonina.
[073] Especificamente, a proporção de L-lisina ou L-treonina: riboflavina no alimento ou aditivo alimentar pode ser 1:0,0001-0,01 tal como acima descrito.
[074] O alimento da presente invenção pode ser preparado ao se preparar um aditivo alimentar que inclua L-aminoácido e riboflavina e ao se misturar o aditivo alimentar com o alimento ou adicionar o aditivo alimentar diretamente ao alimento durante a preparação do mesmo. O L-aminoácido e riboflavina no alimento da presente invenção pode encontrar-se em estado líquido ou estado seco e, especificamente, na forma de pó seco. Exemplos de um método de secagem que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não se limitam a, secagem ao ar, secagem natural, secagem por pulverização e liofilizaçáo. A ração pode incluir, para além de L-aminoácido e riboflavina da presente invenção, aditivos convencionais com capacidade de intensificar características conservantes do alimento.
[075] O aditivo para rações da presente invenção pode ainda incluir outros microrganismos não patogênicos. Microrganismos que podem ser adicionados ao aditivo alimentar da presente invenção podes ser selecionados do grupo que consiste em Bacillus subtilis com capacidade de produzir protease, lipase e enzima conversora de glucose, espécie do género Lactobacillus que possui atividade fisiológica e capacidade de degradar o organismo em condições anaeróbicas, tal como, o estômago da vaca, fungos filamentosos, tais como Aspergillus oryzae que mostra os efeitos do aumento de peso dos animais, a produção do leite e a digestão/absorção da ração (J AnimaISci 43: 910-926, 1976), e levedura tal como Saccharomyces cerevisiae (J Anim Sei 56:735-739, 1983).
[076] Exemplos de rações que contêm o L-aminoácido e riboflavina incluem, mas sem que tal constitua limitação, rações vegetais, tais como grãos, raízes/frutos, subprodutos processadores de alimento, algas, fibras, subprodutos farmacêuticos, óleos e gorduras, amidos, cabaças e subprodutos granulados e alimentos animais, tal como, proteínas, materiais inorgânicos, óleos e gorduras, minerais, proteínas unicelulares, plâncton animal e resíduos alimentares.
[077] Aditivos para rações que compreendam o L-aminoácido e riboflavina da presente invenção incluem, mas sem que tal constitua qualquer limitação, um aglutinante, um emulsionante e um conservante, os quais são adicionados de modo a revenir deterioração em qualidade, aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticas, agentes aromáticos, compostos de azoto não proteicos, silicatos, tampão, corantes, agentes de extração e oligossacarídeos, os quais são adicionados para aumentar efeitos e outras misturas alimentares.
[078] Doravante, a presente invenção será descrita em maior detalhe com referência aos exemplos. No entanto, subentende-se que estes exemplos têm um fim meramente ilustrativo e não devem ser utilizados para limitar o âmbito da presente invenção.
[079] Neste exemplo, de modo a aumentar o fluxo de carbono na via pentose-fosfato, que é a maior fonte de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH) necessário para a produção de L-aminoácido , foi realizada uma experiência para conferir adaptabilidade para alta concentração de ácido glucônico para a estirpe Corynebacterium glutamicum.
[080] Uma mutação artificial em KFCC10881 (Patente Coreana No. 0159812), como uma estirpe progenitora, foi induzida por N-metil-N-nitro-N- nitroguanidina (NTG) e depois a estirpe foi colocada em cultura na seguinte placa de meio contendo 20 g/ £ de ácido glucônico enquanto as estirpes que formavam colônias mais rapidamente que um grupo de controlo não tratado com NTG foram isoladas. No caso do grupo de controlo, o diâmetro médio das colônias formadas a 60 horas era de cerca de 0,5 mm, enquanto no caso do grupo tratado com NTG, o diâmetro das colônias atingiu 1 mm em 40 horas de cultura. Entre as colônias, foi descoberta uma colônia com uma cor amarelo vivo ao contrário do grupo de controlo e, deste modo, esperou-se que um mutante com um novo caracter pudesse ser produzido. Esta estirpe foi denominada “Corynebacterium glutamicum CA01-2183”, ou “KFCC10881-YC” e foi examinada a causa do desenvolvimento da cor. A estirpe mutante, KFCC10881-YC foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCCM11223P.
