KR20020066413A - 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 변형 작물 검출방법 및검출키트 - Google Patents

중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 변형 작물 검출방법 및검출키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응법(PCR)을 이용하여 유전자 변형 작물(GMO)을 신속·정확하게 탐지해 내는 유전자 변형 작물 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로, 특히 도입 유전자의 3 부위를 동시에 탐지하여 정확성을 높인 3중 검사시스템의 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다.
본 발명에서는 (a) 유전자 발현조절부위(35S 프로모터)를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P1/P2; (b) 유전자 발현종결부위(노스 터미네이터)를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P3/P4; 그리고 (c) 유전자 발현조절부위에서 발현종결부위까지의 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P5/P6의 3가지 프라이머쌍을 이용하여 PCR 반응으로 작물에 도입된 유전자의 전범위를 탐지하는 GMO 검출방법 및 검출키트가 제공된다.

Description

중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 변형 작물 검출방법 및 검출키트 {A METHOD AND TEST KIT FOR DETECTING GENETICALLY MODIFIED ORGANISM BY PCR}
본 발명은 중합효소연쇄반응법(PCR)을 이용하여 유전자 변형 작물(GMO)을 신속·정확하게 탐지해 내는 유전자 변형 작물 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로, 특히 도입 유전자의 3 부위를 동시에 탐지하여 정확성을 높인 3중 검사시스템의 검출방법 및 검출키트에 관한 것이다.
유전자 변형 농산물(Genetically Modified Organism: GMO)은 유전자재조합기술로 도입된 외래 DNA에 의하여 유전물질이 변형된 생물체로, 일반적으로 제초제에 대한 내성, 병해충이나 추위에 대한 저항력 등의 특성을 가지게 하기 위해 해당 작물의 유전자가 아닌 다른 외래 유전자를 도입하는 방법으로 유전자를 변형시켜 만든 농산물을 말한다. 본 명세서에서 "유전자 변형 작물(GMO)"이란 특히 한정하지 않는 한 유전자 변형 농산물과 이를 이용한 가공식품까지를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
유전자 변형 농산물은 미래의 식량문제를 해결할 수 있는 대안으로 떠오르고 있으며, 선진국을 중심으로 많은 투자와 연구가 이루어지고 있다. 최근에는 유전공학의 발달에 힘입어 새로운 고부가가치 GMO 작물의 개발과 이용이 점차 증가하고 있으며, 새로운 GMO 작물의 개발과 상품화가 해마다 급속도로 확산되고 있는 실정이다. 현재 대두, 면화, 감자, 옥수수, 담배, 호박, 메론, 및 토마토 등 주요 작물에서 이미 GMO 작물이 개발되었고, 이중 상당수의 제품이 시판되고 있다.
그러나, 인체나 환경에 대한 GMO 작물의 안전성은 아직 검증되지 않은 상태로, 지금까지의 연구 사례를 보면 장기간 GMO 작물을 섭취하였을 경우 면역체계를 약화시킨다는 보고가 있으며, GMO 작물의 장기간 재배시 이종간 수퍼 잡종 또는 해충 출현, 토양 생태계 파괴, 생물 다양성 파괴 등의 문제가 제기되고 있다.
현재 유전자 변형 작물을 탐지하는 방법으로는, GMO의 단백질을 검출하는 특이 항체 이용법과 GMO의 DNA를 검출하는 중합효소연쇄반응 이용법의 2가지 방법이 있다.
특이 항체 이용법은 식물체에 도입된 유전자가 만들어내는 특이 단백질을 검출하는 방법으로, 생체내의 면역계에서 볼 수 있는 항원·항체 반응을 이용한 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)법이 주로 사용된다. ELISA법은 PCR과 비교하여 원료 농산물에서 빠른 시간안에 확인이 가능하다는 장점이 있으나, 반면 도입유전자의 특성상 GMO 단백질의 합성이 없는 경우에는 검출이 불가능하고, 검출대상인 단백질이 가공과정에서 DNA에 비해 훨씬 쉽게 파괴되기 때문에 가공식품에는 적용하기 힘들다는 등의 단점도 있다. 즉, 이 방법은 농산물 및 원료 등 비가공 식품에 적합하며 신속, 저렴한 일상 점검에 유리하다고 할 수 있다. 검정 한계치는 0.5∼1% 정도이다.
