JPH11266875A - 害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマー - Google Patents
害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマーInfo
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- JPH11266875A JPH11266875A JP10095417A JP9541798A JPH11266875A JP H11266875 A JPH11266875 A JP H11266875A JP 10095417 A JP10095417 A JP 10095417A JP 9541798 A JP9541798 A JP 9541798A JP H11266875 A JPH11266875 A JP H11266875A
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- primer
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろ
こし等）の検出方法およびそれに用いるプライマー等を
提供する。 【解決手段】 人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子以外の
遺伝子との相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺
伝子との相同性が高いプライマー、ならびに、当該プラ
イマーを用いたＰＣＲ法により害虫抵抗性遺伝子組み換
え作物（とうもろこし等）に導入されている該遺伝子を
検出する方法、および上記害虫抵抗性の遺伝子組み換え
作物を検出する方法。 【効果】 当該方法により、害虫抵抗性遺伝子組み換え
作物（とうもろこし等）に導入されている人工改変Ｃｒ
ｙＩＡ（ｂ）遺伝子を検出することが可能であり、それ
により、該遺伝子を導入されている害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）を検出、識別、および
確認することが可能となる。
こし等）の検出方法およびそれに用いるプライマー等を
提供する。 【解決手段】 人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子以外の
遺伝子との相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺
伝子との相同性が高いプライマー、ならびに、当該プラ
イマーを用いたＰＣＲ法により害虫抵抗性遺伝子組み換
え作物（とうもろこし等）に導入されている該遺伝子を
検出する方法、および上記害虫抵抗性の遺伝子組み換え
作物を検出する方法。 【効果】 当該方法により、害虫抵抗性遺伝子組み換え
作物（とうもろこし等）に導入されている人工改変Ｃｒ
ｙＩＡ（ｂ）遺伝子を検出することが可能であり、それ
により、該遺伝子を導入されている害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）を検出、識別、および
確認することが可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定のプライマー
を用いたＤＮＡ増幅（ＰＣＲ）法による害虫抵抗性の遺
伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導入された人工
改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出方法、上記害虫抵抗性の遺
伝子組み換え作物の検出方法、該遺伝子組み換え作物の
識別方法およびそれに用いるプライマーに関する。さら
には、本発明は、増幅産物が確実に導入遺伝子由来であ
ることを確認するための上記方法で識別された結果を確
認する方法に関する。
を用いたＤＮＡ増幅（ＰＣＲ）法による害虫抵抗性の遺
伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導入された人工
改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出方法、上記害虫抵抗性の遺
伝子組み換え作物の検出方法、該遺伝子組み換え作物の
識別方法およびそれに用いるプライマーに関する。さら
には、本発明は、増幅産物が確実に導入遺伝子由来であ
ることを確認するための上記方法で識別された結果を確
認する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】世界的な人口増加に伴う食料危機の問題
を、農業の生産性向上の側面から解決することを目的と
して、組み換えＤＮＡ技術を用いた作物の改良が行なわ
れている。こうした遺伝子組み換え作物の例としては、
例えば、日持ちを良くしたトマト、ウイルス抵抗性のカ
ボチャ、除草剤耐性のワタ、大豆、ナタネ、とうもろこ
し等や、害虫抵抗性のジャガイモ、ワタ、とうもろこし
等がある。通常、遺伝子組み換え作物と遺伝子組み換え
されていない作物（在来品種）とは収穫や輸送途中の段
階で混合される可能性が高く、その後の段階で、それら
を識別することは困難であり、また外観から遺伝子組み
換え作物の存在を確認することは不可能である。従っ
て、今日、この様な遺伝子組み換え作物の検出法の確立
が必要とされている。
を、農業の生産性向上の側面から解決することを目的と
して、組み換えＤＮＡ技術を用いた作物の改良が行なわ
れている。こうした遺伝子組み換え作物の例としては、
例えば、日持ちを良くしたトマト、ウイルス抵抗性のカ
ボチャ、除草剤耐性のワタ、大豆、ナタネ、とうもろこ
し等や、害虫抵抗性のジャガイモ、ワタ、とうもろこし
等がある。通常、遺伝子組み換え作物と遺伝子組み換え
されていない作物（在来品種）とは収穫や輸送途中の段
階で混合される可能性が高く、その後の段階で、それら
を識別することは困難であり、また外観から遺伝子組み
換え作物の存在を確認することは不可能である。従っ
て、今日、この様な遺伝子組み換え作物の検出法の確立
が必要とされている。
【０００３】現在までに遺伝子組み換え作物のＰＣＲ法
による識別例としては、日持ちを良くしたトマト（フレ
ーバー セーバー トマト）の識別に関する報告がある
［ＺＬｅｂｅｎｓｍ Ｕｎｔｅｒｓ Ｆｏｒｓｃｈ，２
０１（６）：５８３−５８６（１９９５）］。
による識別例としては、日持ちを良くしたトマト（フレ
ーバー セーバー トマト）の識別に関する報告がある
［ＺＬｅｂｅｎｓｍ Ｕｎｔｅｒｓ Ｆｏｒｓｃｈ，２
０１（６）：５８３−５８６（１９９５）］。
【０００４】ここで、遺伝子組み換えにより作出された
害虫抵抗性作物は、その殆ど全てにバチルス チューリ
ンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ）が産生する蛋白質を産生させるＣｒｙ遺伝子フ
ァミリーに属する何れかの遺伝子、あるいは植物体での
発現量の向上を目的としてそれを人工的に改変した遺伝
子が導入されている。その導入遺伝子の名称は、社団法
人日本衛生協会の食品安全情報相談室に所蔵の申請者の
作成した申請資料に示されている。さらに、その塩基配
列は、遺伝子名や部分配列をもとに遺伝子データべース
検索により入手することが可能であり、また食品安全情
報相談室所蔵の申請者の作成した申請資料にもその報告
があり、閲覧可能である。
害虫抵抗性作物は、その殆ど全てにバチルス チューリ
ンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ）が産生する蛋白質を産生させるＣｒｙ遺伝子フ
ァミリーに属する何れかの遺伝子、あるいは植物体での
発現量の向上を目的としてそれを人工的に改変した遺伝
子が導入されている。その導入遺伝子の名称は、社団法
人日本衛生協会の食品安全情報相談室に所蔵の申請者の
作成した申請資料に示されている。さらに、その塩基配
列は、遺伝子名や部分配列をもとに遺伝子データべース
検索により入手することが可能であり、また食品安全情
報相談室所蔵の申請者の作成した申請資料にもその報告
があり、閲覧可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】菌やＣｒｙ遺伝子ファ
ミリーの系統分類のためにＣｒｙ遺伝子をＰＣＲ法によ
り増幅した例は種々報告されているが、Ｃｒｙ遺伝子フ
ァミリーの中で、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物に導
入されている人工的に改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子を検
出することを目的として、該遺伝子のみに特異的な配列
を有するプライマーを開発した例は、未だ報告されてお
らず、かかる状況下にあって、害虫抵抗性の遺伝子組み
換え作物（とうもろこし等）に導入された該遺伝子のみ
をＰＣＲ法により特異的に検出できるプライマーの開発
が待望されていた。
ミリーの系統分類のためにＣｒｙ遺伝子をＰＣＲ法によ
り増幅した例は種々報告されているが、Ｃｒｙ遺伝子フ
ァミリーの中で、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物に導
