CZ20002750A3 - Molekula DNA obsahující geny biosyntézy riboflavinu z rostlin, buňky a rostliny obsahující tuto molekulu a způsob potlačení růstu plevelu - Google Patents

Description

Molekula DNA obsahující geny biosyntézy riboflavinu z rostlin, buňky a rostliny obsahující tuto molekulu a způsob potlačení růstu plevelu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká enzymatické aktivity účastnící se biosyntézy riboflavinu v rostlinách. Zejména se vynález týká rostlinných genů, které kóduji bifunkčni enzym GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu a β podjednotku enzymového komplexu riboflavinsyntázy (lumazinsyntázy). Využiti vynálezu je velmi různorodé, včetně rekombinantní produkce těchto enzymů biosyntézy riboflavinu v heterologním hostiteli, testování chemických látek na herbicidní aktivitu a použití takto identifikovaných chemických látek k potlačení růstu nežádoucí vegetace. Předkládaný vynález lze použít také k vytváření tolerance k herbicidu u rostlin, rostlinných pletiv, semen a rostlinných buněk.

Dosavadní stav techniky

I. Biosyntéza riboflavinu Riboflavin (vitamin isoalloxazin) je mikroorganismech.

B₂, 6,7-dimetyl-9-(1-D-ribityl)syntetizován v rostlinách a také v mnoha je nezbytný pro

Riboflavin metabolismus, neboť je prekurzorem koenzymů jako a FMN, které jsou potřebné pro enzymatickou sacharidů. Biosyntéza riboflavinu začíná trifosfátu (GTP) a pokračuje několika enzymatickými kroky, jak. je schematicky znázorněno na obr. 1 v publikaci Mironov bazální j e FAD oxidaci z guanosin-5- 2 • · · · » · · • 0 0« • ·· · et al., Mol. Gen. Genet. 242: 201-208, 1994 (která je zahrnuta formou odkazu).

GTP cyklohydroláza II je první enzym biosyntézy riboflavinu, který katalyzuje syntézu 2,5-diamino-4-oxy-6ribosylaminopyrimidin-5-fosfátu z GTP. DHBP syntéza katalyzuje přeměnu ribulózo-5-fosfátu na 3,4-dihydroxy-2butanonfosfát (DHBP). Tyto dvě enzymatické aktivity jsou neseny jediným bifunkčním enzymem v Bacillus, v E. colí jsou to dva samostatné enzymy.

Riboflavinsyntáza je proteinový komplex velikosti přibližně 1 000 000 DA, složený ze 60 β podjednotek a tří a podjednotek. β podjednotky vytvářejí kapsidu, která katalyzuje přeměnu 2,4-dioxy-5-amino-6-ribitylaminopyrimidinu (DARP) a 3,4-dihydroxy-2-butanonfosfátu (DHBP) na 6,7dimetyl-8-ribityllumazin (lumazin), takže β podjednotka je známa také jako lumazinsyntáza. a podjednotky, obsažené uvnitř kapsidy z β podjednotek, katalyzují přeměnu dvou jednotek lumazinu na jednu molekulu DARP, která , je recyklována zpět do první reakce riboflavinsyntázy, a jednu molekulu riboflavinu.

II. Objev herbicidů

Použití herbicidů k boji proti nežádoucí vegetaci jako jsou např. plevele v plodinách, se stalo všeobecně rozšířenou praxí. Světový trh s herbicidy představuje více než 15 miliard dolarů ročně. I přes velmi extenzivní využívání herbicidů ochrana proti plevelům zůstává pro zemědělce stále výzmanným a nákladným problémem.

Účinné využívání herbicidů vyžaduje dobré znalosti a organizaci. Tak např. načasování a způsob aplikace, a také vývojové stadium plevelu, jsou kritickými faktory pro dosažení dobrého výsledku s herbicidy, jsou kritickými • · • · • · · ·

- 3 • · · · • 4 »« ·· faktory pro dosažení dobrého výsledku s herbicidy, jelikož některé druhy plevelů jsou rezistentní k herbicidům, roste důležitost vývoje nových herbicidů. Nové herbicidy je nyní možné vyvíjet pomocí vysoce účinných testovacích metod, které využívají technologii rekombinantní DNA. Metabolické enzymy nezbytné pro růst a vývoj rostlin lze rekombinantně produkovat využitím standardních postupů genového inženýrství a molekulární biologie a je možné je využít jako cíle pro herbicidy v testech (screeningu) při hledání nových inhibitorů enzymové aktivity. Nové inhibitory objevné v takovém screeningu pak mohou být využity jako herbicidy k potlačení nežádoucí vegetace.

III. Rostliny tolerantní k herbicidům

Herbicidy, které mají velký účinek, široké spektrum plevelů a rychlejší degradaci v půdě mají naneštěstí také větší toxicitu (fytotoxicitu) pro plodiny. Jedním řešením tohoto problému, které bylo vyvinuto v minulosti, byl vývoj plodin, které jsou rezistentní nebo tolerantní k herbicidům, hybridy neb variety plodin tolerantní k herbicidům dovolují použití herbicidů k hubení plevelů, aniž by došlo k poškození plodin. Vývoj tolerance dovoluje i použití herbicidů tam, kde dříve bylo jen omezené (např. jen preemergentní) nebo zcela nemožné, a to díky citlivosti plodiny k herbicidu. Tak např. Patent USA č. 4 761 373 (Anderson et al.) popsuje rostliny rezistentní k různým imidazolinovým nebo sulfonamidovým herbicidům. Rezistence je vnesena do rostlin změněným enzymem syntázou acetohydroxykyseliny (AHAS). Patent USA č. 4 975 374 (Goodmann et al.) se týká rostlinných buněk a rostlin obsahujících ge. kódující mutovanou glutaminsyntetázu (GS) rezistentní k inhibici herbicidy, které inhibují GS, např. fosfinotricin a methioninsulfoximin. Patent USA č. 5 013 659 ·· ·· ·· «··· ·· ·· • · · · « · <* « β · ···· · · · · · · · • · · ··· · · ·· ·» « • ·· · · · «··· ······ · · · ·<· ··

- 4 (Bedbrook et al.) se týká rostlin exprimujících mutovanou acetolaktátsyntázu, která poskytuje rostlinám rezistenci k inhibici sulfonylmočovínovými herbicidy. Patent USA č. 5 162 602 (Somers et al.) popisuje rostliny tolerantní k inhibici herbicidy typu cvklohexadionu a aryloxyfenoxypropanové kyseliny. Tolerance je umožněna změnou enzymu acetylkóenzym-A-k.arboxylázy (ACCázy).

Definice

Z důvodu jasného vysvětlení vynálezu jsou zde definovány některé pojmy použité v popisu předkládaného vynálezu:

Aktivovatelná sekvence DNA je sekvence DNA., která reguluje expresi genů v genomu, a sice nejlépe v genomu rostlin. Aktivovatelná se je komplementární k cílovému genu v genomu. Když je aktivovatelná sekvence vnesena do buňky a v ní exprimována, inhibuje expresi cílového genu. K aktivovatelným sekvencím užitečným podle předkládaného vynálezu patří takové sekvence, které kódují nebo působí jako dominantní inhibitory, jako translatovatelné nebo netranslatovatelné sense sekvence schopné narušit funkci genu u stabilně transformovaných rostlin pro pozitivní identifikaci jednoho . nebo několika genů nezbytných k normálnímu růstu a vývoji rostliny. Výhodnou aktivovatelnou sekvencí podle předkládaného vynálezu je antisense DNA sekvence. Cílový gen výhodně kóduje protein, jako je biosyntetický enzym, receptor, protein signální transdukce, produkt strukturního genu nebo transportní protein, který je nutný pro.růst a přežití rostliny. Ve zvláště výhodném cílový gen kóduje lumazisyntázu nebo bifunkční enzym GTP cyklohydrolázů II/DHBP syntázu. Interakce antisense sekvence a cílového genu vede k podstatné inhibici exprese cílového • · genu, takže dojde k zahubení rostliny, nebo alespoň k inhibici normálního růstu a vývoje rostliny. '

Aktivovatelný DNA konstrukt je konstrukt rekombinantní DNA obsahující syntetický promotor operativně spojený s aktivovatelnou sekvencí, který po vnesení do buňky, zejména do rostlinné buňky, není exprimován, tj. je umlčený, dokud není přítomen kompletní hybridní transkripční faktor schopný vazby na syntetický promotor a aktivující ho. Aktivovatelný konstrukt je vnesen do buněk, pletiv nebo rostlin, čímž se vytvoří stabilní transgenní linie schopná exprimovat aktivovatelnou sekvenci.

Chimérický: tento termín se užívá k označení DNA sekvence, jako j-e např. vektor nebo gen, která obsahuje více (více než jednu) sekvencí DNA odlišného původu, které jsou navzájem spojeny technikami rekombinantní DNA do sekvence, které se přirozeně nevyskytuje, a která se zejména nevyskytuje v rostlině, která má být transformována.

Míchání DNA (DNA shuffling) označuje způsob vnášení mutací nebo změn v organizaci, přednostně náhodným způsobem, do molekuly DNA, nebo způsob výměny sekvencí mezi dvěma nebo více molekulami DNA, přednostně náhodným způsobem. Molekula DNA, která je výsledkem procedury míchání DNA je DNA modifikovaná mícháním, což je molekula DNA, která se přirozeně nevyskytuje, odvozená alespoň z jedné templátové DNA molekuly. DNA modifikovaná mícháním kóduje enzym, který je modifikován vzhledem k původnímu enzymu kódovanému templátovou molekulou DNA, a výhodně má změněnou biologickou aktivitu ve srovnání s enzymem kódovaným templátovou molekulou. Enzymová aktivita znamená schopnost enzymu katalyzovat přeměnu substrátu na produkt. K substrátům enzymů patří přirozené substráty enzymu, ale také analogy přirozených φφ φφ φφ ΦΦΦΦ φφ ·· • φ φ φ ♦ · φ φ * φ •ΦΦΦ φ φ φ · φφ φ φφ φφφ φφ φφ φφ φ φ φφ φφφ ΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ φ φ φφ φ φφ φφ substrátů, které mohou být také enzymem přeměněny na produkt nebo analog produktu. Aktivita enzymu se měří např. stanovením množství produktu v reakci po určitém čase. Aktivita enzymu se měří např. také' stanovením množství nespotřebovaného kofaktoru v reakci zbylého v reakční směsi po určitém čase nebo stanovením množství využitého kofaktoru z reakční směsi po určitém čase. Aktivita enzymu se měří např. také stanovením množství donoru volné energie nebo energeticky bohatých molekul (jako je např. ATP, fosfoenolpyruvát, aoetylfosfát- nebo fosfokreatin) zbylých v reakční směsi po určité době nebo stanovením množství využitého donoru volné energie nebo energeticky bohatých λ

molekul (např. ADP, pyruvát, acetát, kreatin) v reakční směsi po určité době.

Exprese se týká transkripce a/nebo translace endogenního genu nebo transgenu v rostlině. V případě exprese antisense konstruktu se termín exprese týká pouze transkripce antisense DNA.

Gen označuje kódující sekvenci a asociované .regulační sekvence,' přičemž kódující sekvence je transkribována do RNA jako je mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA nebo anisense RNA. Příklady regulačních , sekvencí jsou promotory a netranslatovatelné sekvence 5'- a 3'-konce DNA.

Herbicid je chemická látka použitá k hubení rostlin, rostlinných buněk, semen rostlin nebo rostlinného pletiva nebo k potlačení jejich růstu.

Heterologní sekvence DNA je DNA sekvence, která se přirozeně nevyskytuje v hostitelské buňce, do které je

i.

vnesena. Termín zahrnuje také současný výskyt několika kopií téže přirozeně se vyskytující sekvence DNA, ke kterému přirozeně nedochází.

Φ 9

I · Φ • ΦΦΦ • ΦΦΦ Φ Φ

Homologní sekvence DNA je sekvence DNA přirozeně se vyskytující v hostitelské buňce, do které je vnesena.

Inhibitor je chemická látka, která inaktivuje enzymatickou aktivitu proteinu jako je např. enzym, receptor, protein signální transdukce, produkt strukturního genu nebo transportní protein, které jsou nezbytné pro růst a přežívání rostliny. V kontextu popisu předkládaného vynálezu je inhibitor chemická látka, která inaktivuje enzymatickou aktivitu lumazinsyntázy nebo bifunkčního enzymu GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy z rostliny. Termín herbicid je v přihlášce předkládaného vynálezu užit k definici inhibitoru, který je aplikován na rostliny, rostlinné buňky, semena rostlin nebo rostlinná pletiva.

Izolovaný: Tento termín se v kontextu předkládaného vynálezu užívá ve spojení izolovaná molekula DNA nebo izolovaný enzym a znamená takovou molekulu DNA nebo takový enzym, které jsou izolované činností člověka a existující nezávisle na přírodním prostředí, nejde tedy o přírodní produkty. Izolovaná molekula DNA nebo izolovaný enzym existují buďto v purifikované podobě nebo v prostředí, které však není přirozené, např. v hostitelské buňce.

Minimální promotor označuje promotorové prvky, zejména TATA element, které jsou buďto neaktivní nebo které mají velmi sníženou promotorovou aktivitu v nepřítomnosti upstream aktivace. V přítomnosti vhodného transkripčního faktoru minimální promotor funguje tak, že umožní transkripci.

Modifikovaná enzymatická aktivita je enzymatická aktivita odlišná od původní aktivity přirozeně se vyskytující v rostlině (např. enzymatická aktivita, která se přirozeně vyskytuje v nepřítomnosti přímé či nepřímé manipulace této

- 8 fe· fefe · · fefefefe · · fefe ♦ fefe fefe « fefefefe fefefefe fefe · fefefefe fefe fefefe ·· ·· fefe · fe fefe fe fefe fefefefe • fefefe fefe fefefe fefefefe aktivity člověkem), která je tolerantní k inhibitorům, které inhibují přirozeně se vyskytující enzymatickou aktivitu.

Rostlina znamená jakoukoliv rostlinu, zejména semennou rostlinu.

Rostlinná buňka je strukturní a fyziologická jednotka rostliny,, obsahující protoplast a buněčnou stěnu. Rostlinná buňka je buďto ve formě izolované jednotlivé buňky nebo ve formě buněčné kultury, nebo je součástí vyšší organizační jednotky jako je např. pletivo nebo orgán rostliny.

Rekombinantní DNA je molekula kombinující sekvence DNA, které jsou spojeny užitím technologie rekombinantní DNA (tj. genového inženýrství).

Technologie rekombinantní DNA obsahuje metody spojován sekvencí . DNA jak jsou popsány např. v příručce Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Coia Spring Harbor, NY, 1989.

Významné zvýšení je zvýšení enzymatické aktivity, které je vyšší než krajní hodnoty chyb, které jsou vlastní dané měřící technice, výhodně jde o dvojnásobné zvýšení ve srovnání s původní aktivitou enzymu divokého typu v nepřítomnosti inhibitoru, výhodněji jde o pětinásobné zvýšení nebo vyšší a nejvýhodněji se jedná o desetinásobné zvýšení a vyšší.

Významně nižší znamená, že množství. produktu enzymatické reakce je nižší než krajní hodnoty chyb, které jsou vlastní dané měřící technice, výhodně jde o dvojnásobné snížení ve srovnání s původní aktivitou enzymu divokého typu v nepřítomnosti inhibitoru, výhodněji jde o pětinásobné' snížení nebo vyšší a nejvýhodněji se jedná o desetinásobné snížení a vyšší.

V podstatě podobné: tento termín v kontextu předkládaného vynálezu označuje molekulu DNA, která má

♦ · ♦ · • · 999 9 99

9

9

9 alespoň 60% sekvenční identitu s úsekem sekvence id. č. 1, který kóduje lumazinsyntázu, tj . s úsekem sekvence id. č. 1, který kóduje aminokyselinovou sekvenci id. o. 2, nebo DNA molekulu, která má alespoň 60% sekvenční identitu s částí sekvence id. č. 13, která kóduje bifunkční enzym GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu z rostlin, tj . s částí sekvence id. č. 13, která kóduje aminokyselinovou sekvenci id. č. 14. Nukleotidová sekvence v podstatě podobná sekvenci lumazinsyntázy hybridizuje' specificky se sekvencí id. č. 1 nebo, jejím fragmentem v následujících podmínkách: hybridizace v roztoku 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄, pH 7,0, lmM EDTA , při 50 °C, promytí 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C. Nukleotidová sekvence v podstatě podobná sekvenci GTPcyklohydrolázy II/DHBP syntázy z rostlin hybridizuje specificky se sekvencí id. č. 13 za výše definovných podmínek. Pokud jde o proteiny, v podstatě podobný protein znamená protein s aminokyselinovou sekvencí která je alespoň z 90 % identická buďto s- aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 nebo id. č. 14.

Substrát je molekula, kterou enzym přirozeně rozpoznává a přeměňuje na produkt v biochemické metabolické dráze, kde enzymy projevuje přirozeně svou aktivitu, nebo je to modifikovaná verze takové molekuly, která je také enzymem rozpoznávána a přeměňována na produkt v enzymatické reakci podobné k původní přirozeně se vyskytující reakci.

„Syntetický se týká nukleotidová sekvence obsahující strukturní charakteristiky, které nejsou přítomny v přirozených sekvencích. Např. Umělá sekvence, která připomíná nejblíže svým obsahem G+C a normální distribucí kodonů genů dvouděložných a/nebo jednoděložných rostlin se nazývá syntetická sekvence.

0 ···« ♦ · 0 0 • · 4 · «000

00« 04 4 4000

0« 000 0 0 00 »0 0 0 0· 0 4 0 0 4 9 0

0000 04 «4 · «000

- 10 „Tolerance je schopnost rostlin pokračovat v normálním růstu nebo funkci i po expozici inhibitoru nebo herbicidu.

Transformace je proces, při kterém se vnese heterologní DNA do buňky, pletiva nebo celé rostliny. Termínem transformované buňky, pletiva nebo rostliny nejsou označovány jen ty buňky, pletiva a rostliny obsahující výsledný produkt transformačního procesu, ale také jejich potomstvo.

„Transgenní znamená být stabilně transformovaný molekulou rekombinantní DNA, která výhodně obsahuje vhodný .promotor operativně spojený s požadovanou DNA sekvencí.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsoby k identifikaci nových nebo zlepšených herbicidů. Jiným předmětem vynálezu je poskytnout způsoby, jak tyto nové nebo zlepšené herbicidy využít k potlačení růstu rostlin jako jsou třeba plevely. Ještě dalším předmětem vynálezu jsou zlepšené plodiny, které jsou tolerantní k těmto novým nebo zlepšeným herbicidům.

Předkládaný vynález poskytuje molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostliny, která kóduje enzym zúčastněným v biosyntéze' riboflavinu, přičemž enzym má buďto aktivitu lumazinsyntážy nebo ' má aktivitu bifunkčního komplexu GTP cyklohydrolázy II/ DHBP syntázy.

V jednom provedení poskytuje předkládaný vynález izolovanou z rostliny, která kóduje riboflavinsyntázy (lumazinsyntázy). Např.

podle předkládaného vynálezu · obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy, přičemž enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 2. V jiném příkladu DNA molekula podle vynálezu obsahuje molekulu DNA β podjednotku molekula DNA »· φφφφ

- 11 φφ φφ 9 Φ · • ·««

Φ · ΦΦ

Φ · ΦΦΦΦ ΦΦ

ΦΦΦ Φ* Φ

Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

Φ

Φ

Φ

Φ nukleotidovou sekvenci, která kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy, přičemž enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 2. V jiném provedení molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostlin, která kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy, přičemž molekula DNA hybridizuje s molekulou DNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 v následujících hybridizačních podmínkách: 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NAPO₄, pH 7,0. ImM EDTA při 50 °C, promývání 2xSSC, 1% SDS při 50 °C. Vynález dále poskytuje molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostlin, která kóduje enzym účastnící se biosyntézy riboflavinu, přičemž enzym má aktivitu lumazinsyntázy, přičemž molekula DNA hybridizuje s kódující sekvencí id. č. 1 za následujících hybridizačních podmínek: 7% dodecylsulf át sodný (SDS), 0,5 Μ NAPO4, pH 7,0. ImM EDTA při 50 °C, promývání 2xSSC, 1% SDS při 50 °C. V ještě dalším příkladu molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě podobná kódující sekvenci id. č. 1 a která kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy. V dalším provedení molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidou sekvenci izolovanou z rostliny, která kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy, přičemž molekula DNA obsahuje nukleotidový úsek velikosti 20 párů baží identický se sekvencí 20 bezprostředně po sobě následujících párů baží v kódující sekvenci id. č. 1. V dalším příkladu molekula DNA podle vynálezu, obsahuje sekvenci id. č. 1 a kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy. Ačkoliv sekvence id. č. 1 kódující lumazinsyntázu byla izolována z Arabidopsis thaliana, na základě předkládaného vynálezu lze získat pomocí standardních metod odborníkovi· známých nukleotidovou sekvenci kódující lumazinsyntázu z jakékoliv rostliny.