중합효소연쇄반응 이용법은 식물체에 도입된 유전자의 특이 염기서열을 인식하는 프라이머를 이용하여 PCR 반응으로 도입유전자를 증폭하여 확인하는 방법으로, 아주 미량의 시료에서도 GMO를 검출할 수 있는 장점이 있다. 이 방법을 이용하면 농산물 원료는 물론 가공식품에서도 GMO 탐지가 가능하며, 검정 한계치는 0.01% 정도이다. 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction : PCR)은 아주 적은 양의 DNA만을 갖고서도 특정 부위의 DNA서열을 기하급수적으로 증폭할 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하는 서로 반대 방향의 두 종류의 프라이머와, 고온에서도 기능적으로 안정한 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 서로 다른 세 가지 온도의 순환과정인 변성 (Denaturation step), 결합(Annealing step), 연장(Extension step)을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭한다.
일반적으로 유전자 변형 작물 제조시 도입되는 유전자의 구조는 유전자 발현조절부위, 구조 유전자, 그리고 유전자 발현종결부위로 이루어진다. 유전자 발현조절부위로 가장 많이 사용되는 것은 카울리플라우어 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 (CaMV 35S promoter)이며, 구조 유전자로는 제초제 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자 등이 이용되고 있다. 발현종결부위로는 노스 터미네이터 (Nos terminator)가 일반적으로 이용되고 있다.
종래의 중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 변형 작물 검출에서는, 식물체에 도입된 유전자의 어느 한 부분만을 탐지하는 방법을 사용하고 있다. 즉, 기존의 PCR 반응을 이용한 GMO 검출방법은, 유전자 발현조절부위(35S 프로모터)를 탐지하거나, 또는 유전자 발현종결부위(노스 터미네이터)를 탐지하거나, 또는 구조 유전자의 특정 부위를 탐지하는 등 주로 GMO 작물에 도입된 유전자의 어느 한 부분만을 탐지하여 유전자 변형 여부를 판정하였다.
그러나, 이렇게 도입된 유전자의 어느 한 부위만을 탐지하여 유전자 변형 여부를 판정할 경우에는, 중합효소연쇄반응의 민감성으로 의사양성(false positive) 또는 의사음성(false negative)의 문제가 발생하게 되므로 검사의 정확도가 떨어지게 된다. 예를 들어, 시험하고자하는 작물에 카우리플라우어 모자이크 바이러스나 아그로박테리아가 오염되어 있을 경우, 의사양성으로 비유전자 변형 작물을 유전자 변형 작물로 오인할 가능성이 커지게 된다.
본 발명에서는 의사양성 또는 의사음성의 문제를 해결하고 GMO 검출의 정확성을 높이고자, 종래의 방법과 달리 도입 유전자의 3 부위, 즉 유전자 발현조절부위, 구조 유전자, 유전자 발현종결부위를 동시에 탐지할 수 있는 3중 검사시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 (a) 유전자 발현조절부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P1/P2; (b) 유전자 발현종결부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P3/P4; 그리고 (c) 유전자 발현조절부위에서 발현종결부위까지의 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P5/P6의 3가지 프라이머쌍을 이용하여 PCR 반응으로 작물에 도입된 유전자의 전범위를 탐지하는 3중 검사시스템의 유전자 변형 작물 검출방법 및 검출키트가 제공된다.
도 1은 도입 유전자에 대한 PCR 프라이머의 탐지 위치와 예상되는 증폭산물의 크기를 나타낸 것이다.
도 2는 유전자 변형 콩이 혼입된 시료를 검사한 실험결과를 나타낸 것이며,
도 3은 유전자 변형 옥수수가 혼입된 시료를 검사한 실험결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명에서는 도입 유전자의 3 부위를 동시에 탐지할 수 있도록 3개의 PCR 프라이머쌍을 설계하고, 합성한다.
첫번째 PCR 프라이머쌍 P1/P2는 유전자 발현 조절 부위(35S 프로모터)를 탐지할 수 있도록 설계된다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서 P1/P2는 다음과 같은 염기서열을 갖는다.
PCR 프라이머 P1 : CGACAGTGGTCCCAAAGATG (서열목록 1)
PCR 프라이머 P2 : CTGGTGATTTCAGCGTGTCC (서열목록 2)
두번째 PCR 프라이머쌍 P3/P4는 유전자 발현 종결 부위(노스 터미네이터)를탐지할 수 있도록 설계, 합성된다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서 P3/P4는 다음과 같은 염기서열을 갖는다.