入されている人工的に改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子を検
出することを目的として、該遺伝子のみに特異的な配列
を有するプライマーを開発した例は、未だ報告されてお
らず、かかる状況下にあって、害虫抵抗性の遺伝子組み
換え作物（とうもろこし等）に導入された該遺伝子のみ
をＰＣＲ法により特異的に検出できるプライマーの開発
が待望されていた。
【０００６】このような状況の中で、本発明者らは、害
虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導
入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子のみを特異的に
検出できるプライマー、該プライマーを用いた上記遺伝
子組み換え作物の検出方法および識別方法を開発するこ
とを目的として種々研究を積み重ねた結果、上記遺伝子
組み換え作物の検出および識別に有用な特定のプライマ
ーを作製することに成功した。また、当該プライマーを
用いて行った遺伝子組み換え作物の識別結果の確認をす
るために、標的増幅遺伝子産物から異なるサイズを持つ
消化断片を与える制限酵素を使用することが有用である
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導
入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子のみを特異的に
検出できるプライマー、該プライマーを用いた上記遺伝
子組み換え作物の検出方法および識別方法を開発するこ
とを目的として種々研究を積み重ねた結果、上記遺伝子
組み換え作物の検出および識別に有用な特定のプライマ
ーを作製することに成功した。また、当該プライマーを
用いて行った遺伝子組み換え作物の識別結果の確認をす
るために、標的増幅遺伝子産物から異なるサイズを持つ
消化断片を与える制限酵素を使用することが有用である
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】本発明は、ＤＮＡ増幅（ＰＣＲ）法によっ
て、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入された人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅し得
るプライマーを提供することを目的とする。また、本発
明は、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）を検出する方法を提供することを目的とする。ま
た、本発明は、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とう
もろこし等）を識別する方法を提供することを目的とす
る。更に、本発明は、増幅産物が組み換え遺伝子配列由
来かどうかを確認するために、害虫抵抗性の遺伝子組み
換え作物（とうもろこし等）の識別結果を確認する方法
を提供することを目的とする。
て、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入された人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅し得
るプライマーを提供することを目的とする。また、本発
明は、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）を検出する方法を提供することを目的とする。ま
た、本発明は、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とう
もろこし等）を識別する方法を提供することを目的とす
る。更に、本発明は、増幅産物が組み換え遺伝子配列由
来かどうかを確認するために、害虫抵抗性の遺伝子組み
換え作物（とうもろこし等）の識別結果を確認する方法
を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の本発明は、以下の技術的手段から構成される。 （１）人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子以外の遺伝子と
の相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子との
相同性が高いことを特徴とするプライマー。 （２）天然のバチルス チューリンゲンシスのＣｒｙＩ
Ａ遺伝子および遺伝子組み換えされていない作物の遺伝
子との相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子
との相同性が高いことを特徴とする上記（１）に記載の
プライマー。 （３）人工改変された（Ｘ）遺伝子および／または人工
改変された（Ｙ）遺伝子のいずれかと相同性が高いこと
を特徴とする上記（１）〜（２）のいずれか１項に記載
のプライマー。 （４）１５塩基長以上を有することを特徴とする上記
（１）〜（３）のいずれか１項に記載のプライマー。 （５）センスストランドプライマーとして、次の２種の
塩基配列であるプライマー、 ５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴＧ−３’、 ５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＣＧ−３’、 またはこれらと同等の相補性を有するプライマーのうち
から少なくとも１つを選び、アンチセンスストランドプ
ライマーとして、次の２種の塩基配列であるプライマ
ー、 ５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴ
ＴＧ−３’、 ５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＴＧ−３’、 またはこれらと同等の相補性を有するプライマーのうち
から少なくとも１つを選んだことを特徴とする上記
（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプライマー。 （６）作物の遺伝子を抽出し、上記（１）〜（５）のい
ずれか１項に記載のプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅法
により害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅
し、該遺伝子を検出することを特徴とする人工改変Ｃｒ
ｙＩＡ遺伝子の検出方法。 （７）作物の遺伝子を抽出し、上記（１）〜（５）のい
ずれか１項に記載のプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅法
により害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅
し、該遺伝子を検出することを特徴とする上記害虫抵抗
性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）の検出方
法。 （８）作物の遺伝子を抽出し、上記（６）〜（７）のい
ずれか１項に記載の方法により、害虫抵抗性の遺伝子組
み換え作物（とうもろこし等）に導入されている人工改
変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅、検出し、その結果を指標と
して、遺伝子組み換えされていない作物と遺伝子組み換
え作物とを識別することを特徴とする害虫抵抗性の遺伝
子組み換え作物（とうもろこし等）の識別方法。 （９）上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法
で得られた増幅遺伝子産物を制限酵素による消化を行
い、得られた制限酵素消化断片のサイズをみることによ
り増幅遺伝子産物の配列が人工改変された害虫抵抗性遺
伝子由来であることを確認することを特徴とする害虫抵
抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）の確認方
法。 （１０）標的増幅遺伝子配列中に１〜２ケ所の制限酵素
認識部位を有し、かつ制限酵素消化により異なるサイズ
を持つ消化断片を与える制限酵素を使用することを特徴
とする請求項９に記載の害虫抵抗性の遺伝子組み換え作
物（とうもろこし等）の確認方法。
の本発明は、以下の技術的手段から構成される。 （１）人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子以外の遺伝子と
の相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子との
相同性が高いことを特徴とするプライマー。 （２）天然のバチルス チューリンゲンシスのＣｒｙＩ
Ａ遺伝子および遺伝子組み換えされていない作物の遺伝
子との相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子
との相同性が高いことを特徴とする上記（１）に記載の
プライマー。 （３）人工改変された（Ｘ）遺伝子および／または人工
改変された（Ｙ）遺伝子のいずれかと相同性が高いこと
を特徴とする上記（１）〜（２）のいずれか１項に記載
のプライマー。 （４）１５塩基長以上を有することを特徴とする上記
（１）〜（３）のいずれか１項に記載のプライマー。 （５）センスストランドプライマーとして、次の２種の