.Λ ^s X. 1

φ* «Φ·Φ • φ * • φφφ φ • φ φφφ

V jiném provedení předkládaný vynález poskytuje molekulu DNA obsahující nukleotidou sekvenci izolovanou z rostliny, která kóduje bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu. Tak např. molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje enzym, který má aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 14. V jiném příkladu molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje enzym, který má aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž molekula DNA hybridizuje s molekulou DNA, která kóduje aminokyselinovu sekvenci id. č. 14 v následujících hybridizačních podmínkách: 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, pH 7,0. lmM EDTA při 50 °C, promývání 2xSSC, 1% SDS při 50 °C. Vynález dále poskytuje molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje enzym, který se účastní biosyntézy riboflavinu, přičemž enzym má aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, a přičemž molekula DNA hybridizuje s kódující sekvencí id, č. 13 v následujících hybridizačních podmínkách: 7% dodecylsulf át sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, pH 7,0, lmM EDTA při 50 °C, promývání 2xSSC, 1% SDS při 50 °C. V ještě dalším příkladu molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě podobná kódující sekvenci id. č. 13 a která kóduje enzym mající aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy. V dalším provedení molekula DNA podle vynálezu obsahuje nukleotidou sekvenci izolovanou, z rostliny, která kóduje enzym mající aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž molekula DNA obsahuje nukleotidový úsek velikosti 20 párů baží identický se sekvencí 20 bezprostředně po sobě následujících párů baží v kódující sekvenci id. č. 13. V dalším příkladu molekula DNA ·· ·· • · · • ··· •9 4444

4 · • « ·

44

4 4 4

4 4 · ♦··· a· » a a a aa 44 podle vynálezu obsahuje sekvenci id. č. 13 a kóduje enzym mající aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy. Ačkoliv sekvence id, č. 13 kódující bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu byla izolována z Arabidopsis thaliana, na základě předkládaného vynálezu lze získat pomocí standardních metod odborníkovi známých nukleotidovou sekvenci kódující aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy z jakékoliv rostliny.

Předkládaný vynález dále poskytuje chimérický gen obsahující promotor operativně spojený s molekulou DNA. podle vynálezu. Dále předkládaný vynález poskytuje rekombinantní vektor obsahující takový chimérický gen, přičemž vektor je schopen stabilní transformace do hostitelské buňky. A, dále poskytuje předkládaný vynález hostitelskou buňku, která obsahuje takový vektor, přičemž hostitelská buňky je schopna exprimovat molekulu DNA kódující enzym účastnící se syntézy riboflavinu. Hostitelská buňka podle vynálezu je bakteriální buňka, kvasinková buňka nebo rostlinná buňka. Hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu jsou zejména bakteriální buňky.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy nukleotidových sekvencí kódujících genový produkt, který má změněnou aktivitu lumazinsyntázy, obsahující kroky: a) mutace metodou míchání („shuffling) molekuly DNA z rostliny, která kóduje aktivitu lumazinsyntázy, bj exprese výsledné mutované nukleotidové sekvence, a c) selekce na .změněnou aktivitu lumazinsyntázy srovnáním s aktivitou enzymu kódovaného nemutovanou. molekulou DNA. Výhodně je podle vynálezu mutována (metodou „shuffling) sekvence -id. č. 1. Předkládaný vynález se také týká mutované molekuly DNA získané tímto způsobem. Výhodně takto mutovaná molekula DNA kóduje enzym, který má zvýšenou toleranci k inhibitoru lumazinsyntázové /'i'·-'.:·,cVÍÍg?·

·* φφφφ • φ φ φφφφ φφ • φ φφ φ φ φ φ φφ φ φ φ φ φφ φφ aktivity. Předkládaný vynález dále poskytuje chimérický gen obsahující promotor operativně spojený s molekulou DNA podle vynálezu. Dále předkládaný vynález poskytuje rekombinantni vektor obsahující takový chimérický gen, přičemž vektor je schopen stabilní transformace do hostitelské buňky. A dále poskytuje předkládaný vynález hostitelskou buňku, která obsahuje takový vektor, přičemž hostitelská buňka je schopna exprimovat molekulu DNA kódující enzym účastnící se syntézy riboflavinu. Hostitelská buňka podle vynálezu je bakteriální buňka, kvasinková buňka nebo rostlinná buňka, výhodně rostlinná buňka. Vynález se týká také rostlin nebo Semen obsahujících takovou rostlinnou buňku. Výhodně ' je taková rostlina tolerantní k inhibitoru aktivity lumazinsyntázy.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy nukleotidových sekvencí kódujících genový produkt, který má změněnou aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy obsahující kroky: a) mutace metodou míchání („shuffling) molekuly DNA z rostliny, která kóduje aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, b) exprese výsledné mutované nukleotidové sekvence, a c) selekce na změněnou aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy srovnáním s aktivitou enzymu kódovaného nemutovanou molekulou DNA. Výhodně je podle vynálezu mutována (metodou „shuffling) sekvence id. č. 13. Předkládaný vynález se také týká mutované molekuly DNA získané tímto způsobem. Výhodně takto mutovaná molekula DNA kóduje enzym, který má zvýšenou toleranci k inhibitoru aktivity bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy. Předkládaný vynález dále poskytuje chimérický gen obsahující promotor operativně spojený s molekulou DNA podle vynálezu. Dále předkládaný vynález poskytuje rekombinantni vektor obsahující takový chimérický gen, přičemž vektor je schopen stabilní transformace do

99

9 9 • 999 ·· 9999

99

9 9 9

9 9 9

999« 99 » 9 9 9

99 hostitelské buňky. A dále poskytuje předkládaný vynález hostitelskou buňku, která obsahuje takový vektor, přičemž hostitelská buňka je schopna exprimovat molekulu DNA kódující enzym účastnící se syntézy riboflavinu. Hostitelská buňky podle vynálezu je bakteriální buňka, kvasinková buňka nebo rostlinná buňka, výhodně rostlinná buňka. Vynález se týká také rostlin nebo semen obsahujících takovou rostlinnou buňku. Výhodně je taková rostlina tolerantní k inhibitoru aktivity bifunkčni GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká rekombinantní riboflavinu a popsaných enzymů biosyntézy Předkládaný vynález produkce výše způsobů jejich použití zejména poskytuje izolovaný rostlinný enzym účastnící se biosyntézy riboflavinu, přičemž tento enzym má aktivitu lumazinsyntázy. Výhodně tento enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci . id. č. 2. Výhodněji tento enzym obsahuje sekvenci id. č. 2. Předkládaný vynález také zejména poskytuje izolovaný rostlinný enzym účastnící se biosyntézy riboflavinu, přičemž tento enzym má aktivitu bifunkčni GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy. Výhodně tento enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 14. Výhodněji tento enzym obsahuje sekvenci id. č. 14.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob použití purifikovaných enzymů biosyntézy riboflavinu v rostlině jako je lumazinsyntáza a bifukční GTP cyklohydroláza II/DHBP syntáza pro testování jejich nových inhibitorů, které mhou být užity jako herbicidy'k potlačení růstu nežádoucí vegetace na poli, kde jsou pěstovány plodiny, zejména zemědělsky významné plodiny jako je kukuřice a další obiloviny jako pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, trávníkové v -;//·

4« 44 44 44*4 4* 44 . 4 · 4 4 4 4 44 4 « 444 4 4 4 4 4 4 4 • · · 4 4 4 444 4

4444 44 44 4 44 44 a pícninové trávy a pod., a také bavlník, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejka a sója.

Pokud, jde o lumazinsyntázu, také testování, resp. vyhledávání chemických látek, které inhibují aktivitu lumazinsyntázy výhodně obsahuje kroky : a) kombinace enzymu majícího aktivitu lumazinsyntázy v první reakční směsi s-2,4dioxy-5-amino-6-ribitylaminopyrimidinem a 3,4-dihydroxy-2butanonfosfátem v podmínkách, kdy je enzym schopný katalyzovat syntézu lumazinu, b) kombinace se chemické látky a enzymu ve druhé reakční směsi s 2,4-dioxy-5-amino-6ribitylaminopyrimidinem a 3,4-dihydroxy-2-buanonfosfátem ve stejných podmínkách jako v první reakci, c) stanovení množství lumazinu tvořeného v první a druhé reakční směsi,, a d) porovnání množství lumazinu tvořeného v první a druhé reakční směsi, přičemž chemická látka je schopná inhibovat aktivitu lumazinsyntázy, jestliže množství lumazinu tvořeného ve druhé reakční směsi je významně nižší než množství lumazinu tvořeného v první reakční směsi. Výhodná je metoda testování podle předkládaného vynálezu, kdy první reakční směs obsahuje 50μΜ 2,4-dioxy-5-amino-6-ribitylaminopyrimidin a 0,5mM 3,4-dihydroxy-2-buanonfosfát. Dále je podle předkládaného vynálezu výhodná metoda testování, kdy množství lumazinu tvořeného v reakcích je stanoveno pomocí fluorometru při excitační vlnové délce 407 nm.

Pokud jde o bifukční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu, také testování, resp. vyhledávání chemických látek, které inhibují aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy výhodně obsahuje kroky : a) kombinace enzymu majícího aktivitu bifukční.GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy v první reakční směsi s GTP nebo ribulózo-5-fosfátem v podmínkách, kdy je enzym schopný katalyzovat syntézu 2,5-diamino-4-oxy-6ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2·· ·«·«

A A AA • A

A A AAAA A A

A A A A AA AA butanonfosfátu, b) kombinuje se chemická látka a enzym GTP nebo ribulózo-5-fosfátem ve druhé reakční směsi ve stejných podmínkách jako v první reakci, c) stanovení množství 2,5diamino-4-oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4dihydroxy-2-butanonfosfátu tvořeného v první a druhé reakční směsi, a d) porovnání množství 2,5-diamino-4-oxy-6ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2butanonfosfátu tvořeného v první a druhé reakční směsi, přičemž chemická látka je schopná inhibovat aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntézy, jestliže množství 2,5-diamino-4-oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2-butanonfosfátu tvořeného ve druhé reakční směsi je významně nižší než množství 2,5-diamino-4oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2butanonfosfátu tvořeného v první reakční směsi.

Dalším provedením podle vynálezu jsou chemické látky s herbicidním účinkem identifikované výše uvedenou metodou kromě metod potlačení růstu rostlin aplikací takových chemických látek na rostliny, přičemž chemické látky vykazují aktivitu lumazinsyntázy nebo bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntézy v rostlině.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou dále rostliny, rostlinná pletiva, semena a rostlinné buňky, které mají modifikovanou aktivitu enzymů biosyntézy riboflavinu, a které jsou tudíž tolerantní k inhibici hladinou herbicidu, která je normálně inhibující pro přirozeně se vyskytující enzymovou aktivitu biosyntézy riboflavinu. K rostlinám tolerantním k herbicidu podle předkládaného vynálezu patří takové rostliny, které by jinak byly potenciálním cílem normálně inhibujícího herbicidu, zejména agronomicky významné rostlin vyjmenované výše. Podle tohoto provedení vynálezu, rostliny, rostlinná pletiva, semena rostlin nebo rostlinné buňky, jsou • · «· > · ·

999

- 18 *· ···· stabilně transformované molekulou rekombinantní DNA, která obsahuje vhodný promotor operativně spojený s nukleotidovou sekvencí kódující modidfikovaný enzym biosyntézy riboflavinu, který ke tolerantní k inhibici herbicidem v koncentraci, která by normálně inhibovala aktivitu enzymu divokého typu, tj . nemodifikovaného enzymu biosyntézy riboflavinu. Modifikovaná aktivita enzymu biosyntéza riboflavinu může být do rostlin vnesena také zvýšenou expresí enzymů biosyntézy riboflavinu divokého typu, které jsou senzitivní k herbicidu, a to tím, že se rostlině poskytne několik kopií genu enzymů biosyntézy riboflavinu nebo se geny enzymu divokého typu biosyntézy riboflavinu nadměrně exprimují (overexprese genů) pod kontrolou promotoru silnějšího než je promotor divokého typu. Transgenní rostliny, rostlinná pletiva, semena a rostlinné buňky takto připravené jsou pak · selektovány konvenčními metodami selekce, přičemž jsou charakterizovány a dále rozvíjeny linie k herbicidu. Alternativně je možné využít náhodnou mutagenezi nebo místně specifickou mutagenezi k vytváření linií tolerantních k herbicidu.

Předkládaný vynález dále poskytuje rostlinu, rostlinnou buňku, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo obsahující obsahuje nukleotidovou sekvenci která kóduje enzym účastnící se přičemž erižym má aktivitu izolovány, tolerantní.

molekulu DNA, která izolovanou z rostliny, biosyntézy riboflavinu, lumazinsyntázy, přičemž molekula DNA uděluje rostlině, rostlinné buňce, semenu nebo rostlinnému pletivu toleranci k herbicidu v množství, které normálně inhibuje přirozeně .se vyskytující lumazinsyntázovou aktivitu. V jednom příkladu provedení podle vynálezu enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 2. V jiném příkladu předkládaného vynálezu je molekula DNA «· ··♦· ·· ·· I · · • · ·· ·» ·· • · ♦ · • · · t • · · · • · · ·

44 v podstatě podobná kódující sekvenci id. č. 1. Předkládaný vynález se také týká způsobu selektivního potlačení růstu plevelu v poli s rostoucími plodinami nebo vysetými semeny plodin, který obsahuje kroky:' a) vysazení/vysetí rostlin nebo semen tolerantních k herbicidu, což jsou rostliny nebo semena tolerantní k herbicidu, který inhibuje přirozeně se vyskytující lumazinsyntázovou aktivitu, a b) aplikace herbicidu na ro,stiiny nebo semena a plevel, a to v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující lumazinsyntázovou aktivitu, přičemž herbicid potlačí růst plevelu aniž by významně potlačil růst plodiny.

Předkládaný vynález dále poskytuje rostlinu, rostlinnou buňku, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo obsahující molekulu DNA, která' obsahuje nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostliny, která kóduje enzym účastnící se biosyntézy riboflavinu, přičemž enzym má aktivitu aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž molekula DNA uděluje rostlině, rostlinné buňce, semenu nebo rostlinnému pletivu toleranci k herbicidu v množství, které normálně inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy. V jednom příkladu provedení podle vynálezu enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 14. V jiném' příkladu předkládaného vynálezu je molekula DNA v podstatě podobná kódující sekvenci id. č. 13. Předkládaný vynález se také týká způsobu selektivního potlačení růstu plevelu v poli s rostoucími plodinami nebo vysetými semeny plodin, který obsahuje kroky: a) vysazení/vysetí rostlin nebo semen tolerantních k herbicidu, což jsou rostliny nebo semena tolerantní k herbicidu, který inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, a b) aplikace herbicidu na • e ···* *· ·· ► · · • >·· • · • · 99

99

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

- 20 rostliny nebo semena a plevel, a to v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž herbicid potlačí růst plevelu aniž by významně potlačil růst plodiny.

Další předměty vynálezu budou odborníkovi jasné na základě následujícího podrobného popisu vynálezu a příkladů, které však vynález nikterak neomezují.

I. Geny biosyntézy riboflavinu v rostlinách

Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostlinného zdroje, která kóduje β podjednotku riboflavinsyntázy (lumazinsyntázy). Konkrétně Předkládaný vynález poskytuje molekulu DNA izolovanou z Arabidopsis thaliana, která kóduje lumazinsyntázu a molekuly s ní v podstatě podobné, které kódují enzymy s aktivitou lumazinsyntázy. Kódující sekvence DNA pro lumazinsyntázu z Arabidopsis thaliana je zde uvedena jako sekvence id. č. 1.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostlinného zdroje, která kóduje bifunkční GTP cyklohydrolázu 11/3,4dihydroxy-2-butanonfos fátsyntázu předkládaný vynález poskytuje z Arabidopsis thaliana, která (DHBP syntázu molekulu kóduj e

Konkrétně DNA izolovanou bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu a molekuly s ní v podstatě podobné, které kódují enzymy s aktivitou aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy. Kódující sekvence DNA pro bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu z Arabidopsis thaliana je zde uvedena jako sekvence id. č. 13.

Poznatek, že aktivita GTP cyklohydrolázy II a DHBP syntázy představují v rostlině jediný bifunkční enzym, je poprvé zveřejněn v této přihlášce.

MM

- 21 • Φ «* Β 9 · • · ··

999 99

99

Β 9 9 9 » · 9 9

Β · 9 9

Β 9 9 9

99

Na základě objevu původce je možné poprvé izolovat sekvenci DNA kódující enzymy syntézy riboflavinu z genomu libovolného druhu rostliny. Příklady metod izolace genů biosyntézy riboflavinu z rostlin jsou uvedeny v příkladech 1 a 11. Použití této metody prohledávání databáze EST klonů Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Biological Resource Center,. Ohio State University, Columbus, Ohio) vedlo k odhalení klonů EST s homologií s β podjednotkou riboflavinsyntázy z E. coli a GTP hydrolázou z B. subtilis. Fragmenty DNA připravené pomocí PCR s oligonukleotidovými primery .specifickými pro tyto EST klony byly použity jako sondy k testování lambda-ZAP knihovny Arabidopsis thaliana, ze které byla izolovány cDNA,. Stanovená proteinová sekvence kódovaná jednou cDNA ukazovala přibližně 68% podobnost s β podjednotkou riboflavinsyntázy jak z E. coli tak B. subtilis. Stanovená- proteinová sekvence kódovaná druhou cDNA ukazovala přibližně 70% podobnost s GTP cyklhydrolázou B. subtilis.

Geny biosyntézy riboflavinu je možné izolovat z jakékoliv rostliny v oboru známými metodami na základě sekvenční podobnosti s kódující sekvencí z- Arabidopsis thaliana (sekvence id. č. 1 a 13) podle předkládaného vynálezu. Přitom se část nebo celá kódující sekvence genu biosyntézy riboflavinu z rostliny užije jako sonda, která selektivně hybridizuje se sekvencí jiného genu biosyntézy riboflavinu, která je přítomna v populaci klonovaných fragmentů genomové DNA nebo cDNA (tj. v genomové knihovně nebo v knihovně cDNA). Tato technika obsahuje hybridizační screening vysetých knihoven DNA (tj,. buďto plaků nebo kolonií, viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a následnou amplifikaci pomocí PCR s oligonukleotidovými primery, které odpovídají

- 22 φφ φφ φ φ φ · • φφφ φ • φ φ · φ φφφφ φφφφ φφ <

φφ «φφφ

Φ 4 Φ » Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ Φ • Φ Φ ·

Φ Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ . Φ

ΦΦ ΦΦ konzervativním sekvenčním , doménám ve známých aminokyselinových sekvencích enzymů biosyntézy riboflavinu (viz např. Innis et al., PCR protocols, A Guide to Methods

Tyto metody jsou enzymů biosyntézy blízce příbuzné biosyntézy riboflavinu and· Applicatopns, Academie Press, 1990) zvláště vhodné k izolaci sekvencí genů riboflavinu z organismů, které jsou organismu, - ze kterého byla získána sekvence použitá jako sonda. takže použití této metody se sondou získanou z Arabidopsis thaliana je zvláště vhodné pro izolaci genů biosyntézy riboflavinu z jiných rostlinných druhů, a to jak dvouděložných tak i jednoděložných rostlin.

Sekvence genů enzymů biosyntézy riboflavinu podle předkládaného vynálezu mohou být modifikovány standardními metodami genového inženýrství, aby byly vhodné k jakémukoliv použití. Tak např. celou sekvenci genu enzymu biosyntézy riboflavinu z rostliny nebo její část je možné použít jako sondu schopnou specificky hybridizovat s kódující sekvencí nebo mediátorovou RNA. Aby bylo dosaženo specifické hybridizace v různých podmínkách, takové sondy obsahují sekvence, které jsou jedinečné pro sekvence genů biosyntézy riboflavinu v rostlinách a jsou dlouhé alespoň 10 nukleotidů, výhodně alespoň 20 nukleotidů a nejvýhodněji alespoň 50 nukleotidů. Tyto sondou se užívají k amplifikaci a analýze sekvencí genů biosyntézy riboflavinu v rostlinách z vybraného organismu pomocí techniky PCR. PCR (polymerázová řetězová reakce) je užitečná k izolaci dalších sekvencí genů v rostlinách z vybraných organismů nebo jako diagnostický tesť ke sťanovení přítomnosti genů biosyntézy riboflavinu ve zkoumaném organismu. PCR je také užitečná k detekci přítomnosti změněných sekvencí genu biosyntézy riboflavinu v rostlinách asociované s nějakých • · • · • ·

- 23 určitým stavem, jako je např. tolerance k herbicidu, špatný zdravotní stav apod.