[081] Composição do meio da placa (pH 7,0)
[082] 20 g de ácido glucônico, 50 g de (NH4)2SO4, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 5 g K2HPO4, 10 g de K2HPO4, 0,5 g MgSO4-7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de cloreto de tiamina, 2000 μg de ácido pantoténico de cálcio, 2000 μg de nicotinamida e 20 g de agar (por litro de água destilada).
[083] De modo a examinar as características da estirpe KFCC10881-YC preparada no Exemplo 1 acima, a estirpe foi colocada em cultura da seguinte forma para se comparar a capacidade de produção de L-lisina e os componentes do meio de cultura foram igualmente analisados.
[084] Especificamente, cada estirpe foi inoculada num balão de Erlenmeyer de fundo dividido (baffle) de 250 ml contendo 25 de meio de sementeira e depois colocada em cultura a 30 °C durante 20 horas com agitação a 200 rpm. Posteriormente, 1 ml da cultura de sementeira foi inoculada num balão de Erlenmeyer de fundo dividido (baffle) de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção e depois colocada em cultura a 30 °C durante 72 horas com agitação a 200 rpm. As composições de meio de sementeira e o meio de produção são como segue: Composição do meio de sementeira (pH 7,0)
[085] 20 g de glucose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g KH2PO4, 8 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de tiamina HCI, 2000 μg sal de cálcio ácido pantoténico e 2000 μg de nicotinamida (por litro de água destilada). Composição do meio de produção (pH 7,0)
[086] 100 g de glucose, 40 g de peptona, 2.5 g de extrato de levedura, 5 g de ureia, 1 g KH2PO4, 8 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de tiamina HCI, 2000 μg sal de cálcio ácido pantoténico e 3000 μg de nicotinamida e 30 g de CaCO3 (por litro de água destilada).
[087] Após conclusão da cultura, a estirpe KFCC10881-YC manteve a cor amarelo vivo e o sobrenadante da cultura tinha também uma cor amarela, ao contrário do meio de cultura do controlo KFCC10881. Consequentemente, os autores da presente invenção assumiram que o material que deu lugar a este desenvolvimento de cor estaria contido no meio de cultura. Para verificar este pressuposto, foram analisadas as concentrações de carotenoides e riboflavina que influenciam o desenvolvimento da cor no microrganismo. Como resultado, a concentração de riboflavina no meio de cultura revelou uma diferença evidente comparativamente ao controlo e não se verificou diferença significativa na concentração de carotenoides. As concentrações de L-lisina e riboflavina analisadas por HPLC foram apresentadas no Quadro 1 abaixo. Quadro 1: Concentrações de L-lisina e riboflavina produzidas em KFCC10881- YC.
[088] Consequentemente, tal como mostrado no Quadro 1, a concentração média de L-lisina em KFCC-10881-YC foi semelhante à da estirpe KFCC10881 produtora de L-lisina, mas a concentração média de riboflavina em KFCC10881-YC aumentou 57 vezes. Deste modo, poderia observar-se que a cor amarelo vivo da colônia, a qual e a característica distinta que distingue da estirpe progenitora, é atribuível ao aumento na concentração de riboflavina.
[089] De modo a investigar a mutação de nucleotídeos que induziu à alteração de cor e aumentou a capacidade de produção de riboflavina na estirpe KFCC10881-YC preparada no Exemplo 1, a sequência de nucleotídeos da região cromossómica relacionada com a biossíntese da riboflavina na estirpe KFCC-10881-YC da espécie Corynebacterium glutamicum foi determinada e confirmada com base na base de dados da NIH GenBank.
[090] Consequentemente, foi descoberto que os -10° a -16° resíduos nucleotídeos do códon de iniciação do gene rpe localizado a montante do operon rib tinha uma substituição G-para-A e uma substituição G-para-T respectivamente. O promotor com as duas substituições dos nucleotídeos na região esperada do promotor do operon rib foi denominada "Pmrb" (SEQ ID NO: 5).