塩基配列であるプライマー、 ５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴＧ−３’、 ５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＣＧ−３’、 またはこれらと同等の相補性を有するプライマーのうち
から少なくとも１つを選び、アンチセンスストランドプ
ライマーとして、次の２種の塩基配列であるプライマ
ー、 ５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴ
ＴＧ−３’、 ５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＴＧ−３’、 またはこれらと同等の相補性を有するプライマーのうち
から少なくとも１つを選んだことを特徴とする上記
（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプライマー。 （６）作物の遺伝子を抽出し、上記（１）〜（５）のい
ずれか１項に記載のプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅法
により害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅
し、該遺伝子を検出することを特徴とする人工改変Ｃｒ
ｙＩＡ遺伝子の検出方法。 （７）作物の遺伝子を抽出し、上記（１）〜（５）のい
ずれか１項に記載のプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅法
により害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅
し、該遺伝子を検出することを特徴とする上記害虫抵抗
性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）の検出方
法。 （８）作物の遺伝子を抽出し、上記（６）〜（７）のい
ずれか１項に記載の方法により、害虫抵抗性の遺伝子組
み換え作物（とうもろこし等）に導入されている人工改
変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅、検出し、その結果を指標と
して、遺伝子組み換えされていない作物と遺伝子組み換
え作物とを識別することを特徴とする害虫抵抗性の遺伝
子組み換え作物（とうもろこし等）の識別方法。 （９）上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法
で得られた増幅遺伝子産物を制限酵素による消化を行
い、得られた制限酵素消化断片のサイズをみることによ
り増幅遺伝子産物の配列が人工改変された害虫抵抗性遺
伝子由来であることを確認することを特徴とする害虫抵
抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）の確認方
法。 （１０）標的増幅遺伝子配列中に１〜２ケ所の制限酵素
認識部位を有し、かつ制限酵素消化により異なるサイズ
を持つ消化断片を与える制限酵素を使用することを特徴
とする請求項９に記載の害虫抵抗性の遺伝子組み換え作
物（とうもろこし等）の確認方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】次に、本発明についてさらに詳細
に説明する。本発明のプライマーは、人工改変されたＣ
ｒｙＩＡ遺伝子以外の遺伝子との相同性が低く、人工改
変されたＣｒｙＩＡ遺伝子との相同性が高いことを特徴
とする。さらには、天然のバチルス チューリンゲンシ
スのＣｒｙＩＡ遺伝子および遺伝子組み換えされていな
い作物の遺伝子との相同性が低く、害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）に導入されている人工
改変ＣｒｙＩＡ遺伝子に対して高い相同性を有すること
を特徴とする。
に説明する。本発明のプライマーは、人工改変されたＣ
ｒｙＩＡ遺伝子以外の遺伝子との相同性が低く、人工改
変されたＣｒｙＩＡ遺伝子との相同性が高いことを特徴
とする。さらには、天然のバチルス チューリンゲンシ
スのＣｒｙＩＡ遺伝子および遺伝子組み換えされていな
い作物の遺伝子との相同性が低く、害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）に導入されている人工
改変ＣｒｙＩＡ遺伝子に対して高い相同性を有すること
を特徴とする。
【００１０】本発明において、プライマーが天然のバチ
ルス チューリンゲンシスのＣｒｙＩＡ遺伝子との相同
性が低いことを要件とするのは、以下の理由による。す
なわち、Ｃｒｙ遺伝子を持つバチルス チューリンゲン
シスは、その菌自体（死菌体等）が微生物農薬として使
用されており、また自然界にはＣｒｙ毒素遺伝子を持つ
バチルス チューリンゲンシスが存在しており、これら
由来のＣｒｙ遺伝子が作物に混入する可能性もゼロでは
ない。従って、これら天然のＣｒｙ遺伝子を検出するこ
となく、人工改変されたＣｒｙ遺伝子のみを特異的に検
出することが可能なプライマーを用いることにより、遺
伝子組み換え作物のみを精度よく識別することが可能と
なる。
ルス チューリンゲンシスのＣｒｙＩＡ遺伝子との相同
性が低いことを要件とするのは、以下の理由による。す
なわち、Ｃｒｙ遺伝子を持つバチルス チューリンゲン
シスは、その菌自体（死菌体等）が微生物農薬として使
用されており、また自然界にはＣｒｙ毒素遺伝子を持つ
バチルス チューリンゲンシスが存在しており、これら
由来のＣｒｙ遺伝子が作物に混入する可能性もゼロでは
ない。従って、これら天然のＣｒｙ遺伝子を検出するこ
となく、人工改変されたＣｒｙ遺伝子のみを特異的に検
出することが可能なプライマーを用いることにより、遺
伝子組み換え作物のみを精度よく識別することが可能と
なる。
【００１１】本発明のプライマーを作製する方法として
は、具体的には、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（と
うもろこし等）に導入されている人工改変された（Ｘ）
遺伝子（配列番号：１）および／または（Ｙ）遺伝子
（配列番号：２）の中から、遺伝子データーベースを使
用して在来品種の人工改変ＣｒｙＩＡ以外の遺伝子との
相同性が低い特異的な配列を検索し、プライマー候補を
選定する。
は、具体的には、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（と
うもろこし等）に導入されている人工改変された（Ｘ）
遺伝子（配列番号：１）および／または（Ｙ）遺伝子
（配列番号：２）の中から、遺伝子データーベースを使
用して在来品種の人工改変ＣｒｙＩＡ以外の遺伝子との
相同性が低い特異的な配列を検索し、プライマー候補を
選定する。
【００１２】上記に従って、本発明に適合するプライマ
ーを作製した。即ち、さらに詳細には、本発明に用いら
れたプライマーは、センスプライマー： ５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴＧ−３’（配列番号：３）、 ５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＣＧ−３’（配列番号：４）、 アンチセンスストランドプライマーとして、次の２種の
塩基配列であるプライマーであって、 ５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴ
ＴＧ−３’（配列番号：５）、 ５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＴＧ−３’（配列番号：６）、 である。これらには、ホモロジー検索の結果、配列番
号：３〜６の遺伝子配列は人工改変ＣｒｙＩＡ以外の遺
伝子との類似性は低かった。すなわち、これらの配列は
人工改変ＣｒｙＩＡ以外の遺伝子との相同性が低いもの
であった。
ーを作製した。即ち、さらに詳細には、本発明に用いら
れたプライマーは、センスプライマー： ５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴＧ−３’（配列番号：３）、 ５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＣＧ−３’（配列番号：４）、 アンチセンスストランドプライマーとして、次の２種の
塩基配列であるプライマーであって、 ５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴ
ＴＧ−３’（配列番号：５）、 ５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＴＧ−３’（配列番号：６）、 である。これらには、ホモロジー検索の結果、配列番
号：３〜６の遺伝子配列は人工改変ＣｒｙＩＡ以外の遺
伝子との類似性は低かった。すなわち、これらの配列は
人工改変ＣｒｙＩＡ以外の遺伝子との相同性が低いもの
であった。
【００１３】これらのプライマーに対する相補鎖も、も
ちろん本発明のプライマーとして用いることができる。
ちろん本発明のプライマーとして用いることができる。
【００１４】通常、ＰＣＲ法に用いるプライマーは、１
５塩基以上であると、所望の特異性が得られる。従っ
て、本発明のプライマーも１５塩基以上であることが望