Hybridizační sondy specifické pro lumazinsyntázu a bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntézu se také mohou užít k lokalizaci těchto nativních genů v genomu vybraných rostlin užitím standardních metod založených na selektivní hybridizaci sondy s genomovými sekvencemi. K těmto metodám patří, přičemž výčet není omezující, identifikace polymorfismů DNA identifikovaných nebo obsažených v sekvenci » sondy, a použití' takových polymorfismů k následující segregaci genu vzhledem k dalším markérům známé pozice na mapě v mapovací populaci získané samoopylením hybridu dvou polymorfních rodičovských linií (viz. Helentjaris et al., Plant. Mol. Biol. 5: 109, 1985, Sommer et al., Biotechniques 12: 82, 1992, DOvidio et al., Plant. Mol. Biol. 15: 169,

1990). V podstatě jakákoliv sekvence genu enzymu biosyntézy riboflavinu je vhodná jako sonda k mapování genů biosyntézy riboflavinu, ale výhodné jsou genové sekvence z rostlinných druhů blízce příbuzných k vybraným druhům rostlin, přičemž nejvýhodnější jsou sekvence přímo z požadovaného rostlinného druhu. Mapování genů biosyntézy riboflavinu tímto způsobem je zvláště užitečné pro účely šlechtění. Např. na základěznalosti pozice v genetické mapě mutovaného genu biosyntézy riboflavinu, který rostlině poskytuje rezistenci k herbicidu, je možné identifikovat přilehlé DNA markéry z referenční genetické mapy (viz např. Helentjaris, Trend Genet. 3: 217, 1987) . V průběhu vnášení znaku rezistence k herbicidu do nové . šlechtitelské linie mohou být tyto markéry užity k monitorování rozsahu vázaných obklopujících chromozómových DNA dosud přítomných v opakovaných rodičovských rostlinách po každém kole zpětného křížení.

• · • 0 • ···

00 0

- 24 Hybridizační sondy specifické pro lumazinsyntázu a bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu se také mohou užít ke kvantifikaci hladiny mRNA genů. biosyntézy riboflavinu v rostlinách pomocí standardních metod jako je analýza northernovým přenosem (northern blot). Tato metoda je užitečná jako diagnostický test k detekci změněných hladin exprese genů biosyntézy riboflavinu, které jsou asociovány s konkrétním stavem jak· je. např. zvýšená tolerance k herbicidu, jehož cílem jsou geny biosyntézy riboflavinu.

II. Nezbytnost genů biosyntézy riboflavinu v rostlinách demonstrovaná pomocí antisense inhibice Jak je ukázáno v příkladech předkládaného vynálezu, nezbytnost genů biosyntézy riboflavinu pro normální růst a vývoj rostlin byla demonstrovaná pomocí antisense inhibice lumazinsyntázy, a sice pomocí tzv. . validačního systému popsaného v současně projednávané přihlášce vynálezu stejného přihlašovatele č. 08/978 830 (Methods and

Compositíons Useful for Activatíon of Silent Transgenes, podáno 26. 11. 1997), která je plně zahrnuta formou odkazu.

V tomto systému je připraven gen hybridního transkripčního faktoru, který obsahuje DNA-vazebnou doménu a aktivační doménu. Kromě toho je připraven aktivovatelný DNA konstrukt, který ' obsahuje syntetický promotor operativně spojený s aktivovatelnou sekvencí DNA. gen hybridního transkripčního faktoru a syntetický promotor jsou vybrány nebo zkonstruovány tak, DNA-vazebná doména hybridního transkripčního faktoru je schopna se specificky vázat k syntetickému promotoru, který tak aktivuje expresi aktivovatelné sekvence DNA.. První rostlina je transformována genem hybridního transkripčního faktoru a druhá rostlina je transformována aktivovatelným konstruktem DNA. První a druhá rostlina se pak kříží, aby • · ·· ·9 0 0 · 0 0 0 ·· ♦ · · · 0 · · 0 0

0000 0 · 0 0 00 0

000 00 00 00 0 • 0 0·· 0 0 · 0

0· 00 0 00 00

- 25 vytvořily potomstvo obsahující jak sekvenci kódující jak hybridní transkripční faktor tak i syntetický promotor, takže ,v potomstvu těchto ' rostlin je exprimována aktivovatelná sekvence DNA. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je aktivovatelná sekvence DNA antisense sekvence, která je schopná inaktivovat expresi endogenního genu jako je gen pro lumazinsyntázu nebo gen pro bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntézu. Takže rostliny potomstva nejsou schopny normálně exprimovat endogenní gen.

Tento antisense validační systém je zvláště užitečný k expresi znaků, které by jinak nebylo možné zjistit jako konstitutivně řízené transgeny. Např. cizorodé geny s potenciálně letálním účinkem nebo antisense geny nebo dominantně negativní mutace, zkonstruované k narušení funkce esenciálních genů, ačkoliv představují oblast značného zájmu v základním výzkumu rostlin biologie, představují podstatné experimentální problémy. Snížená transformační účinnost je uváděna často jako důkaz letality spojené s určitým konstitutivně exprimovaných transgenem, avšak negativní výsledky tohoto mají ještě alternativní triviální vysvětlení. Předkládaný vynález představuje důležité zlepšení v oboru zemědělství, neboť umožňuje trvale udržovat a množit testovaný transgen odděleně od jeho exprese. Tato schopnost oddělit vložení transgenu od jeho exprese je zvláště vhodná k potvrzení závěrů o nezbytnosti příslušné genové funkce. Podstatným přínosem předkládaného vynálezu je to, že rostlinné geny nezbytné pro normální růst a vývoj rostlin mohou být identifikovány tímto způsobem. identifikace takových genů poskytuje užitečné cíle pro screening knihoven sloučenin a. vyhledávání účinných herbicidů. V následující části je podrobně popsán antisense validační systém.

- 26 »·· ·

A. Gen hybridního transkripčního faktoru

Gen hybridního transkripčního faktoru vhodný pro použití v antisense validačním systému popsaném v této přihlášce obsahuje sekvence DNA kódující: 1) DNA-vazebnou doménu a 2) aktivační doménu,která interaguje se složkami transkripčního mechanismu, který se sestavuje na promotoru. Genové fragmenty jsou spojeny, typicky např. tak, že DNA-vazebná doména je v úseku na 5'konci zatímco aktivační doména je směrem ke 3'konci, v hybridním genu,jehož exprese vede ke tvorbě hybridního transkripčního faktoru. Odborník je schopen rutinním způsobem kombinovat různé sekvence DNA kódující DNAvazebné domény s různými sekvencemi DNA kódujícími aktivační domény, aby se vytvořilo široké spektrum genů hybridního transkripčního faktoru. K příkladů sekvencí DNA, které kódují DNA-vazebné domény patří (ale výčet není. omezující) DNAvazebná doména GLA4, bakteriofágu 434, lexA, láci a represoru fágu lambda. K příkladů sekvencí DNA, které kódují aktivační domény patří (ale výčet není omezující) kyselé aktivační domény herpes simplex VP16, kukuřice Cl a Pl. Kromě toho vhodné aktivační domény mohou být izolovány fúzí úseků DNA z vybraného organismu s vhodnými DNA-vazebnými doménami a přímou selekcí na tuto funkci (Estruch et al., Nucl. Acids Res. 22: 3983-3989, 1994). Domény proteinových transkripčních aktivátorů mohou být vyměňovány mezi proteiny různého původu (Brent a Ptashne, Cell 43: 729-736, 1985). Výhodný gen hybridního transkripčního faktoru obsahuje sekvenci DNA, která kóduje DNA-vazebnou doménu GAL4 fúzovanou s aktivační doménou Cl z kukuřice.

B. Aktivovatelný .konstrukt DNA

Aktivovatelný konstrukt DNA pro použití v antisense validačním systému popsaném v předkládané přihlášce obsahuje:

• φ φ φ φφφφ

- 27 • ΦΦΦ

1) syntetický promotor operativně spojený s 2) aktivovatelnou sekvencí DNA. Syntetický promotor obsahuje alespoň jedno DNAvazebné místo rozpoznávané DNA-vazebnou doménou hybridního transkripčního faktoru a minimální promotor, výhodně element TATA odvozený z promotoru rozpoznávaného v rostlinné buňce. TATA element je zejména odvozen z promotoru rozpoznávaného v rostlinných buňkách toho typu, do kterých bude syntetický promotor vnášen. Je výhodné, když se DNA-vazebné místo v syntetickém promotoru několikrát opakuje, takže minimální promotor je účinněji aktivován, takže aktivovatelná sekvence DNA spojená se syntetickým promotorem je účinněji exprimována. Odborník může snadno využít rutinních metod molekulární biologie a genového inženýrství k přípravě potřebných syntetických promotorů. K příkladům DNA-vazebných míst vhodných k přípravě syntetického promotoru, bez omezení, patří upstream aktivační sekvence UAS_G rozpoznávaná DNA-vazebným proteinem GAL4, operátor lac a vazebné místo lexA. K příkladům TATA elementů rozpoznávaných v rostlinách patří elementy odvozené z promotorů 35S CaMV, Bzl promotoru kukuřice a promotoru UBQ3 kukuřice. Zvláště výhodný syntetický promotor obsahuje zkrácenou sekvenci 35S, CaMV obsahující TATA element (nukleotidy -59 až +48 od počátku transkripce) fúzovaný na 5'-konci k řetězci- 10 přímých opakování upstream aktivační sekvence UAS_G rozpoznávané DNA-vazebnou doménou GAL4.

Aktivovatelná sekvence DNA obsahuje jakoukoliv sekvenci DNA, pro kterou je požadována stabilní vnesení do rostlinné buňky a exprese v buňce. Zvláště vhodné aktivovatelné sekvence DNA jsou antisense . nebo sense sekvence, jejichž exprese vede ke snížení exprese jejich endogenního.partnera, čímž je inhibován normální růst a vývoj rostliny,. Aktivovatelná sekvence DNA je operativně spojena se ► · * • · • ··· .28 syntetickým promotorem a vytváří tak aktivovatelný konstrukt DNA. Aktivovatelná DNA v aktivovatelném konstruktu není v transgenní rostlině exprimována, tj. je umlčena, dokud není současně přítomen hybridní transkripční .faktor schopný vázat se na syntetický promotor a tím ho aktivovat. Aktivovatelný DNA konstrukt je vnesen do rostlinné buňky, pletiva nebo rostliny, čímž se vytvoří stabilní transgenní linie exprimující aktivovatelnou sekvenci, jak je popsáno podrobněji dále v textu. Aktivovatelná sekvence podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje antisense sekvenci genu lumazinsyntázy nebo antisense sekvenci genu pro bifunkční GTP cyklohydrolázů II/DHBP syntázu.

C. Transgenní rostliny obsahující gen hybridního transkripčního faktoru nebo aktivovatelný DNA konstrukt

Antisense validační systém popsaný ' v předkládané přihlášce užívá první rostlinu obsahující gen hybridního transkripčního faktoru hybridního transkripčního faktoru a druhou rostlinu obsahující aktivovatelný DNA konstrukt. Geny hybridního transkripčního faktoru a aktivovatelné DNA konstrukty popsané v předkládaném vynálezu se vnesou do rostlin jakoukoliv metodou odborníkovi známou, k nimž patří (přičemž výčet není omezující) křížení, transformace zprostředkovaná Agrobacterium tumefaciens, transformace provedená Ti plazmidovými vektory, přímým příjmem DNA např. ostřelováním mikročásticemi, přenosem zprostředkovaným liposomy nebo mikroinjekcemi. Transformanty se pak testují na přítomnost a funkci transgenů standardními metodami, které jsou odborníkům známy.

„ ----29 • · · · · · · ·· · φ φ ·· * · φ · * · · · φ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φ «•ΦΦΦ φφ φ · ·· φ φ ·· φ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφ φ · φφ φφ

D. Transgenní rostliny obsahující gen hybridního transkripčního faktoru společně s aktivovatelným DNA konstruktem

FI rostliny obsahující jak gen hybridního transkripčního faktoru tak i aktivovatelný DNA konstrukt se vytvářejí křížovým opylením a pak selekcí na přítomnost příslušného genového markéru. Na rozdíl od rostlin, které obsahují samotná aktivovatelný DNA konstrukt, tyto FI rostliny •generují vysokou hladinu expresního produktu aktivovatelného DNA konstruktu, srovnatelnou s hladinou získanou se silným konstitutivním promotorem jako je 35S CaMV.

rostlina stabilně konstruktem, který

Antisense validační test

Užitečný antisense validační test obsahuje následující kroky:

a) připraví se první transgenní rostlina transformovaná genem hybridního transkripčního faktoru,který kóduje hybridní transkripční faktor, schopný aktivovat syntetický promotor, když je syntetický promotor přítomen v rostlině, přičemž první transgenní rostlina je homozygotní pro hybridní transkripční faktor,

b) připraví se druhá transgenní transformovaná aktivovatelným DNA obsahuje syntetický promotor aktivovatelný hybridním transkripčním faktorem z kroku a) , a který je operativně spojen s aktivovatelnou sekvencí DNA, jako je např. antisense sekvence lumazinsyntázy nebo antisense sekvence bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy,

c) kříží se první transgenní rostlina s druhou transgenní rostlinou, čímž se získají dceřinné rostliny FI exprimující aktivovatelnou sekvenci DNA v přítomnosti hybridního transkripčního faktoru, a • » · · • · · • · 99

- 30 • ·· · ·« • * • · · * ·· 99 9 ·« * 9 9 9

9 9 » • · · · • 9 · · « · · ·

d) stanoví se účinek exprese sekvence aktivovatelné DNA na rostliny FI.

III. Rekombinantní produkce rostlinných enzymů biosyntézy riboflavinu a jejich použití

Pro rekombinantní produkci enzymů biosyntézy riboflavinu v hostitelském organismu jsou sekvence kódující rostlinné enzymy biosyntézy riboflavinu podle předkládaného vynálezu vloženy do expresní kazety zkonstruované pro daného hostitele a vneseny do hostitele, kde dochází k rekombinantní produkci. Výběr specifických regulačních sekvencí jako jsou promotory, signální sekvence, 5'a 3' netranslatované sekvence a zesilovače vhodného pro daného hostitele, je v kompetenci průměrného odborníka. Výsledná molekula obsahující jednotlivé elementy navzájem spojené ve -shodné čtecím rámci je vložena do vektoru ' schopného transformace do hostitelské buňky. Vhodné expresní vektory a způsoby rekombiantní produkce proteinů jsou znám pro hostitele jako je E. coli, kvasinky nebo hmyzí buňky (viz např. Luckow a Summers, Bio/Technol. 6: 47, 1988). Ke specifickým příkladů patří plazmidy jako je pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, Ca) a bakulovirové expresní vektory, např. vektory odvozené z genomu viru jaderné polyhedrózy Autographica californíca (AcMNPV). Výhodný systém bakulovirus/hmyzí buňky je systém pVI11392/buňky Sf21 (Invitrogen, La JOlla, CA).

Rekombinantně produkované enzymy biosyntézy riboflavinu z rostlin mohou být izolovány a purifikovány řadou standardních metod. Aktuální metoda, která se použije, závisí např. na tom, jaký byl užit hostitelský organismus, zda je enzym secernován, a dalších faktorech, které jsou odborníkovi • 9 ····

99 • « · 9

9 9 9 známy (viz kapitola 16 z Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, Inc.,1994)

Rekombinantně produkované enzymy biosyntézy riboflavinu z rostlin jsou užitečné pro řadu aplikací, tak např. mohou být užity v testech in vitro k testování chemických látek s herbicidním účinkem, u nichž dosud nebylo identifikováno místo působení, zda se nejedná o látku s inhibičním účinkem na enzymy biosyntézy riboflavinu. Takové testy in vitro mohou být obecně užity k identifikaci chemických látek,které inhibují tyto enzymatické aktivity a jsou proto případnými kandidáty na herbicidy. Rekombinantně produkované enzymy biosyntézy riboflavinu z rostlin s emohou případně využít pro další charakterizaci jejich asociace se známými inhibitory, což pomůže racionální konstrukci nových herbicidů založených na inhibitorech a také' nových, k herbicidu tolerantních forem enzymů.

Inhibitorové testy

Test vhodný k identifikaci inhibitorů esenciálních rostlinných genů jako jsou např. geny biosyntézy riboflavinu, obsahuje následující kroky:

a) enzymy biosyntézy riboflavinu se ponechají reagovat s jejich substráty v přítomnosti předpokládaného inhibitoru funkce enzymu,

b) porovná se rychlost enzymatické reakce v přítomnosti předpokládaného inhibitoru s rychlostí enzymatické reakce ve stejných podmínkách ale bez inhibitoru,

c) stanoví se, zda předpokládaný inhibitor skutečně inhibuje enzymy biosyntézy'riboflavinu .

Např. inhibiční účinek na rostlinnou lumazinsyntázu může být stanoven podle snížení nebi úplné inhibice syntézy lumazinu v testové reakci. Takové stanovení se provede ·· ·· « · · · · • ··· · ·

- 32 4 4 · · · ·«·· ·· ·· ·· ·· • · · · · • · · · · • · · 4 4 4

4 4 4 4 • 4 4 4 4 srovnáním množství lumazinu syntetizovaného v přítomnosti a v nepřítomnosti předpokládaného inhibitoru v in vitro testu pomocí měření fluorescence nebo absorbance jak je popsáno v příkladech provedení vynálezu. Podobný test je možné užít ke screeningu inhibitorů bifunkčního enymu GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

Kromě toho rekombinantně připravené enzymy biosyntézy riboflavinu se mohou použít ke zjištění komplexní struktury těchto molekul, jak již bylo provedeno pro riboflavinsyntázu z Bacillus subtilis (Ladenstein et al., J. Mol. Biol. 203: 1045-1070, 1988) . , Takové informace týkající se struktury enzymů biosyntézy riboflavinu v rostlinách se mohou využít pro racionální konstrukci nových inhibitorů vhodných jako herbicidy.

IRostliny tolerantní k herbicidu

Předkládaný vynález se dále týká rostlin, rostlinného pletiva, semen rostlin a rostlinných buněk, které jsou tolerantní k herbicidu,který inhibuje přirozeně se vyskytující enzymy biosyntézy riboflavinu v těchto, rostlinách, přičemž tolerance je způsobena změněnými enzymy biosyntézy riboflavinu.. Změněné aktivity enzymů biosyntézy riboflavinu lze dosáhnout v rostlinách podle předkládaného vynálezu zvýšením exprese enzymů biosyntézy riboflavinu divokého typu senzitivních k herbicidu tím, že se rostlině poskytnou další geny pro tyto enzymy biosyntézy riboflavinu, nebo expresí modifikovaných enzymů biosyntézy riboflavinu tolerantních k herbicidu v rostlině a nebo kombinací obou těchto způsobů. K reprezentativním rostlinám patří všechny rostliny, na které se normálně takové herbicidy aplikují. K výhodným rostlinám patří agronomicky důležité plodiny jako je např. bavlník, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejka, φ· ·· * φ φ • φφφ

- 33 φφφ φφφφ φφ ·· φφφφ • · Φ

ΦΦ Φ

ΦΦ ΦΦ • · Φ ·

Φ · Φ · • 9 9 9

9 9 9

99 sója, kukuřice, pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, trávníkové a pícninové trávy a pod.

A. Zvýšená exprese enzymů biosyntézy riboflavinu divokého typu

Dosažení změněné aktivity enzymů biosyntézy riboflavinu zvýšenou expresí vede k hladinám enzymů biosyntézy riboflavinu v rostlinných buňkách, které jsou dostatečné k tomu, aby překonaly inhibici růstu způsobenou herbicidem. Hladina exprimovaného enzymu je v takovém případě alespoň dvakrát, výhodně alespoň pětkrát a nejvýhodněji alespoň desetkrát vyšší než je přirozené původní množství. Zvýšené exprese lze dosáhnout buďto větším počtem kopií genů biosyntézy riboflavinu divokého typu, zvětšením počtu kódujících sekvencí v rámci genu (tj. genovou amplifikací) nebo mutací v nekódující, regulační sekvenci endogenního genu v rostlinné buňce. Rostliny mající takovou změněnou genovou aktivitu byly získány přímou selekcí metodami v oboru známými (viz např. patenty USA č. 5 162 602 a 4 761 373 a literatura v nich citovaná). Takové rostliny lze získat i metodami genového inženýrství známými v oboru. Zvýšená exprese genů biosyntézy riboflavinu senzitivních k herbicidu může být dosažena stabilní transformací rostlinných buněk rekombinantní nebo chimérickou molekulou DNA obsahující promotor schopný řídit expresi asociovaného strukturního genu v rostlinné buňce, který je operativně spojen s homologním nebo heterologním strukturním . genem, který kóduje enzym' biosyntézy riboflavinu.