[091] De modo a examinar o efeito do aumento na concentração de riboflavina por aumentos na expressão que induziu a atividade e atividade enzimática do promotor Pmrb que tinha as substituições de nucleotídeos, foi construído um vetor para introduzir o promotor no cromossoma
[092] Com base na sequência nucleotídea reportada, foram sintetizados um iniciador com local de enzima com restrição EcoRI inserido no terminal 5' e um iniciador com um local de enzima de restrição Sail inserido no terminal 3' (SEQ ID NOS: 7 e 8). Utilizando os promotores, foi executada a PCR com o cromossoma de KFCC10881-YC como modelo para amplificar um fragmento de gene de 650-bp Pm-rpe, incluindo uma região de 350 bp, que se espera ser o promotor do operon rib. A PCR foi executada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 °C durante 5 minutos e depois 30 ciclos, constituído cada um por desnaturação a 94 °C durante 30 seg., “hibridação” a 56 °C durante 30 seg. e extensão a 72 °C durante 40 seg., seguido de extensão final a 72 °C durante 7 min. Os iniciadores utilizados na PCR são os seguintes: SEQ ID NO. 7. 5'-tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctc-3' SEQ ID NO. 8. 5'-tttgtcgacattccgctaaaacacgt-3'
[093] O fragmento de gene amplificado por PCR foi tratado com as enzimas de restrição EcoRI e Sail para obter um fragmento de ADN que foi depois ligado a um vetor pDZ (publicação de patente coreana n.° 2009- 0094433) que possui os locais EcoRI e Sail nas extremidades, para introdução no cromossoma. Depois, o vetor foi transformado em E.coli DH5a, que foi depois aplicado em placa com meio sólido LB, contendo canamicina (25 mg/l). A colônia transformada com o vetor que compreende o gene desejado foi rastreada por PCR e depois foi obtido um plasmídeo empregando um método de extração de plasmídeos conhecido da técnica. Este plasmídeo foi designado “pDZ-Pmrb” (FIG. 3).
[094] O vetor pDZ-Pmrb preparado no exemplo 3 foi transformado na estirpe produtora de L-lisina Corynebacterium glutamicum KFCC10881 por meio de recombinação cromossómica. Depois, uma estirpe com uma mutação no promotor do operon rib introduzido no cromossoma foi separado com base numa alteração da cor das colônias e foi cultivado de modo igual ao descrito no exemplo 2 e as concentrações de L-lisina e riboflavina recolhidas da cultura foram analisadas (quadro 2). A estirpe em que foi introduzida a mutação do promotor do operon rib, foi designada “Corynebacterium glutamicum CA01- 2162” ou “KFCC10881::Pmrb”. A estirpe mutante, KFCC10881 ::Pmrb foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCCM11221P. Quadro 2: Análise da produção de L-lisina e riboflavina através da introdução de uma mutação promotora
[095] Em resultado, como se pode observar no quadro 2, a concentração média de L-lisina no caso de KFCC10881::Pmrb (grupo de ensaio 4) introduzido com o Pmrb promotor com duas mutações de substituição de nucleotídeos, não sofreu alterações em comparação com a do controlo KFCC10881 (grupo de ensaio 3) que possui o promotor do gene rpe de tipo selvagem, mas a concentração média da riboflavina no grupo de ensaio 4 foi 61 vezes mais.
[096] Para superexpressar unicamente o gene do grupo de biossíntese da riboflavina, excluindo o gene rpe, foi ligado um promotor forte derivado de Corynebacterium ao códon de iniciação do gene ribG (SEQ ID NO 4) localizado na frente da família de genes de biossíntese rib, construindo assim um vetor recombinante para induzir a expressão da família de genes de biossíntese da riboflavina.