PCR 프라이머 P3 : TGCGCGCTATATTTTGTTTTC (서열목록 3)
PCR 프라이머 P4 : CGATCGTTCAAACATTTGGC (서열목록 4)
세번째 PCR 프라이머쌍 P5/P6은 유전자 발현 조절 부위(35S 프로모터)에서 구조 유전자를 거쳐 유전자 발현 종결 부위(노스 터미네이터)까지 도입 유전자 전체를 탐지할 수 있도록 설계, 합성된다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서 P5/P6은 다음과 같은 염기서열을 갖는다.
PCR 프라이머 P5 : GCTCCTACAAATGCCATCA (서열목록 5 참조)
PCR 프라이머 P6 : TTATCCTAGTTTGCGCGCTA (서열목록 6 참조)
도 1에 본 발명의 PCR 프라이머의 도입 유전자에 대한 탐지 위치와 예상되는 증폭 산물의 크기가 나타나 있다. 도 1의 35S 프로모터를 탐지하는 프라이머쌍 P1/P2의 경우 증폭 크기는 205bp이며, 노스 터미네이터를 탐지하는 프라이머쌍 P3/P4의 경우 증폭 크기는 200bp이다. 35S 프로모터에서 노스 터미네이터까지 검출하는 프라이머쌍 P5/P6은 도입 유전자에 따라 증폭크기가 달라지는데, 유전자 변이 콩의 경우 2.1kb, 유전자 변이 옥수수의 경우 1.3kb이다.
본 발명에서는 상기 3가지 프라이머쌍을 이용한 3중 검사시스템의 PCR 반응으로 GMO를 검출하는 방법을 제공한다. 검출방법은, 먼저 유전자 변형 농산물 또는 그 가공식품으로부터 DNA를 추출한 후, 이를 주형 DNA로 하여 상기 3가지 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응으로 도입유전자를 증폭하고, PCR 반응이 끝나면 증폭된 유전자 산물을 아가로스 젤상에서 전기영동하여 유전자 증폭 유무에 따라 유전자 변형 작물의 혼입 여부를 판정한다 (도 2 및 도 3 참조).
본 발명에 따른 검출방법은, GMO 내의 발현조절부위, 발현종결부위, 그리고 발현조절부위에서 발현종결부위까지 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 3가지 프라이머쌍을 이용하므로 거의 모든 유전자 변형 작물을 탐지할 수 있으며, 도입 유전자의 전 범위를 동시에 탐지하므로 의상양성(false positive) 또는 의사음성 (false negative)을 방지하여 검출의 정확성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 작물에 도입된 유전자를 검출하는 PCR 프라이머로 상기 3가지 프라이머쌍을 포함하는 3중 검사시스템의 GMO 검출키트가 제공된다. 검출키트는 상기 3가지 프라이머쌍과 PCR을 이용한 GMO 검출키트의 일반적인 구성성분(반응완충액, Taq DNA 중합효소 등)을 포함하게 되며, 바람직하게는 PCR 조절 프라이머(PCR control primer:B-actin, zein 등) 등을 부가적으로 포함한다. 본 발명의 바람직한 일 실시에에서 검출키트는 다음과 같이 구성된다.
(1) 유전자 발현조절부위(35S 프로모터) 검출용 PCR 프라이머쌍 P1/P2
(2) 유전자 발현종결부위(노스 터미네이터) 검출용 PCR 프라이머쌍 P3/P4
(3) 발현조절부위에서 발현종결부위까지 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P5/P6
(4)B-actin 프라이머
(5) zein 프라이머
((1)∼(5) : 프라이머 혼합액)
6) 반응완충액(Reaction Buffer)
7) Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)
본 발명의 GMO 검출방법 및 검출키트는 일반적인 모든 유전자 변형 농작물 및 그 가공식품에 이용 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
유전자 변형 작물 검출용 프라이머의 설계 및 합성
작물에 도입된 유전자의 3 부위를 동시에 탐지할 수 있도록 다음의 표 1과 같이 유전자 변형 작물 검출용 PCR 프라이머를 설계·합성하였다 (도 1 참조).