• · ···· ·· ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 · · · · t • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9 99 99

- 34 B. Exprese modifikovaných enzymů biosyntézy riboflavinu tolerantních k herbicidu

V tomto provedení vynálezu jsou rostliny, rostlinná · pletiva, semena a rostlinné buňky stabilně transformované molekulou rekombinantní DNA, která obsahuje vhodný promotor funkční v rostlinách operativně spojený s kódující sekvencí, která kóduje formu enzymu biosyntézy riboflavinu tolerantní k herbicidu. Forma enzymu tolerantní k herbicidu má alespoň .jednu aminokyselinovou substituci, adici nebo deleci, která ji uděluje toleranci k herbicidu, který inhibuje nemodifikovanou přirozeně se vyskytující formu enzymu. Transgenní rostliny, rostlinná, pletiva, semena a rostlinné buňky takto vytvořené se pak selektují konvenčními metodami, čímž se selektují, charakterizují a dále vyvíjejí linie tolerantní k herbicidu. Dále jsou popsány metody přípravy genů, které kódují formy enzymů biosyntézy riboflavinu tolerantní k herbicidu.

Obecná základní strategie obsahuje přímou nebo nepřímou mutagenezi u mikroorganismů. Tak např. geneticky snadno manipulovatelné mikroorganismy jako je E. coli nebo

S. cerevisiae se mohou podrobit náhodné mutagenezi in vivo 'pomocí mutagenů jako je UV záření nebo etyl- či metylmetansulfonát. Takové postupy mutageneze jsou popsány např. v Miller, Eperiments in Molecuar Genetics, Cold Spring Harbor Laboratoty, Cold Spring Harbor, NY, 1972, Davis et al., Advances in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1980, Sherman et al., Methods in Yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, NY, 1983, patent USA č. 4 975 374.

Mikroorganismus vybraný pro mutagenezi obsahuje normální, k inhibitoru senzitivní gen biosyntézy riboflavinu a je závislý na aktivitě poskytované tímto genem. Buňky určené pro

·· fefefefe fefe · fefefe • · * • fefe fe · • fefefe · • · · • fe · • fe mutagenezi se kultivují v přítomnosti inhibitoru v koncentraci, která inhibuje nemodifikovaný gen. Kolonie mikroorganismů po mutagenezi, které rostou v přítomnosti inhibitoru lépe (tj. projevují rezistencí k inhibitoru) než nemutované mikroorganismy jsou selektovány pro další analýzy. Geny pro enzymy biosyntézy riboflavinu jsou izolovány z těchto mikroorganismů, buďto klonováním nebo pomocí PCR, a pak je stanovena jejich sekvence. Sekvence, která kóduje změněný genový produkt se pak klonuje zpět do mikroorganismu, aby se potvrdilo, že poskytuje toleranci k inhibitoru.

Metody získání k herbicidu tolerantních alel. genů biosyntézy riboflavinu z rostlin zahrnují přímou selekci rostlin. Např. vliv mutovaného genu biosyntézy riboflavinu na inhibici růstu např. u Arabidopsis thaliana, sóji nebo kukuřice se stanoví tak, že se sterilizovaná semena vysejí standardním způsobem na plotny s médiem obsahujícím minimální živiny, které obsahují zvyšující se koncentraci inhibitoru. Koncentrace inhibitoru jsou obvykle 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000 a 3000 ppm (parts per milion). Nejnižší dávka, při které lze reprodukovatelně detekovat významnou inhibici růstu je pak užita v dalších pokusech.

Mutageneze rostlinného materiálu se užívá, aby se zvýšila frekvence, s jakou se vyskytují rezistentní alely v selektované populaci. Mutovaná semenný materiál se získává z různých zdrojů, jako je např. chemická nebo fyzikální mutageneze semen, nebo chemická nebo fyzikální mutageneze pylu (Neuffer, Maize for Biological Research, Sheridan- (ed.) Univ. Press, Grand Forks, ND, s. 61-64, 1982), který je pak užit k oplodnění rostlina výsledná Ml mutovaná semena se sklidí. Typicky M2 semena Arabidopsis thaliana (Lehle Seeds, Tuscon, AZ), která jsou potomstvem semen nebo rostlin »S*Í« ·· * 0 0 • 0 00 • · · 0000 00 • 0 ··

0 0 • · 0 «

- 36 ·· 0·00

0 0 00 00 pěstovaných ze semen podrobených chemické mutagenezi, jako je např. etylmetansulfonát, nebo mutagenezi fyzikálními činidly, jako je gama záření nebo rychlé neutrony, jsou vyseta v hustotě do .10000 semen na plotnu (s průměrem 10 cm) média obsahujícího minimální soli a vhodné koncentrace inhibitoru pro selekci na toleranci. Semenáčky, které pokračují v růstu a zůstávají zelené 7 až 21 dnů po vysetí jsou přeneseny do půdy a pěstovány dále až do zralosti a získání semen. Potomstvo z těchto semen se testuje na toleranci k herbicidu. Pokud je znak tolerance dominantní, rostliny jejichž semena segregují v poměru 3:1 rezistentní:senzitivní se pokládají za heterozygoty pro rezistenci v generaci M2. Rostliny, které poskytují jen rezistentní semena jsou považovány za homozygotní rta rezistenci v generaci M2. Taková mutageneze prováděná na intaktních semenech a screening M2 potomstva se mohou provádět i u jiných druhů rostlin, např. sóji (viz např. patent USA č. 5 074 082). Alternativně mutované semena, která se pak testují na rezistenci k herbicidu, jsou získána po oplodnění pylem, který byl vystaven mutagenezi chemickými nebo fyzikálními činidly.

Potvrzení toho, že genetickým základem tolerance k herbicidu ·je modifikovaný gen biosyntézy riboflavinu je uvedeno v následujících příkladech. Za prvé, alely genu biosyntézy riboflavinu z rostlin jevících rezistenci k inhibitoru byly izolovány pomocí PCR s primery odvozenými z konzervativních úseků kódující sekvence cDNA z Arabidopsis thaliana, které jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 13, výhodněji odvozenými z nezměněné sekvence genu biosyntézy riboflavinu z rostliny použité k vytvoření tolerantní alely. Po provedení sekvenční analýzy alel ke zjištění přítomnosti mutací v kódující sekvenci jsou alely testovány na jejich schopnost přenášet toleranci k inhibitoru φφ ·φ φ φ φ • φφφ φ φ φ

φ φφφ φ φ

na rostliny, do kterých bylo tyto alely s předpokládanou tolerancí vneseny. Rostliny jsou bud Arabidopsis thaliana nebo jakékoliv rostliny, jejichž růst je citlivý k inhibitoru. Za druhé, geny biosyntézy riboflavinu jsou mapovány relativně vzhledem ke známému polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP) (viz např. Chang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 6856-6860, 1988, Nam et al., Plant Cell 1: 699-705, 1989). Znak tolerance se nezávisle mapuje pomocí stejných markérů, jestliže je tolerance způsobena mutací v genu biosyntézy riboflavinu , znak tolerance spadá do pozice nerozlišitelné od pozice genu_z biosyntézy riboflavinu.

Jinou metodou, jak získat k herbicidu tolerantní alely genu biosyntézy riboflavinu je selekce v rostlinných kulturách.' Explantáty z rostlinného pletiva, např. embrya, listové disky apod. nebo aktivně rostoucí kalusové nebo suspenzní kultury požadovaných rostlin jsou kultivovány na médiu obsahujícím rostoucí koncentrace inhibujícího herbicidu nebo analogického inhibitoru, který je vhodný pro použití v laboratorních podmínkách. U různých kultur byly zaznamenány odlišné stupně růstu. V některých ·kulturách se objevují kolonie rychle rostoucích variant, které pokračují v růstu v přítomnosti koncentrace inhibitoru, která je normálně inhibující. Frekvence, s jakou se tyto rychle rostoucí varianty objevují, může být zvýšena působením chemických nebo fyzikálních mutagenů před tím, než je pletivo nebo tkáň vystavena působení inhibitoru. Předpokládané tolerantní alely genu biosyntézy riboflavinu jsou pak izolovány a testovány postupy, které byly popsány v předchozích odstavcích. Alely, které jsou identifikovány jako alely poskytující toleranci k herbicidu jsou pak metodami genové inžénýrství upraveny pro optimální expresi a transformovány do rostliny. Alternativně

99

9 9 • 999

99 ·· 9

9 9 ·

- 38 *· 9 9 9 9

9 9

9999 99

9 9

9

9 9 9

99 se rostliny regenerují z tkáňových nebo buněčných kultur obsahujících tyto alely.

Ještě další způsob spočívá v mutagenezi k herbicidu senzitivních genů biosyntézy riboflavinu divokého typu z rostlin v bakteriích nebo kvasinkách,po které následuje kultivace příslušného mikroorganismu v médiu obsahujícím inhibující koncentrace inhibitoru a pak selekce těch kolonií, které rostou i v přítomnosti inhibitoru. Konkrétně rostlinná cDNA jako je např. cDNA z Arabidopsis thaliana kódující lumazinsyntázu (sekvence id.. č. 1) nebo bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu . (sekvence id. č. 13) je klonována do mikroorganismu, který jinak zcela postrádá aktivitu vybraného genu. Transformovaný mikroorganismus je pak podroben mutagenezi in vitro některou z mnoha v oboru známých chemických nebo enzymatických metod, např. disiřičitanem sodným (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468, 1983, methoxylaminem (Kadonga et al.., Nucl. Acids Res. 13: 1733-1745, 1985, oligonukleotidem řízenou saturační mutagenezi (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 710-714, 1986) nebo využitím různých strategií chybné inkorporace polymerázami (viz např. Shortle, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 1588-1592, 1982, Shirashi et al., gene 64: 313-319, 1988 a Leung et al., Techniques 1: 11-15, 1989). Kolonie rostoucí v přítomnosti koncentrace, která je normálně inhibující, jsou vybrány a purifikovány a pak opakovaně naneseny a kultivovány. Pak jsou z nich purifikovány plazmidy a testovány, zda mají schopnost přenášet toleranci k inhibitoru, a to tak, že se znovu transformují do mikroorganismu, který postrádá aktivitu genu biosyntézy riboflavinu. Pak je sekvencována sekvence DNA z inzertů cDNA plazmidů, které prošly uvedeným testem.

44

4 4

04«

- 39 4 0 0 0 0 0

0000 00 40 4

00

0 4 0

4 4 «

0 0 4

0 0 0

44

Geny biosyntézy riboflavinu rezistentní k herbicidu lze také získat metodami, které zahrnují metodu in vitro rekombinace zvanou míchání DNA. Tímto mícháním DNA se mutace, výhodně náhodné mutace, vnášejí do genů biosyntézy riboflavinu. Míchání DNA vede také k rekombinaci a změně uspořádání sekvence genu biosyntézy riboflavinu . nebo k rekombinaci a výměně sekvencí mezi dvěma nebo více různými sekvencemi kódujícími protein biosyntézy riboflavinu. Tyto metody dovolují vytvořit miliony mutovaných genů biosyntézy riboflavinu. Mutované nebo míchané geny se pak testují na požadované vlastnosti, např. zlepšenou toleranci k herbicidu, a na mutace,, které poskytují široké spektrum tolerance k různým třídám inhibitorů. Takové testy jsou odborníkům dobře známy.

Ve výhodném provedení vynálezu mutovaný gen biosyntézy riboflavinu, je vytvořen z'alespoň jednoho templářů genu biosyntézy riboflavinu, přičemž templátový gen biosyntézy riboflavinu byl štěpen na dvouřetězcové náhodné fragmenty požadované velikosti. Metoda míchání DNA obsahuje kroky, kdy se přidá k výsledné populaci dvouřetězcových náhodných fragmentů jeden nebo několik jedno- nebo dvouřetězcových oligonukleotidů, přičemž tyto oligonukleotidy obsahují oblast identity a heterologní oblast vzhledem k náhodným fragmentům, výsledná směs dvouřetězcových fragmentů a oligonukleotidů se denaturuje na j ednořetě-zcové fragmenty, výsledná populace jednořetězcových . fragmentů v podmínkách, které vedou se inkubuje s polymerázou k nasednutí jednořetězcových fragmentů v oblastech identity, takže se vytvoří páry spřažených fragmentů, přičemž oblast identity je dostatečná k tomu, aby jeden člen páru sloužil jako očko pro replikaci vytvoří mutovaný druhého, cimz se dvouřetězcový polynukleotid, pak se opakuje druhý a třetí krok alespoň

φφ φφ • · φ φ φφφ φφ φφ φ φ φ φ • ΦΦΦ

- 40 φφ ··»» •ΦΦΦ φφ « ·. φ φφ φ • φφφ φ* ·· ještě další dva cykly, přičemž výsledná směs z druhého kroku dalšího cyklu obsahuje mutované dvouřetězcové polynukleotidy ze třetího kroku předchozího cyklu, a další cykly vytvářejí další mutované dvouřetězcové polynukleotidy, přičemž mutovaný polynukleotid je mutovaný gen biosyntézy riboflavinu, který má zvýšenou toleranci k herbicidu, který inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu biosyntézy riboflavinu. Ve výhodném provedení vynálezu koncentrace jednotlivých druhů dvouřetězcových náhodných fragmentů v populaci dvouřetězcových náhodných fragmentů je menší než 1 % (hmot.) celkové DNA. V dalším výhodném provedení .templátový dvouřetězcový polynukleotid obsahuje alespoň , 100 druhů polynukleotidů. V ještě dalším výhodném provedení vynálezu je velikost náhodných dvouřetězcových fragmentů 5 bp až 5 kb. V dalším- výhodném provedení čtvrtý krok metody obsahuje opakování druhého a třetího kroku alespoň v 10 cyklech. Taková ' metody byla popsána např. v Stemmer et al., Nátuře 370: 389-391, 1994, v patentu USA č. 5 605 793, Crameri et al., Nátuře 391: 288-291, 1998 a v patentové přihlášce WO 97/20078, kteréžto publikace jsou plně zahrnuty formou odkazu.

V jiném výhodném provedení vynálezu je jakákoliv kombinace dvou nebo více různých genů biosyntézy riboflavinu mutována in vitro metodou střídavé extenze (StEP, staggered extension process), která byla popsána v Zhao et al., Nátuře Biotechnology 16: 258-261. Stručně shrnuto, dva nebo více genů biosyntézy riboflavinu ' se užijí jako templát pro PCR amplifikaci, kdy se užívají cykly extenze (prodlužování řetězce) výhodně při nižší teplotě než je optimální polymerizační teplota dané polymerázy. Tak např. když se použije termostabilní polymeráza s optimem 72 °C, teplota použitá pro extenzi je nižší než 72°C, výhodně nižší než

Á- a* č';

·· ·« • ·· • ·*·) • φ · • φ) · • · ♦ · · · ···· ·· φφφ

- 41 65 °C, ještě výhodněji je nižší než 60 °a nejvýhodněji se pro extenzní reakci užije teplota 55 °C. navíc je trvání extenzního kroku PCR reakce kratší, než se obvykle užívá, jak je odborníkům známo, výhodně je kratší než 30 vteřin, výhodněji kratší než 15 vteřin, ještě výhodnější je trvání extenzní reakce 5 vteřin. Po«uze krátký fragment DNA se polymerizuje v každé extenzní reakcí, což umožňuje, že templát přeskakuje mezi výchozími molekulami DNA po každém cyklu denaturace a nasednutí, čímž vzniká diverzita vytvářených produktů. Optimální počet cyklů PCR závisí na délce . kódujících úseků genů biosyntézy riboflavinu, ale žádoucí je více než 40 cyklů, výhodně více než 60 cyklů a nejvýhodněji se užije více než 80 cyklů. Optimální podmínky extenze a optimální počet cyklů PCR pro každou kombinaci genů biosyntézy riboflavinu je třeba stanovit užitím postupů odborníkům známých. Další parametry PCR jsou v zásadě shodné s obecně užívanými v oboru. Primery pro amplifikaci PCR jsou výhodně navrženy tak, aby nasedly na sekvence DNA lokalizované vně kódující sekvence . genů biosyntézy riboflavinu, tj . na sekvence DNA vektoru, který obsahuje geny biosyntézy riboflavinu, přičemž různé geny biosyntézy riboflavinu použité v reakci PCR jsou výhodně obsaženy v samostatných vektorech. Primery výhodně nasedají na sekvence lokalizované ve vzdálenosti méně než 500 bp od kódující sekvence genu biosyntézy riboflavinu, výhodně ve vzdálenosti méně než 200 bp a ještě výhodněji vzdálenosti méně než 120 bp od kódující sekvence genu biosyntézy riboflavinu. Výhodně jsou kódující sekvence genu- biosyntézy riboflavinu obklopeny restrikčními místy, která jsou součástí DNA amplifikované. v . PCR, což usnadňuje klonování amplifikovaných produktů do vhodných vektorů.

I · Φ φ φ • · · φ

- 42 V jiném výhodném provedení fragmenty genů biosyntézy riboflavinu mají kohezní konce a jsou připraveny způsobem popsaným v patentové přihlášce WO 98/05765. Kohezní konce jsou vytvořeny ligací prvního oligonukleotidu, který odpovídá části genu biosyntézy riboflavinu, k druhému oligonukleotidu, který není přítomen v genu nebo odpovídá části genu, která nesousedí s částí genu odpovídající prvnímu oligonukleotidu, přičemž druhý oligonukleotid obsahuje alespoň jeden ribonukleotid. Dvouřetězcová DNA se připraví použitím prvního oligonukleotidu jako templátu a druhého oligonukleotidu jako primeru. Ribonukleotid se vyštěpí a odstraní. Nukleotid (nukleotidy) lokalizované na 5'se také odstraní, což vede k vytvoření dvouřetězcových fragmentů, které mají kohezní konce. Tyto fragmenty se pak náhodně ligací pospojují, čímž se vytvoří nové kombinace genových sekvencí.

Pro in vitro rekombinaci podle předkládaného vynálezu se užije jakýkoliv gen biosyntézy riboflavinu nebo jakákoliv kombinace genů biosyntézy riboflavinu, např. gen biosyntézy riboflavinu získaný z rostlin jako je např. Arabidopsis thaliana, nebo např. gen biosyntézy riboflavinu uvedný jako sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 13 nebo gen biosyntézy riboflavinu z E. coli nebo Bacillus subtilis. V předkládaném vynálezu se užijí celé geny biosyntézy. riboflavinu nebo jejich části. Knihovna mutovaných genů biosyntézy riboflavinu získaná výše uvedenými metodami se klonuje do vhodných expresních vektorů a výsledné vektory se transformují do vhodných hostitelů, např. řasy jako je Chlamydomonas, nebo kvasinka nebo bakterie. Výhodným hostitelem je takový hostitel, který normálně postrádá aktivitu genů biosyntézy riboflavinu. Hostitelské buňky transformované vektory, které obsahují knihovnu mutovaných genů biosyntézy riboflavinu, se kultivují v médiu, které obsahuje inhibující koncentraci • ·

- 43 inhibitoru, a pak se selektují kolonie rostoucí v přítomnosti inhibitoru. Kolonie rostoucí v koncentraci inhibitoru, která je normálně inhibující, jsou vybrány, izolovány a znovu kultivovány. Jejich plazmidová DNA je purifiko.vána a stanoví se sekvence DNA inzertů cDNA z plazmidů, které prošly testem.

Test pro identifikaci modifikovaných genů biosyntézy riboflavinu tolerantních k inhibitoru lze provést stejným způsobem, jak bylo popsáno výše pro identifikaci inhibitorů enzymů biosyntézy riboflavinu, avšak s následujícími modifikacemi: Za prvé, v reakční směsi inhibitorového testu je enzym biosyntézy riboflavinu divokého typu nahrazen mutovaným enzymem biosyntézy riboflavinu. Za druhé, inhibitor enzymu divokého typu je přítomen v obou reakčních směsích. Za třetí, mutovaná aktivita (aktivita v přítomnosti inhibitoru a mutovaného enzymu) a nemutovaná aktivita v přítomnosti inhibitoru a enzymu divokého porovnají, aby se stanovilo, zda došlo k významnému zvýšení enzymatické aktivity v případě mutované ve srovnání s nemutovanou aktivitou. Mutovaná aktivita je jakákoliv míra aktivity mutovaného enzymu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Nemutovaná aktivita je jakákoliv míra aktivity enzymu divokého typu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Významné zvýšení je definováno jako zvýšení enzymatické aktivity, které je vyšší než hranice chyby vlastní dané měřící technice, výhodně se jedná o zvýšení 2x a více než je aktivita enzymu divokého typu v přítomnosti výhodně zvýšení 5x a více a nej výhodněji lOx (aktivita typu) se inhibitoru, a více.