[097] Para obter um fragmento de gene ribG derivado de Corynebacterium glutamicum, o ADN cromossómico de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 foi preparado como um um modelo e foram sintetizados os iniciadores (SEQ ID NO: 9 e 10) concebidos para terem um local de enzima de restrição EcoRI na extremidade 5' e um local da enzima de restrição Xbal na extremidade 3'. Foi executada PCR utilizando os iniciadores sintetizados para obter um fragmento de ADN compreendendo uma região de 300 bp a montante do códon de iniciação do gene ribG. Foram também sintetizados iniciadores (SEQ ID NO: 11 e 12) concebidos para possuir locais da enzima de restrição Xbal e Ndel na extremidade 5' e um local da enzima de restrição Sail na extremidade 3' e foi executada PCR utilizando os iniciadores sintetizados para se obter um fragmento de 300 bp compreendendo o códon de iniciação do gene ribG. A PCR foi executada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 °C durante 5 minutos e depois 30 ciclos, constituído cada um por desnaturação a 94 °C durante 30 seg., “hibridação” a 56 °C durante 30 seg. e extensão a 72 °C durante 30 seg., seguido de extensão final a 72 °C durante 7 min. Os dois produtos PCR foram tratados com EcoRI e Xbal e Sail respectivamente e depois foram ligados com um fragmento de ADN obtido por meio do tratamento de um vetor pDZ com as enzimas de restrição Sail e EcoRI, construindo assim um vetor pDZ-ribG. As sequências dos iiniciadores utilizados na PCR são os seguintes: SEQ ID NO. 9: 5'- tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctcc-3' SEQ ID NO. 10: 5'- tttctagattactgcgcgagtgctc-3' SEQ ID NO. 11:5'- ttttctagataacatatggatgttgcgcacgcg-3' SEQ ID NO. 12: 5'- tttgtcgacattggcgtaaaacacgt-3'
[098] Os iniciadores (SEQ ID NOS: 13 e 14) concebidos para amplificar o promotor lysCPI derivado de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 6) e para terem um local enzima de restrição Xbal inserido na extremidade 5' e um local enzima de restrição Ndel inserido na extremidade 3‘. Utilizando os iniciadores, foi executada a PCR com o ADN cromossómico da estirpe de cromossoma de Corynebacterium glutamicum como modelo para amplificar um fragmento promotor de cerca de 400-bp. A PCR foi executada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 °C durante 5 minutos e depois 30 ciclos, constituído cada um por desnaturação a 94 °C durante 30 seg., “hibridação” a 58 °C durante 30 seg. e extensão a 72 °C durante 30 seg., seguido de extensão final a 72 °C durante 7 min. O produto da amplificação PCR foi tratado com Xbal e Ndel e depois foi ligado com um fragmento de ADN obtido por meio do tratamento de um vetor pDZ-ribG com Xbal e Ndel, construindo assim um vetor pDZ-lysCP1_ribG (FIG. 4). As sequências iniciadoras utilizadas na PCR são os seguintes: SEQ ID NO. 13: 5'-ttttctagatagggagccatcttttgggg-3' SEQ ID NO: 14: 5'-tttcatatgctttgtgcacctttcg-3'
[099] O vetor pDZ-lysCP1_ribG preparado no exemplo 5 foi transformado na estirpe produtora de L-lisina Corynebacterium glutamicum KFCC10881 por meio do método de impulsos eléctricos. Uma estirpe com LysCPI em substituição do promotor inerente do gene cromossómico ribG foi isolada selectivamente, obtendo-se assim KFCC10881::lysCP1_ribG que produz tanto L-lisina como riboflavina. Esta estirpe foi cultivada de modo igual ao descrito no exemplo 2 e as concentrações de L-lisina e riboflavina no meio de cultura foram analisadas (quadro 3). A estirpe KFCC10881 ::lysCP1_ribG foi designada "Corynebacterium glutamicum CA01-216T ou “KFCC10881::lysCP1_ribG”. Esta estirpe mutante KFCC10881 ::lysCP1_ribG foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Coreia) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCCM11220P. Quadro 3: Análise da produção de L-lisina e riboflavina através da introdução do promotor
[0100] Em resultado, como se mostra no quadro 2, quando ribG é superexpressado utilizando o promotor lysCPI (grupo de ensaio 6), a concentração média de L-lisina raramente sofreu alterações em comparação com o controlo KFCC10881 (grupo de ensaio 5), com um promotor de tipo selvagem, mas a concentração de riboflavina aumentou cerca de 73 vezes.
[0101] Pode-se assim observar que, quando o operon da biossíntese de riboflavina foi superexpressado recorrendo a um promotor heterogéneo, a produção de riboflavina pode aumentar muito sem influenciar a produção de lisina e à medida que a atividade indutora da expressão se foi tornando mais intensa, a produção de riboflavina aumentou por meio de superexpressão da família de genes da biossíntese da riboflavina.
[0102] Exemplo 7: Comparação das produtividades de lisina e riboflavina de Construção de uma estirpe com número de cópias do operon rib aumentado.