프라이머 목적 염기서열(5'쪽-3쪽')
프라이머쌍 1/2 35S 프로모터 탐지 CGACAGTGGTCCCAAAGATG (서열목록1)
CTGGTGATTTCAGCGTGTCC (서열목록2)
프라이머쌍 3/4 노스터미네이터 탐지 TGCGCGCTATATTTTGTTTTC (서열목록3)
CGATCGTTCAAACATTTGGC (서열목록4)
프라이머쌍 5/6 35S 프로모터에서 구조유전자를 거쳐 노스터미네이터까지 탐지 GCTCCTACAAATGCCATCA (서열목록5)
TTATCCTAGTTTGCGCGCTA (서열목록6)
실시예 2
유전자 변형 작물 검출키트의 구성
실시예 1에서 합성한 PCR 프라이머를 이용하여 다음의 표 2와 같이 검출키트를 구성하였다.
키트구성성분 증폭크기
서열목록 1,2의 35S 프로모터 검출용 프라이머쌍 P1/P2 증폭크기: 205 bp
서열목록 3,4의 노스 터미네이터 검출용 프라이머쌍 P3/P4 증폭크기: 200 bp
서열목록 5,6의 35S 프로모터에서 노스 터미네이터까지 검출용 프라이머쌍 P5/P6 유전자 변형 콩의 경우 2.1 kb,유전자 변형 옥수수의 경우 1.3 kb
B-actin 프라이머 증폭크기 : 497 bp
zein 프라이머 증폭크기 : 250 bp
5×Reaction Buffer(dNTPs 포함)
Taq DNA polymerase(1U/㎕)
실시예 3
중합효소연쇄반응을 이용한 유전자 변형 작물의 탐지
유전자 변형 작물과 이를 이용한 가공식품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 실시예 2에서 제조한 본 발명의 프라이머 혼합액으로 PCR 반응시켜 도입 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자 산물을 1.5% 아가로스 젤상에서 전기영동한 후도입 유전자의 증폭유무에 따라 유전자 변형 작물의 혼입여부를 판정하였다 (도 2 및 도 3 참조). 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
1) DNA 추출
유전자 변형 작물을 액체 질소 하에서 파쇄한 후, 파쇄된 작물가루 100㎎을 적당한 용량의 시험관에 분주하고 세포벽과 단백질을 용해시킬 수 있는 용액을 첨가하여 시료와 용액이 잘 섞이도록 혼합한 후 약 30분간 37℃에서 진탕하였다. 진탕 후 3,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상청액을 새로운 시험관에 옮기고, 트리스-이디티에이로 포화시킨 페놀/클로로포름을 동량 첨가하여 교반한 후 10,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 페놀층과 수층을 분리하였다. 분리된 수층을 별도의 시험관에 옮긴 후 트리스-이디티에이로 포화시킨 페놀/클로로포름을 동량 첨가하여 교반하는 과정을 2회 반복하고, 수층을 별도의 시험관에 옮긴 후 클로로포름/아이소아밀알콜을 동량 첨가하여 같은 조작을 반복하였다. 새로운 시험관에 클로로포름/아이소아밀알콜 추출 후의 수층을 옮기고, 동량의 아이소프로필알콜을 첨가하여 잘 혼합한 다음, 4℃, 12,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 주의하여 제거하고, 70% 에탄올로 침전물을 세정한 후, 진공 건조기로 가볍게 건조하고, 적당량의 트리스-이디티에이 완충액으로 용해시켰다. 이렇게 얻어진 0.1∼5㎕의 DNA 용액을 아가로스 젤로 전기 영동하여 추출 정도를 확인한 후, 50∼100ng의 DNA를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
2) PCR 반응액 (전체 반응액 25㎕)
주형 DNA50∼100ng
5×Reaction Buffer5㎕
프라이머 혼합액 4㎕
Taq DNA 중합효소(1U/㎕)1㎕
증류수잔부(전체 25㎕)
3) PCR 조건
중합효소연쇄반응은 초기 변성(pre-denaturation)을 94℃에서 2분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 20초), 결합(annealing, 60℃에서 40초), 연장 (extension, 72℃에서 2분)을 총 40회 실시하였다.
4) 유전자 변형 작물의 혼입여부 판정
반응이 끝난 PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤상에서 전기영동으로 전개하여, 정확한 크기의 유전자 증폭 산물의 형성 유무로 유전자 변형 작물의 혼입여부를 판정하였다. 유전자 변형 콩에 대한 실험결과는 도 2와 같으며, 유전자 변형 옥수수에 대한 실험결과는 도 3과 같다.