Kromě k herbicidu, tolerantní využití k přípravě rostlin geny. kódující enzymy biosyntézy k herbicidu se mohou využít tolerantních riboflavinu také jako selektovatelné markéry v metodách transformace- rostlin. Ták • ·

např. rostliny, rostlinná pletiva, semena a rostlinné buňky transformované transgenem mohou být transformovány také genem, který kóduje změněný enzym biosyntézy riboflavinu, který je schopen exprese v dané rostlině. Transformované buňky se pak přenesou na médium obsahující inhibitor enzymu v množství dostatečném k inhibici přežívání rostlin,které neexprimují modifikovaný gen, takže jen transformované rostliny mohou přežít. Tuto metodu lze použít pro jakoukoliv rostlinnou buňku, která může být transformována genem kódujícím modifikovaný enzym biosyntézy riboflavinu,' a lze ji užít s jakýmkoliv požadovaným transgenem. Exprese transgenu a modifikovaného genu může být řízena stejným promotorem, který je funkční v rostlinné buňce, nebo odlišnými promotory.

II. Postupy transformace rostlin

Gen divokého typu biosyntézy riboflavinu nebo jeho forma tolerantní k herbicidu může být vnesena do rostlinné nebo bakteriální buňky konvenčními technikami rekombinantní DNA. Obecně řečeno to znamená vložit molekulu DNA kódující enzym biosyntézy riboflavinu do expresního systému, vzhledem ke kterému je molekula DNA heterologní (tj. není v něm normálně přítomna), konvenčními metodami v oboru známými. Takový vektor obsahuje všechny nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující protein v hostitelské buňce, která obsahuje vektor. Je možné užít celou řadu vektorů, které jsou v oboru známy, jako např. plazmidy, bakteriofágní viry a jiné modifikované viry. Složky expresního systému mohou být modifikovány, aby se zvýšila exprese. Tak např. lze využít zkrácených sekvencí, nukleotidových substitucí nebo jiných modifikací. Expresní systémy v oboru známé mohou být za vhodných podmínek užity k transformaci skutečné jakékoliv plodiny. Transformované ·· ···· ·· ·· • · 9 9 9 9 • · · · · ·

9 9 9 9 9 9

9 · ···

9 99 99 buňky mohou být regenerovány na celé rostliny, takže vybraná forma genu biosyntézy riboflavinu poskytuje toleranci k herbicidu v transgenních rostlinách.

A. Požadavky na konstrukci rostlinných expresních kazet

Genové sekvence zamýšlené pro expresi v transgenních rostlinách se nejdříve sestaví do expresní kazety za vhodný promotor, který je schopný řídit expresi v rostlině. Expresní kazety mohou také obsahovat jakékoliv další sekvence potřebné nebo vybrané k expresi transgenů. K takovým, sekvencím patří, přičemž výčet není omezující, terminátory transkripce, externí sekvence ke zvýšení exprese jako jsou např. introny, vitální sekvence a sekvence vhodné k zacílení genového produktu do určité organely nebo buněčného kompartmentu. Tyto expresní kazety mohou být snadno přeneseny pomocí rostlinných transformačních vektorů popsaných dále. V následující části jsou popsány různé složky typických expresních kazet.

I

1. Promotory

Výběr promotorů použitých v expresních kazetách určuje prostorový a časový vzorec exprese transgenů v transgenní rostlině, vybrané promotory vedou k expresi transgenů ve specifických typech buněk (jako jsou např. buňky epidermis listu, mezofylové buňky, buňky kůry kořene) nebo ve specifických pletivech či orgánech (např. kořeny, listy nebo květy) a tak výběr odráží požadovanou lokalizaci akumulace genového produktu. Alternativně vybraný promotor řídí expresi za různých indukujících podmínek. Promotory se liší ve své síle, tj . schopnosti zahajovat transkripci. V závislosti na použitém hostitelském systému, v podstatě kterýkoliv promotor v oboru známý může být· využit. Tak např. pro konstitutivní expresi lze užít promotor 35S CaMV, promotor aktinu z rýže ·:·.·/ • · · · • · · • ···

- 46 ·· ··

• · · · · · • ·· · ·· ·· · nebo promotor ubikvitinu. Pro regulovanou expresi je možné užít chemicky indukovatelný promotor PR-1 z tabáku nebo Arabidopsis thaliana (viz patent USA č. 5 689 044) .

2. Terminátory transkripce

Celá řada terminátorů transkripce je dostupná použití v expresních kazetách. Terminátory transkripce zodpovědné za ukončení správnou polyadenylaci transkripce jsou ty, v rostlinách a patří k pro j sou za transgenem a za Vhodné terminátory známy, že fungují terminátr 35S CaMV, transkripce transkriptu. které jsou nim např.

terminátor tmi, terminátor nopalinsyntázy a terminátor rbcS E9 hrachu. Lze je využít jak v jednoděložných tak ve dvoudšložných rostlinách.

3. Sekvence pro zvýšení exprese nebo pro regulaci exprese

Byly nalezena mnohé sekvence, které zvyšují expresi z dané transkripční jednotky, a tyto sekvence mohou být využity ve spojení s geny podle předkládaného vynálezu ke zvýšení exprese těchto genů v transgenních rostlinách. Např. bylo ukázáno, že různé intronové sekvence jako jsou introny genu adhl z kukuřice zvyšují expresi, zvláště u jednoděložných rostlin, kromě toho řada netranslatovaných vedoucích sekvencí pocházejících z virů také zvyšuje expresi, přičemž jsou zejména účinné u dvoudšložných rostlin.

4. Optimalizace kódující sekvence

Kódující sekvence vybraného genu může být metodami genového inženýrství upravena pro optimální expresi.v plodině vybraného rostlinného druhu. Metody pro modifikaci kódujících sekvencí k dosažení optimální exprese u konkrétních druhů plodin jsou známy (viz např. Perlak, Proč. Nati. Acad. Sci.

9 9 9 • · ···· e · • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 9 ··· ··· 9999 ••99 99 99 9 99 99

- 47 USA 88: 3324., 1991, Koziel et al., Bio/Technol. 11: 194,

1993).

5. Zaměřování genového produktu uvnitř buňky

Je známo, že u rostlin existují různé mechanismy zaměřování genových produktů a sekvence řídící tyto mechanismy byly již do jisté míry charakterizovány. Tak např. změření genového produktu do chloroplastu je řízeno signální sekvencí nalezenou na N-konci různých proteinů, přičemž tento konec je v průběhu importu do chloroplastu odštěpen a vzniká maturovaný protein (např. Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109, 1988). Jiné genové produkty jsou lokalizovány v jiných organelách jako např. v mitochondriích a peroxisomech (viz např. Unfer.et al., Plant. Mol. Biol. 13: 411-418, 1989). cDNA kódující tyto produkty může být upravena, aby se ovlivnilo zaměření heterologních genových produktů do těchto organel. Kromě toho byly charakterizovány i sekvence, které řídí zaměřování produktu do jiných buněčných kompartmentů. Sekvence N-konce jsou zodpovědné za směrování produktu do ER, apoplastu a za extracelulární sekreci z aleuronových buněk (Koehler a HO, Plant Cell 2:

769-783, 1990) . Navíc sekvence N-konce ve spojení se.

sekvencemi karboxylového konce jsou zodpovědné za ' směrování produktu do vakuoly (Shinshi et al., Plant Mol. Biol. 14: 357-368, 1990). Fúzí vhodných zaměřovačích sekvencí zde popsaných se sekvencí požadovaného transgenu je možné nasměrovat produkt transgenu do. jakékoliv organely nebo buněčného kompartmentů.

B. Konstrukce vektorů pro transformaci rostlin

Odborníkům je nyní známa celá řada vektorů pro transformaci rostlin, a geny podle předkládaného vynálezu

- 48 • · · * k · · • ·«· mohou být užity ve spojení s těmito vektory. Výběr vhodného vektoru' závisí na zvoleném způsobu transformace a na cílovém rostlinném druhu transformace. Pro určité cílové druhy mohou být výhodné určité markéry pro selekci pomocí antibiotik nebo herbicidů. K selekčním markérům rutinně využívaným pro transformaci patří gen nptll, který poskytuje rezistenci ke kanamycinu a příbuzným antibiotikům (Messing a Vierra, Gene 19: 259-268, 1982, Bevan et al., Nátuře 304: 184-187, 1983), gen bar, který poskytuje rezistenci k herbicidu fosfinotricinu (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062, 1990, Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631, 1990), gen hph, který poskytuje rezistenci k antibiotiku hygromycinu (Blochinger a Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931), gen dhfr, který poskytuje rezistenci k methotrexatu (Bourois

et al., EMBO J.:	1099-1104,	1983) a gen	EPSPS, který uděluje
rezistenci ke	glyfosatu	(patenty	USA č. 4 940 935
a 5 188 642) .
1. .Vektory	vhodné	k transformaci zprostředkované

Agrobacterium tumefaciens

Pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium tumefaciens je. k dispozici celá řada vektorů. Tyto vektor typicky nesou alespoň jednu hraniční sekvenci T-DNA a patří k nim vektory jako např. pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res., 1984) a pXYZ. K typickým vektorům pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium tumefaciens patří binární vektory pCIB200 a pCIB2001, a také binární vektor pCIBlO a jeho deriváty s hygromycinovou selekcí (viz např. patent USA č. 5 639 949).

- 49 9 9

9 99

9 9999

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

2. Vektory vhodné pro jiné metody transformace

Transformace jiným způsobem než pomocí Agrobacterium tumefaciens se vyhýbá, požadavku na přítomnost T-DNA sekvence v transformačním vektoru a tudíž lze použít vektory, které postrádají tuto sekvenci kromě již výše zmíněných vektorů obsahujících T-DNA sekvence. K metodám transformace bez využití Agrobacterium tumefaciens patří např. ostřelování mikročásticemi, příjem do protdplastů (např. pomocí PEG nebo elektroporací) a mikroinjekce. Výběr vhodných vektorů závisí zejména na požadovaném způsobu selekce transformovaných rostlin. K typickým vektorům vhodným pro transformace jiné než pomocí Agrobacterium tumefaciens patří pCIB3064, pSOG19 a pSOG35 (vuz např. patent USA č. 5 639 949).

C. Techniky transformace

Jakmile byla jednou požadovaná klonována do expresního systému, je možné ji transformovat do rostlinné buňky. Způsoby transformace rostlinných buněk a následné regenerace rostlin jsou odborníkům známy. Tak např. Ti-plazmidové vektory byly užity k přenosu cizorodé DNA, a stejně tak přímý příjem DNA, případně přenos pomocí liposomů, elektroporace, mikronjekcí nebo mikroprojektilů. Kromě toho mohou být k přenosu genů do rostlinných buněk užity bakterie rodu Agrobacterium.

Techniky transformace dvouděložných rostlin patří k nim techniky,

Agrobacterium tumefaciens a techniky bez využití Agrobacterium tumefaciens. K technikám bez využití Agrobacterium tumefaciens patří zejména přímý příjem exogenního genetického materiálu protoplasty nebo buňkami. To lze provést pomocí PEG nebo elektroporace, kódující sekvence sou které odborníkům dobře známy a využívají zprostředkování

99 • 9 9 9

9« 99*9 metodou ostřelování mikročásticemi nebo mikroinjekcemi. V každém případě se transformované buňky pak regenerují na celé rostliny standardními metodami, které jsou odborníkům známy.

Nyní se stala rutinou i transformace většiny druhů jednoděložných rostlin. K výhodným metodám patří přímý příjem zprostředkovaný PEG nebo elektroporací, metodou ostřelováni mikročásticemi nebo mikroinjekcemi kalusového pletiva, ale také transformace zprostředkovaná Agrobacterium tumefaciens:

III. Šlechtění

Geny biosyntézy riboflavinu divokého typu nebo jejich změněné formy podle předkládaného vynálezu mohou být použity k vnášení tolerance k herbicidu do celé řady různých rostlinných buněk, a to jak rostlin nahosemenných tak i jednoděložných a dvouděložných. Ačkoliv gen může být vnesen do jakékoliv rostlinné buňky v rámci těchto široce definovaných kategorií, jedná se zejména o buňky zemědělsky významných plodin jako je např. rýže, pšenice, ječmen, žito, kukuřice, brambor, karotka, sladké brambory, cukrová řepa, fazol, hrách, čekanka, salát, kapusta, zelí, květák, brokolice, tuřín, ředkvička, špenát, chřest, cibule, česnek, lilek, paprika, celer, dýně a tykve, cuchýny, okurky, melouny, 'jabloň, hrušeň, kdoule, švestka, třešeň, broskev, nektarinka, meruňka, jahodník, grapefruit, malinovník, borůvka,ananas, avokádo, papája, mangovník, banánovník, sója, tabák, rajčata, čirok a cukrová třtina.

Vysoká exprese genu biosyntézy riboflavinu divokého typu a/nebo exprese k herbicidu tolerantní formy genu biosyntézy riboflavinu, která poskytuje rostlině toleranci k herbicidu, v kombinaci s dalšími vlastnostmi důležitými pro produkci

- 51 • Φ «·Φ· φ φ φ * φφφ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ · φφφ φφφφ φφ φφ · φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ a kvalitu, mohou být vneseny do rostlinných linií v oboru známými šlechtitelskými metodami.

Když je izolována alela genu biosyntézy riboflavinu tolerantní k herbicidu přímou selekcí v plodině nebo v buněčné kultuře, ze které je možné regenerovat rostlinu, přenese se do komerčních odrůd klasickými metodami šlechtění, kterými se získá plodina tolerantní k herbicidu, aniž by bylo třeba alelu upravovat metodami genového inženýrství a vnášet ji do rostlin transformací.

Předkládaný vynález je dále podrobněji popsán a vysvětlen formou příkladů, které slouží k ilustraci vynálezu a nijak vynález neomezují.

Popis sekvencí uvedených v seznamu sekvencí

Sekvence id. č. 1 je sekvence cDNA kódujíc β podjednotku riboflavinsyntázy (lumazinsyntázy) z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 2 je predikovaná aminokyselinová sekvence lumazinsyntázy ze Arabidopsis thaliana kódované

sekvencí id.	č. 1	•
Sekvence	id.	č.	3 je oligonukleotid DG-63.
Sekvence	id.	č.	4 je oligonukleotid DG-65.
Sekvence	id.	č.	5 je oligonukleotid JG-L.
Sekvence	id.	č.	6 je oligonukleotid RS-1.
Sekvence	id.	č.	7 je oligonukleotid RS-2.
Sekvence	id	č	. 8 je syntetický polypeptid	použitý
v příkladu 7.
Sekvence	id.	č.	9 je jiný syntetický polypeptid	použitý
v příkladu 7.
Sekvence	id.	č.	10 je oligonukleotid DG-252.
Sekvence	id.	č.	11 je oligonukleotid DG-253.

• 4

4 4

4 4

4 9 * • 4 ·

9 99

- 52 4 4 ··»· ·

9999 99

4»

Sekvence id. č, 12 je oligonukleotid DG-254,

Sekvence id. č. 13 je částečná sekvence cDNA kódující bifunkční GTP cyklohydrolázu II/DHBP syntázu z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 14 je aminokyselinová sekvence maturovaného proteinu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy z Arabidopsis thaliana kódované sekvencí id. č. 13.

Sekvence	id.	č.	15	je	oligonukleotid	DG-67.
Sekvence	id.	č.	16	je	oligonukleotid	DG-69.
Sekvence	id.	č.	17	je	oligonukleotid	DG-392a.
Sekvence	id.	č.	18.	je	1 oligonukleotid	DG-393a.
Sekvence	id.	č.	19	je	oligonukleotid	DG-390a.
Sekvence	id.	Č ·	20	je	oligonukleotid	DG-391a.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech byly použity standardní metody rekombinantní DNA a klonování, známé odborníkům, které jsou popsány např. v laboratorní příručce’ Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, TJ. Šilhavý, M.L.Berman a L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1984 a Ausubel et al., Current . Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. a Willey-Interscience, 1987.

• · fefe » fefe • fefefe • fe fefefefe fefe fefe • · · fefefefe • · · fefefefe • fefe fefefefe • fe fe fefe fefe

Příklad 1

Izolace cDNA kódující lumazinsyntázu z Arabidopsis thaliana

Prohledávání databáze klonů exprimovaných sekvenčních značek (EST) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Columbus, Ohio) vedlo k odhalení EST klonu (EST č. P25540, gb č. Z34233) s homologií s β podjednotkou riboflavinsyntázy z E. coli. V polymerázové řetězové reakci (PCR), ve které byla užita cDNA knihovna Arabidopsis thaliana (Minet etla., Plant J. 2: 417-422, 1992) jako templát a jako primery byly užity syntetické oligonukleotidy DG-63 (sekvence id. č. 3) a DG-65 (sekvence id. č. 4) navržené podle sekvence EST klonu, byl amplifikován fragment DNA velikosti 204 bp. Tento 20 bp fragment byl ligován do TA klonovacího vektoru pCRI.I (Invitroigen Corp., San Diego, CA). Sekvencování tohoto fragmentu terminační metodou s dideoxynukleotidy fluorescenčně značenými (Applied Biosytems, lne., Fosteř City, CA) potvrdilo, že sekvence fragmentu velikosti 204 bp byla identická se sekvencí klonu EST P25540.

Přibližně 150 000 pfu cDNA knihovny lambda ZAP Arabidopsis 'thaliana bylo vyseto v hustotě 8000 plaků na lOcm Petriho misky a po 7 hodinách inkubace ve 37 °C byly připraveny repliky plaků. Repliky pak byly testovány hybridizací s výše popsaným fragmentem DNA velikosti 204 bp značeným 32P-dCTP metodou náhodných primerů pomocí soupravy Prime Time (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT). Hybridizační podmínky byly 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄ pH 7,0, lmM EDTA, 1% hovězí sérový albumin při 65°C. Po hybridizací přes noc byly filtry promyty 1% SDS, 50mM NaPO₄, lmM EDTA při 65 °C. Autoradiogpaf ií pak bylo

00

0 0

0 0

- 54 0 0 0 0 ·· · 00· • 0 · · 0 0

000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 « 0 0 0 0 0 .

0000 00 00 0

0 0 00 00

12: 387-95, podj ednotkou podobný a ze

Research Culture Peoria, IL 61604, detekováno 6 pozitivních plaků. Po purifikaci jednotlivých plaků byly izolovány cDNA inzerty a byla stanovena jejich sekvence terminační metodou _t s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy (Applied Biosytems, lne., Foster City, CA). Databázová analýza nejdelšího klonu označeného RS0-1 pomocí programu GAP (Deveraux et al., Nucl. Acids Res

1984) ukázala sekvenční podobnost s β riboflavinsyntázy z E. coli. protein byl z 68 % % identický. Navíc srovnání maturovaného proteinu z Arabidopsis thaliana s β podjednotkou riboflavinsyntázy z E. coli vedlo k předpokladu, že zde byl. přítomen chloroplastový tranzitní peptid.

Ρδβ-Ι ve vektoru pBluescript SK byl 7. února 1995 uložen jako pDG-4a.t. pod číslem B-21400 ve sbírce kultur pro zemědělský výzkum NRRL (Agricuktural

Collection, NRRL, 1815 N. University St.

USA) v souladu s Budapešťskou dohodou.

Sekvence· cDNA z Arabidopsis thaliana kódující ΡΞβ-Ι je zde uvedena jako sekvence id. č. 1 a aminokyselinová sekvence jako sekvence id.

příslušná kódovaná

č. 2.

Příklad 2

Izolace dalších genů .lumazinsyntázy na základě podobnosti s kódující sekvencí lumazinsyntázy z Arabidopsis

Fágová nebo plazmidová knihovna byla vyseta v hustotě 8000 plaků na lOcm Petriho misky a po 7 hodinách inkubace ve 37 °C byly připraveny repliky plaků na filterch. Filtry pak byly testovány hybridizací s cDNA, uvedenou zde jako sekvence ·« ·· • · · ♦ ···

- 55 • · · ···· ·« ·· ·<·· ·* ··

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 id. č. 1, značenou 32P-dCTP metodou náhodných primerů pomocí soupravy Prime Time (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT). Hybridizační podmínky byly 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄ pH 7,0, lmM EDTA, při 50 °C. Autoradiografií pak byly detekovány pozitivní plaky. Po purifikaci jednotlivých plaků byly izolovány cDNA inzerty a byla stanovena jejich sekvence terminační metodou s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy (Applied Biosytems, lne., Foster City, CA). Tento laboratorní protokol může být použit jakýmkoliv odborníkem k získání genů lumazinsyntázy v podstatě podobných kódující sekvenci z Arabidopsis (sekvence id. č. 1) z jakéhokoliv druhu rostliny.

