CN107475240A - 一种维生素b2高产菌株的筛选方法 - Google Patents

一种维生素b2高产菌株的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种维生素B2高产菌株的筛选方法，所述维生素B2高产菌株通过以下步骤得到：原始菌株预处理后，经过紫外和化学诱变，然后再经过代谢底物类似物驯化，最后再通过营养培养基和发酵培养基筛选得到。本发明综合利用物理、化学复合诱变和代谢底物类似物驯化，从而筛选出一种稳定、高产的维生素B2菌株，与原有菌株相比，克服现有技术中维生素B2产量不高的缺陷，在发酵周期不变的情况下，其维生素B2合成能力提高6g/L左右，发酵成本大幅度降低。

Description

一种维生素B2高产菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及一种菌株的筛选方法，具体说，是涉及一种维生素B2高产菌株的筛选方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
维生素B2(化学式：C17H20N4O6，式量376.37)又叫核黄素，是一种水溶性B族维生素。维生素B2是人和动物体必需的维生素之一，为黄素酶类辅酶的组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。
目前，工业上应用的维生素B2生产方法主要由化学合成法、化学半合成法和微生物发酵法三种。与化学合成法相比，微生物发酵法具有生产工艺简单、原料廉价以及对环境污染少、绿色可再生等优点。因此，生物方法生产维生素B2倍受世界维生素B2生产商的青睐，正在逐渐代替以石油为基础的化学合成法。
维生素B2的生物发酵过程是一个复杂的代谢过程，发酵菌株是影响微生物发酵产量和经济效益的关键因素之一。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)由于具有发酵周期短、原料要求简单等优点而广泛的用于维生素B2的微生物发酵中。尽管有上述优点，但是采用常规的枯草芽胞杆菌进行维生素B2的微生物发酵，其维生素B2的产量还是不够高，无法满足维生素B2工业的高产、节能要求。因此，需要对枯草芽胞杆菌进行诱变筛选，选出能高效合成维生素B2的枯草芽胞杆菌株。
传统意义上的菌株诱变多是通过诱变剂的作用造成对菌种的基因发生突变，导致菌株某些特性的改变。这种常规诱变，随机性较大，实验结果几乎无可重复性，且经过诱变的菌株不稳定，很容易在传代后恢复突变，造成菌株的不稳定，对菌株后续的筛选造成不利影响，进而不利于提高维生素B2的产量。因此，需要开发出一种新的枯草芽胞杆菌的筛选方法，以筛选出高产稳定的维生素B2菌株。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种维生素B2高产菌株的筛选方法，以克服现有技术中维生素B2产量不高的缺陷。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种维生素B2高产菌株的筛选方法，包括如下步骤：
a)原始菌株的预处理：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原始菌株(例如枯草芽孢杆菌168)涂布于平板培养基上进行培养，培养得到的平板用蒸馏水进行洗吹，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液；
b)将步骤a)得到的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株；
c)将步骤b)得到的紫外诱变菌株用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；
d)将步骤c)得到的复合诱变菌株接种到不同代谢底物类似物的基本培养基中进行培养驯化；
e)将经过上述步骤处理得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物接种到发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素B2最高的菌株。
作为优选方案，步骤a)中，平板培养基为：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化钠9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，琼脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-36小时。
作为优选方案，步骤b)中，紫外诱变时间为30-60s，诱变高度为40-80cm。
作为优选方案，步骤c)中，甲基磺酸乙酯诱变剂量为0.05-0.5mol/L，诱变时间为20-60分钟。
作为优选方案，步骤d)中，代谢底物类似物包括8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素，浓度为10-100mg/L；将上述代谢底物类似物进行随机组合，分别加入到经过紫外诱变、化学诱变后得到的复合诱变菌株的菌液中，在基本培养基中进行培养。培养得到的菌株每24小时进行一次传代培养，传代培养5-10天，以考察菌株的传代稳定性。
作为进一步优选方案，基本培养基为：葡萄糖4.5-5.5g/L，硫酸铵0.15-0.25g/L，磷酸氢二钾1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-0.7g/L，柠檬酸钠0.1-0.3g/L，色氨酸0.04-0.06g/L，琼脂粉15-17g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。
作为优选方案，步骤e)中，营养培养基为：葡萄糖9.5-10.5g/L，蛋白胨9.5-10.5g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，牛肉膏4.5-5.5g/L，氯化镁3.5-4.5g/L，琼脂15-17g/L，pH7.2；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。
作为优选方案，步骤e)中，发酵培养基为：葡萄糖80-90g/L，酵母粉8-15g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，柠檬酸钠4.5-5.5g/L，七水硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为48-72小时。
与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：
本发明综合利用物理、化学复合诱变和维生素B2合成代谢过程中重要代谢底物类似物驯化，使菌种发生定向性的改变，向维生素B2合成的方向进行，维生素B2的含量将会得到明显的提高，从而筛选出一种稳定、高产的维生素B2菌株，与原有菌株相比，克服现有技术中维生素B2产量不高的缺陷，在发酵周期不变的情况下，其维生素B2合成能力提高6g/L左右，发酵成本大幅度降低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案做进一步详细、完整地说明。
实施例
一种维生素B2高产菌株的筛选方法，包括如下步骤：
a)原始菌株的预处理：将80μl枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原始菌株的甘油菌均匀涂布于平板培养基上在37℃下培养24小时，平板培养基的组分为：酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉18g/L，pH7.0；培养24小时后，吸取5ml无菌蒸馏水至培养得到的平板上，接菌针刮去平板上的菌体，混合均匀后，吸取至无菌离心管中，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液，备用；
b)取2ml步骤a)得到的菌液滴于无菌空白培养平板上，在无菌条件下紫外诱变30s，得到紫外诱变菌株；