ましく、上記配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
またはその相補鎖を有するプライマーも本発明のプライ
マーに包含される。
５塩基以上であると、所望の特異性が得られる。従っ
て、本発明のプライマーも１５塩基以上であることが望
ましく、上記配列のうち、少なくとも連続した１５塩基
またはその相補鎖を有するプライマーも本発明のプライ
マーに包含される。
【００１５】本発明のプライマーは、ＰＣＲ法による害
虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導
入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出用プライ
マーとして用いられるだけでなく、害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）に導入されている該遺
伝子の検出用プローブとして用いることもできる。従っ
て、本発明のプライマーと同一の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドは、その用途に限定されず、全て本発明
に包含される。
虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導
入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出用プライ
マーとして用いられるだけでなく、害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）に導入されている該遺
伝子の検出用プローブとして用いることもできる。従っ
て、本発明のプライマーと同一の塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドは、その用途に限定されず、全て本発明
に包含される。
【００１６】本発明のプライマーを用いるＤＮＡ増幅法
による害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の増
幅、および該遺伝子の検出は、ＰＣＲ法／電気泳動法、
またはそれと同効の方法等を用いて、適宜、通常の方法
で行なえばよい。例えば、液体窒素で凍結し、ドライア
イス存在下で細かく粉砕した種子等の可食部分から、市
販のＤＮＡ抽出キット等を用いて抽出したＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲを行なった後、増幅したＤＮＡ断片を電気
泳動法により検出すればよい。そして、上記ＤＮＡ増幅
法により上記人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅し、該遺
伝子を検出することにより、その作物の種類に限定され
ることなく、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物を検出す
ることができる。さらに、同様に、上記方法により、上
記人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅、検出し、その結果
を指標として、その作物の種類に限定されることなく、
在来品種と遺伝子組み換え作物とを識別することができ
る。
による害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし
等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の増
幅、および該遺伝子の検出は、ＰＣＲ法／電気泳動法、
またはそれと同効の方法等を用いて、適宜、通常の方法
で行なえばよい。例えば、液体窒素で凍結し、ドライア
イス存在下で細かく粉砕した種子等の可食部分から、市
販のＤＮＡ抽出キット等を用いて抽出したＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲを行なった後、増幅したＤＮＡ断片を電気
泳動法により検出すればよい。そして、上記ＤＮＡ増幅
法により上記人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅し、該遺
伝子を検出することにより、その作物の種類に限定され
ることなく、害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物を検出す
ることができる。さらに、同様に、上記方法により、上
記人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅、検出し、その結果
を指標として、その作物の種類に限定されることなく、
在来品種と遺伝子組み換え作物とを識別することができ
る。
【００１７】また、上記方法によって得られた増幅ＤＮ
Ａ断片を制限酵素で消化し、制限酵素消化断片のサイズ
を見ることによって増幅ＤＮＡの配列が人工改変された
遺伝子組み換え作物に由来するものである否かを確認す
ることができる。使用し得る制限酵素としては、例え
ば、Ａｌｗｌ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｓａ
Ｉ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍｂｏ Ｉ、Ｎｓｐ
Ｉ、Ｒｓａ Ｉ、 Ｔａｑ Ｉ、Ｘｈｏ ＩＩ、Ａｆｌ
ＩＩＩ、Ｂｇｌ Ｉ、ＢｓｐＭ ＩＩ、Ｅａｒ Ｉ、
Ｈｐａ ＩＩ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｘｍｎ
Ｉ、Ｍａｅ ＩＩ、Ｍｎｌ Ｉ、ＮｓｐＢ ＩＩ、Ｓｅ
ｃ Ｉ等を例示することができる。そして、これら制限
酵素のうち、標的増幅配列中に１〜２ケ所の制限酵素認
識部位を有し、かつ制限酵素消化により異なるサイズを
持つ消化断片を与える制限酵素を使用することが好まし
い。
Ａ断片を制限酵素で消化し、制限酵素消化断片のサイズ
を見ることによって増幅ＤＮＡの配列が人工改変された
遺伝子組み換え作物に由来するものである否かを確認す
ることができる。使用し得る制限酵素としては、例え
ば、Ａｌｗｌ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｓａ
Ｉ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈｈａ Ｉ、Ｍｂｏ Ｉ、Ｎｓｐ
Ｉ、Ｒｓａ Ｉ、 Ｔａｑ Ｉ、Ｘｈｏ ＩＩ、Ａｆｌ
ＩＩＩ、Ｂｇｌ Ｉ、ＢｓｐＭ ＩＩ、Ｅａｒ Ｉ、
Ｈｐａ ＩＩ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｘｍｎ
Ｉ、Ｍａｅ ＩＩ、Ｍｎｌ Ｉ、ＮｓｐＢ ＩＩ、Ｓｅ
ｃ Ｉ等を例示することができる。そして、これら制限
酵素のうち、標的増幅配列中に１〜２ケ所の制限酵素認
識部位を有し、かつ制限酵素消化により異なるサイズを
持つ消化断片を与える制限酵素を使用することが好まし
い。
【００１８】
【実施例】次に、実施例を開示して本発明を具体的に説
明するが、本発明は当該実施例により何らかの限定を受
けるものではない。 実施例１ （１）プライマー：害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物
（とうもろこし）に導入されている人工改変された
（Ｙ）遺伝子の塩基配列（配列番号：２参照）の中か
ら、該遺伝子配列に特異的な配列を検索し、さらに前記
プライマー設計条件に留意して、以下の配列を有するオ
リゴヌクレオチドを合成した。 センスプライマー：５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧ
ＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧ−３’（配列番号：４） アンチセンスプライマー：５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣ
ＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：６） 尚、同様にして、（Ｘ）遺伝子の塩基配列（配列番号：
１参照）の中から、該遺伝子配列に特異的な配列を検索
し、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し
た。 センスプライマー：５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧ
ＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧ−３’（配列番号：３） アンチセンスプライマー：５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣ
ＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：５）
明するが、本発明は当該実施例により何らかの限定を受
けるものではない。 実施例１ （１）プライマー：害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物
（とうもろこし）に導入されている人工改変された
（Ｙ）遺伝子の塩基配列（配列番号：２参照）の中か