Příklad 3

Konstrukce vektoru obsahujícího fúzi vazebné místo GLA4/minimální promotor 35S CaMV s antisense sekvencí lumazinsyntázy pAT71:

Sekvence 10 vazebných míst GAL4 a minimální promotor 35S (-59 až +1) byly vystřiženy z pGLAlucž (Goff et al., Genes and Development 5: 298-309, 1991) jako fragment EcoRI-Pstl a byly vloženy do příslušných míst v pBluescript, čímž vznikl pAT52. pAT66 byl zkonstruován třícestnou ligací mezi fragmentem HindlII-Pstl z pAT52, Pstl-EcoRI fragmentem z pCIB1716 (obsahujícím netranslatovanou vedoucí sekvenci 35S, gen GUS, terminátor 35S) a HindlII-EcoRI naštěpený pUC18. Vedoucí sekvence 35S z pAT66 byla vystřižena Pstla Ncolj a nahrazena fragmentem vytvořeným pomocí PCR, který φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φφ • · · • φφφ φ

φ /

- 56 ·· φφφφ φ φ φφφφ φφ φ φ φ φφ φφ obsahoval 35S vedoucí sekvenci od +1 do +48, čímž vznikl pAT71.

pJG404:

Plazmid pBS SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) byl linearizován štěpením Sací, pak byl ošetřen nukleázou z bobu, aby se odstranilo místo Sací a pak znovu ligován T4 ligázou, čímž byl připraven pJG201. Kazeta obsahující sled 10xGAL4 konvenční vazebná místa/minimální promotor 35S CaMV/gen GUS/ terminátor CaMV byla vyjmuta z pAT71 štěpením KpnI a klonována do místa KpnI v pJG201, čímž vznikl pJG304.

pJG304 byl částečně štěpen restrikční endonukleázou Asp718 pro izolaci lineárního fragmentu plné délky. Tento fragment byl ligován s molárním nadbytkem oligonukleotidu velikosti 22 baží JG-L (sekvence ' id. č. 5). Restrikční analýza pak byla užita k' identifikaci klonu s tímto linkerem (spojkou) vloženým na 5' DNA-vazebného místa GAL4, a tento plazmid byl pojmenován pJG304?XhoI.

pDGl:

Fragment cDNA lumazinsyntázy byl amplifikován pomocí PCR z cDNA klonu pRS-l užitím oligonukleotidů RS-1 - (sekvence id. č. 6) a RS-2 (sekvence id. č. 7). Tento PCR produkt obsahuje 5'úsek cDNA lumazinsyntázy (sekvence id. č. 1) končící párem baží 792. Vektor pJG304?XhoI byl pak štěpen Sací a Ncol, aby se vyštěpila sekvence kódující gen GUS. Fragment lumazinsyntázy připravený PCR byl štěpen Sací a Ncol a pak ligován do pJG304?XhoI, čímž vznikl pDGl.

áíOiíí;

99

9 9 « • · · « *♦ ·

9 99

- 57 ·· »··«

9999 99

Příklad 4

Vektory pro transformaci rostlin exprimující antisense sekvenci lumazinsyntázy z promotoru vazebné místo GLA4/minimální 35S CaMV promotor pJG261:

Vektor pGPTV (Becker et al., Plant. Mol. Biol. 20: 11951197, 1992) byl štěpen EcoRI a HindlII, aby se odstranila kazeta promotor nopalinsyntázy/GUS. Sočasně byl vyštěpěn superlinker z pSE380 (Invitrogen, San Diego, CA) enzymy EcoRI a HindlII a klonován do linearizovaného EcoRI/HindlII pGPTV, čímž vznikl pJG261.

pDG2:

pDGl byl štěpen Xhol, aby se odstranila kazeta obsahující fúzi vazebné místo GLA4/minimální promotor 35S/antisense lumazinsyntáza/terminátor CaMV. Tato kazeta pak byla vložena do pJG261 naštěpeného Xhol, takže transkripce byla odlišena od selekčního markérů bar, čímž vznikl pDG2.

Příklad 5

Příprava transgenních rostlin obsahujících fúzi vazebné místo GAL4/minmální 35S CaMV promotor/antisénse lumazinsyntáza

Plazmid pDG2 byl elekt.roporací transformován (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) do Agrobacterium tumefaciens kmene C58C1 (pMP90) a následně byly rostliny Arabidopsis thaliana (ekotyp Columbia) transformovány infiltrací

• · φφ • φ φ • · »·

- 58 • ' · Φ·Φ· φφ ·· ···· • φ ·· φ · φ φ φ φ φφφ φφ φ φφφ φφ φφ *

φ φ

φ (Berchtold et al., C.R. Acad. Sci. Paris 316: 1188-93, 1993). Semena infiltrovaných rostlin byla selektována na klíčícím médiu (Murashige-Skoog sůl 4,3 g/1, Mes 0,5 g/1, 1% sacharóza, thiamin 10 μς/ιηΐ, pyridoxin 5 μg/ml, kyselina nikotinová 5 gg/ml, myoinositol 1 mg/ml, pH 5,8) s obsahem BASTA 15 mg/ml.

Příklad 6

Příprava transgenních rostlin obsahujících fúzi GAL4/C1 transaktivátor pSGZLl byl konstruován ligací fragmentu EcoRI z pGALCl (Goff et al., Genes and Development 5: 298-309, 1991) do místa EcoRI pIC20H. Fragment GLA4-C1 z pSGZLl byl vyštěpen BamHI-BglII a vložen do místa BamHI pCIB770 (Rothstein et al., Gene 53: 153-161, 1987), čímž vznikl pAT53.

Kořeny Arabidopsis byly transformovány pAT53 metodou, kterou popsali Velvekens et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5536-5540, 1985. Transgenní rostliny s inzertem v jediném místě a pozitivní na expresi GAL4/C1 byly považovány za homozygotní.

Příklad 7

Antisense inhibice lumazinsyntázy pomocí GAL4/C1 transaktivátor a vazebné místo GAL4/minimální 35S CaMV promotor ·· • 9 9 9

9 9 ·

9 9 9

9 9 9

99 ·· ·♦ » « * • · ··

- 59 *· ···· • · · ···· ·· ♦ · · ·· ·

Patnáct transgenních rostlin obsahujících konstrukt vazebné místo GAL4/minimální 35S CaMV promotor/antisense lumazinsyntáza bylo přeneseno do půdy a pěstováno ve skleníku až do zralosti. Květy na primárních transformantách byly sprášeny pylem z linie pAT53-105 homozygotní v GAL4/C1 transaktivátor. Semena FI byla vyseta na klíčicí médium obsahující 15 mg/ml BASTA. Jedna linie poskytla 50 % letálního fenotypu. Semena z ostatních FI linií byla přenesena do půdy a rostliny byly pěstovány ve skleníku do zralosti. Polovina semenáčků linií FI v půdě zahynula..

Protilátka rozpoznávající lumazinsyntázu byla připravena v koze injekcí syntetického peptidu CIGAVIRGDTT (sekvence id. č. 8) a KAGNKGAETALTALEM (sekvence id. č. 9) konjugovaného s derivátem purifikovného proteinu. Westernová analýza rostlin FI ukázala významné snížení hladiny lumazinsyntázy (Towbin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354).

Příklad 8

Exprese a purifikace rekombinantní rostlinné lumazinsyntázy v E. coli

Pro produkci rekombinantní rostlinné lumazinsyntázy v E.. coli byla pomocí PCR připravena translační fúze cDNA lumazinsyntázy z Arabidopsis (sekvence id. č. 1) k 5'konci genu thioredoxinu (laVallie et al., Biotechnology 11: 187193, 1992) v plazmidu pET-32a (Novagen, lne., Madison, WI) . Jako primery byly užity oligonukleotidy DG-252 (sekvence id. č. 10), DG-253 (sekvence id. č. 11) a DG-254 (sekvence id. č. 12) v PCR k amplifikaci fragmentů DNA velikosti 693 bp a 483 bp. Produkty PCR byly štěpeny Ncol a EcoRI. Produkty

99

9 9 9 • · « *♦ • · · ·

- 60 99 9999

9 9 9 9

999 999

9 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9

999999 99 9 • · ♦· byly po štěpení separovány elektroforézou na nízkotající agaróze a fragmenty byly vyříznuty. Současně byl plazid pET32a naštěpen Ncol a EcoRI. produkty štěpení byly separovány na gelu a vektor pET32a byl vyříznut z gelu. Vektorový fragment byl ligován se dvěma fragmenty připravenými v PCR a ligační produkt byl transformován do kompetentních buněk E. coli XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) .

Kolonie rezistentní k ampicilnu byly selektovány, kultivovány a byla izolována jejich plazmidová DNA. Struktura plazmidů byla ověřena sekvencováním terminačni metodou s dideoxynukleotidy fluorescenčně značenými (Applied Biosytems, lne., Foster City, CA). Rekombinantní plazmidy s očekávanou strukturou byly označeny pET32aRSPFL-l a pET32aRS3NoCTP-l.

Plazmidy pET32aRSPFL-l a pET32aRS3NoCTP-l byly pak transformovány kompetentních buněk E. coli BL21 (DE3) a rekombinantní proteiny byly exprimovány a purifikovány podle doporučení výrobce (Příručka pET Systému, Novagen lne., Madison, WI). Výsledné fúzní proteiny produkované tímto kmenem obsahovaly přibližně 132 aminokyselin thioredoxinového proteinu E. coli, His značku, trombinové štěpné místo, a pak následovala sekvence předpokládaná kódující sekvence maturované lumazinsyntázy z Arabidopsis thaliana, která začíná kodonem 1 predikované proteinové sekvence v plazmidů pET32aRSpFL-l a kodonem 71 predikované proteinové sekvence v‘plazmidů pET32aRSPNoCTP-l.

·* φφ • * » • φφφ

- 61 «φ φφφφ

9 9

9999 99 • · Φ

ΦΦ Φ

99

Φ 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

Příklad 9

Test lumazinsyntázové aktivity

Aktivitu lumazinsyntázy je možné detekovat kombinací HPLC a fluorimetru. Jak lUmazin tak i 2,4-dioxy-5-amino-6ribitylaminopyrimidin (DARP) fluoreskují za následujících podmínek: excitační vlnová délka 407 nm, emisní vlnová délka 487 nm. Avšak fluorescence lumazinu je asi 6 x intenzivnější než fluorescence ekvimolární koncentrace DARP. Je také asi 6násobný rozdíl v absorbanci mezi lumazinem a DARP při 405 nm. 3,4-dihydroxy-2-butanonfosfát nefluoreskuje. Lumazin a DARP mohou být separovány na koloně C18 při užití směsi 33% 90mM kyseliny mravenčí, 60 % vody a 7 % metanolu. Lumazin se eluuje první po 4 minutách a 2 minuty později následuje DARP.

Plocha vrcholu přímo odpovídá molárnímu množství produkovaného lumazinu. Optimalizační studie ukázaly, že výhodný pufr pro reakci je lOOmM KPO₄, pH 7,5, 5mM β-merkaptoetanol, 3mM DTT. Enzym je aktivní v rozmezí pH 6,5 až 7,5, ale pH 7,0 je nej výhodnější. Kinetické studie ukázaly, že hodnota Km pro butanonfosfát je 190 μΜ a Km pro DARP je 5,5 μΜ. Kis et al., Biochem 34: 2883-2892, 1995, publikovali hodnoty Km 130 a 5, v uvedeném pořadí, pro bakteriální enzym.

Reakce se inkubuje 10 minut při 37 °C a pak se zastaví TCA. Precipitovaný protein se odstraní supernatantu se injikuje do HPLC.

Jelikož reakce může probíhat . neenzymaticky, je potřeba u všech vzorků mít kontrolní vzorek ke korekci na základní aktivitu.

přidáním 5 s centrifugací a 10 (11

-.A..· Λ'' ....-. .,4»

9 9

9 9

9 *

9 9

99 • · · • ··· • · • ·

9999 99

- 62 99 9999

9 ·

• 9

9

9'

Příklad 10

Vysokokapacitní testy

Vysokokapacitní testy nových inhibitorů lumazinsyntázy jsou výhodně založeny na skutečnosti, že lumazin a DARP fluoreskují s odlišnou intenzitou v podmínkách optimálních pro lumazin a nebo na skutečnosti, že existuje 6násobný rozdíl v absorbanci těchto dvou sloučenin. Jako příklad lze uvést následující protokol pro vysokokapacitní test: lumazinsyntáza, pufr, testovaná látka a DARP se smíchají dohromady v jamkách 96-jamkové mikrotitrační destičky v objemu 190 μΐ a stanoví se počáteční fluorescence (např. fluorimetrickým čtecím zařízením pro destičky fy. Waters). reakce se zahájí přidáním 10 μΐ 3,4-dihydroxy-2butanonfosfátu. Po přiměřené inkubační době se opět stanoví fluorescence. Rozdíl mezi počáteční a konečnou hodnotou se pak vyjádří jako procenta kontrolní reakce. Počáteční koncentrace substrátů v úplné reakční směsi jsou výhodně 50mM DARP a 0,5mM butanonfosfátu. Množství lumazinsyntázy a inkubační doba se nastaví tak, aby byl produkován lumazin do koncentrace asi 25 μΜ. To vede k fluorescenčnímu signálu přibližně 4x silnějšímu než je základní hodnota.

Příklad 11

Izolace cDNA kódující bifunkční GTP cyklohydrolázu 11/3,4dihydroxy-2-butanon-4-fosfátsyntázou z Arabidopsis thaliana « · • · ··

- 63 Prohledávání databáze exprimovaných sekvenčních značek (EST) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Columbus, Ohio) vedlo k odhalení EST klonu (EST č’ SCH1T7P, gb Č.T12970) s homologií s GTP cyklohydrolázou z Bacillus subtilis. V polymérázové řetězové reakci (PCR), ve které byla užita cDNA knihovna Arabidopsis thaliana (Minet et al., Plant J. 2: 417-422, 1992) jako templát a jako primery byly užity syntetické oligonukleotidy DG-67 (sekvence id. č. 15) a DG-69 (sekvence id. č. 16) navržené podle sekvence EST klonu, byl amplifikován fragment DNA velikosti 322 bp. Tento 322-bp fragment byl ligován do TA klonovacího vektoru pCRII (Invitroigen Corp., San Diego, CA). Sekvencování tohoto fragmentu terminační metodou s dideoxynukleotidy fluorescenčně značenými (A.pplied Biosytems, lne., Foster City, CA) potvrdilo, že sekvence fragmentu velikosti 322 bp byla identická se sekvencí klonu EST SCH1T7P.

Přibližně 150 000 pfu cDNA knihovny lambda ZAP Arabidopsis thaliana bylo vyseto v hustotě 8000 plaků na lOcm Petriho misky a po 7 hodinách inkubace ve 37 °C byly připraveny repliky plaků. Repliky pak byly testovány hybridizací s výše popsaným fragmentem DNA velikosti 322 >bp značeným 32P-dCTP metodou náhodných primerů pomocí soupravy Prime Time (International Biotechnologies, lne.,. New Haven, CT). Hybridizační podmínky byly 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaP0₄ pH 7,0, ImM EDTA, 1% hovězí sérový albumin při 65°C. Po hybridizací přes noc byly filtry promyty 1% SDS, 50mM NaPO₄, ImM EDTA při 65 °C. Autoradiograf ií pak bylo detekováno 10 pozitivních plaků. Po purifikaci jednotlivých plaků byly izolovány cDNA inzerty a. byla stanovena jejich sekvence terminační metodou s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy (Applied Biosytems, lne., Foster City, CA).

- 64 • ·· ·

Databázová analýza nejdelšího klonu označeného GTP-1 pomocí programu GAP (Deveraux et al., Nucl. Acids Res. 12: 387-95, 1984) ukázala sekvenční .. podobnost s bifunkční GTP cyklohydrolázou II/3,4-dihydroxy-2-butanon-4-fosfátsyntázou z Bacillus subtilis. Protein byl ze 70 % podobný a z 54 % identický. Navíc srovnání maturovaného proteinu z Arabidopsis thaliana s bifunkční GTP cyklohydrolázou II/DHBP syntázou z Bacillus subtilis vedlo k předpokladu, že zde byl přítomen chloroplastový tranzitní peptid.

GTP-1 ve vektoru pBluescript SK byl 7. února 1995 uložen jako pDG-3a.t. pod číslem B-21399 ve sbírce kultur pro zemědělský výzkum NRRL (Agricultural

Collection, NRRL, 1815 N. University St USA) v souladu s Budapešťskou dohodou.

Sekvence cDNA z Arabidopsis thaliana kódující GTP-1 je zde uvedena jako sekvence id. č. 13 a příslušná kódovaná aminokyselinová sekvence jako sekvence id. č. 14.

Research Culture Peoria, IL 61604,

Příklad 12

Izolace Izolace dalších genů bifunkční GTP cyklohydrolázy II/3,4-dihydroxy-2-butanon-4-fosfátsyntázy na základě podobnosti s kódující sekvencí bifunkční GTP cyklohydrolázy II/3,4-dihydroxy-2-butanon-4-fosfátsyntázy z Arabidopsis

Fágová nebo plazmidová knihovna byla vyseta v hustotě 8000 plaků na lOcm Petriho misky a po 7 hodinách inkubace ve 37 °C byly připraveny repliky plaků na filterch. Filtry pak byly testovány hybridizací s cDNA, uvedenou zde jako sekvence id. č. 13, značenou 32P-dCTP metodou náhodných primerů pomocí soupravy Prime Time (Internation-al Biotechnologies, lne., New

- 65 • ·

Haven, CT). Hybridizační podmínky byly 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄ pH 7,0, lmM EDTA, při 50 °C. Autoradiografií pak byly detekovány pozitivní plaky. Po purifikaci jednotlivých plaků byly izolovány cDNA inzerty a byla stanovena jejich sekvence terminační metodou s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy (Applied Biosytems, lne., Foster City, CA). Tento laboratorní protokol může být použit jakýmkoliv odborníkem k získání genů bifunkční GTP cyklohydrolázy II/3,4-dihydroxy-2-butanon-4fosfátsyntázy v podstatě podobných s kódující sekvenci z Arabidopsis (sekvence id. č. 13) z jakéhokoliv druhu rostliny.

Příklad 13

Exprese a purifikace rekombinantní rostlinné bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy v E. coli

Pro produkci rekombinantní rostlinné bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy v E. coli . byla pomocí dvoustupňové PCR připravena translační fúze cDNA bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy z Arabidopsis (sekvence id. č. 13) k 5'konci genu thioredoixinu (laVallie et al., Biotechnology 11: 187-193, 1992) v plazmidu pET-32a (Novageň, lne., Madison, WI) . Jako primery byly užity oligonukleotidy DG-392a (sekvence id. č. 17), DG-393a (sekvence id. č. 18) v PCR k amplifikaci fragmentu DNA velikosti 939 bp. Produkty PCR byly štěpeny Ncol a EcoRI. Produkty byly po štěpení separovány elektroforézou na nízkotající agaróze a fragmenty byly vyříznuty. Současně byl plazid pET32a naštěpen Ncol a EcoRI. produkty štěpení byly separovány na gelu a vektor

- 66 pET32a byl vyříznut z gelu. Vektorový fragment byl ligován se dvěma fragmenty připravenými v PCR a ligační priodukt byl transformován do kompetentních buněk E. coli XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA).

Kolonie rezistentní k ampicilinu byly selektovány, kultivovány a byla z nich izolována plazmidová DNA. Struktura plazmidů byla ověřena sekvencováním terminační metodou s dideoxynukleotidy fluorescenčně značenými -(Applied Biosytems, lne., Foster City, CA). Rekombinantní plazmid s očekávanou strukturou byl označen pET32aGTP-l.

Syntetické oligonukleotidy DG-390a (sekvence id. č. 19) a DG-391a (sekvence id. č. 20) byly dále použity v PCR k amplifikaci fragmentu DNA velikosti 662 bp. Produkty PCR byly štěpeny Ncol. Produkty byly po štěpení separovány elektroforézou na nízkotající agaróze a fragmenty byly vyříznuty. Současně byl plazid pET32aGTP-l naštěpen Ncol. produkty štěpení byly separovány na gelu a vektor pET32aGTP-l byl vyříznut z gelu. Vektorový . fragment byl ligován s fragmentem připraveným v PCR a ligační produkt byl transformován do kompetentních buněk E. coli XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA).