c)取0.2ml步骤b)得到的紫外诱变菌株的菌液，加入到0.1mol/L的甲基磺酸乙酯溶液中，补加无菌水至反应体系2ml，在37℃下摇床220rpm振荡30min，实现化学诱变，得到复合诱变菌株；
d)将浓度为10-100mg/L的代谢底物类似物：8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素，进行随机组合，分别加入到步骤c)得到的复合诱变菌株的菌液中，在基本培养基中进行培养驯化，基本培养基为：葡萄糖5g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸氢二钾1.8g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，柠檬酸钠0.2g/L，色氨酸0.05g/L，琼脂粉16g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24小时；驯化得到的菌株每24小时进行一次传代培养，传代培养5-10天；
e)将经过上述步骤处理得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，营养培养基为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽取物5g/L，牛肉膏5g/L，氯化镁4g/L，琼脂16g/L，pH7.2；培养温度均匀为37℃，培养时间为24小时；然后将得到的营养培养物接种到发酵培养基中进行培养，发酵培养基为：葡萄糖85g/L，酵母粉12g/L，酵母抽取物5g/L，柠檬酸钠5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为48小时；筛选出生产维生素B2最高的菌株即为所需要的维生素B2高产菌株。
本实施例筛选出的维生素B2高产菌株用于维生素B2合成时，发酵48小时维生素B2的浓度达到17.4g/L。
对比例
一种维生素B2菌株的筛选方法，包括如下步骤：
a)原始菌株的预处理：将80μl枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原始菌株的甘油菌均匀涂布于平板培养基上在37℃下培养24小时，平板培养基的组分为：酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉18g/L，pH7.0；培养24小时后，吸取5ml无菌蒸馏水至培养得到的平板上，接菌针刮去平板上的菌体，混合均匀后，吸取至无菌离心管中，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液，备用；
b)取2ml步骤a)得到的菌液滴于无菌空白培养平板上，在无菌条件下紫外诱变30s，得到紫外诱变菌株；
c)将诱变得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，营养培养基为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母抽取物5g/L，牛肉膏5g/L，氯化镁4g/L，琼脂16g/L，pH7.2；培养温度均匀为37℃，培养时间为24小时；然后将得到的营养培养物接种到发酵培养基中进行培养，发酵培养基为：葡萄糖85g/L，酵母粉12g/L，酵母抽取物5g/L，柠檬酸钠5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为48小时；筛选出生产维生素B2最高的菌株即得对比维生素B2菌株。
本对比例筛选出的维生素B2菌株用于维生素B2合成时，发酵48小时维生素B2的浓度达到9.7g/L。
综上所述：本发明采用的筛选方法，筛选出的维生素B2菌株稳定高产，与原有菌株相比，克服现有技术中维生素B2产量不高的缺陷，在发酵周期不变的情况下，其维生素B2合成能力提高6g/L以上，发酵成本大幅度降低，相对于现有技术而言，取得了显著性进步和出乎意料的效果。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种维生素B2高产菌株的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
a)原始菌株的预处理：将枯草芽孢杆菌原始菌株涂布于平板培养基上进行培养，培养得到的平板用蒸馏水进行洗吹，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液；
b)将步骤a)得到的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株；
c)将步骤b)得到的紫外诱变菌株用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；
d)将步骤c)得到的复合诱变菌株接种到不同代谢底物类似物的基本培养基中进行培养驯化；
e)将经过上述步骤处理得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物接种到发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素B2最高的菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中，平板培养基为：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化钠9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，琼脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-36小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b)中，紫外诱变时间为30-60s，诱变高度为40-80cm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c)中，甲基磺酸乙酯诱变剂量为0.05-0.5mol/L，诱变时间为20-60分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤d)中代谢底物类似物包括8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素，浓度为10-100mg/L；将上述代谢底物类似物进行随机组合，分别加入到经过紫外诱变、化学诱变后得到的复合诱变菌株的菌液中，在基本培养基中进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：基本培养基为：葡萄糖4.5-5.5g/L，硫酸铵0.15-0.25g/L，磷酸氢二钾1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-0.7g/L，柠檬酸钠0.1-0.3g/L，色氨酸0.04-0.06g/L，琼脂粉15-17g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤e)中，营养培养基为：葡萄糖9.5-10.5g/L，蛋白胨9.5-10.5g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，牛肉膏4.5-5.5g/L，氯化镁3.5-4.5g/L，琼脂15-17g/L，pH7.2；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤e)中，发酵培养基为：葡萄糖80-90g/L，酵母粉8-15g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，柠檬酸钠4.5-5.5g/L，七水硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为48-72小时。
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