ら、該遺伝子配列に特異的な配列を検索し、さらに前記
プライマー設計条件に留意して、以下の配列を有するオ
リゴヌクレオチドを合成した。 センスプライマー：５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧ
ＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧ−３’（配列番号：４） アンチセンスプライマー：５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣ
ＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：６） 尚、同様にして、（Ｘ）遺伝子の塩基配列（配列番号：
１参照）の中から、該遺伝子配列に特異的な配列を検索
し、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し
た。 センスプライマー：５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧ
ＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧ−３’（配列番号：３） アンチセンスプライマー：５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣ
ＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：５）
【００１９】（２）使用とうもろこし種子：害虫抵抗性
の遺伝子組み換え作物としては米国Ｃｉｂａｇｅｉｇｙ
社開発の害虫抵抗性とうもろこし（Ｅｖｅｎｔ１７６）
を、在来品種としては１９９６年前期に市場で流通して
いたとうもろこし８品種を用いた。
の遺伝子組み換え作物としては米国Ｃｉｂａｇｅｉｇｙ
社開発の害虫抵抗性とうもろこし（Ｅｖｅｎｔ１７６）
を、在来品種としては１９９６年前期に市場で流通して
いたとうもろこし８品種を用いた。
【００２０】（３）ＤＮＡ抽出：ＱＩＡＧＥＮ社製ＤＮ
ｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、同キ
ト添付のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋに従って以下の方法で行った。液体窒素で凍
結し、ドライアイス存在下で細かく粉砕したとうもろこ
し種子２００ｍｇを容器に入れ、ｂｕｆｆｅｒ ＡＰ１
を６００μｌ、２０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡを３０μｌ
加え、混合した後、６５℃で１０分間保温した。その
後、該混合物にｂｕｆｆｅｒ ＡＰ２を１９５μｌ加
え、氷中で５分間放置した。その後、遠心分離によりそ
の上清液を得、これをＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｓｐｉ
ｎ Ｃｏｌｕｍｎに供し、遠心分離によりＱＩＡｓｈｒ
ｅｄｄｅｒ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎパス液を得た。この
パス液に０．５容量のｂｕｆｆｅｒ ＡＰ３、１容量の
エタノールを加えて混合した。この混合液をＤＮｅａｓ
ｙ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎに６５０μｌずつ供し、約
６，０００ｘｇで１分間の遠心分離によりＤＮＡをＤＮ
ｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに吸着させた。その
後、ＤＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに５００μ
ｌのｂｕｆｆｅｒ ＡＷを加え、遠心によりＤＮｅａｓ
ｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを２回洗浄した。その後、
ＤＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに６５℃で予め
保温しておいたｂｕｆｆｅｒ ＡＥを１００μｌ供し、
遠心分離によりＤＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ
からＤＮＡを溶出・回収した。
ｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、同キ
ト添付のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｈａｎ
ｄｂｏｏｋに従って以下の方法で行った。液体窒素で凍
結し、ドライアイス存在下で細かく粉砕したとうもろこ
し種子２００ｍｇを容器に入れ、ｂｕｆｆｅｒ ＡＰ１
を６００μｌ、２０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡを３０μｌ
加え、混合した後、６５℃で１０分間保温した。その
後、該混合物にｂｕｆｆｅｒ ＡＰ２を１９５μｌ加
え、氷中で５分間放置した。その後、遠心分離によりそ
の上清液を得、これをＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｓｐｉ
ｎ Ｃｏｌｕｍｎに供し、遠心分離によりＱＩＡｓｈｒ
ｅｄｄｅｒ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎパス液を得た。この
パス液に０．５容量のｂｕｆｆｅｒ ＡＰ３、１容量の
エタノールを加えて混合した。この混合液をＤＮｅａｓ
ｙ ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎに６５０μｌずつ供し、約
６，０００ｘｇで１分間の遠心分離によりＤＮＡをＤＮ
ｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに吸着させた。その
後、ＤＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに５００μ
ｌのｂｕｆｆｅｒ ＡＷを加え、遠心によりＤＮｅａｓ
ｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを２回洗浄した。その後、
ＤＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎに６５℃で予め
保温しておいたｂｕｆｆｅｒ ＡＥを１００μｌ供し、
遠心分離によりＤＮｅａｓｙ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ
からＤＮＡを溶出・回収した。
【００２１】（４）ＰＣＲ：ＤＮＡの増幅反応は、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣ
ｌ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２μＭ プライマー
（配列番号：４）、０．２μＭ プライマー（配列番
号：６）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１．２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー アプライドバイオスシス
テムズ社）、および１００〜５００ｎｇ鋳型ＤＮＡを加
えた反応溶液５０μｌを酵素活性化（９４℃，９分）
後、変性（９５℃，１分）、アニーリング（６３℃，１
分）、伸展（７２℃，１分）の反応を５０回繰り返し、
最終伸展（７２℃，２分）した。得られたＰＣＲ反応液
を２％アガロースゲル電気泳動法に供して、エチジウム
ブロマイド染色−ＵＶ法により解析した。その結果を図
１に示す。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣ
ｌ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．２μＭ プライマー
（配列番号：４）、０．２μＭ プライマー（配列番
号：６）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１．２５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ（パーキンエルマー アプライドバイオスシス
テムズ社）、および１００〜５００ｎｇ鋳型ＤＮＡを加
えた反応溶液５０μｌを酵素活性化（９４℃，９分）
後、変性（９５℃，１分）、アニーリング（６３℃，１
分）、伸展（７２℃，１分）の反応を５０回繰り返し、
最終伸展（７２℃，２分）した。得られたＰＣＲ反応液
を２％アガロースゲル電気泳動法に供して、エチジウム
ブロマイド染色−ＵＶ法により解析した。その結果を図
１に示す。
【００２２】（５）結果：図１から明らかな様に、本発
明のプライマーを用いて上記ＰＣＲを行ない解析した結
果、人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を導入されている害虫抵
抗性の遺伝子組み換えとうもろこしについては、所望の
位置にバンドが検出され、在来品種であるとうもろこし
の８品種では、バンドが検出されなかった。以上の結果
から、上記検出の結果を指標として、在来品種のとうも