[0103] Foi introduzido um plasmídeo compreendendo o operon rib na estirpe KFCC10881 para aumentar o número de cópias do gene da biossíntese da riboflavina e foi examinada a capacidade de produção de riboflavina pela estirpe.
[0104] Com base na sequência de nucleotídeos reportada, foram sintetizados um iniciador com local de enzima com restrição Xbal inserido no terminal 5' e um iniciador com o mesmo local de enzima de restrição inserido no terminal 3' (SEQ ID NOS: 15 e 16) e, utilizando os iniciadores, foi executada a PCR com o cromossoma de KFCC10881 como modelo para amplificar um operon rib de cerca de 4500-bp. A PCR foi executada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 °C durante 5 minutos e depois 30 ciclos, constituído cada um por desnaturação a 94 °C durante 30 seg., “hibridação” a 56 °C durante 30 seg. e extensão a 72 °C durante 4 min., seguido de extensão final a 72 °C durante 7 min. SEQ ID NO. 15: 5'-TTTGGTACCGATTGAAAAGTCCGTGCGTG-3'; SEQ ID NO. 16: 5'-TTTGGTACCCGCGATCTTTTTCAGAAACT-3'
[0105] O fragmento de gene amplificado por PCR foi tratado com a enzima de restrição Xbal para obter um fragmento de ADN. O fragmento de ADN foi ligado a um vetor pECCGi 17 com os locais de restrição Xbal nas extremidades e o vetor foi transformado em E.coli DH5a, que foi depois aplicado em placa com meio sólido LB, contendo canamicina (25 mg/l). Depois, a colônia transformada com o vetor que compreende o gene desejado foi rastreado por PCR e depois foi obtido um plasmídeo empregando um método de extração de plasmídeos conhecido da técnica. Este plasmídeo foi designado “pECCG117- rib”.
[0106] O vetor pECCG117-rib preparado como descrito acima foi introduzido na estirpe KFCC10881 melo método de impulsos eléctricos e cultivada de modo igual ao descrito no exemplo 2 e as concentrações de L- lisina e riboflavina no meio de cultura foram analisadas (quadro 4). Quadro 4: Análise da produção de L-lisina e riboflavina através da introdução do plasmídeo
[0107] Em resultado, verificou-se no quadro 4, no caso em que o número de cópias do operon rib foi aumentado através da introdução do plasmídeo (grupo de ensaio 8), a concentração média da L-lisina raramente sofreu alterações em comparação com o controlo KFCC10881 ::pECCG117 (grupo de ensaio 7) que contém o operon rib, mas a concentração de riboflavina aumentou cerca de 66 vezes.
[0108] Pode-se assim observar que, quando o gene da biossintese de riboflavina foi superexpressado através do aumento do número de cópias do operon da biossintese da riboflavina, recorrendo ao plasmídeo, a produção de riboflavina na estirpe pode ser aumentada muito sem influenciar a produção de lisina.
[0109] Neste exemplo, a fim de aumentar a capacidade de produção de L- treonina de Corynebacterium glutamicum, foi executada uma experiência para conferir resistência ao AHV análogo da L-treonina (2-amino-3-hidroxi-valerato). Especificamente, foi introduzida uma mutação artificial em KFCC10881 como uma estirpe progenitora, foi induzida por N-metil-N-nitro-N-nitroguanidina (NTG) e depois a estirpe foi colocada em cultura e meio mínimo contendo 1-10 g/l de AHV, enquanto se analisava se outras colônias eram formadas a várias concentrações de AHV em comparação com um grupo de controlo que não foi tratado com NTG. O grupo de controlo que não foi tratado com NTG revelou resistência a 1-3 g/l de AHV com 72 horas de cultura, mas no grupo tratado com NTG foram formadas colônias até uma concentração de AHV de 6 g/l no mesmo momento. A fim de examinar se a capacidade de produção de L- treonina das estirpes aumentou ou não, as estirpes foram cultivadas da seguinte forma, e a produção de L-treonina foi analisada.