Kolonie rezistentní k ampicilinu byly selektovány, kultivovány a byla z nich izolována plazmidová DNA. Struktura plazmidů byla ověřena sekvencováním terminační metodou s dideoxynukleotidy fluorescenčně značenými (Applied Biosytems, lne., Foster City, CA). Rekombinantní plazmid₍ s očekávanou strukturou byl označen pET32aGTP-2.

Plazmid pET32aGTP-2 byl pak transformován do kompetentních buněk E. coli BL21 (DE3) a rekombinantní proteiny byly exprimovány a purifikovány podle doporučení výrobce (Příručka pET Systému, Novagen lne., Madison, WI) . Výsledné fúzní proteiny produkované tímto kmenem obsahovaly « · · · • · · • · ·· ···· ··

- 67 přibližně 132 aminokyselin thioredoxinového proteinu E. coli, His značku, trombinové štěpné místo, a pak následovala sekvence předpokládaná kódující sekvence maturované bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy z Arabidopsis thaliana.

Příklad 14

In vitro rekombinace genů biosyntézy riboflavinu metodou míchání DNA·

Rostlinný gen biosyntézy riboflavinu · (např. gen sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 13) kódující protein biosyntézy riboflavinu (např. sekvence id. č. 2 nebo sekvence id. č. 14) byl amplifikován v PCR. Výsledný fragment DNA byl naštěpen DNázou I v podstatě jak popsali Stremmer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751, 1994). Výsledné fragmenty byly. klonovány do pTRC99a (Pharamcia, katalog, č. 27-5007-01) a transformací vneseny do dioxygenázového mutantního hostitele, např. elektroporací pomocí pulzního zařízení Gene Pulser fy. Βίο-Rad podle doporučení výrobce. Transformovaný hostitel byl pak kultivován v médiu obsahujícím inhibující koncentrace inhibitoru vybraného metodami popsanými výše a kolonie rostoucí v přítomnosti inhibitoru v koncentraci, která je normálně inhibující, byly odebrány, purifikovány a znovu kultivovány. Jejich plazmidy byly purifikovány a sekvence cDNA z inzertů byly stanoveny.

V podobné reakci, PCR amplifikované fragmenty DNA obsahující gen biosyntézy riboflavinu podle předkládaného vynálezu kódující protein biosyntézy riboflavinu a PCR amplifikované fragmenty DNA obsahující gen biosyntézy riboflavinu z různých hostitelů byly rekombinovány in vitro

• · • · • · · · · ·

- 68 a výsledné varianty se zlepšenou tolerancí k inhibitoru se získaly postupem výše popsaným.

Příklad 15

In vitro rekombinace genů biosyntézy riboflavinu metodou střídavé extenze

Rostlinný gen biosyntézy riboflavinu (např. gen sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 13) kódující protein biosyntézy riboflavinu (např. sekvence id. č. 2 nebo sekvence id. č. 14) a odpovídající gen biosyntézy riboflavinu z jiného hostitele byly každý samostatně klonovány do polylinkeru vektoru pBluescript SK+. PCR reakce byla provedena postupem, v podstatě jak popsali Zhao et al., Nátuře Biotechnology 16: 258-261, 1998, pomocí reverzního primeru a M13 20 primeru (viz katalog Stratagene). Amplifikované fragmenty PCR byly štěpeny příslušnými restrikčními enzymy a klonovány do pTRC99a a mutované geny biosyntézy riboflavinu byly testovány postupem popsaným, v příkladu 14.

Předkládaný vynález lze různými způsoby modifikovat, jak je odborníkovi zřejmé. Takové modifikace jsou však také předmětem předkládaného vynálezu, který je definován v připojených patentových nárocích.

i.

• · • · · ·

- 69 • φ ·· ♦ · φ · * • · ·· φ · φ • φ · · φ φ • · φ φ φφ φφ φ

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 991 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: ODS (B) POZICE: 35 .. 718 (D) DALŠÍ INFORMACE: produkt= lumazinsyntáza (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

AGAGAACCGT CTCTAAAACT CCGACGAACG AAAA ATG AAG TCA TTA GCT TCG 52

Met Lys Ser Leu Ala Ser 1 5

CCG CCG

TGT CTC CGC

CTG Leu

ATA Ile

CCG ACG

GCA CAC

CGT CAG

CTC Leu 20

AAT Asn

TCG Ser

100 Pro

Pro

Cys

Leu Arg 10

Pro

Thr 15

Arg

Gin

Ala

His

CGT

CAA

TCT

TCC

TCC

GCC

TGT

TAT

ATA

CAC

GGT

GGC

TCT

TCT

GTG

AAC

148

Arg

Gin

Ser

Ser

Ser

Ala

Cys

Tyr

Ile

His

Gly

Gly

Ser

Ser

Val

Asn

25

30

35

AAA

TCC

AAT

AAT

CTC

TCA

TTC

TCC

TCA

TCC

ACA

TCC

GGA

TTT

GCG

TCA

196

Lys

Ser

Asn

Asn

Leu

Ser

Phe

Ser

Ser

Ser

Thr

Ser

Gly

Phe

Ala

Ser

40

45

50

CCA

CTA

GCT

GTA

GAG

AAG

GAA

TTA

CGC

TCT

TCA

TTC

GTA

CAG

ACG

GCT

244

Pro

Leu

Ala

Val

Glu

Lys

Glu

Leu

Arg

Ser

Ser

Phe

Val

Gin

Thr

Ala

55

60

65

70

- 70 • · · * » 0 0

000

0» 0 00 0

GCT GTT CGC CAT GTT ACG GGG TCT CTT ATC AGA GGC GAA GGT CTT AGA 292

Ala Val Arg His Val Thr Gly Ser Leu Ile Arg Gly Glu Gly Leu Arg 75 80 85

TTC GCC ATC GTG GTA GCT CGT TTC AAT GAG GTT GTG ACT AAG TTG CTT 340

Phe Ala Ile Val Val Ala Arg Phe Asn Glu Val Val Thr Lys Leu Leu

90

95

100

TTG

GAA

GGA

GCG

ATT

GAG

ACT

TTC

AAG

AAG

TAT

TCA

GTC

AGA

GAA

GAA

388

Leu

Glu

Gly

Ala

Ile

Glu

Thr

Phe

Lys

Lys

Tyr

Ser

Val

Arg

Glu

Glu

105

110

115

GAC

ATT

GAA

GTT

ATT

TGG

GTT

CCT

GGC

AGC

TTT

GAA

ATT

GGT

GTT

GTT

435

Asp

Ile

Glu

Val

Ile

Trp

Val

Pro

Gly

Ser

Phe

Glu

Ile

Gly

Val

Val

120

125

130

GCA

CAA

AAT

CTT

GGG

AAA

TCG

GGA

AAA

TTT

CAT

GCT

GTT

TTA

TGT

ATC

484

Ala

Gin

Asn

Leu

Gly

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe

His

Ala

Val

Leu

Cys

Ile

135

140

145

150

GGC

GCT

GTG

ATA

AGA

GGA

GAT

ACC

ACA

CAT

TAT

GAT

GCT

GTT

GCC

AAC

532

Gly

Ala

Val

Ile

Arg

Gly

Asp

Thr

Thr

His

Tyr

Asp

Ala

Val

Ala

Asn

155

160

165

TCT

GCT

GCG

TCT

GGA

GTA

CTT

TCT

GCT

AGC

ATA

AAT

TCA

GGC

GTT

CCA

580

Ser

Ala

Ala

Ser

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Ser

Ile

Asn

Ser

Gly

Val

Pro

170

175

180

TGC

ATA

TTT

GGT

GTA

CTG

ACT

TGC

GAG

GAC

ATG

GAT

CAG

GCT

CTG

AAT

628

Cys

Ile

Phe

Gly

Val

Leu

Thr

Cys

Glu

Asp

Met

Asp

Gin

Ala

Leu

Asn

185

190

195

• fe • · fefe • fefe fefe • fefefe · « fefe fefefe · • fefe fefe «•fefe fefe fefe fefefefe fefe fefe • fe fe • « tfe · fe fefe fefe · • fefefefe fe fefe fefe

CGA 676

TCT

GGT

GGC

AAA

GCC

GGC

AAT

AAG

GGA

GCT

GAA

ACT

GCT

TTG

ACG

Arg

Ser

Gly

Gly

Lys

Ala

Gly

Asn

Lys

Gly

Ala

Glu

Thr

Ala

Leu

Thr

200 205 210

<

GCG CTC GAA 718

ATG

GCG

TCG

TTG TTT GAG CAC CAC CTG

AAA TAG

Ala

Leu

Glu

Met

Ala

Ser

Leu

Phe

Glu

His

His

Leu

Lys *

215

220

225

CTCGGCTCGT 778	TCGATGGATG	AACATGATCA	CGTATGAGAA	CCTCTTGATG	TTGTCCCATT
TGGTTACAAT 838	CCAGTCTCTG	AAATTGTTTG	TACCTCAAAG	ATTGTCCAAA	TGTTTTACCC
TTGGTTACCA 898	AATCAATTAA	ACGCTTTTGT	AAGCTTCTGG	CCTTGTTTTT	TTTTTTTGAA
TCGTATGATA 958	ATAATAATTC	CTCCGAATTT	TGGGGTCTTT	CTGTACTAAT	CAAAAATGTG
ATCTTCTTTG	TTGTAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAA

991 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 228 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi)	POPIS SEKVENCE:	: SEKVENCE S	ID. C.	2 :
Met Lys	Ser Leu Ala Ser	Pro Pro Cys	Leu Arg	Leu Ile Pro Thr Ala
1	5		10	15
His Arg	Gin Leu Asn Ser	Arg Gin Ser	Ser Ser	Ala Cys Tyr Ile His
	20	25		30

• 4 444 4

- 72 9 4 Μ • · · 9 9

9999 · *

4 »94 4

4-4 · 4· •••4 99 44

4

4 4 4 4

4 · · ·

4*44

4 4 4

4»

Gly Gly Ser Ser Val Asn Lys Ser Asn Asn Leu Ser Phe Ser Ser Ser 35 40 45

Thr Ser Gly Phe Ala Ser Pro Leu Ala Val Glu Lys Glu Leu Arg Ser 50 55 60

Ser Phe Val Gin Thr Ala Ala Val Arg His Val Thr Gly Ser Leu Ile 65 70 75 80

Arg Gly Glu Gly Leu Arg' Phe Ala Ile Val Val Ala Arg Phe Asn Glu 85 90 95

Val Val Thr Lys Leu Leu Leu Glu Gly Ala Ile Glu Thr Phe Lys Lys 100 105 110

Tyr Ser Val Arg Glu Glu Asp Ile Glu Val Ile Trp Val Pro Gly Ser 115 120 125

Phe Glu Ile Gly Val Val Ala Gin Asn Leu Gly Lys Ser Gly Lys Phe 130 135 140

His Ala Val Leu Cys Ile Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Thr Thr His

145 150 155 160

Tyr Asp Ala Val Ala Asn Ser Ala Ala Ser Gly Val Leu Ser Ala Ser

165 170 175

Ile Asn Ser Gly Val Pro Cys Ile Phe Gly Val Leu Thr Cys Glu Asp 180 185 190

Met Asp Gin Ala Leu Asn Arg Ser Gly Gly Lys Ala Gly Asn Lys Gly 195 200 205

Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ala Leu Glu Met Ala Ser Leu Phe Glu His 210 215 220

His Leu Lys *

225

9999

- 73 • 9 99

9 9

9 9 9 9 9

9

9999 99

99

9 9 9 • 9 9 ·

9 9 9 • 9 9 9

99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina .

(C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-63 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

ATTTTGTAAC CAAGGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) ' CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-65 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

GGCAATAAGG GAGCTG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = JG-L (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:

GTACCTCGAG TCTAGACTCG AG 22

- 74 99 99 99 9999 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9.9

9999 99 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 · 99 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = RS-1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:

AGCTACCATG GGAGGTTCTC ATACGTG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = RS-2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7: AGCTAGAGCT CACGAGAGAA CCGTCTC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

Cys

Ile Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Thr Thr

• Φ φφ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφφ φφφφ φ φ φ .

φφ

- 75 φφ φφφφ φφ φ

φ φφ φφ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (C) TYP VLÁKNA: není relevantní (D) TOPOLOGIE: není relevantní (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č.. 9:

Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ala Leu Glu

Met,

5 10 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-252 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:

GATCCCATGG CTAAGTCATT AGCTTCGCCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-253 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:

ATCGCCATGG CTGTTCGCCA TGTTACG

A A AA

A A A A

A A A A

A A A A

A A A A

AA A A ·· A ·« ·

- 76 A A AA A A A • AAA A A A

A A A

AAAA AA

A A

AA A (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-254 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 12:

CAGTGAATTC CTAGAGCTAT TTCAGGTGGT G

INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1665 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS' (B) POZICE: 2 .. 1432 . (D) DALŠÍ INFORMACE: produkt= bifunkční GTP cyklohydroláza II/DHBP syntéza (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 13:

C TCA TTC ACC AAC GGA AAC ACT CCT CTC TCA AAT GGG TCT CTC ATT 46

Ser Phe Thr Asn Gly Asn Thr Pro Leu Ser Asn Gly Ser Leu Ile

1

5

10

15

GAT

GAT

CGG

ACC

GAA

GAG

CCA

TTA

C-AG

GCT

GAT

TCG

GTT

TCA

CTT

GGA

94

Asp

Asp

Arg

Thr

Glu

Glu

Pro

Leu

Glu

Ala

Asp

Ser

Val

Ser

Leu

Gly

20

25

30

ACA

CTT

GCT

GCT

GAT

TCT

GCT

CCT

GCA

CCA

GCC

AAT

GGT

TTT

GTT

GCT

142

Thr

Leu

Ala

Ala

Asp

Ser

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Asn

Gly

Phe

Val

Ala

35

40

45

«* ···· *· ► · · t · ·· • · · « « · »··· ·· ♦ ♦ ·*·· ·· ·· ♦ · « · · · · e · · · · · ♦ ··· ····· • · · · « · ·

O 9 99 99

GAA

GAT

GAT

GAC

TTT

GAG

TTG

GAT

TTA

CCA

ACT

CCT

GGT

TTC

TCT

TCT

190

Glu

Asp

Asp

Asp

Phe

Glu

Leu

Asp

Leu

Pro

Thr

Pro

Gly

Phe

Ser

Ser

50

55

60

ATC

CCT

GAG

GCC

ATT

GAA

GAT

ATA

CGC

CAA

GGA

AAG

CTT

GTG

GTG

GTT

238

Ile

Pro

Glu

Ala

Ile

Glu

Asp

Ile

Arg

Gin

Gly

Lys

Leu

Val

Val

Val

65

70

•

75

GTG

GAT

GAT

GAA

GAT

AGG

GAA

AAT

GAA

GGG

GAT

TTG

GTG

ATG

GCT

GCT

286

Val

Asp

Asp

Glu

Asp

Arg

Glu

Asn

Glu

Gly

Asp

Leu

Val

Met

Ala

Ala

80

85

90

95

CAG

TTA

GCA

ACA

CCT

GAA

GCT

ATG

GCT

TTT

ATT

GTG

AGA

CAT

GGA

ACT

334

Gin

Leu

Ala

Thr

Pro

Glu

Ala

Met

Ala

Phe

Ile

Val

Arg

His

Gly

Thr

100

105

110

GGG

ATA

GTT

TGT

GTG

AGC

ATG

AAA

GAA

GAT

GAT

CTC

GAG

AGG

TTG

CAC

382

Gly

Ile

Val

Cys

Val

Ser

Met

Lys

Glu

Asp

Asp

Leu

Glu

Arg

Leu

His

115

120

125

CTT

CCT

CTA

ATG

GTG

AAT

CAG

AAG

GAA

AAC

GAA

GAA

AAG

CTC

TCT

ACT

430

Leu

Pro

Leu

Met

Val

Asn

Gin

Lys

Glu

Asn

Glu

Glu

Lys

Leu

Ser

Thr

130

135

140

-

GCA

TTT

ACA

GTG

ACT

GTG

GAT

GCA

AAA

CAT

GGC

ACA

ACA

ACG

GGA

GTA

478

Ala

Phe

Thr

Val

Thr

val

Asp

Ala

Lys

His

Gly

Thr

Thr

Thr

Gly

Val

145

150

155

TCA

GCT

CGT

GAC

AGG

GCA

ACA

ACC

ATA

TTG

TCT

CTT

GCA

TCA

AGA

GAT

526

Ser

Ala

Arg

Asp

Arg

Ala

Thr

Thr

Ile

Leu

Ser

Leu

Ala

Ser

Arg

Asp

160

165

170

175

99 » 9 9 9 ft 9 9 9

- 78 • 9 99

9 9 * 999 •9 9999

9 > 9 9 «

99

TCA AAG 574 Ser Lys	CCT GAG	GAT Asp 180	TTC AAT CGT CCA GGT CAT ATC TTC CCA
Pro	Glu
Phe Asn Arg	Pro	Gly 185	His	Ile	Phe	Pro
TAT CGG	GAA	GGT	GGG	GTT CTG AAA	AGG	GCT	GGA	CAC	ACT	GAA
622
Tyr Arg	Glu	Gly 195	Gly	Val Leu Lys	Arg 200	Ala	Gly	His	Thr	Glu 205
GTT GAT	CTC	ACT	GTT	TTA GCT GGA	CTG	GAT	CCT	GTT	GGA	GTA

670

CTG AAG

Leu Lys 190

GCA TCT

Ala Ser

CTT TGT

Val

Asp Leu 210

. Thr

Val

Leu

Ala

Gly.Leu Asp 215

Pro Val

Gly 220

Val

Leu

Cys

GAA

ATT

GTT

GAT

GAT

GAT

GGT

TCC

ATG

GCT

AGA

TTA

CCA

AAA

CTT

CGT

718

Glu

Ile

Val

Asp

Asp

Asp Gly

Ser

Met

Ala

Arg

Leu

Pro

Lys

Leu

Arg

225

230

235

GAA

TTT

GCC

GCC

GAG

AAC

AAC

CTG

AAA

GTT

GTT

TCC

ATC

GCA

GAT

TTG

766

Glu

Phe

Ala

Ala

Glu

Asn

Asn

Leu

Lys

Val

Val

Ser

Ile

Ala

Asp

Leu

240

245

250

255

ATC

AGG

TAT

AGA

AGA

AAG

AGA

GAT

AAA

TTA

GTG

GAA

CGT

GCT

TCT

GCG

814

Ile

Arg

Tyr

Arg

Arg

Lys

Arg

Asp

Lys

Leu

Val

Glu

Arg

Ala

Ser

Ala

»

260

265

270

β

GCT

CGG

ATC

CCA

ACA

ATG

TGG

GGA

CCT

TTC

ACT

GCT

TAC

TGC

TAT

AGG

862

Ala

Arg

Ile

Pro

Thr

Met

Trp

Gly

Pro

Phe

Thr

Ala

Tyr

Cys

Tyr

Arg

275

280

285

TCC

ATA

TTA

GAC

GGA

ATA

GAG

CAC

ATA

GCA

ATG

GTT

AAG'

GGT

GAG

ATT

910

Ser

Ile

Leu

Asp

Gly

Ile

-Glu

His

Ile

Ala

Met

Val

Lys

Gly

Glu

Ile

290

295

300

0 0 0 0 0 »0 • 0 0

000

0 0 •·*0 ·· ·· 00

0 0 0

0 0 0

0 0 ·

0 0 0

0 00

GGT GAC 958

Gly Asp 305

GGG GAC 1006 Gly. Asp 320

CTC TCG 1054

Leu Ser

CTA CGT 1102 Leu Arg

GCT TAC 1150 Ala Tyr

GAA TTA 1198 Glu Leu

385

ΑΤΑ ATA 1246 Ile Ile 400

CCC CCA 1294 Pro Pro

79

GGT

CAA

GAC

ATT

CTC

GTG

AGG

GTT

CAT

TCT

GAA

TGT

CTA

ACA

Gly

Gin

Asp

Ile

Leu 310

Val

Arg

Val

His

Ser 315

Glu

Cys

Leu

Thr

ATA

TTT

GGG

TCT

GCA

AGG

TGT

GAT

TGC

GGG

AAC

CAG

CTA

GCA

Ile

Phe

Gly

Ser 325

Ala

Arg

Cys

Asp

Cys 330

Gly

Asn

Gin

Leu

Ala 335

ATG

CAG

CAG

ATC

GAG

GCT

ACT

GGT

CGC

GGT

GTG

CTG

GTT

TAC

Met

Gin

Gin 340

Ile

Glu

Ala

Thr

Gly 345

Arg

Gly

Val

Leu

Val 350

Tyr

GGA

CAT

GAA

GGA

AGA

GGG

ATC

GGT

TTA

GGA

CAC

AAG

CTT

CGA

Gly

His 355

Glu

Gly

Arg

Gly

Ile 360

Gly

Leu

Gly

His

Lys 3 65

Leu

Arg

AAT

CTG

CAA

GAT

GCT

GGT

CGA

GAC

ACG

GTT

GAA

GCT

AAT

GAG

Asn 370

Leu

Gin

Asp

Ala

Gly 375

Arg

Asp

Thr

Val

Glu 380

Ala

Asn

Glu

GGA

CTT

CCT

GTT

GAT

TCT

AGA

GAG

TAT

GGA

ATT

GGT

GC.A

CAG

Gly

Leu

Pro

Val

Asp 390

Ser

Arg

Glu

Tyr

Gly 395

Ile

Gly

Ala

Gin

AGG

GAT

TTA

GGT

GTT

AGG

ACA

ATG

AAG

CTG

ATG

ACA

AAT

AAT

Arg

Asp

Leu

Gly 405

Val

Arg

Thr

Met

Lys 410

Leu

Met

Thr

Asn

Asn 415

AAG

TAT

GTT

GGT

TTG

AAG

GGA

TAT

GGA

TTA

GCC

ATT

GTT

GGG

Lys

Tyr

Val 420

Gly

Leu

Lys

Gly

Tyr 425

Gly

Leu

Ala

Ile

Val 43 0

Gly

	·· «· ·*	···· ··
	• · · . · ·	• · ·	• ·
	f ··· · ·	• · ·	• *
	• · · · · ·	» · · ·	• ·
	♦ · · · ·	• · ·	• ·
	»««· ·· ··	• ··	• >
- 80 -