ろこしと遺伝子組み換えとうもろこしを識別することが
できることが分かった。
明のプライマーを用いて上記ＰＣＲを行ない解析した結
果、人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を導入されている害虫抵
抗性の遺伝子組み換えとうもろこしについては、所望の
位置にバンドが検出され、在来品種であるとうもろこし
の８品種では、バンドが検出されなかった。以上の結果
から、上記検出の結果を指標として、在来品種のとうも
ろこしと遺伝子組み換えとうもろこしを識別することが
できることが分かった。
【００２３】実施例２ （１）ＤＮＡ抽出：液体窒素で凍結し、ドライアイス存
在下で細かく粉砕した在来品種のとうもろこし種子９９
０ｍｇと、同様に粉砕した遺伝子組み換えとうもろこし
種子１０ｍｇを容器に入れ１０００ｍｇの試料（１％の
比率で遺伝子組み換えとうもろこし種子が存在する試
料）を用意した。この試料にｂｕｆｆｅｒ ＡＰ１を３
ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを１５０μｌ加
え、混合した後、６５℃で１０分間保温した。その後、
ｂｕｆｆｅｒ ＡＰ２を６５０μｌ加え、氷中で５分間
放置した。その後、遠心分離によりその上清液を得、こ
れをＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ
に供し、遠心分離によりＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒＳｐｉ
ｎ Ｃｏｌｕｍｎパス液を得た。このパス液から１ｍｌ
を取り、以後、実施例１と同様の方法でＤＮｅａｓｙ
Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（２個）に吸着した後にＤＮＡ
を溶出・回収した。
在下で細かく粉砕した在来品種のとうもろこし種子９９
０ｍｇと、同様に粉砕した遺伝子組み換えとうもろこし
種子１０ｍｇを容器に入れ１０００ｍｇの試料（１％の
比率で遺伝子組み換えとうもろこし種子が存在する試
料）を用意した。この試料にｂｕｆｆｅｒ ＡＰ１を３
ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを１５０μｌ加
え、混合した後、６５℃で１０分間保温した。その後、
ｂｕｆｆｅｒ ＡＰ２を６５０μｌ加え、氷中で５分間
放置した。その後、遠心分離によりその上清液を得、こ
れをＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ
に供し、遠心分離によりＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒＳｐｉ
ｎ Ｃｏｌｕｍｎパス液を得た。このパス液から１ｍｌ
を取り、以後、実施例１と同様の方法でＤＮｅａｓｙ
Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（２個）に吸着した後にＤＮＡ
を溶出・回収した。
【００２４】（２）ＰＣＲ：実施例１と同様の方法でＰ
ＣＲ反応液を調製し、得られたＰＣＲ反応液を２％アガ
ロースゲル電気泳動法に供してＤＮＡを検出した。
ＣＲ反応液を調製し、得られたＰＣＲ反応液を２％アガ
ロースゲル電気泳動法に供してＤＮＡを検出した。
【００２５】（３）結果：本発明のプライマーを用いて
上記ＰＣＲを行なった結果、所望の位置にバンドが検出
された。以上の結果から、在来品種のとうもろこし種子
中に１％の比率で遺伝子組み換えとうもろこし種子が存
在する場合でも在来品種のとうもろこしと遺伝子組み換
えとうもろこしを識別することができることが分かっ
た。
上記ＰＣＲを行なった結果、所望の位置にバンドが検出
された。以上の結果から、在来品種のとうもろこし種子
中に１％の比率で遺伝子組み換えとうもろこし種子が存
在する場合でも在来品種のとうもろこしと遺伝子組み換
えとうもろこしを識別することができることが分かっ
た。
【００２６】実施例３ （１）制限酵素消化：実施例１で得られた増幅したＤＮ
Ａ断片を含むＰＣＲ反応液１０μｌ、１０×ｂｕｆｆｅ
ｒ Ｅ ２μｌ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ（１０
μｇ／μｌ）０．２μｌ、ｄＨ2 Ｏ ７．３μｌ及び制
限酵素Ｔａｑ Ｉ（１０Ｕ／μｌ）０．５μｌを加えた
反応液２０μｌを６５℃で５分間反応させて制限酵素消
化を行った（試薬：プロメガ社）。得られた制限酵素消
化したＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動法に供
して、エチジウムブロマイド染色−ＵＶ法により解析し
た。その結果を図２に示す。
Ａ断片を含むＰＣＲ反応液１０μｌ、１０×ｂｕｆｆｅ
ｒ Ｅ ２μｌ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＢＳＡ（１０
μｇ／μｌ）０．２μｌ、ｄＨ2 Ｏ ７．３μｌ及び制
限酵素Ｔａｑ Ｉ（１０Ｕ／μｌ）０．５μｌを加えた
反応液２０μｌを６５℃で５分間反応させて制限酵素消
化を行った（試薬：プロメガ社）。得られた制限酵素消
化したＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動法に供
して、エチジウムブロマイド染色−ＵＶ法により解析し
た。その結果を図２に示す。
【００２７】（２）結果：図２から明らかな様に、本発
明のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ
断片を制限酵素Ｔａｑ Ｉによって消化することによ
り、約８０ｂｐおよび１２０ｂｐの位置にバンドが検出
された。このことは（Ｙ）遺伝子の塩基配列と、使用し
た制限酵素の消化部位から決定される消化断片のサイズ
と一致した。以上の結果から、上記制限酵素消化断片の
結果を指標として、増幅されたＤＮＡ断片が（Ｙ）遺伝
子の導入された遺伝子組み換えとうもろこし由来である
ことがより確実に確認された。
明のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ
断片を制限酵素Ｔａｑ Ｉによって消化することによ
り、約８０ｂｐおよび１２０ｂｐの位置にバンドが検出
された。このことは（Ｙ）遺伝子の塩基配列と、使用し
た制限酵素の消化部位から決定される消化断片のサイズ
と一致した。以上の結果から、上記制限酵素消化断片の
結果を指標として、増幅されたＤＮＡ断片が（Ｙ）遺伝
子の導入された遺伝子組み換えとうもろこし由来である
ことがより確実に確認された。
【００２８】
【発明の効果】本発明のプライマーを用いる害虫抵抗性
の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導入された
人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出方法によると、該遺伝
子を導入されている害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物を
検出することが可能になる。また、上記方法により、在
来品種と遺伝子組み換え作物を識別することができる。
の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）に導入された
人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子の検出方法によると、該遺伝
子を導入されている害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物を
検出することが可能になる。また、上記方法により、在
来品種と遺伝子組み換え作物を識別することができる。
【００２９】
配列番号：１（Ｘ） 配列の長さ：１８４５ 配列の型：核酸 配列 ATGGACAACA ACCCAAACAT CAACGAATGC ATTCCATACA ACTGCTTGAG TAACCCAGAA 60 GTTGAAGTAC TTGGTGGAGA ACGCATTGAA ACCGGTTACA CTCCCATCGA CATCTCCTTG 120 TCCTTGACAC AGTTTCTGCT CAGCGAGTTC GTGCCAGGTG CTGGGTTCGT TCTCGGACTA 180 GTTGACATCA TCTGGGGTAT CTTTGGTCCA TCTCAATGGG ATGCATTCCT GGTGCAAATT 240 GAGCAGTTGA TCAACCAGAG GATCGAAGAG TTCGCCAGGA ACCAGGCCAT CTCTAGGTTG 300 GAAGGATTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT 360 CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCGCC 420 TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGTC CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG 480 TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA 540 AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATT 600 GGAAACTACA CCGACCACGC TGTTCGTTGG TACAACACTG GCTTGGAGCG TGTCTGGGGT 660 CCTGATTCTA GAGATTGGAT TAGATACAAC CAGTTCAGGA GAGAATTGAC CCTCACAGTT 720 TTGGACATTG TGTCTCTCTT CCCGAACTAT GACTCCAGAA CCTACCCTAT CCGTACAGTG 780 TCCCAACTTA CCAGAGAAAT CTATACTAAC CCAGTTCTTG AGAACTTCGA CGGTAGCTTC 840 CGTGGTTCTG CCCAAGGTAT CGAAGGCTCC ATCAGGAGCC CACACTTGAT GGACATCTTG 900 AACAGCATAA CTATCTACAC CGATGCTCAC AGAGGAGAGT ATTACTGGTC TGGACACCAG 960 ATCATGGCCT CTCCAGTTGG ATTCAGCGGG CCCGAGTTTA CCTTTCCTCT CTATGGAACT 1020 ATGGGAAACG CCGCTCCACA ACAACGTATC GTTGCTCAAC TAGGTCAGGG TGTCTACAGA 1080 ACCTTGTCTT CCACCTTGTA CAGAAGACCC TTCAATATCG GTATCAACAA CCAGCAACTT 1140 TCCGTTCTTG ACGGAACAGA GTTCGCCTAT GGAACCTCTT CTAACTTGCC ATCCGCTGTT 1200 TACAGAAAGA GCGGAACCGT TGATTCCTTG GACGAAATCC CACCACAGAA CAACAATGTG 1260 CCACCCAGGC AAGGATTCTC CCACAGGTTG AGCCACGTGT CCATGTTCCG TTCCGGATTC 1320 AGCAACAGTT CCGTGAGCAT CATCAGAGCT CCTATGTTCT CATGGATTCA TCGTAGTGCT 1380 GAGTTCAACA ATATCATTCC TTCCTCTCAA ATCACCCAAA TCCCATTGAC CAAGTCTACT 1440 AACCTTGGAT CTGGAACTTC TGTCGTGAAA GGACCAGGCT TCACAGGAGG TGATATTCTT 1500 AGAAGAACTT CTCCTGGCCA GATTAGCACC CTCAGAGTTA ACATCACTGC ACCACTTTCT 1560 CAAAGATATC GTGTCAGGAT TCGTTACGCA TCTACCACTA ACTTGCAATT CCACACCTCC 1620 ATCGACGGAA GGCCTATCAA TCAGGGTAAC TTCTCCGCAA CCATGTCAAG CGGCAGCAAC 1680 TTGCAATCCG GCAGCTTCAG AACCGTCGGT TTCACTACTC CTTTCAACTT CTCTAACGGA 1740 TCAAGCGTTT TCACCCTTAG CGCTCATGTG TTCAATTCTG GCAATGAAGT GTACATTGAC 1800 CGTATTGAGT TTGTGCCTGC CGAAGTTACC TTCGAGGCTG AGTAC 1845
【００３０】配列番号：２（Ｙ） 配列の長さ：１９４７ 配列の型：核酸 配列 ATGGACAACA ACCCCAACAT CAACGAGTGC ATCCCCTACA ACTGCCTGAG CAACCCCGAG 60 GTGGAGGTGC TGGGCGGCGA GCGCATCGAG ACCGGCTACA CCCCCATCGA CATCAGCCTG 120 AGCCTGACCC AGTTCCTGCT GAGCGAGTTC GTGCCCGGCG CCGGCTTCGT GCTGGGCCTG 180 GTGGACATCA TCTGGGGCAT CTTCGGCCCC AGCCAGTGGG ACGCCTTCCT GGTGCAGATC 240 GAGCAGCTGA TCAACCAGCG CATCGAGGAG TTCGCCCGCA ACCAGGCCAT CAGCCGCCTG 300 GAGGGCCTGA GCAACCTGTA CCAAATCTAC GCCGAGAGCT TCCGCGAGTG GGAGGCCGAC 360 CCCACCAACC CCGCCCTGCG CGAGGAGATG CGCATCCAGT TCAACGACAT GAACAGCGCC 420 CTGACCACCG CCATCCCCCT GTTCGCCGTG CAGAACTACC AGGTGCCCCT GCTGAGCGTG 480 TACGTGCAGG CCGCCAACCT GCACCTGAGC GTGCTGCGCG ACGTCAGCGT GTTCGGCCAG 540 CGCTGGGGCT TCGACGCCGC CACCATCAAC AGCCGCTACA ACGACCTGAC CCGCCTGATC 600 GGCAACTACA CCGACCACGC CGTGCGCTGG TACAACACCG GCCTGGAGCG CGTGTGGGGT 660 CCCGACAGCC GCGACTGGAT CAGGTACAAC CAGTTCCGCC GCGAGCTGAC CCTGACCGTG 720 CTGGACATCG TGAGCCTGTT CCCCAACTAC GACAGCCGCA CCTACCCCAT CCGCACCGTG 780 AGCCAGCTGA CCCGCGAGAT TTACACCAAC CCCGTGCTGG AGAACTTCGA CGGCAGCTTC 840 CGCGGCAGCG CCCAGGGCAT CGAGGGCAGC ATCCGCAGCC CCCACCTGAT GGACATCCTG 900 AACAGCATCA CCATCTACAC CGACGCCCAC CGCGGCGAGT ACTACTGGAG CGGCCACCAG 960 ATCATGGCCA GCCCCGTCGG CTTCAGCGGC CCCGAGTTCA CCTTCCCCCT GTACGGCACC 1020 ATGGGCAACG CTGCACCTCA GCAGCGCATC GTGGCACAGC TGGGCCAGGG AGTGTACCGC 1080 ACCCTGAGCA GCACCCTGTA CCGTCGACCT TTCAACATCG GCATCAACAA CCAGCAGCTG 1140 AGCGTGCTGG ACGGCACCGA GTTCGCCTAC GGCACCAGCA GCAACCTGCC CAGCGCCGTG 1200 TACCGCAAGA GCGGCACCGT GGACAGCCTG GACGAGATCC CCCCTCAGAA CAACAACGTG 1260 CCACCTCGAC AGGGCTTCAG CCACCGTCTG AGCCACGTGA GCATGTTCCG CAGTGGCTTC 1320 AGCAACAGCA GCGTGAGCAT CATCCGTGCA CCTATGTTCA GCTGGATTCA CCGCAGTGCC 1380 GAGTTCAACA ACATCATCCC CAGCAGCCAA ATCACCCAGA TCCCCCTGAC CAAGAGCACC 1440 AACCTGGGCA GCGGCACCAG CGTGGTGAAG GGCCCCGGCT TCACCGGCGG CGACATCCTG 1500 CGCCGCACCA GCCCCGGCCA GATCAGCACC CTGCGCGTGA ACATCACCGC CCCCCTGAGC 1560 CAGCGCTACC GCGTCCGCAT CCGCTACGCC AGCACCACCA ACCTGCAGTT CCACACCAGC 1620 ATCGACGGCC GCCCCATCAA CCAGGGCAAC TTCAGCGCCA CCATGAGCAG CGGCAGCAAC 1680 CTGCAGAGCG GCAGCTTCCG CACCGTGGGC TTCACCACCC CCTTCAACTT CAGCAACGGC 1740 AGCAGCGTGT TCACCCTGAG CGCCCACGTG TTCAACAGCG GCAACGAGGT GTACATCGAC 1800 CGCATCGAGT TCGTGCCCGC CGAGGTGACC TTCGAGGCCG AGTACGACCT GGAGAGGGCT 1860 CAGAAGGCCG TGAACGAGCT GTTCACCAGC AGCAACCAGA TCGGCCTGAA GACCGACGTG 1920 ACCGACTACC ACATCGATCA GGTGTAG 1947
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 配列 CTTGACGGAA CAGAGTTCGC CTATG 25
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 配列 CTGGACGGCA CCGAGTTCGC CTACG 25
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列 CTGATGATGC TCACGGAACT GTTG 24
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 配列 CGGATGATGC TCACGCTGCT GTTG 24