[0110] Cada estirpe foi inoculada num balão de Erlenmeyer de fundo dividido (baffled) de 250 ml contendo 25 ml de meio de sementeira e depois colocada em cultura a 30 °C durante 20 horas com agitação a 200 rpm. Posteriormente, 1 ml da cultura de sementeira foi inoculada num balão de Erlenmeyer de fundo dividido (baffle) de 250 ml contendo 24 ml do meio de produção e depois colocada em cultura a 30 °C durante 48 horas com agitação a 200 rpm. As composições de meio de sementeira e o meio de produção são como segue: Composição do meio mínimo (pH 7,2)
[0111] 5 g de glucose, 1 g de KH2PO4, 5 g de (NH4)2SO4, 0,4 g de (NH4)2SO4, 0,5 g de NaCI, 200 μg de biotina, 100 μg de tiamina HCI, 100 μg de sal de cálcio do ácido pantoténico, 0,03 g nicotinamida, 0,01 g de L-treonina, 2 g de ureia, 0,09 mg de Na2B4O7l0H2O, 0,04 mg de (NH4)6Mo7O274H2O, 0,01 mg de ZnSO47H2O, 0,01 mg de CuSO45H2O, 0,01 mg de MnCI24H2O, 1 mg de FeCI36H2O, e 0,01 mg CaCI2 (por litro de água destilada). Composição do meio de sementeira (pH 7,0)
[0112] 20 g de glucose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g KH2PO4, 8 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4 7H2O, 100 μg de biotina, 1000 μg de tiamina HCI, 2000 μg sal de cálcio ácido pantoténico e 2000 μg de nicotinamida (por litro de água destilada). Composição do meio de produção (pH 7,0)
[0113] 100 g de glucose, 20 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g sólidos de milhocina, 3 g de ureia, 1 g KHKH2PO4, 0,5 g MgSO47H2O, 100 μg biotina, 1000 μg tiamina HCI, 2000 μg ácido pantoténico de cálcio, 3000 μg nicotinamida e 30 g CaCO3 (por litro de água destilada).
[0114] Depois de concluída a cultura, a concentração de L-treonina no meio de cultura foi analisada por HPLC e a estirpe mutante que apresentava a maior capacidade de produção de L-treonina foi designada "Corynebacterium glutamicum CA01-2182” ou “KFCC10881-THR”. A estirpe mutante, KFCC10881-THR foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (Yurim B/D, Honje 1-dong, Sudaemun-gu, Seoul, Korea) a 11 de Novembro de 2011 com o número de acesso KCKCCM11222P. A capacidade de produção de L-treonina de KFCC10881-THR encontra-se apresentada no quadro 5 seguinte. Quadro 5: Concentração de L-treonina produzida em KFCC10881-THR
[0115] No quadro 5 supra, o grupo de ensaio 9 indica a concentração média de L-treonina no controlo KFCC10881, e o grupo de ensaio 10 indica a concentração média de L-treonina em KFCC10881-THR.
[0116] Em resultado, como se pode observar no quadro 5 supra, a produção de L-treonina em KFCC10881-THR aumentou em cerca ed 5,6 g/l, em comparação com o de KFCC10881.
[0117] Cada um do vetor pDZ-Pmrb, preparado no exemplo 3 e o vetor pDZ-lysCP1_ribG preparado no exemplo 5 foi transformado na estirpe produtora de L-lisina KFCC10881 (preparada no exemplo 8) por meio do método de impulsos eléctricos. Depois, uma estirpe com Pmrb em substituição do promotor de tipo selvagem do gene rpm ou uma estirpe com lysCPI em substituição do promotor de tipo selvagem do gene ribG foi selectivamente isolada e cultivada de modo igual ao descrito no exemplo 7. As concentrações de L-treonina e riboflavina no meio de cultura foram analisadas (quadro 6). Quadro 6: Análise da produção de L-treonina e riboflavina através da introdução de mutação no promotor
[0118] Em resultado, como se pode observar no quadro 6, no caso de KFCC10881 :Pmrb (grupo de ensaio 12) compreendendo o Pmrb promotor com duas mutações de substituição de nucleotídeos, e KFCC10881- THR::lysCP1_ribG (grupo de ensaio 13), com RibG superexpressado pelo promotor lysCPI, as concentrações médias de L-treonina raramente sofreram alterações em comparação com do controlo KFCC10881-THR (grupo de ensaio 11) que possui os promotores dos genes rpe e ribG de tipo selvagem, mas a concentração média nas estirpes mutantes aumentou cerca de 56 vezes a 66 vezes, respectivamente.