도 2 및 도 3에서 레인(Lane) 2는 35S 프로모터 부위로 205bp 밴드가 검출되면 유전자 변형 작물이 포함되어 있는 것으로 판정되며, 레인 3은 노스 터미네이터 부위로 200bp 밴드가 검출되면 유전자 변형 작물이 포함되어 있는 것으로 판정된다. 레인 4는 35S 프로모터에서 노스 터미네이터 부위까지로 유전자 변형 콩의 경우 2.1kb 밴드가 검출되면 유전자 변형 작물이 포함되어 있는 것이며, 유전자 변형 옥수수의 경우 1.3kb 밴드가 형성되면 유전자 변형 작물이 포함되어 있는 것이다.
본 발명에 따른 유전자 변형 작물 검출법은 3쌍의 프라이머를 이용한 3중 검사시스템을 사용하여 도입된 유전자의 여러 부위를 PCR로 증폭하여 확인하기 때문에 신속·정확하게 유전자 변형체의 혼입여부를 탐지할 수 있으며, 의사양성(false positive)이나 의사음성(false negative)의 문제를 방지할 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 유전자 변형 작물 검출키트는 GMO 내의 발현조절부위, 발현종결부위, 그리고 발현조절부위에서 구조 유전자를 거쳐 발현종결부위까지 도입 유전자의 전부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머가 포함되어 있으므로 거의 모든 유전자 변형 작물을 탐지할 수 있으며, 작물에 따라 다른 종류의 GMO 검출키트를 구입하여야 하는 번거로움이 없이 모든 유전자 변형 작물을 검사할 수 있다.

Claims (5)

  1. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 작물에 도입된 유전자를 검출하는 유전자 변형 작물의 검출방법에 있어서,
    작물에 도입된 유전자를 증폭하는 PCR 프라이머로 (a) 유전자 발현조절부위 검출용 PCR 프라이머쌍 P1/P2; (b) 유전자 발현종결부위 검출용 PCR 프라이머쌍 P3/P4; 그리고 (c) 유전자 발현조절부위에서 발현종결부위까지의 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P5/P6의 3가지 PCR 프라이머쌍을 사용하여, 도입 유전자의 전범위를 탐지하는 것을 특징으로 하는 3중 검사시스템의 유전자 변형 작물 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 발현조절부위 검출용 프라이머쌍 P1/P2는 서열목록 1, 2의 염기서열을 가지며;
    상기 유전자 발현종결부위 검출용 프라이머쌍 P3/P4는 서열목록 3, 4의 염기서열을 가지며;
    상기 발현조절부위에서 발현종결부위까지 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 프라이머쌍 P5/P6는 서열목록 5, 6의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 작물에 도입된 유전자를 검출하도록 PCR 프라이머, 반응완충액, Taq DNA 중합효소 등으로 구성된 유전자 변형 작물 검출키트에 있어서,
    상기 PCR 프라이머는 (a) 유전자 발현조절부위 검출용 PCR 프라이머쌍 P1/P2; (b) 유전자 발현종결부위 검출용 PCR 프라이머쌍 P3/P4; 그리고 (c) 발현조절부위에서 발현종결부위까지의 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 PCR 프라이머쌍 P5/P6의 3가지 PCR 프라이머쌍을 포함하는 프라이머 혼합액인 것을 특징으로 하는 3중 검사시스템의 유전자 변형 작물 검출키트.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 유전자 발현조절부위 검출용 프라이머쌍 P1/P2는 서열목록 1, 2의 염기서열을 가지며;
    상기 유전자 발현종결부위 검출용 프라이머쌍 P3/P4는 서열목록 3, 4의 염기서열을 가지며;
    상기 발현조절부위에서 발현종결부위까지 도입 유전자 전부위를 탐지할 수 있는 프라이머쌍 P5/P6는 서열목록 5, 6의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 검출키트.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 프라이머 혼합액에는 PCR 조절 프라이머(PCR control primer)가 포함되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 작물 검출키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100458009B1 (ko) * 2002-09-03 2004-11-18 대한민국 감자 특이 ｄｎａ를 증폭하는 단일 ｐｃｒ 프라이머 및이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 ｐｃｒ 판별방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100458009B1 (ko) * 2002-09-03 2004-11-18 대한민국 감자 특이 ｄｎａ를 증폭하는 단일 ｐｃｒ 프라이머 및이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 ｐｃｒ 판별방법

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