【図１】実施例１に示す方法により得られたＰＣＲ反応
液を、２％アガロースゲル電気泳動法ならびにエチジウ
ムブロマイド染色−ＵＶ法により解析した結果を示す説
明図である。
液を、２％アガロースゲル電気泳動法ならびにエチジウ
ムブロマイド染色−ＵＶ法により解析した結果を示す説
明図である。
【図２】実施例１に示す方法により増幅した害虫耐性遺
伝子組み換え作物由来ＤＮＡ断片を、実施例３に示す方
法により制限酵素Ｔａｑ Ｉで消化し、２％アガロース
ゲル電気泳動法ならびにエチジウムブロマイド染色−Ｕ
Ｖ法により解析した結果を示す説明図である。
伝子組み換え作物由来ＤＮＡ断片を、実施例３に示す方
法により制限酵素Ｔａｑ Ｉで消化し、２％アガロース
ゲル電気泳動法ならびにエチジウムブロマイド染色−Ｕ
Ｖ法により解析した結果を示す説明図である。
【図３】人工改変された（Ｘ）遺伝子の塩基配列を示す
説明図である。
説明図である。
【図４】人工改変された（Ｙ）遺伝子の塩基配列を示す
説明図である。
説明図である。
Claims (10)
- 【請求項１】 人工改変されたＣｒｙＩＡ遺伝子以外の
遺伝子との相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩＡ遺
伝子との相同性が高いことを特徴とするプライマー。 - 【請求項２】 天然のバチルス チューリンゲンシスの
ＣｒｙＩＡ遺伝子および遺伝子組み換えされていない作
物の遺伝子との相同性が低く、人工改変されたＣｒｙＩ
Ａ遺伝子との相同性が高いことを特徴とする請求項１に
記載のプライマー。 - 【請求項３】 人工改変された（Ｘ）遺伝子および／ま
たは人工改変された（Ｙ）遺伝子のいずれかと相同性が
高いことを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記
載のプライマー。 - 【請求項４】 １５塩基長以上を有することを特徴とす
る請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライマー。 - 【請求項５】 センスストランドプライマーとして、次
の２種の塩基配列であるプライマー、 ５’−ＣＴＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＴＧ−３’、 ５’−ＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴ
ＡＣＧ−３’、 またはこれらと同等の相補性を有するプライマーのうち
から少なくとも１つを選び、アンチセンスストランドプ
ライマーとして、次の２種の塩基配列であるプライマ
ー、 ５’−ＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＣＴＧＴ
ＴＧ−３’、 ５’−ＣＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＴＧ−３’、 またはこれらと同等の相補性を有するプライマーのうち
から少なくとも１つを選んだことを特徴とする請求項１
〜４のいずれか１項に記載のプライマー。 - 【請求項６】 作物の遺伝子を抽出し、請求項１〜５の
いずれか１項に記載のプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅
法により害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこ
し等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増
幅し、該遺伝子を検出することを特徴とする人工改変Ｃ
ｒｙＩＡ遺伝子の検出方法。 - 【請求項７】 作物の遺伝子を抽出し、請求項１〜５の
いずれか１項に記載のプライマーを用いて、ＤＮＡ増幅
法により害虫抵抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこ
し等）に導入されている人工改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増
幅し、該遺伝子を検出することを特徴とする上記害虫抵
抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）の検出方
法。 - 【請求項８】 作物の遺伝子を抽出し、請求項６〜７の
いずれか１項に記載の方法により、害虫抵抗性の遺伝子
組み換え作物（とうもろこし等）に導入されている人工
改変ＣｒｙＩＡ遺伝子を増幅、検出し、その結果を指標
として、遺伝子組み換えされていない作物と遺伝子組み
換え作物とを識別することを特徴とする害虫抵抗性の遺
伝子組み換え作物（とうもろこし等）の識別方法。 - 【請求項９】 請求項６〜８のいずれか１項に記載の方
法で得られた増幅遺伝子産物を制限酵素による消化を行
い、得られた制限酵素消化断片のサイズをみることによ
り増幅遺伝子産物の配列が人工改変された害虫抵抗性遺
伝子由来であることを確認することを特徴とする害虫抵
抗性の遺伝子組み換え作物（とうもろこし等）の確認方
法。 - 【請求項１０】 標的増幅遺伝子配列中に１〜２ケ所の
制限酵素認識部位を有し、かつ制限酵素消化により異な
るサイズを持つ消化断片を与える制限酵素を使用するこ
とを特徴とする請求項９に記載の害虫抵抗性の遺伝子組
み換え作物（とうもろこし等）の確認方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09541798A JP3475072B2 (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | 害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09541798A JP3475072B2 (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | 害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11266875A true JPH11266875A (ja) | 1999-10-05 |
| JP3475072B2 JP3475072B2 (ja) | 2003-12-08 |
Family
ID=14137119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09541798A Expired - Fee Related JP3475072B2 (ja) | 1998-03-24 | 1998-03-24 | 害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3475072B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030018218A (ko) * | 2001-08-27 | 2003-03-06 | 주식회사 지디바이오텍 | 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트 |
| KR20030084184A (ko) * | 2002-04-25 | 2003-11-01 | 주식회사 지디바이오텍 | 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트 |
| KR100474115B1 (ko) * | 2001-06-01 | 2005-03-08 | 대한민국 | 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머 |
| KR100816738B1 (ko) | 2007-02-13 | 2008-03-25 | 대한민국 | 씨알와이1에이씨 함유 해충저항성 쌀의 검정방법 |
-
1998
- 1998-03-24 JP JP09541798A patent/JP3475072B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100474115B1 (ko) * | 2001-06-01 | 2005-03-08 | 대한민국 | 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머 |
| KR20030018218A (ko) * | 2001-08-27 | 2003-03-06 | 주식회사 지디바이오텍 | 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트 |
| KR20030084184A (ko) * | 2002-04-25 | 2003-11-01 | 주식회사 지디바이오텍 | 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트 |
| KR100816738B1 (ko) | 2007-02-13 | 2008-03-25 | 대한민국 | 씨알와이1에이씨 함유 해충저항성 쌀의 검정방법 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3475072B2 (ja) | 2003-12-08 |
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