[0119] Os resultados anteriormente descritos indicam que, quando o operon da biossíntese da riboflavina é superexpressado, a produção de riboflavina pode aumentar muito sem influenciar a produção de L-treonina, produzindo assim L-treonina e riboflavina ao mesmo tempo. Assim pode-se observar que, assim que a atividade indutora da expressão do operon da biossíntese da riboflavina na estirpe produtora de L-treonina se torna mais forte, a produção de riboflavina aumenta através da superexpressão da família de genes da biossíntese da riboflavina.
Claims (11)
1. Método para a produção de L-lisina ou L-treonina e riboflavina, caracterizado por compreender: a cultura de um micro-organismo Corynebacterium sp. modificado para produzir simultaneamente L-lisina ou L-treonina, e riboflavina, que é modificado por meio de aumento da atividade de uma família de enzimas de biossíntese de riboflavina em um micro-organismo Corynebacterium sp. com capacidade para a produção de L- lisina ou L-treonina, de forma a aumentar a produção de riboflavina, mantendo uma elevada concentração de produção de L-lisina ou L-treonina; e a produção de L-lisina ou L-treonina e riboflavina simultaneamente, em que o aumento da atividade da família de enzimas de biossíntese de riboflavina é realizado por um ou mais selecionados do grupo que consiste em um método para aumentar o número de cópias intracelulares de um gene que codifica cada enzima do operão rib compreendendo a família de enzimas de biossíntese de riboflavina e um método de substituir a sequência regulatória do gene cromossômico que codifica cada enzima do operão rib que compreende a família de enzimas da biossíntese de riboflavina por uma sequência estabelecida em SEQ ID NO: 5 ou 6.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo Corynebacterium sp. ser seleccionado do grupo constituído por Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o micro-organismo Corynebacterium sp. ser Corynebacterium glutamicum.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proporção de L-lisina ou L-treonina: riboflavina ser 1:0,0001-0,1.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a granulação do meio de cultura fermentado que compreende L- lisina ou L-treonina e riboflavina.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a remoção de um sedimento bacteriano do meio de cultura fermentado que compreende L-lisina ou L-treonina e riboflavina.
7. Micro-organismo Corynebacterium glutamicum modificado que é modificado por meio de indução de uma mutação aleatória num micro-organismo Corynebacterium glutamicum com capacidade para a produção de L-lisina ou L- treonina em altas concentrações, de forma a aumentar a produção de riboflavina, mantendo uma elevada concentração de produção de L-lisina ou L-treonina caracterizado por o micro-organismo Corynebacterium glutamicum modificado se encontrar depositado com o número de acesso KCCM11223P.
8. Micro-organismo Corynebacterium sp. modificado para a produção simultânea de L-lisina ou L-treonina e riboflavina, caracterizado por ser modificado por meio de aumento da atividade de uma família de enzimas que é expressada pelo operão rib, que compreende a família de genes da biossíntese da riboflavina, num micro-organismo Corynebacterium sp. com capacidade para a produção de L-lisina ou L-treonina, de forma a aumentar a produção de riboflavina, mantendo uma elevada concentração de produção de L-lisina ou L-treonina, em que o aumento da atividade da família de enzimas que é expresso pelo operão rib que compreende a família de genes de biossíntese de riboflavina é realizado por um ou mais selecionados do grupo que consiste em um método para aumentar o número de cópias intracelulares de um gene que codifica cada enzima do operão rib compreendendo família de enzimas de biossíntese de riboflavina e um método de substituição da sequência reguladora do gene cromossômico que codifica cada enzima do operão rib compreendendo família de enzimas de biossíntese de riboflavina com uma sequência estabelecida em SEQ ID NO: 5 ou 6.
9. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o micro-organismo Corynebacterium sp. ser selecionado do grupo constituído por Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum e Brevibacterium lactofermentum.
10. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o micro-organismo modificado destinado à produção simultânea de L-lisina e riboflavina ser um micro-organismo depositado com o número de acesso KCCM11220P, KCCM11221P ou KCCM11223P.
11. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o micro-organismo Corynebacterium sp. com capacidade de produção de L-treonina ser um micro-organismo depositado com o número de acesso KCCM11222P.
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