AGA GTC 1342 Arg Val

CCT CTA TTG

AGT CTT ATC ACG AAG GAG AAT AAG AGA TAT

CTG Leu

Pro

Leu 435

Leu

Ser Leu

Ile

Thr 440

Lys

Glu Asn

Lys Arg Tyr 445

GAG ACA

AAG

CGG

ACC

AAG

ATG

GGT

CAC

ATG

TAT

GGC

TTG

AAG

TTC

AAA

1390

Glu Thr

Lys

Arg

Thr

Lys

Met

Gly

His

Met

Tyr

Gly

Leu

Lys

Phe

Lys

450

455

460

GGG GAT

GTT

GTG

GAG

AAG

ATT

GAG

TCT

GAA

TCT

GAG

TCC

TAA

1432

Gly Asp

Val

Val

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Glu

Ser

Glu

Ser

★

465

470

475

GCTTAAAAAC CAGGACGAAC CGAATGGAAT CAAGAACTAT AGATATAATA CTTCCCAAAA 1492

AACAAGGAAA GAAATTGACA CAGAAGAAGA'GGAAAAAGAC ATTTGATCTG TCTGAGAAAC 1552

TTGATTAGAT TGGTTTATGT TCTAATCTAA TCTGATTTGA TTTTTTTTTA TTTTGTCTAC 1612

GATTCTTGAG TTACGAAATG TTCATCATTT GTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1665

- 81 t·) *· • Φ Φ φ ΦΦΦ • 94

44Φ Φ * φφ φ·φφ « Φ Φ

ΦΦΦ • Φ Φ Φ· Φ

ΦΦ ΦΦ

Φ Φ ·

Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ * Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 477 aminokyselin (B) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 14:

Ser Phe Thr Asn Gly Asn Thr Pro Leu Ser Asn Gly Ser Leu Ile Asp 1 5 10 15

Asp Arg Thr Glu Glu Pro Leu Glu Ala Asp Ser Val Ser Leu Gly Thr 20 25 30

Leu Ala Ala Asp Ser Ala Pro Ala Pro Ala Asn Gly Phe Val Ala Glu 35 40 45

Asp Asp Asp Phe Glu Leu Asp Leu Pro Thr Pro Gly Phe Ser Ser Ile 50 55 60

Pro Glu Ala Ile Glu Asp Ile Arg Gin Gly Lys Leu Val Val Val Val 65 70 75 80

Asp Asp Glu Asp Arg Glu Asn Glu Gly Asp Leu Val Met Ala Ala Gin 85 90 95

Leu Ala Thr Pro Glu Ala Met Ala Phe Ile Val Arg His Gly Thr Gly 100 105 110

Ile Val Cys Val Ser Met Lys Glu Asp Asp Leu Glu Arg Leu His Leu 115 120 125

Pro Leu Met Val Asn Gin Lys Glu Asn Glu Glu Lys Leu Ser Thr Ala 130 135 140

Phe Thr Val Thr Val Asp Ala Lys His Gly Thr Thr Thr Gly Val Ser 145 , 150 155 160 ^j >82

0« Λ· *0 0··· 0« ·· • 0 0 • 0 00

0000

0 000 00 0 0 0· 0 0 00 00 0 0000 »000 00 00 « 00 00

165

230

245

325

310

170

175

215

295

185

190

200

250

265

280

360

330

220

205

345

235

315

240

300

285

365

255

270

350

335

320 • ·

- 83 ··· · · · · · · ···· · · · · ··

Tyr

Asn

Leu

Gin

Asp

Ala

Gly

Arg

Asp

Thr

Val

Glu

Ala

Asn

Glu

Glu

370

375

380

Leu

Gly

Leu

Pro

Val

Asp

Ser

Arg

Glu

Tyr

Gly

Ile

Gly

Ala

Gin

Ile

385

390

395

400

Ile

Arg

Asp

Leu

Gly

Val

Arg

Thr

Met

Lys

Leu

Met

Thr

Asn

Asn

Pro

405

410

415

Pro

Lys

Tyr

Val

Gly

Leu

Lys

Gly

Tyr

Gly

Leu

Ala

Ile

Val

Gly

Arg

420

425

430

Val

Pro

Leu

Leu

Ser

Leu

Ile

Thr

Lys

Glu

Asn

Lys

Arg

Tyr

Leu

Glu

435

440

445

Thr

Lys

Arg

Thr

Lys

Met

Gly

His

Met

Tyr

Gly

Leu

Lys

Phe

Lys

Gly

450

455

46,0

Asp

Val

Val

Glu

Lys

Ile

Glu

Ser

Glu

Ser

Glu

Ser

★

465 470 475 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-67 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 15:

GCTAATGAGG AATTAG 16 • ·

INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-69 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 16:.

TGATTCCATT GGGTTC (2) (2)

INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-392a (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 17:·

TGTCTCTTGC ATCAAGAG

INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-393a (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 18:

CAGTGAATTC TTAAGCTTAG GACTCAGATT CAG

• ·· ·

- 85 • · ·· * · · ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-390a (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 19:

GATCCCATGG GTTTCTCTTC TATCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: .18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: desc = DG-391a (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 20:

Claims (60)

1. Molekula DNA obsahující nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostlin, která kóduje enzym zúčastněný v biosyntéze riboflavinu, přičemž tento enzym má aktivitu lumazinsyntázy nebo bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

Λ

2. Molekula DNA podle nároku .1, kde enzym má aktivitu lumazinsyntázy.

3. Molekula DNA podle nároku 2, kde enzym obsahuj e aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 2 . 4. Molekula DNA podle nároku 2, kde enzym obsahuj e aminokyselinovou id. č. 2.

5. Molekula DNA obsahující nukleotidovou.sekvenci izolovanou z rostlin, která kóduje enzym mající aktivitu lumazinsyntázy, přičemž tato molekula DNA hybridizuje s molekulou DNA podle nároku 4 za následujících podmínek: hybridizace v roztoku obsahujícím 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄, pH 7,0, ImM EDTA, při 50 °C, promytí v roztoku obsahujícím 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C.

6. Molekula DNA podle nároku 2, která hybridizuje s kódující sekvencí, id. č. 1 za následujících podmínek: hybridizace v roztoku obsahujícím 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPCh, pH 7,0, ImM EDTA, při 50 °C, promytí v roztoku obsahujícím 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C.

- 87 • · · · φ φ · · · · · · • φ φ · · φ φ φ φ · φ φφ φ φφφφ φ φφ φφφ φφφφ φφφφφφ φφ · φφ φφ

7. Molekula DNA podle nároku 2, která obsahuje úsek velikosti 20 nukleotidů sekvenčně identický s úsekem 20 bezprostředně po sobě jdoucích nukleotidů z kódující sekvence id. č. 1.

8. Molekula DNA podle nároku 2, která obsahuje kódující sekvenci id. č. 1.

9. Molekula DNA podle nároku 1, kde enzym má aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

10.Molekula DNA podle nároku 9, kde enzym obsahuj e aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové.sekvenci id. č. 14. 11.Molekula DNA podle nároku ' 9, kde enzym obsahuj e aminokyselinovou id. č. 14.

12. Molekula DNA obsahující nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostlin, která kóduje enzym mající aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž tato molekula s molekulou DNA podle nároku 11 podmínek: hybridizace v roztoku obsahujícím 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄, pH 7,0, lmM EDTA, při 50 °C, promytí v roztoku obsahujícím 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C.

DNA hybridizuje za následujících

13. Molekula DNA podle nároku 9, která hybridizuje s kódující sekvencí id. č. 13 za následujících podmínek: hybridizace v roztoku obsahujícím 7% dodecylsulfát sodný (SDS), ·· 0···

0 0 0 0

0 0 0 0 0

0040 0 0

00 04 • 04 0

4 4 0 4

0 0 0 0

400000 00 0 00 00

- 88 0,5M NaPO₄, pH 7,0, lmM EDTA, při 50 °C, promytí v roztoku obsahujícím 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C.

14.Molekula DNA podle nároku 9, která obsahuje úsek velikosti 20 nukleotidů sekvenčně identický s úsekem 20 bezprostředně po sobě jdoucích nukleotidů z kódující sekvence id. č. 13..

15.Molekula DNA podle nároku 9, která obsahuj e kóduj ící sekvenci id. č. 13. 16.Chimérický gen obsahující promotor operativně spoj ený s molekulou DNA podle nároku 1.

17. Rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle nároku 16, který je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.

18. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 17, která je schopná exprimovat molekulu DNA kódující enzym zúčastněný v biosyntéze riboflavinu.

19. Hostitelská buňka podle nároku 18, která je vybrána ze skupiny obsahující bakteriální buňku, kvasinkovou buňku a rostlinnou buňku.

20. Hostitelská buňka podle nároku 19, která je bakteriální buňka.

21. Způsob přípravy nukleotidových sekvencí kódujících genový produkt s modifikovanou aktivitou lumazinsyntázy vyzn„ačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

• · ·» ···· • · • 9 · 9 9

9 999 9 9

99 99

9 9 9 *

9 4 9 9 • · · · • · · · • · 9 9

a) molekula DNA podle nároku 2 se podrobí modifikaci mícháním DNA,

b) výsledné míchané nukleotidové sekvence se exprimuji, a

c) selektuje se na modifikovanou aktivitu lumazinsyntázy ve srovnání s aktivitou enzymu kódovaného molekulou DNA podle nároku 2.

22. Způsob podle nároku 21 v y z n a č u j i c i se tím, že nukleotidová sekvence je sekvence id. č. 1.

23. Molekula DNA modifikovaná mícháním připravitelná způsobem podle nároku 22.

24. Molekula DNA modifikovaná mícháním podle nároku 23, která kóduje enzym, se zvýšenou tolerancí k inhibitoru aktivity lumazinsyntázy.

25. Chimérický gen obsahující promotor operativně spojený s molekulou DNA modifikovanou mícháním podle nároku 23.

26. Rekombinantní vektor obsahující 'chimérický gen podle nároku 25, který je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.

27. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 26.

28. Hostitelská buňka podle nároku 27, která je vybrána ze skupiny obsahující bakteriální buňku, kvasinkovou buňku a rostlinnou buňku.

MMHT*

99 99

9 9 9

9·99 ·♦ 9999

9 999 9 9

99 99

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99

-90-.

29. Hostitelská buňka podle nároku 28, která je rostlinná buňka.

30. Rostlina nebo semeno rostliny obsahující rostlinnou buňku podle nároku 29.

31. Rostlina podle nároku 30, která je . tolerantní k inhibitoru aktivity lumazinsyntázy.

32. Způsob přípravy nukleotidových sekvencí kódujících genový produkt s modifikovanou aktivitou bifunkčni GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

d) molekula DNA podle nároku 9 se podrobí modifikaci mícháním DNA,

e) výsledné míchané nukieotidové sekvence se exprimují, a

f) selektuje se na modifikovanou aktivitu bifunkčni GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy ve srovnání s aktivitou enzymu kódovaného molekulou DNA podle nároku 9.

33. Způsob podle nároku 32 vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence je sekvence id. č. 13.

34. Molekula DNA modifikovaná mícháním DNA připravitelná způsobem podle nároku 33.

35. Molekula DNA modifikovaná mícháním podle nároku 23, která kóduje enzym se zvýšenou tolerancí k inhibitoru aktivity bifunkčni GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

- 91 ·· ·· ·· ···· ♦· ·· • * · · « ♦ · t · · • ··· · ♦ ♦ · · · · • · · · · ·· · · · · · • · · · · · · · · « ···· ·· ·· · 49 44

36. Chimérický gen obsahující promotor operativně spojený s molekulou DNA modifikovanou mícháním'' podle nároku 34.

37. Rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle nároku 36, který je schopen trvale transformovat hostitelskou buňku.

38. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 37.

39. Hostitelská buňka podle nároku 38, která je vybrána ze skupiny obsahující bakteriální buňku, kvasinkovou buňku a rostlinnou buňku.

40. Hostitelská buňka podle nároku 39, která je rostlinná buňka.

41. Rostlina nebo semeno rostliny obsahující rostlinnou buňku podle nároku 40.

42. Rostlina podle nároku 41, která je tolerantní k inhibitoru aktivity bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

43.Izolovaný rostlinný enzym zúčastněný v biosynťéze riboflavinu, který má aktivitu lumazinsyntázy nebo bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

44. Enzym podle nároku 43, který má aktivitu lumazinsyntázy.

45. Enzym podle nároku 44, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id.

č. 2.

!ΜΒ8ΜΒ««Β8888)ΕΒί8Βί

-“ΐ'

•9 ΦΦΦΦ

ΦΦ ·· • · · • · ΦΦ • Λ 9

ΦΦΦ

Φ· ΦΦ

Φ · Φ · • Φ Φ 9

9 9 9 · • Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

- 92

46. Enzym podle nároku 44, který obsahuje aminokyselinovou id.

č. 2.

47. Enzym podle nároku 43, který má aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

48. Enzym podle nároku 47, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 14.

49. Enzym podle nároku 47, který obsahuje aminokyselinovou id. č. 14.

50. Způsob testování chemických látek na schopnost inhibovat aktivitu lumazinsyntázy vyznačujíc.i se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) smíchá se enzym podle nároku 44 v první reakční směsi s 2,4-dioxy-5-amino-6-ribitylaminopyrimidinem a 3,4dihydroxy-2-butanonfosfátem v podmínkách, kdy je enzym schopný katalyzovat syntézu lumazinu,

b) smíchá se chemická látka a enzym ve druhé reakční směsi s 2,4-dioxy-5-amino-6-ribitylaminopyrimidinem a 3,4dihydroxy-2-butanonfosfátem ve stejných podmínkách jako v první reakci,

c) stanovení množství lumazinu vytvořené v první a druhé reakční směsi, a

d) porovná se množství lumazinu vytvořeného v první a druhé reakční směsi, přičemž chemická látka je schopná inhibovat enzymatickou aktivitu lumazinsyntázy, jestliže množství lumazinu vytvořeného ve druhé reakční směsi je významně nižší než množství lumazinu vytvořeného v první reakční směsi.

·· φφ • φ · • ·ΦΦ ·· φφφφ » ΦΦ Φ Φ · • Φ Φ

9 9 9

9999 99

- 93

51. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že první reakční směs obsahuje 50 μΜ 2,4-dioxy-5-amino-6ribitylaminopyrimidin a 0,5mM 3,4-dihydroxy-2butanonfosfát.

52. Způsob podle nároku 50 vyznačující se tím, že množství lumazinu vzniklého v reakční směsi je měřeno pomocí fluorometru při excitační vlnové délce 407 nm.

53. Chemická látka identifikovaná způsobem testování podle nároku 50.

54. Způsob potlačení růstu rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se aplikuje na rostlinu chemická látka podle nároku 53, přičemž tato látka inhibuje aktivitu lumazinsyntázy v rostlině.

55.Způsob testování chemických látek na schopnost inhibovat aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) smíchá se enzym podle nároku 47 v první reakční směsi s GTP nebo ribulózo-5-fosfátem v podmínkách, kdy je enzym schopný katalyzovat syntézu 2,5-diamino-4-oxy-6ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3, 4-dihydroxy-2butanonfosfátu,

b) smíchá se chemická látka a enzym ve druhé reakční směsi s GTP nebo ribulózo-5-fosfátem ve stejných podmínkách jako v první reakci,

c) stanoví se množství 2,5-diamino-4-oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2-

φφ φφ φ · φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φ φ φφ ·♦·· φφ φ φφ φφ φ φ φ # φ β φ φ φ φ φ φ φ * φ φ φφ φφ

- 94 butanonfosfátu vytvořené v první a druhé reakční směsi, a

d) porovná se množství 2,5-diamino-4-oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2butanonfosfátu vytvořeného v první a druhé reakční směsi, přičemž chemická látka je schopná inhibovat enzymatickou aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, jestliže množství 2,5-diamino-4-oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'-fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2-butanonfosfátu vytvořeného ve druhé reakční směsi je významně nižší než množství 2,5-diamino-4-oxy-6-ribosylaminopyrimidin-5'fosfátu nebo 3,4-dihydroxy-2-butanonfosfátu vytvořeného v první reakční směsi.

56. Chemická látka identifikovaná způsobem testování podle nároku 55.

57. Způsob potlačení růstu rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se aplikuje na rostlinu chemická látka podle nároku 56, přičemž tato látka inhibuje aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy v rostlině.

58. Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo obsahující molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci izolovanou z rostliny kódující enzym zúčastněný v biosyntéze riboflavinu, a tento enzym má aktivitu lumazinsyntázy nebo aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž molekula DNA poskytuje rostlině, rostlinné buňce, semenu rostliny nebo

• fe fefefefe • fe fefe fefefe fefe fe fefefe · · · • fe fefe fe fefe · • fefefe • fefe fefe • fefefe fefe fefe • fefe · • fe fefe

- 95 rostlinnému pletivu toleranci k herbicidu v množství, které normálně inhibuje biosyntézu riboflavinu.

59. Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo podle nároku 58, kde enzym má ' aktivitu lumazinsyntázy, přičemž molekula DNA poskytuje rostlině, rostlinné buňce, semenu rostliny nebo rostlinnému pletivu toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje aktivitu přirozeně se vyskytující lumazinsyntázy.

60. Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo podle nároku 59, kde enzym obsahuje aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci id. č. 2. .

61. Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo podle nároku 59, kde molekula DNA hybridizuje s kódující sekvencí id. č. 1 za následujících podmínek: hybridizace v roztoku obsahujícím 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄, pH 7,0, lmM EDTA, při 50 °C, promytí v roztoku obsahujícím 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C.

62. Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo podle nároku 58, kde enzym má aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž molekula DNA poskytuje rostlině, rostlinné buňce, semenu rostliny nebo rostlinnému pletivu toleranci k herbicidu v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy.

63. Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo podle nároku 62, kde enzym obsahuje φ* φφφ»

- 96 φφ »* φ · φ φ φφφ φφφ φφφφ φφ φ φ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ aminokyselinovou sekvenci aminokyselinové sekvenci id. č v podstatě

14., podobnou

64.Rostlina, rostlinná buňka, semeno rostliny nebo rostlinné pletivo podle nároku 62, kde molekula DNA hybridizuje s kódující sekvencí id. č. 13 za následujících podmínek: hybridizace v roztoku obsahujícím 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5M NaPO₄, pH 7,0, lmM EDTA, při 50 °C, promytí v roztoku obsahujícím 2x SSC, 1% SDS, při 50 °C.

65.Způsob selektivního potlačení růstu plevelu na poli s vysetými semeny nebo s porostem plodiny vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy: a) vysadí se rostliny nebo vysejí semena plodiny podle nároku 59, bj na rostliny nebo semena a plevel na poli se aplikuje herbicid v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu lumazinsyntázy, přičemž herbicid potlačí růst plevelu- aniž by významně potlačil růst plodiny.

66.Způsob selektivního potlačení růstu plevelu na poli s vysetými semeny nebo s porostem plodiny vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

c) vysadí se rostliny nebo vysejí semena plodiny podle nároku 39,

d) na rostliny nebo semena a plevel na poli se aplikuje herbicid v množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující aktivitu bifunkční GTP cyklohydrolázy II/DHBP syntázy, přičemž herbicid potlačí růst plevelu aniž by významně potlačil růst plodiny.